FI89943C - Foerfarande foer framstaellning av heparin med laog molekylvikt - Google Patents
Foerfarande foer framstaellning av heparin med laog molekylvikt Download PDFInfo
- Publication number
- FI89943C FI89943C FI871909A FI871909A FI89943C FI 89943 C FI89943 C FI 89943C FI 871909 A FI871909 A FI 871909A FI 871909 A FI871909 A FI 871909A FI 89943 C FI89943 C FI 89943C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- heparin
- molecular weight
- filtrate
- depolymerization
- lmw
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof
- C08B37/0078—Degradation products
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
1 89943
Pienimolekyylipainoisen hepariinin valmistusmenetelmä esillä oleva keksintö koskee pienimolekyylipainoisen hepariinin (LMW-hepariinin) valmistusmenetelmää, jossa käytetään hepariinin entsymaattista depolymerointia.
Tavanomainen hepariini on mukopolysakkaridien heterogeeninen seos, jonka molekyylipainoalue on 5000-50000 daltonia ja lukukeskimääräinen molekyylipaino on noin 10-14000 daltonia.
Hepariini vaikuttaa suoraan tai epäsuorasti joukkoon proteiineja, erityisesti hyytymisjärjestelmän entsyymeihin.
Monet tekijät vaikuttavat hepariinin tehoon, kuten esimerkiksi toiminnallisten ryhmien jakaantuminen molekyylissä ja molekyylipaino. On varmasti todettu, että viimeksi mainitulla seikalla on tärkeä osuus hepariinin aktiivisuudessa, erityisesti antitrombiini III:n välittämässä trombiinin ja tekijä Xa:n inaktivaatiossa.
Antitrombiiniaktiivisuus edellyttää hepariinin vähimmäismo-lekyylipainoa, joka vastaa noin 18 monosakkaridia, se on noin 5400 daltonia, kun taas tekijä Xa:ta estävä aktiivisuus voidaan osoittaa hepariinimolekyyleillä, jotka ovat 5-6 sak-karidiyksikön mittaisia, kooltaan 1500-1800 daltonia.
Hepariinin molekyylipaino vaikuttaa voimakkaasti hepariinin muiden vaikutusten sarjaan, esimerkiksi antitromboottiseen tehoon (hepariinin oligosakkarideilla, jotka sisältävät mo-nosakkarideja 18 tai sitä vähemmän, näyttää olevan heikko antitromboottinen aktiivisuus), vaikutukseen, joka kohdistuu ADP:n indusoimaan trombosyyttien aggregaatioon, biologiseen hyväksikäytettävyyteen ihon alle suoritetun annostelun jäi- 2 89943 keen, PF :n ja HRG:n i nhi boi tumi seen seka aktiivisuuteen si - 4 säisen järjestelmän hyytyrnisentsyymeitä kohtaan, jotka entsyymit vastaavat tekijä Xa:n muodostumisesta.
Viime vuosina mielenkiinto on kohdistunut hepariinifragment-teihin tai -jakeisiin, joilla on korkea XaI/anti trombiiniak-tiivisuus ja joiden molekyylipaino on 4000 daltonista ylöspäin 6000 daltoniin saakka, koska sellaisilla aineilla on ilmoitettu olevan hyvä antitromboottinen teho ja samanaikaisesti vähän tai ei ollenkaan taipumusta aiheuttaa vuotokompli-kaatiota. Niiden biologinen hyväksikäytettävyys on myös kohonnut, erityisesti ihonalaisen annostelun jälkeen.
Koska hepariinin vaikutuksen seiektiivisyy s korreloi molekyy-lipainon kanssa, on todennäköistä, että on olemassa suhteellisen kapea molekyylipainon alue, jolla hepariinin aktiivisuus on suotuisin.
Sen tähden menetelmä LMW-hepariinin valmistamiseksi, jolla on spesifinen, haluttu molekyylipaino ja kapea molekyylipainon jakauma, esimerkiksi alhainen polydispergoituminen, olisi edul1i nen .
Esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä tekee mahdolliseksi saada hepariinista depolymerointi tuotteen mikä tahansa haluttu molekyylipainon alue.
LMW-hepariinia voidaan valmistaa alhaisin saannoin fraktioimalla tavanomaista hepariinia (DOS-2 944 792 ja 2 945 595). Melkein kaikki LMU-hepariinista valmistetaan kuitenkin hepariinin depolymeroinnin avulla, joka suoritetaan kemiallisin tai entsymaattisin menetelmin, minkä jälkeen suoritetaan fraktiointi, jos se on tarpeen (vrt. A. Horner, Heparin, Kak-kar, julkaisija Thomas, 1976, ja Periin et ai. Carbohydrate Res. 1^8 185 (1971 ).
li 3 39943
Hepariinin kemiallista depolymerointi a kuvataan julkaistuissa EP-patenttihakemuksissa O 037 319, 0 076 279 ja O 014 184, US-patentissa 4 351 938 sekä GB-patentissa 2 002 406.
Entsymaattista depolymerointi a kuvataan US-patentissa 3 766 167, GB-patentissa 2 002 406, julkaistussa EP-patentti-hakemuksessa O 014 184 sekä US-patentissa 4 396 762.
Pääasiallinen ongelma, joka on luonteenomainen kaikille erinä suoritetuille depolymerointimenetelmi 11 e, on polymerointi-reaktion pysäyttäminen oikean keskimääräisen molekyy1ipainon kohdalla. Ennen kaikkea, depolymeroi nti reaktio antaa tulokseksi hepariinifragmentteja, jotka ovat pienempiä tai suurempia kuin haluttu molekyylipaino, vieläpä sivureaktioiden puuttuessa.
Hepariinin depolymerointiin käytetyissä, tunnetuissa depolymeroi nti reakti oi ssa , joissa käytetään epäorgaanisia depolymeroi ntireagensseja (typpihappoa, vetyperoksidia, jne.), ei ole mitään etusijaa käsiteltävän molekyylin koon tai pilkottavan sidoksen sijainnin suhteen molekyylin sisällä. R.J. Linhard-tin et ai. mukaan, Biochem. Biophys. Acta 702 (1982) 197-203, ei edes heparinaasientsyymi tee mitään eroa toimintatapansa suhteen, vaan se on satunnaisesti endolyyttinen.
Tämä tarkoittaa, että hepariinin jokaisen depolymerointi seoksen polydispergoituminen kehittyy statistisesti ennustettavissa olevalla tavalla depolymeroitumisasteen funktiona. Erityisesti ajankohtana, jolloin keskimääräinen molekyylipaino on juuri halutun arvon yläpuolella, suurella osalla fragmentteja on haluttu molekyylipaino, mutta depolymeroinnin satunnaisen endolyyttisen luonteen vuoksi niillä on myös suhteellisesti suurempi mahdollisuus depolymeroitua edelleen, jolloin muodostuu fragmentteja, joiden koko on optimi koon ala-puolelia.
