NO167577B - Fremgangsmaate for fremstilling av lmv-heparin ved enzymatisk depolymerisering. - Google Patents
Fremgangsmaate for fremstilling av lmv-heparin ved enzymatisk depolymerisering. Download PDFInfo
- Publication number
- NO167577B NO167577B NO871784A NO871784A NO167577B NO 167577 B NO167577 B NO 167577B NO 871784 A NO871784 A NO 871784A NO 871784 A NO871784 A NO 871784A NO 167577 B NO167577 B NO 167577B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- heparin
- molecular weight
- filtrate
- depolymerization
- lmv
- Prior art date
Links
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 title claims abstract description 88
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 title claims abstract description 88
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 85
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 46
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 claims abstract description 34
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims abstract description 32
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 22
- 108010022901 Heparin Lyase Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 238000012691 depolymerization reaction Methods 0.000 claims abstract description 16
- 239000003055 low molecular weight heparin Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000012465 retentate Substances 0.000 claims abstract description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 57
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 12
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 9
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 5
- 238000004064 recycling Methods 0.000 claims description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 2
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 claims description 2
- 229940127215 low-molecular weight heparin Drugs 0.000 abstract description 8
- 238000012937 correction Methods 0.000 abstract description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 17
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 16
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 230000009471 action Effects 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 4
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 4
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 239000002634 heparin fragment Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 3
- 239000004019 antithrombin Substances 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229940064551 bovine heparin Drugs 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 2
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 2
- 230000002367 endolytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000013365 molecular weight analysis method Methods 0.000 description 2
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000589565 Flavobacterium Species 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000605114 Pedobacter heparinus Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 102100023038 WD and tetratricopeptide repeats protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 238000000333 X-ray scattering Methods 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 1
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000009530 blood pressure measurement Methods 0.000 description 1
- 229920001525 carrageenan Polymers 0.000 description 1
- 235000010418 carrageenan Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 230000007797 corrosion Effects 0.000 description 1
- 238000005260 corrosion Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 239000002565 heparin fraction Substances 0.000 description 1
- -1 heparin oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012872 hydroxylapatite chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000001738 isopycnic centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001374 small-angle light scattering Methods 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof
- C08B37/0078—Degradation products
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for produksjon av lav-molekylvekt-heparin (LMV-heparin) ved enzymatisk depolymerisering av heparin.
Konvensjonell heparin er en heterogen blanding av mucopoly-sakkarider som dekker et molekylvektområde fra 5000-50000 dalton med et antall midlere molekylvekt på omtrent 10 - 14000 dalton.
Heparin virker direkte eller indirekte på funksjonen av en rekke proteiner, spesielt enzymene til koaguleringsprosessen.
Virkningene av heparin er influert av en rekke faktorer, slik som fordelingen av funksjonelle grupper i molekylet og molekylvekten. Således er det med sikkerhet bevist at den sistnevn-te spiller en viktig rolle for aktiviteten av heparin, spesielt inaktivering av trombin og faktor Xa formidlet ved antitrombin
III.
Antitrombin-aktivitet krever en minimum-heparinmolekylvekt som tilsvarer omtrent 18 monosakkarider, dvs. omtrent 5400 dalton, mens antifaktor Xa-aktivitet kan uttrykkes ved heparinmolekyler så små som 5-6 sakkarid-enheter 1500-1800 dalton.
En rekke andre virkninger av heparin, for eksempel antitrombotisk virkning (heparin-oligosakkarider som inneholder 18 monosakkarider eller mindre, synes å ha dårlig antitrombotisk virkning) virker på ADP-indusert trombocyt-aggregering, biologisk tilgjengelighet etter s.k.-administrering, inhibering av PF^ og HRG, såvel som virkningen mot koaguleringsenzymer i den intrins-iske cyklus som er ansvarlig for dannelse av faktor Xa, er sterkt influert av molekylvekten til heparin.
I senere år er interessen sentrert om heparin-fragmenter - eller fraksjoner med høy Xal/antitrombin-aktivitet med molekylvekt fra 4000 og opp til 6000 dalton, siden slike stoffer er blitt rapportert å ha god antitrombotisk virkning og på samme tid ingen eller liten tendens til å forårsake blødningskomplikasjoner. De viser også forbedret biologisk tilgjengelighet, spesielt etter subkutan administrering.
Siden selektiviteten av heparinvirkning er korrelert med molekylvekten, er det sannsynlig at det eksisterer et relativt snevert molekylvektområde, hvor heparinaktivitet er optimal.
En fremgangsmåte for fremstilling av LMV-heparin med en spe-sifikk, ønsket molekylvekt og en snever molekylvektfordeling, dvs. lav polydispersitet, ville derfor være fordelaktig.
Fremgangsmåten i henhold til denne oppfinnelse muliggjør oppnåelse av et hvilket som helst ønsket molekylvektområde for depolymeriseringsprodukt fra heparin. LMV-heparin kan fremstilles med lavt utbytte fra konvensjonell heparin ved fraksjoner (BRD. -of f*-skrif t 2 944 792 og 2 945 595). Det meste LMV-heparin blir imidlertid fremstilt ved depolymerisering av heparin enten ved kjemiske eller enzymatiske fremgangsmåter, fulgt av fraksjonering, om nødvendig (kfr. A. Rorner, Heparin, Kakkar, eds. Thomas,1976 og Perlin et al. Carbohydrate Res. 18, 185 (19 71)).
Kjemisk depolymerisering av heparin er beskrevet i EP-publiserte patentsøknader nr. 0037 319, 0076 279 og 0014 184, US-patent nr. 4 351 9 38 og GB-patent nr. 2 002 406.
Enzymatisk depolymerisering er beskrevet i US-patent nr.
3 766 16 7, GB-patent nr. 2 002 406, EP-publisert patentsøknad nr. 0014 184 og US-patent nr. 4 396 762.
Et hovedproblem som følger med alle de kjente depolymeriseringsprosessene som gjennomføres porsjonsvis, er å stoppe depolymeriseringsreaksjonen ved den riktige gjennomsnitts-molekylvekt. Videre resulterer depolymeriseringsreaksjonen i heparinfragmenter med mindre eller større størrelse enn den ønskede molekylvekt, selv i fravær av sidereaksjoner.
I de kjente depolymeriseringsprosessene for depolymerisering av heparin som bruker uorganiske depolymeriseringsreagenser (salpetersyrling, hydrogenperoksyd, etc.) eksisterer det ikke noe fortrinn når det gjelder størrelse av molekyl som blir angrepet eller når det gjelder stilling inne i molekylet av bindingen som ' skal brytes. I henhold til R.J.Linhardt et al., Biochem.Biophys. Acta 702 (1982) 197-203 gjør selv ikke enzymet heparinase noen slik distinksjon, idet virkningsmåten av heparinase er tilfeldig endolytisk.
Dette betyr at polydispersiteten av en hvilken som helst heparin-depolymeriseringsblanding utvikler seg på en statistisk forutsigbar måte som en funksjon av graden av depolymerisering. Spesielt på det tidspunktet når gjennomsnitts-molekylvekten er like over den ønskede: verdi, har en stor del av fragmentene den ønskede molekylvekt, men på grunn av den tilfeldige endolytiske natur av depolymeriseringen har de også en forholdsvis stor sjangse for å bli videre depolymerisert til å gi fragmenter av suboptimal størrelse.
Hvis en mer snever molekylvektfordeling er ønsket i LMV-heparinproduktet, må depolymeriseringsblandingen fraksjoneres, dvs. fragmenter med høyere eller mindre molekylvekt enn ønsket, blir separert og tømt ut. Dette betyr tap av utbytte og spill av det dyre startmaterialet heparin.
Det er et mål med oppfinnelsen å gi en frem-
gangsmåte hvorved en snever molekylvektfordeling i LMV-heparin-depolymeriseringsblandingen blir oppnådd uten tap av utbytte og spill av startmateriale.