39943 4
Jos halutaan kapeampaa molekyylipainon jakaumaa LMW-heparii-nivai misteessa, depolymerointi seos täytyy fraktioida, esimerkiksi fragmentit, joilla on suurempi tai pienempi molekyyli-paino, erotetaan ja heitetään pois. Tämä merkitsee saantotap-piota ja kalliin hepariinilähtöaineen hukkaa.
Esillä olevan keksinnön eräänä kohteena on antaa käyttöön menetelmä, jolla saadaan LMW-hepariinin depolymerointi seoksen kapea molekyylipainojakauma ilman saantotappiota ja lähtöaineen hukkaa.
LMW-hepariinivai miste, jolla on kapea molekyylipainon jakauma, saatetaan saada jatkuvan menetelmän avulla, jossa poistetaan fragmentit, joilla on haluttu molekyylipaino, niin nopeasti kuin mahdollista, jotta estetään niiden 1isädepolymeroitumi-nen. Tämä voidaan suorittaa depolymerointireaktioseoksen jatkuvan fraktioinnin avulla depolymeroinnin aikana, suodatuksen avulla, käyttämällä selektiivistä suodatuksen väliainetta, joka sallii molekyylien, joilla on haluttu molekyylipaino, läpäistä suodattimen, kun taas suurimolekyylisempi materiaali (entsyymi mukaanluettuna) kierrätetään uudelleen lisädepoly-merointia varten.
Monissa kokeissa on kuitenkin havaittu, että molekyylipaino hepariinifragmentei11 a, jotka pystyvät läpäisemään ultrasuo-datusmembraanin , riippuu voimakkaasti pidättyvän nesteen hepari i ni konsentraati osta . Pidättyvän nesteen hepariinikonsent-raation ollessa korkeampi, fragmenttien molekyylipaino saadussa suodoksessa on suurempi.
Myös muut parametrit, kuten esimerkiksi pidättyneen jakeen keskimääräinen molekyylipaino ja polydispergoituminen, reaktioseoksen pH, ioni vahvuus ja orgaanisten muuntajien pitoisuus sekä suodattimen pinta-ala tuotteeseen verrattuina vaikuttavat suodoksen molekyylipainon jakaumaan.
Il 5 0 9 943 Tämä tarkoittaa, että ei ole mahdollista luottaa yksinään suodatinvä1iaineen ominaisuuksiin haluttaessa varmistaa suo-doksen sisältämän LMW-hepariinivai misteen haluttu, vakio molekyyli pai no . Pidättyvässä jakeessa (esimerkiksi depolyme-rointireaktioseoksessa) täytyy suuri joukko parametrejä pitää vakioina, jotta saadaan tuotesuodos, jolla on vakiot, halutut molekyylipaino-omi naisuudet, esimerkiksi keskimääräinen mole-kyylipaino ja polydispergoituminen.
Sen tähden, että tuote poistetaan suodattamalla jatkuvan de-polymerointi reaktion aikana, olisi monimutkaista laskea, vakiinnuttaa ja pitää yllä välttämättömiä vakio-oiosuhteita tai steady state -tilannetta depolymerointireaktioseoksessa .
Esillä olevan keksinnön mukaisesti tämä ongelma on ratkaistu mittaamalla suodoksesta jatkuvasti tai toistuvasti M :n n tai polydispergoitumisen D poikkeamat halutuista arvoista, jonka jälkeen depolymerointireaktion helposti säädettäviä reaktioparametrejä, varsinkin substraatin konsentraatiota, substraatin syöttönopeutta, entsyymin aktiivisuutta, reaktio-lämpötilaa, paineen putoamista membraanisuodattimen toisella puolella ja pidättyneen jakeen uudelleen kierrätyksen virtausta muutetaan jatkuvasti tai usein, niin että poikkeamat halutuista arvoista vähenevät tai ne pysyvät tarkalleen määrätyissä rajoissa.
Esillä olevan keksinnön kokeissa on havaittu, että käyttämällä nopeana vasteanalyysinä A :ssä, suoritettavaa mittausta, 235 voidaan saavuttaa hepariinin depolymeroitumisen steady state ja pitää sitä yllä jonkin aikaa. Samoin on selvitetty, mitä toimintaparametrejä voidaan säätää helposti.
On havaittu, että on mahdollista saada aikaan suodokseen vakio, kapea molekyylipainon jakauma suorittamalla hepariinin jatkuva depolymerointi heparinaasin avulla.
6 39943
Esillä oleva keksintö koskee näin ollen menetelmää pienimole-kyylipainoisen hepariinin (LMW-hepariinin) valmistamiseksi hepariinin entsymaattisen depolymeroinnin avulla, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että hepariinin vesiliuosta syötetään jatkuvasti heparinaasia sisältävään reaktioastiaan, jossa hepariinille suoritetaan entsymaattinen depolymerointi; depo-lymeroitua hepariiniliuosta poistetaan jatkuvasti reaktioas-tiasta ja sille suoritetaan ultrasuodatus, jolloin saadaan pidättynyt jae ja suodos; ainakin osa pidättyneestä jakeesta uudelleenkierrätetään reaktioastiaan; ja LMW-hepariinivalmiste kerätään suodoksesta, jolloin suodoksen valoabsorption nousu, jonka saa aikaan tyydyttämättömien pilkkoutumistuotteiden muodostuminen, mitataan jatkuvasti tai usein koko prosessin aikana, ja suodoksen lukukeskimääräinen molekyylipaino M„ ja poly-dispergoituminen D määritetään jatkuvasti tai usein, edulliset! alkuvaiheessa kunnes depolymerointireaktio on stabiloitunut pysyvälle tasolle, ja jolloin mahdolliset poikkeamat halutuista arvoista korjataan säätämällä entsymaattisen depo-lymerointireaktion prosessiparametrejä.
Esillä olevaa keksintöä valaistaan edelleen viittaamalla liitteenä seuraaviin piirroksiin, joissa: kuvio 1 esittää hepariinin jatkuvan depolymerointimenetelmän edullisen muodon virtauskaaviota; kuvio 2 esittää eri jakeiden HPLC-mittaustuloksia, jotka on saatu esimerkin 1 mukaisen jatkuvan depolymeroinnin kuluessa; ja kuvio 3 esittää esimerkin 2 mukaisen jatkuvan depolymeroinnin kuluessa saatujen eri jakeiden molekyylipainoa.
Hepariinin keskimääräinen molekyylipaino eli LMW-hepariini voidaan esittää lukukeskimääräisenä molekyylipainona (MJ , esimerkiksi painona/moolien lukumäärä tai painokeskimääräisenä molekyylipainona (MJ tai molekyylipainohuippuna (Μ,,Μίρ|Η1) . M^a tai M,,uippu:a käytetään tavallisesti luonnehtimaan hepariinia tai LMW-hepariinivalmisteita.
Il 7 S9943
Valmisteen molekyylipaino voidaan määrittää monin eri menetelmin, esim. geelipermeaatiokromatografian avulla (GPC/HPLC) (N. Sugisaka, F.J. Petracek: Rapid molecular size characterization of heparins by high pressure liquid chromatography, Fed.Proc. 36(1), 89-92, 1977), pienessä kulmassa saapuvan laservalon sironnan avulla (LALLS) (D. Lecacheux, R. Panams, G. Brigand, G. Martin: Molecular weight distribution of carrageenans by size exclusion chromatography and low angle laser light scattering, Carbohydrate Polymers _5, 423-440, 1985), pienessä kulmassa saapuvan X-säteen sironnan avulla (S.S. Stivala, M. Herbst, 0. Kratky, I. Pilz: Physicochemical studies of fractionated bovine heparin V, Arch. Biochem. Biophys. 127 , 795-802, 1968), viskosi teetti mittausten perusteella ja tasapainosentrifugoinnin avulla (S.E. Lasker, S.S. Stivala: Physicochemical studies of fractionated bovine heparin I, Arch. Biochem. Biophys. 115 , 360-372, 1966 ), sekä osmoottisen paineen mittausten sekä di älyysitasapainon avulla (K.E. van Holde: Physical Biochemistry, osa 2.3, sivut 39-47, Prentice Hall, Inc., New Jersey, 1971). Kuitenkin edullisempi olisi menetelmä, jossa viiveaika olisi mahdollisimman lyhyt, kuten esimerkiksi depolyrointi menetelmässä muodostuneiden toiminnallisten ryhmien määrittäminen.
..... Entsymaattinen depolymerointimenetelmä, jossa käytetään hepa- rinaasia, soveltuu spektrofotometriseen 1ukukeskimääräisen molekyylipainon määritykseen, koska entsymaattinen menetelmä on poistava menetelmä, jossa muodostuu yksi pelkistävä pääte-ryhmä ja yksi pääteryhmä, joka sisältää 4,5-tyydyttymättömän iduronihappojohdannaisen, jolla on selvä UV-absorptio 230-235 nm:ssä. Molaarisen absorptiokertoimen Linker ja Hovingh (Biochem. (1972), 563-568) ovat julkaisseet joukolle di-, tetra-, heksa- sekä oligosakkaridien LMW-hepariinifragmentteja. Julkaistujen molaaristen absorptiokertoimien keskimääräinen arvo on 5500.
Voidaan helposti johtaa yhtälö, kuten esimerkiksi 8 99943 , ΔΑ I _ 1 + 235 (!) M ~ M c.r n n ,u joka antaa suhteen, joka vallitsee lukukeskimääräisen molekyy- lipainon (M ) ja 235 nmrssä mitatun absorption nousun välillä, n
Kaavassa (1) M on depolymeroidun tuotteen lukukeskimääräi-n nen molekyylipaino, M on hepariinisubstraatin lukukeski- n, u määräinen molekyylipaino, c on substraatin konsentraatio (g/1) , ΔΑ on absorption lisäys 235 nmrssä mitattuna ja 235 ε on molaarinen absorptiokerroin.
M :n laskeminen on mahdollista, kun hepariinisubstraatin (M ) M , substraatin konsentraatio {c, g/1) ja tyydyt-n jU n tymattömien depolymerointituotteiden absorptiokerroin (ε) ovat tunnetut ja ΔΑ mitataan.
235
Monissa kokeissa hepariini depolymeroitiin heparinaasi11 a, joka oli osittain puhdistettu hydroksyyliapatiittikromatogra-fiaa käyttämällä Linkerin ja Hovinghin mukaisesti (Methods in Enzymology 28 (1972), 902-911).
Lukukeskimääräinen molekyylipaino M laskettiin yhtälön (1) n mukaan sekä käyttäen julkaistua ε:η arvoa 5500, ja M :n ar- n voa verrattiin GPC-HPLCrllä määritettyyn M :n arvoon.
n Täten havaittiin kuitenkin, että M :n (M (ΔΑ)) laskettu n n arvo erosi aina 20 %:iin saakka M :n arvosta, joka määri- n tettiin HPLCrn avulla.
Muuntamalla kaava (1) muotoon 39943 9 ΔΑ = c . ε (2) 235 Μ Μ η η ,ιι on mahdollista laskea absorption lisäys ΔΑ^^^, joka vastaa haluttua lukukeskimääräistä molekyylipainoa M . Mutta kokeet n osoittivat jälleen, että jos depolymerointi pysäytettiin ΔΑ :n laskettuun arvoon, todellinen M , joka oli määritetty 235 n HPLC:n avulla, oli merkittävästi suurempi kuin haluttu M :n n arvo, jos käytettiin Hovinghin ja Linkerin määrittämää tm arvoa 5500.
Pääteltiin, että huono vastaavuus M (ΔΑ):n ja M (HPLC):n vä-L n n lilla johtui arvon ε = 5500 käytöstä.
Yhtälön (1) muuntaminen uudelleen seuraavaan muotoon ε = A . M . M (3) 235 n__n , u _ c (M - M ) n ,u n ilmaisee, että voidaan laskea käyttämällä c:n ja M :n tun- n,u nettuja arvoja sekä samanaikaisesti määritettyjä ΔΑ :n ja 235 M (H P L C ):n arvoja, n Tällä tavalla saatiin arvo ε = 7600, joka antoi hyvän korrelaation lasketun M (ΔΑ): n ja havaitun M (HPLC):n arvojen vä- n n lilla monissa kokeissa.
Vaikka yllä esitettyä yhtälöä (1) käytetään erädepolymerointi -menetelmään, on havaittu, että jatkuvasta depolymerointireak-tiosta saadun valmistesuodoksen M voidaan laskea käyttämällä yhtälöä (1) sekä arvoa ε = 7600, edellyttäen, että järjestelmä on lähellä steady state -tilaa. Poikkeamat steady statesta 10 09943 vähentävät Μ,,ιη laskemisen tarkkuutta, mutta antavat vielä tietoa tarpeellisten muutosten suunnasta. Yhtälössä (1) M„>u on tunnettu, mitataan käyttämällä "on-line"-spektrofotomet- ria, ja c:n arvo voidaan saada mittaamalla suodoksen taitekerroin Rl käyttämällä "on-line"-kalibroitua Rl-ilmaisinta tai mittaamalla UV-absorptio kahdella eri aallonpituudella, esimerkiksi 197 ja 235 nm:ssä.
Koska suodoksen Rl ja A^n mittaus antaa välitöntä informaatiota menetelmän tilasta, menetelmäparametrien tarpeelliset korjaukset voidaan tehdä välittömästi, kun havaitaan poikkeamat halutuista molekyylipainon ja polydispergoitumisen arvoista .