Et LMV-heparinprodukt med en snever molekylvektfordeling
kan fåes fra en kontinuerlig prosess ved å fjerne fragmenter med den ønskede molekylvekt så snart de blir dannet, for å forhindre deres videre depolymerisering. Dette kan gjøres ved kontinuerlig fraksjonering av depolymeriserings-reaksjonsblandingen idet depolymeriseringsprosessen går frem ved filtrering ved å anvende et selektivt filtermedium som tillater molekyler med den ønskede molekylvekt å gå gjennom, mens den resirkulerer høyere molekyl-vektmateriale (inkludert enzym) for å bli videre depolymerisert.
Det er imidlertid blitt funnet, gjennom en rekke eksperimenter, at molekylvekten av heparinfragmenter som er i stand til å passere en ultrafiltreringsmembran, avhenger sterkt av heparin-konsentrasjonen i retentatet. Høyere heparinkonsentrasjon i retentatet gav høyere molekylvekt av fragmentene i filtratet.
Også andre parametere slik som gjennomsnitts-molekylvekt
og polydispersitet av retentatet, pH, ionestyrke og innhold av organiske modifiseringsmidler i reaksjonsblandingen, såvel som området av filteret, sammenlignet med produkt, har innflytelse på molekylvekt-fordelingen av filtratet.
Dette betyr at det ikke er mulig å stole på egenskapene av filtermedium alene, for å sikre et konstant, ønsket molekylvekt-LMV-heparinprodukt i filtratet. Et stort antall parametere må holdes ved konstante nivåer i retentatet (dvs. i depolymeriser-ingsreaksjonsblandingen) for å få et produktfiltrat med konstante, ønskete molekylvektegenskaper, dvs. gjennomsnittsmolekylvekt og polydispersitet.
På grunn av fjerning av produkt ved filtrering i løpet av den kontinuerlige depolymeriseringsreaksjon ville det være et komplekst problem å beregne, opprette og opprettholde de nød-vendige konstante betingelser eller stabil tilstand i depolymer-iseringsreaksjonsblandingen.
I henhold til den foreliggende oppfinnelse er dette problem blitt løst ved å måle avvikene av Mn og polydispersitet D i filtratet fra de ønskede verdier kontinuerlig eller ofte, hvorpå lett kontrollerbare reaksjonsparametere i depolymeriseringsblandingeh, spesielt substratkonsentrasjon; substrattilførselshastighet; enzymaktivitet, reaksjonstemperatur; trykkfall over membranfilteret; og resirkuleringsstrøm i retentatet, blir forandret kontinuerlig eller ofte for å redusere og holde avvikene fra de ønskede verdier innen spesifiserte grenser.
Ved å anvende hurtigrespons A225~<m>ålingsanalyse i sine eksperimenter beviste oppfinnerne her at en stabil tilstands-depolymerisering av heparin kan oppnås, og opprettholdes over tid.
De lærte hvilke opererende parametere som lett kan kontrolleres.
Det er blitt funnet mulig å oppnå en konstant, snever molekylvektfordeling i filtratet fra en kontinuerlig depolymerisering av heparin. med heparinase.
I et bredt aspek.t gir den foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for produksjon av lavmolekylvektheparin (LMV-heparin) ved enzymatisk depolymerisering av heparin, som omfatter følgende trinn: kontinuerlig tilførsel av en vandig løsning av heparin til en heparinase-holdig; reaktor og i denne underkastelse av heparin for enzymatisk depolymerisering;
fjerning av depolymerisert heparinløsning fra reaktoren,
så underkastelse av løsningen av depolymerisering heparin for ultrafiltrering, for derved å produsere et retentat og et filtrat;
resirkulering av minst en del av retentatet til reaktoren, og
utvinning av et LMV-heparinprodukt fra filtratet; hvor gjennomsnittsmolekylvekten og polydispersiteten av filtratet blir bestemt kontinuerlig eller ofte, hvorpå mulige avvik fra de ønskede verdier blir motvirket ved å korrigere prosessparameterne'
i den enzymatiske depolymeriserings-reaksjon. Det henvises til krav l.
Kort beskrivelse av tegningene.
Den foreliggende oppfinnelse er videre illustrert ved re-feranse til de vedlagte tegninger, hvor: Figur 1 illustrerer strømbanen for en foretrukket metode for den kontinuerlige heparin-depolymeriseringsprosess. Figur 2 illustrerer HPLC-målinger av forskjellige fraksjoner som testes i løpet av den kontinuerlige depolymerisering i eksempel 1, og
figur 3 illustrerer molekylvekten av forskjellige fraksjoner i løpet av den kontinuerlige depolymerisering i eksempel 2.
Gjennomsnittsmolekylvekten av heparin eller en LMV-heparin kan gis som antallsmidlere molekylvekt (Mn), dvs. vekt/antall mol eller som vekt gjennomsnittlig molekylvekt (Mv) eller topp-molekylvekt (Mt. opp ). M v eller Mt. opp anvendes normalt for å ka-rakterisere heparin eller LMV-heparinprodukter.
Molekylvekten av produktet kan bestemmes ved en rekke forskjellige fremgangsmåter, for eksempel gel-permeasjonskromato-grafering (GPC/HPLC) (N. Sugisaka, F.J. Petracek: Rapid molecular size characterization of heparins by high pressure liquid chromatography, Fed.Proe.36(1),89-92,1977), lavvinkel-laserlys-ledning (LALLS) (D.Lecacheux, R.Panams, G.Brigand, G.Martin: Molecular weight distribution of carrageenans by size exclusion chromatography and low angle laser light scattering. Carbohyd-rate Polymers 5, 423-440, 1985, lavvinkel-røntgenstrålespredning (S.S.Stivala, M.Herbst, O.Kratky, I.Pilz: Physico-chemical studies of fractionated bovine heparin V, Arch.Biochem.Biophys 127, 795-802, 1968), viskositetsmålinger og likevektssentrifuger-ing (S.E.Lasker, S.S. Stivala: Physicochemical studies of fractionated bovine heparin I. Arch.Biochem.Biophys. 115, 360-372, 1966), og osmotiske trykkmålinger og dialyselikevekt (K.E. van Holde: Physical Biochemistry, section 2.3, s.39-4 7. Prentice-Hall, Inc., New Jersey, 1971). Imidlertid vil en mer foretrukket fremgangsmåte være en som har en minimal hviletid, slik som en spektrofotometrisk bestemmelse av funksjonelle grupper, dannet i depolymeriseringsprosessen.
Den enzymatiske depolymeriseringsprosess, som anvender heparinase, støtter seg til en spektrofotometrisk antallsmidlere molekylvekt-(Mn)-bestemmelse, siden den enzymatiske fremgangsmåte er eliminerende, idet den danner en reduserende endegruppe og
en endegruppe som består av et (A 4,5-umettet-iduronsyrederi-vat, som har en distinkt UV-absorpsjon ved 230-235 nm. Den molare absorpsjonskoeffisient for en rekke LMV-heparinfragmenter av di-,tetra-,heksa- og oligosakkarider, ble publisert av Linker og Hovingh (Biochem.11 (1972), 563-568). Gjennomsnittsverdien av de publiserte molare absorpsjonskoeffisienter er 5500.
som gir forholdet mellom tall-gjennomsnittsmolekylvekten (Mn)
og økningen i absorpsjon ved 235 nm, kan lett utledes.
I formel (1) er Mn antallsmidlere molekylvekt av det depolymeriserte produkt, Mn antallsmidlere molekylvekt av heparinsubstratet, c er substratkonsentrasjonen (g/l), h& 235 er Øknin<?en i absorpsjon ved 235 nm og e er den molare absorpsjonskoeffisient.
Beregning av M er mulig når M n av heparinsubstratet (M ),
' ^ n ^ n c n,u
substratkonsentrasjon (c, g/l) og absorpsjonskoeffisienten (e)
av de umettede depolymeriseringsprodukter, er kjente og ^ 235 blir målt.
I en rekke eksperimenter ble heparin depolymerisert med heparinase som var delvis renset ved å anvende hydroksylapatitt-kromatografering i henhold til Linker og Hovingh (Methods in Enzymology 28 (1972), 902-911).
Antallsmidlere molekylvekt Mn ble beregnet ved å bruke ligning (1) og anvende den publiserte verdi av (e = 5500, og sammenlignet me. d M nbestemt ved GPC-HPLC.
Det ble imidlertid ved sammenholding funnet at den beregne-de verdi av M (M (AA)) var forskjellig fra verdien av M som
n n j-s n
ble funnet ved å bruke HPLC (Mn(HPLC)), med opp til 20 %.