Aiheeseen perehtyneelle henkilölle on selvää, että UV-absorption nousu, jonka saa aikaan tyydyttämättömien hajoamistuotteiden muodostuminen heparinaasin vaikuttaessa hepariiniin, voidaan mitata muilla aallonpituuksilla kuin 235 nm:ssä. Ab-sorptiokerroin kuitenkin mitataan 235 nm:ssä, koska sillä on maksimi tässä aallonpituudessa.
Depolymerointireaktiota voidaan valvoa säätelemällä substraatin syöttönopeutta, substraatin syöttökonsentraatiota substraatin virtausnopeussuhteeseen nähden sekä entsyymin aktiivisuutta. Substraatin syöttönopeuden muutokset voidaan saada muuttamalla substraatin virtausnopeutta tai substraatin syöttökonsentraatiota tai molempia. Substraatin syöttökonsentraa-tion muutokset substraatin virtausnopeussuhteeseen nähden voidaan saada muuttamalla substraatin syöttökonsentraatiota tai substraatin virtausnopeutta tai molempia. "Substraatin virtausnopeus" tässä yhteydessä käytettynä tarkoittaa substraatin tilavuutta aikayksikköä kohti (esim. litra/tunti).
li 11 '39943 "Substraatin syöttökonsentraatio" tarkoittaa hepariinin kon-sentraatiota järjestelmään suoritetussa substraatin syötössä (esim. mg/ml). "Substraatin syöttönopeudel1 a" tarkoitetaan hepariinin painomäärää, joka on syötetty järjestelmään aikayksikössä (esim. g/tunti). "Substraatin virtausnopeus" x "substraatin syöttökonsentraatio" = "substraatin syöttöno-peus".
Entsyymin aktiivisuutta voidaan lisätä lisäämällä entsyymiä tai nostamalla reaktiolämpöti1 aa, tai aktiivisuutta voidaan vähentää laskemalla reaktiolämpöti1 aa tai poistamalla entsyymiä reaktioastiasta (esimerkiksi, jos se on tehty liikkumattomaksi). Muut parametrit, joita voidaan käyttää depolyme-rointireaktion säätelyssä, ovat paineen pudotus membraanisuodattimen toisella puolella tai pidättyneen jakeen uudelleen-k i errä ty s.
Esillä olevan keksinnön mukaisesti menetelmä parametri en korjaukset voidaan suorittaa seuraavasti: a) Jos suodoksen M on suurempi kuin haluttu M :n arvo, . . n n substraatin syöttö nopeutta voidaan vähentää pienentämällä substraatin virtausnopeutta tai substraatin syöttökonsentraa- tiota tai molempia tai lisätään entsyymin aktiivisuutta. Jos M on alhaisempi kuin haluttu M :n arvo, menetellään vas-n n takkaisella tavalla.
b) Jos suodoksen polydispergoituminen on voimakkaampaa kuin on toivottavaa, substraatin syöttökonsentraatiota substraatin virtausnopeussuhteeseen nähden voidaan pienentää vähentämällä substraatin syöttökonsentraatiota tai lisäämällä substraatin virtausnopeutta tai molempia. Jos polydispergoituminen on haluttua määrää vähäisempää, menetellään vastakkaisella tavalla.
c) Jos M sekä polydispergoituminen poikkeavat halutuista ar- n voista, voidaan suorittaa yllä mainittujen korjausten yhdistelmä. Korjaukset voidaan suorittaa seuraavissa esimerkeissä kuvatulla tavalla, joista esimerkki 1 valaisee ainoastaan
12 3994 J
M :n säätelyä ja esimerkki 2 valaisee M :n säätelyä ja n n polydispergoitumista mainitussa järjestyksessä.
Esillä olevan keksinnön mukaisesti käytetty heparinaasi valmistettiin tunnetulla tavalla, jota Hovingh ja Linker ovat kuvanneet (Methods in Enzymology 2J3 ( 1972 ), 902-911 ja J. Biol. Chem. 245 (1970), 6170-6175), kasvattamalla Flavo-bacterium hepariumia hepariinia sisältävällä substraatilla, kokoamalla solut ja rikkomalla solut ääni käsittelyn avulla sekä puhdistamalla heparinaasi mm. suorittamalla kromatogra-fia hydroksiapatiiti 11 a.
LMW-hepariinituote voidaan saostaa lisäämällä alkoholia (mieluummin 0,6-10 ti 1 av./ti 1 av.), ja depolymeroitu tuote voidaan puhdistaa hyvin tunnetuin menetelmin, esimerkiksi valkaisun avulla, steriilisuodatuksen avulla sekä alkoholi saostuksella.
Hepariinin depolymerointireaktio suoritetaan mieluummin o 25-40 C:n lämpötilassa ja pHrssa 6-8.
Yksi heparinaasiyksikkö määritellään Hovinghin ja Linkerin mukaisesti, Methods in Enzymol., 28 (1972), 902-911.
Jotta varmistutaan depolymerointireaktion nopeasta takaisin-syötön säädöstä, joka riippuu keskimääräisen molekyylipainon ja polydispergoitumisen poikkeamasta halutuista arvoista, voidaan menetelmä suorittaa kuvassa 1 esitetyllä tavalla. Kuva 1 kuvaa esillä olevan keksinnön erityistä suoritusmuotoa, joka nimenomaan on käyttökelpoinen depolymeroitaessa hepariinia entsymaattisesti LMW-hepariiniksi, jonka polydispergoituminen on alhainen, käyttämällä liikkumattomaksi tehtyä heparinaasia pääasiallisena entsyymin lähteenä. Kuitenkin esitetään myös tapa hepariini1iuoksel1 a suoritettavaa täydennystä varten.
Hepariinisubstraatti a, jolla on ennalta määritetty, haluttu konsentraatio , käytetään siten, että hepariinin varastoiiuos- 13 89943 ta 16 sekoitetaan puskurin 17 kanssa sekoittajassa 1 ja seos syötetään annostelupumpun 2 avulla suljettuun kierto-reaktio vyöhykkeeseen. Reaktiovyöhyke koostuu pidättynyttä jaetta kierrättävästä pumpusta 4, uitrasuotimesta 5, entsyymi reaktioasti asta 3 ja tämän kanssa rinnan kytketystä venttiilistä 6. Koska reaktiovyöhyke on suljettu substraatin syöttölinjaa ja uitrasuodatusmembraania lukuunottamatta, suodoksen virtaus tulee olemaan yhtä suuri kuin substraatin virtaus. Pidättyvän jakeen nopea virtaus on toivottavaa, jotta estetään polaroituminen uitrasuodatusmembraani11 a. Tämä saattaa kuitenkin vaurioittaa liikkumattomaksi tehdyn entsyy-mikerroksen, mikä johtuu paineen pudotuksesta, joka tapahtuu kerroksen toisella puolella. Pidättyneen jakeen päävirta kiertää sen tähden rinnakkain kytketyn linjan ja venttiilin 6 kautta, jota avataan tai suljetaan paineen pudotuksen säätämiseksi entsyymikerroksen toisella puolella.