Omflytting av (1) til
muliggjør beregning av en absorpsjonsøkning AA235 som tilsvarer en ønsket antallsmidlere molekylvekt Mn- Men igjen viste eksperimentet at hvis depolymeriseringen ble stoppet ved den bereg-nede verdi av AA^^ var den aktuelle Mn bestemt ved HPLC, betraktelig høyere enn den ønskede Mn, hvis verdien av e = 5500 funnet av Hovingh og Linker, ble anvendt.
Det ble konkludert at det dårlige samsvar mellom Mn( AA) og Mn(HPLC) var forårsaket av anvendelsen av verdien av e = 5500.
Omflytting av ligningen (1) til
viser at e kan beregnes ved å bruke kjente verdier for c og M og samtidig bestemte verdier for AA--- og M (HPLC).
n , u <s o 3 n
På denne måte ble en verdi av e = 7600 funnet, som gav nær korrelasjon mellom beregnet Mn(£A) og observert Mn (HPLC) i en rekke eksperimenter.
Selv om ligning (1) ovenfor anvendes til en depolymeriseringsprosess som gjennomføres porsjonsvis, er det nå blitt funnet at Mn av produktfiltratet fra den kontinuerlige depolymeriseringsreaksjon kan beregnes ved å anvende ligning (1) og en verdi av e = 7600, forutsatt at systemet er i eller nær betingelse med stabil tilstand. Avvik fra stabil tilstand reduserer nøy-aktigheten av beregningen av Mn, men gir fortsatt informasjon om retningen av de nødvendige forandringer. I ligning (1) er
M „ kjent, AA__C måles ved å bruke for eksempel et på-linje-tt, U ^JD
spektrofotometer, og c kan finnes ved å måle brytnings-
indeksen RI av filtratet ved å anvende en på-linje-kalibrert RI-detektor, eller ved å måle UV-absorpsjon ved to forskjellige bøl-gelengder, for eksempel 197 og 235 nm.
I henhold til en foretrukket utgave av den foreliggende oppfinnelse blir lysabsorpsjonen av filtratet målt, og forandring i denne anvendt til å kontrollere depolymeriseringsreaksjonen.
Idet RI og A235"Meiling på filtratet gir nesten øyeblikkelig informasjon om status av prosessen, kan de nødvendige korrosjon-er i prosessparametrene gjøres øyeblikkelig der hvor avvik fra de ønskede verdier av molekylvekt eller polydispersitet blir observert.
Det er innlysende for fagmannen på området at økningen i UV-absorpsjon forårsaket ved dannelse av umettede nedbrytnings-produkter ved virkning av heparinase på heparin kan måles ved andre bølgelengder enn 235 nm. Absorpsjonskoeffisienten blir imidlertid fortrinnsvis målt ved 235 nm , fordi den har sitt mak-simum ved denne bølgelengde.
Depolymeriserings-reaksjonen kan kontrolleres ved regulering av substrattilførselshastighet, forholdet mellom substrattil-førselskonsentrasjon og substratstrømhastighet og enzymaktivitet. Forandringer i substrattilførselshastighet kan oppnås ved å forandre substratstrømhastighet eller substrattilførselskon-sentrasjon eller begge. Forandringer i forholdet mellom substrat-tilf ørselskonsentrasjon og substratstrømhastighet kan oppnås ved å forandre substrattilførselskonsentrasjon eller substratstrøm-hastighet eller begge. Ved "substratstrømhastighet" som anvendt her er det ment volum av substrat pr. tidsenhet (for eksempel liter/time). Ved "substrattilførselskonsentrasjon" er det ment heparinkonsentrasjon i substrat tilført inn i systemet (for eksempel mg/ml).. Ved "substrattilførselshastighet" er det ment vekt av heparin tilført til systemet pr. tidsenhet (for eksempel g/time). "Substratstrømhastighet" x "substrattilførselskonsent-rasjon" = "substrattilførselshastighet".