UItrasuodatusmembraanin toisella puolella suodatuksen painetta, joka mitataan manometrillä 14, voidaan lisätä, jos se on tarpeen sulkemalla venttiili 15 osittain. Entsyymireak-ti on lämpötilaa voidaan sää tää vedenkiertovaipan (reaktioas-tian 3 ympärillä (ei kuvattu)) avulla. LMW-hepariinijae, joka poistuu uitrasuodoksessa sijaitsevasta depolymerointi vyöhykkeestä, analysoidaan keskimääräisen molekyylipainon ja poly-dispergoitumisen suhteen. Näytteenottolaite 7, joka on esitetty skemaattisesti, ottaa näytteitä automaattisesti, ennen kuin suodos kulkee mittareihin 8, 9, 10.
Esillä olevan keksinnön suoritusmuodossa mitataan kolme parametriä: taitekerroin (Rl), UV-absorptio 235 nmrssä (A ) 235 ja polydispergoituminen (D). Rl ja A mitataan jatkuvasti 235 tai lyhyin välein vastaavasti Rl-ilmaisimen ja spektrofoto-metrin 9 avulla. D määritetään satunnaisestiikromatografia- laittein 10 suoritetun M :n ja M :n GPL-HPLC-määrityksen , n n avulla. Näytteistä saadut tulokset syötetään tietojenkäsittely-yksikköön 12, joka laskee LMW-hepariinin konsentraation c ,, 39943 14
(g/1itra) RI:stä, 1ukukeskimääräisen molekyylipal no M
(Dalton) c:stä absorption lisäyksen 235 nm:ssä (ΔΑ 1, ent- 235 syymiaktiivisuuden (NE) kaavasta NE = ΔΑ^ * virtausnopeus, sekä polydispergoitumisen D HPLC-tuloksista. Käsittely- yksikkö säätelee prosessia laskettujen parametrien M , D, c n sekä NE:n perusteella säätämällä substraattikonsentraatiota sekoittajan 1 avulla, virtausnopeutta (SEV) pumpun 2 avulla, entsyymiaktiivisuutta varastoiiuoksesta 18 entsyymiini i säysventti i 1 i n 13 avulla ja/tai reaktioiämpöti1 an säädön (ei esitetty kaaviossa) avulla, paineenpudotusta memb-raanisuodattimen toisella puolella venttiilin 15 avulla ja pidättyneen jakeen kiertovirtausta kierrätyspumpun 4 avulla. Ohjausvirtapiirit sekä automaattisesti toimiva laitteisto, joka on kaaviomaisesti esitetty kuvan 1 juoksukaaviossa, ovat ta vanomai siä jä rjestelmi ä ja laitteita, eikä niitä tarvitse kuvata tässä yhteydessä.
Hepariinin jatkuvasti tapahtuva depolymerointi kuvan 1 mukaisesti, 1aboratoriomittakaavassa, esitetään alla esimerkkinä.
Esimerkki 1 FI avobacterium heparinumia kasvatettiin hepariinia sisältävällä substraatilla, ja heparinaasi valmistettiin homogenoidusta soiukonsentraatista suodattamalla se 100 KD:n sekä vä-kevöimällä 30 KD:n uitrasuodattimien avulla. Entsyymi tehtiin liikkumattomaksi CNBr:11ä aktivoidun Sepharose 4B:n avulla hepariinin läsnäollessa.
750 yksikköä liikkumattomaksi tehtyä heparinaasia, jonka laskettu depolymerointikapasiteetti ympäristön lämpötilassa oli 5-600 mg/h hepariinia, jonka M «/11500, LMW-hepari i ni ksi, n, u jonka M ^4000 daltonia, asetettiin entsyymireaktioastiaan 3. n Järjestelmä täytettiin hepariinisubstraatti 1iuoksel1 a (10 mg/ml 0,1 M Na-asetaatissa, 0,005 M Ca-asetaatissa, pH 7,0), josta oli poistettu pidättynyt ilma, ja hepari1nisubstraat- is 39943 tia syötettiin järjestelmään alkunopeudella 60 ml/h, ympäristöni ämpöti 1assa.
Joidenkin minuuttien jälkeen suodoksen virtausnopeus vastasi täsmälleen substraatin virtausnopeutta. Kokeen aikana koottiin jakeet, joiden suuruus oli 10 ml. Taitekerrointa Rl tarkkailtiin jatkuvasti, ja absorptio 235 nm:ssä, A , mitat- 235 tiin usein, ainakin kerran jaetta kohti, sen jälkeen kun näytteet oli laimennettu 1,7-M perkloorihapolla .
Valmisteen 1ukukeskimääräinen molekyylipaino M laskettiin n
Rl- ja A -arvoista ja sijoitettiin jakeen numeroa vastaan 235 graafiseen esitykseen, kuvan 2 osoittamalla tavalla.
HPLC-molekyylipainoanalyysi suoritettiin muutamista jakeista.
Tulokset varmistavat lasketut M -arvot, kuten käy ilmi kuvas- n ta 2, ja lisäksi tulokset antavat käyttöön painokeskimääräi- sen molekyylipainon M sekä polydispergoitumisen D (kaavasta w 0 = M /M laskettuna) lukuarvot. Koska laskettu M vastaa . . w n n hyvin M -arvoa, joka on mitattu HPLC:llä, kyseessä oleva esi-n merkki näyttää toteen, että yhtälöä (1) voidaan käyttää jatkuvalla depolymerointi reaktion a saadun LMW-hepariinivalmis- teen M :n määrittämiseen, n
Rl, A -menettely antaa lähes välitöntä tietoa menetelmän 235 tilasta ja tekee mahdolliseksi korjausmittausten suorittamisen .
Esillä oleva esimerkki valaisee edelleen valmisteen saamista, jolla on haluttu M , siten että substraatin virtausno- n peus säädetään substraatin syöttökonsentraation ollessa kiinteä .
Koe suoritettiin kolmessa vaiheessa.
16 o 9 9 4 3 1) Virtausnopeus 60 ml/h: Tässä vaiheessa tuotteen M lisääntyi tasaisesti ja saavutti halutun 4000 daltonin arvon ^22 jakeen jälkeen.
2) Virtausnopeus 30 ml/h: Muutamien lisäjakeiden jälkeen virtausnopeus väheni 30 ml:aan/h jakeesta no 27 lähtien.
Kuten voidaan nähdä kuvasta 2, vaste oli tasainen M :n lasku.
n 3) Virtausnopeus 60 ml/h: Kun valmiste M saavutti arvon 3300 n daltonia jakeessa 43 vielä vähentyen, aloitettiin uudelleen aikuvirtausnopeudel1 a 60 ml/h. M :n arvon putoaminen pysähtyi, n ja sitä seurasi uudelleen tasainen lisäys, joka tasoittui jakeen no 60 kohdalla. Tästä kohdasta lähtien ja kokeen koko loppuajan pienet vaihtelut havaituissa parametreissä ilmaisivat, että muuttumaton tila (steady state) oli saavutettu.
Vertailun vuoksi käytettiin 1iikkumattomaksi tehtyä hepari- naasia hepariinin polymerointiin erä tyyppisissä reaktioissa.
Eräässä kokeessa hepariini depolymeroitiin lukukeskimääräi- seen molekyylipainon arvoon M *4000 daltonia, joka on vertai- n lukelpoinen jatkuvalla menetelmällä saadun "steady state"- valmistesuodoksen M :n kanssa.
n
Eräässä toisessa kokeessa hepariini depolymeroitiin painokes-kimääräiseen molekyylipainoon, joka on vertailukelpoinen jatkuvalla menetelmällä saadun "steady state"-valmistesuodoksen M :n kanssa, n M - ja M -jakaumat analysoitiin HPLC:n avulla. Kahden n w reaktiotyypin tulokset annetaan alla sijaitsevassa taulukossa.
li 17 9 9 943
Taulukko I
Jatkuva reaktio M M D M
w n n (mitattu HPLCrllä) (lask. RI:stä ja
Jae no A :stä ) 235 65 6152 3734 1,65 3950 74 7365 4179 1,76 4120 83 6650 3979 1,67 3950 94 6823 4114 1,66 4120 keskiarvo 6748 4002 1,69 4035 S.D. +500 S.D. +200 S.D. +0,05 S.D. +100
Eränä suoritettu reaktio 1 (M :πλ/4000 saamiseksi)
Näyte no M M ° D
w n 1 7894 3996 1,98 2 7507 3937 1,91 3 7503 3897 1,93 keskiarvo 7635 3943 1,94 S.D. +225 S.D. +50 S.D. +0,04
Eränä suoritettu reaktio 2 (M :n arvon 6700 saamiseksi) w
M M D
w n 6681 3175 2,10
Yllä esitetystä käy ilmi, että jatkuvasta menetelmästä saadun LMW-hepariinivalmisteen polydispergoituminen on huomattavasti vähentynyt eränä suoritettavaan depolymerointimenetelmään 18 89945 verrattuna. Edelleen käy ilmi, että lasketut M -arvot pitävät hyvin yhtä jatkuvalle reaktiolle mitattujen M :n arvojen kanssa.
Esimerkki 2
Hepariini depolymeroitiin LMW-hepariiniksi liikkumattomaksi tehdyllä heparinaasi11 a, käyttämällä esimerkin 1 mukaista laitetta ja esimerkin 1 mukaisia ilmaisumenetelmiä.
Valmistusta säädettiin kahdessa vaiheessa.
Vaiheessa 1, kuten esimerkissä 1, käytettiin substraatin virtausnopeuden vastetta reaktiona vai mistesuodoksen M :n poikkeamaan halutusta, noin 4000 daltonin suuruisesta arvosta, jotta saatiin steady state, jossa substraatin virtausnopeus vastasi suodoksen haluttua M -arvoa.
n
Kuten voidaan nähdä taulukosta IV ja kuten on esitetty kuvassa 3, alkuperäistä substraatin virtausnopeutta, joka oli 60 ml tunnissa hepariinisubstraati11 e, jonka konsentraatio oli 10 mg/ml , vähennettiin asteittain 12 ml:k s i tunnissa, joka vastasi substraatin syöttönopeutta 120 mg tunnissa, jotta saatiin steady state (I) jakeesta no 78 lukien.
Steady state -tilassa LMW-hepariinivai misteen 1ukukeskimääräi- nen molekyylipaino ja polydispergoituminen , jotka saatiin GPC- HPLC-analyysin perusteella, olivat vastaavasti M = 4150 ja n D = 1,71 vastaten painokeskimääräistä molekyylipaino M =
7100. W
Toisessa vaiheessa jakeesta no 114 lähtien substraatin syöt-tökonsentraatiota substraatin virtausnopeuden suhteen muutettiin 25-kertaisesti vähentämällä substraatin syöttökonsent-raatiota viisinkertaisesti 2 mg:aan hepariinia mi 11i1itrassa sekä lisäämällä viisinkertaisesti substraatin virtausnopeutta aina 60 ml:aan tunnissa, jolloin substraatin syöttönopeus pysyi 120 mg:na tunnissa.
Il >39943 19
Muutosten johdosta syntyi uusi steady state -tila (II) jakees-ta no 140 lähtien, kuten voidaan nähdä taulukosta II ja kuvasta 3.
Lukukeskimääräinen molekyylipaino M säilyi käytännöllisesti n katsoen muuttumattomana, mutta valmisteen polydispergoitumi- nen väheni niin alhaiseen arvoon kuin D = 1,55, joka vastasi M :n arvoa 6450, kuten voidaan nähdä taulukosta IV ja ku-w vasta 3.
Taulukko II
Jae Substr. kons. Virtaus- M M D M
n n w no1) nopeus (mg/ml) (ml/h) (laskettu) (GPC-HPLC-analyysi) 1 10 60 3850 4300 1,73 7450 6 - - 4300 4500 1,73 7800 7 30 4500 9 - 4700 4750 1,78 8450 10 - 18 4900 5000 1,76 8800 20 - - 4560 4450 1,79 7950 50 - - 4100 4350 1,76 7650 75 - - 4350 4700 1,78 8350 80 - 12 4300 4150 1,71 7100 100 - - 4150 1,69 7000 110 - - 4050 1,74 7050 115 2 60 4100 1,67 6725 130 - - 4250 1,65 7000 140 - - 4050 1,58 6400 150 - - 4150 1,55 6450 160 - - 4200 1,55 6500 170 - - 4500 4300 1,55 6650
Jakeen koko: 10 m) 20 8 9 9 4 3
Esimerkkien 1 ja 2 tuloksista ja vastavasti kuvien 2 ja 3 graafisista esityksistä voidaan nähdä, että esillä olevan keksinnön mukainen jatkuva depolymerointi toimii pitkiä jaksoja häiriöttä, mikä havainnollisti sitä seikkaa, että jatkuva depolymerointireaktiojärjestelmä on suhteellisen pysyvä. Niinpä kyseessä olevan keksinnön toteuttamisen avulla tutkitaan hepariinin jatkuvan depolymeroinnin suorittamista ilman sen säätöä A :n tai muiden vastaavien mittausten avulla, 235 esimerkiksi HPLC-molekyylipainomittausten avulla. Kuitenkin, kuten jo mainittiin, A -mittauksen avulla suoritettu säätä- 235 minen muodostaa edullisen toimintatavan.
Kuten esimerkin 2 antamista tuloksista voidan päätellä, esillä olevan keksinnön mukaisesti voidaan saada LMW-heparii-nivalmiste, jonka polydispergoitumisaste on jokseenkin alhainen saavuttaen (katso jakeet 140-170) alueen 1-1,6, joka on edullinen kyseessä olevaa keksintöä toteutettaessa.
li
Claims (9)
- 21 d9943
- 1. Menetelmä LMW-hepariinin valmistamiseksi hepariinin ent-symaattisen depolymeroinnin avulla, tunnettu siitä, että hepariinin vesiliuosta syötetään jatkuvasti heparinaasia sisältävään reaktioastiaan, jossa hepariinille suoritetaan entsymaat-tinen depolymerointi; depolymeroitua hepariiniliuosta poistetaan jatkuvasti reaktio-astiasta ja sille suoritetaan ultrasuodatus, jolloin saadaan pidättynyt jae ja suodos; ainakin osa pidättyneestä jakeesta uudelleenkierrätetään reaktioastiaan; ja LMW-hepariinivalmiste kerätään suodoksesta, jolloin suodoksen valoabsorption nousu, jonka saa aikaan tyydyttämättömien pilkkoutumistuotteiden muodostuminen, mitataan jatkuvasti tai usein koko prosessin aikana, ja suodoksen luku-keskimääräinen molekyylipaino M„ ja polydispergoituminen D määritetään jatkuvasti tai usein, edulliset! alkuvaiheessa kunnes depolymerointireaktio on stabiloitunut pysyvälle tasolle, ja jolloin mahdolliset poikkeamat halutuista arvoista korjataan säätämällä entsymaattisen depolymerointireaktion pro-sessiparametrejä. ... 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valoabsorptio mitataan 235 nm:ssä ja että lisäksi mitataan jatkuvasti tai usein suodoksen taitekerroin Rl, ja että mittaustuloksia käytetään LMW-valmisteen lukukeskimääräisen molekyylipainon M„ laskemiseen suodoksesta.
- 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, - että substraatin syöttönopeutta alennetaan, jos suodoksen si sältämän depolymeroidun hepariinin lukukeskimääräinen molekyylipaino M„ on suurempi kuin haluttu molekyylipaino.
- 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että substraatin syöttönopeutta lisätään, jos suodoksen sisältämän depolymeroidun hepariinin lukukeskimääräinen molekyyli-paino M„ on alhaisempi kuin haluttu molekyylipaino. 22 89943
- 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että suhdetta hepariinisubstraatin syöttökonsentraation ja substraatin virtausnopeuden välillä alennetaan, kun depolyme-roidun hepariinin suodoksen polydispergoituminen on suurempi kuin haluttu polydispergoituminen.
- 6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että suhdetta hepariinisubstraatin syöttökonsentraation ja substraatin virtausnopeuden välillä lisätään, kun depolyme-roidun hepariinin suodoksen polydispergoituminen on alhaisempi kuin haluttu polydispergoituminen.
- 7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että heparinaasin entsyymiaktiivisuutta säädetään, jolloin sitä alennetaan, jos LMW-hepariinin depolymerointivalmisteen molekyylipainosta tulee liian alhainen, ja entsyymiaktiivisuutta lisätään, jos LMW-hepariinin depolymerointivalmisteen molekyylipainosta tulee liian korkea.
- 8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että heparinaasia käytetään liikkumattomassa muodossa.
- 9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että prosessiparametrejä säädetään siten, että valmistetun LMW-hepariinivalmisteen polydispergoituminen on noin 1-1,6.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK196886 | 1986-04-30 | ||
| DK196886A DK196886D0 (da) | 1986-04-30 | 1986-04-30 | Fremstilling af polysaccharider |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI871909A0 FI871909A0 (fi) | 1987-04-29 |
| FI871909A FI871909A (fi) | 1987-10-31 |
| FI89943B FI89943B (fi) | 1993-08-31 |
| FI89943C true FI89943C (fi) | 1993-12-10 |
Family
ID=8109192
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI871909A FI89943C (fi) | 1986-04-30 | 1987-04-29 | Foerfarande foer framstaellning av heparin med laog molekylvikt |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0244235B1 (fi) |
| JP (1) | JPS62283102A (fi) |
| AT (1) | ATE84801T1 (fi) |
| AU (1) | AU585709B2 (fi) |
| CA (1) | CA1334080C (fi) |
| DE (1) | DE3783644T2 (fi) |
| DK (1) | DK196886D0 (fi) |
| ES (1) | ES2052559T3 (fi) |
| FI (1) | FI89943C (fi) |
| GR (1) | GR3006929T3 (fi) |
| IE (1) | IE60409B1 (fi) |
| NO (1) | NO167577C (fi) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK196986D0 (da) * | 1986-04-30 | 1986-04-30 | Novo Industri As | Fremstilling af polysaccharider |
| FR2663639B1 (fr) * | 1990-06-26 | 1994-03-18 | Rhone Poulenc Sante | Melanges de polysaccharides de bas poids moleculaires procede de preparation et utilisation. |
| USRE38743E1 (en) | 1990-06-26 | 2005-06-14 | Aventis Pharma S.A. | Mixtures of particular LMW heparinic polysaccharides for the prophylaxis/treatment of acute thrombotic events |
| US5707973A (en) * | 1991-04-23 | 1998-01-13 | Rhone-Poulenc Rorer S.A. | Sulfated polysaccharids for treatment or prevention of thromboses |
| FR2675806B1 (fr) * | 1991-04-23 | 1994-06-10 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Polysaccharides sulfates, procede de preparation, composition pharmaceutique et utilisation. |
| US5744457A (en) * | 1995-03-31 | 1998-04-28 | Hamilton Civic Hospitals Research Development Inc. | Compositions and methods for inhibiting thrombogenesis |
| US6001820A (en) * | 1995-03-31 | 1999-12-14 | Hamilton Civic Hospitals Research Development Inc. | Compositions and methods for inhibiting thrombogenesis |
| US5763427A (en) * | 1995-03-31 | 1998-06-09 | Hamilton Civic Hospitals Research Development Inc. | Compositions and methods for inhibiting thrombogenesis |
| US5767269A (en) * | 1996-10-01 | 1998-06-16 | Hamilton Civic Hospitals Research Development Inc. | Processes for the preparation of low-affinity, low molecular weight heparins useful as antithrombotics |
| PT946185E (pt) * | 1996-11-27 | 2005-02-28 | Aventis Pharm Prod Inc | Composicao farmaceutica compreendendo um composto que possui actividade anti-xa e um composto antagonista da agregacao plaquetaria |
| CA2293595A1 (en) * | 1997-06-06 | 1998-12-10 | Hamilton Civic Hospitals Research Development, Inc. | Modified low molecular weight heparin that inhibits clot associated coagulation factors |
| HUP0201712A3 (en) * | 1999-06-30 | 2003-03-28 | Weitz Jeffrey I Ancaster | Clot associated coagulation factors inhibiting heparin compositions |
| JP4828795B2 (ja) | 2002-03-11 | 2011-11-30 | モメンタ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド | 硫酸化多糖類の分析 |
| EP1582531A1 (en) * | 2004-03-24 | 2005-10-05 | Aventis Pharma S.A. | Process for oxidizing unfractionated heparins and detecting presence or absence of glycoserine in heparin and heparin products |
| EP1792621B1 (en) | 2005-11-30 | 2012-04-04 | Istituto di Ricerche Chimiche e Biochimiche "G. Ronzoni" | Orally administrable heparin derivatives |
| US9139876B1 (en) | 2007-05-03 | 2015-09-22 | Momenta Pharmacueticals, Inc. | Method of analyzing a preparation of a low molecular weight heparin |
| EP2526122B1 (en) | 2010-01-19 | 2020-06-10 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | Evaluating heparin preparations |
| WO2012115952A1 (en) | 2011-02-21 | 2012-08-30 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | Evaluating heparin preparations |
| CN102690862B (zh) * | 2012-06-08 | 2015-01-28 | 上海太阳生物技术有限公司 | 抗凝血酶ⅲ(at-ⅲ)测定试剂盒(发色底物法) |
| JP2022540849A (ja) | 2019-07-09 | 2022-09-20 | オプティムヴィア、エルエルシー | 抗凝固性多糖類の合成方法 |
| CN111763702A (zh) * | 2020-07-13 | 2020-10-13 | 福州大学 | 一种制备硫酸乙酰肝素寡糖的方法 |
| EP4182452A4 (en) | 2020-07-14 | 2024-07-31 | Optimvia Llc | METHOD FOR THE SYNTHESIS OF NON-ANTICOAGULATING HEPARAN SULFATE |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4351938A (en) * | 1980-05-19 | 1982-09-28 | Riker Laboratories, Inc. | Anticoagulant substance |
| US4396762A (en) * | 1981-08-24 | 1983-08-02 | Massachusetts Institute Of Technology | Heparinase derived anticoagulants |
| DE3244214A1 (de) * | 1982-11-30 | 1984-05-30 | B. Braun Melsungen Ag, 3508 Melsungen | Verfahren zur reinigung und fraktionierung von heparin |
| DK196986D0 (da) * | 1986-04-30 | 1986-04-30 | Novo Industri As | Fremstilling af polysaccharider |
-
1986
- 1986-04-30 DK DK196886A patent/DK196886D0/da not_active Application Discontinuation
-
1987
- 1987-04-29 EP EP87303835A patent/EP0244235B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-04-29 NO NO871784A patent/NO167577C/no not_active IP Right Cessation
- 1987-04-29 DE DE8787303835T patent/DE3783644T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1987-04-29 FI FI871909A patent/FI89943C/fi not_active IP Right Cessation
- 1987-04-29 AT AT87303835T patent/ATE84801T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-04-29 ES ES87303835T patent/ES2052559T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-04-30 JP JP62104845A patent/JPS62283102A/ja active Granted
- 1987-04-30 CA CA000536095A patent/CA1334080C/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-04-30 AU AU72253/87A patent/AU585709B2/en not_active Ceased
- 1987-05-11 IE IE115287A patent/IE60409B1/en not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-01-28 GR GR930400176T patent/GR3006929T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI871909A0 (fi) | 1987-04-29 |
| DE3783644D1 (de) | 1993-03-04 |
| NO167577B (no) | 1991-08-12 |
| FI871909A (fi) | 1987-10-31 |
| EP0244235A3 (en) | 1988-09-28 |
| GR3006929T3 (fi) | 1993-06-30 |
| EP0244235A2 (en) | 1987-11-04 |
| IE871152L (en) | 1987-10-30 |
| EP0244235B1 (en) | 1993-01-20 |
| NO871784L (no) | 1987-11-02 |
| ATE84801T1 (de) | 1993-02-15 |
| ES2052559T3 (es) | 1994-07-16 |
| JPH0542918B2 (fi) | 1993-06-30 |
| NO167577C (no) | 1991-11-20 |
| NO871784D0 (no) | 1987-04-29 |
| AU585709B2 (en) | 1989-06-22 |
| FI89943B (fi) | 1993-08-31 |
| JPS62283102A (ja) | 1987-12-09 |
| IE60409B1 (en) | 1994-07-13 |
| DK196886D0 (da) | 1986-04-30 |
| AU7225387A (en) | 1987-11-05 |
| CA1334080C (en) | 1995-01-24 |
| DE3783644T2 (de) | 1993-05-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI89943C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av heparin med laog molekylvikt | |
| US5106734A (en) | Process of using light absorption to control enzymatic depolymerization of heparin to produce low molecular weight heparin | |
| FI90090C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av heparin med laog molekylvikt | |
| US4871357A (en) | Ionic heparin coating | |
| EP0394971A1 (en) | Oligosaccharide-containing inhibitors of endothelial cell growth and angiogenesis | |
| US6492503B1 (en) | Glycosaminoglycan and drug compositions containing the same | |
| DE69333834T2 (de) | Reinigung, zusammensetzung und spezifität von heparinase i, ii und iii aus flavobacterium heparinum | |
| EP0544592B1 (fr) | Héparosanes-N,O-sulfates de haute masse moléculaire, leur procédé de préparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent | |
| EP3510147B1 (en) | Biosynthetic heparin | |
| FR2669932A1 (fr) | Nouvel heparosane-n,o-sulfate, son procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui le contiennent. | |
| US6248726B1 (en) | Method of peritoneal dialysis using glucose polymer solutions | |
| WO2012116048A1 (en) | Single step heparosan n-deacetylation and depolymerization for making bioengineered heparin | |
| US5721357A (en) | Preparation of sulfated polysaccharides for treatment or prevention of thromboses | |
| Linhardt et al. | Low molecular weight dermatan sulfate as an antithrombotic agent structure-activity relationship studies | |
| EP0231573B1 (en) | Improved ionic heparin coating | |
| Tiozzo et al. | Effect of heparin derived fractions on the proliferation and protein synthesis of cells in culture | |
| US4438261A (en) | Anticoagulant substance | |
| LINDAHL et al. | The antithrombin-binding sequence of heparin | |
| Romeo et al. | Liquid-chromatographic analysis of the depolymerization of (1→ 4)-β-D-mannuronan by an extracellular alginate lyase from a marine bacterium | |
| DK162108B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af lmw-heparin | |
| US4507205A (en) | Process for the purification of glucosaminoglucans | |
| CN112175109B (zh) | 一种超低分子量肝素钠及其制备方法 | |
| Gasciolli et al. | Viscous properties and molecular characterization of enzymatically size-controlled oligodextrans in aqueous solutions | |
| EP1634893A1 (en) | Process for the sulfation of chondroitin | |
| JPH0532703A (ja) | 低分子量ヘパリン誘導体の製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application | ||
| FG | Patent granted |
Owner name: NOVO NORDISK A/S |
|
| MA | Patent expired |