Enzymaktivitet kan økes ved å tilsette enzym eller ved å
øke reaksjonstemperaturen og kan minkes ved å senke reaksjonstemperaturen eller ved å fjerne enzym fra reaktoren (for eksempel hvis det blir immobilisert). Videre parametere som kan brukes for å kontrollere depolymeriseringsreaksjonen, er trykkfallet over membranfilteret eller retentat-resirkuleringsstrømmen.
I henhold til den foreliggende oppfinnelse kan korreksjonene av prosessparametrene utføres som følger: (a) Hvis Mn av filtratet er høyere enn ønsket, kan substrat-tilf ørselshastigheten senkes ved å senke substratstrøm-hastighet eller substrattilførselskonsentrasjon eller begge eller ved å øke enzymaktiviteten. Hvis Mn er lavere enn
ønsket, gjelder det motsatte.
(b) Hvis polydispersiteten av filtratet er høyere enn ønsket,
kan forholdet mellom substrattilførselskonsentrasjon og substratstrømhastighet senkes ved å senke substrattil-førselskonsentrasjonen eller øke substratstrømhastighet eller begge. Hvis polydispersiteten er lavere enn ønsket,
gjelder det motsatte.
(c) Hvis både Mn og polydispersitet avviker fra de ønskede verdier kan kombinasjoner av de ovenfor nevnte korrek-sjoner gjøres.
Korreksjonene kan på en bekvem måte utføres som frem-satt i de følgende eksempler, hvor eksempel 1 illustrerer regulering av Mn alene og eksempel 2 illustrerer regulering av Mn og polydispersitet i den rekkefølgen.
Heparinasen som blir anvendt i henhold til den foreliggende oppfinnelse fremstilles på en kjent måte, som beskrevet av Hovingh og Linker (Methods in Enzymology 28 (1972), 902-911 og J.Biol.Chem. 245 (1970) 6170-6175) ved å dyrke Flavobacterium heparium på et heparin-inneholdende substrat, celle-innhøsting og celle-struktur ved ultralydbehandling og rensing ved bl.a. kroma-tografering på hydroksyapatitt. LMV-heparinproduktet kan presipiteres ved tilsetning av al-kohol (fortrinnsvis 0,6-10 vol/vol) og det depolymeriserte produkt kan renses ved fremgangsmåter som er velkjente på fagområd-et, for eksempel bleking, steril filtrering og alkoholpresipite-ring.
Heparin-depolymeriseringsreaksjonen blir fortrinnsvis utført ved en temperatur på 25-40°C og ved en pH på 6-8.
Én heparinase-enhet er definert i henhold til Hovingh og Linker, Methods in Enzymol., 28 (1972), 902-911.
For å sikre en rask feed-back-kontroll av depolymeriserings-reaks jonen, avhengig av avviket i gjennomsnittsmolekylvekt og polydispersitet fra de ønskede verdier, kan prosessen utføres som vist i fig. 1. Fig. 1 illustrerer en spesiell utførelses-form av den foreliggende oppfinnelse, spesielt anvendbar til enzymatisk depolymerisering av heparin til LMV-heparin av lav polydispersitet, ved å anvende immobilisert heparinase som hovedkilde for enzym. Imidlertid er metoder for tilførsel av heparinase i væskeform også kjente.
Heparinsubstrat med en forutbestemt ønsket konsentrasjon blir besørget ved å blande en heparinstamløsning (16) med buffer (17) i blander (1) og tilført til en lukket kretsreaksjonssone ved hjelp av en doseringspumpe (2). Reaksjonssonen består av en retentat-sirkuleringspumpe (4), et ultrafilter (5), en enzymreaktor (3) og en shunt-kobling med en ventil (6). Siden reaksjonssonen er lukket med unntak av substrat-tilførselskoblingen og ultrafiltreringsmembranen, vil filtratstrømmen være lik substrat-strømmen. En rask retentatstrøm er ønskelig for å forhindre po-larisering på ultrafiltreringsmembranen. Dette kan imidlertid være skadelig for det immobiliserte enzymlag på grunn av trykkfallet som er dannet over laget. Hovedstrømmen av retentat blir derfor sirkulert gjennom shunt-koblingen og ventilen (6), som åpnes eller lukkes for å regulere trykkfallet over enzymlaget.
Filtreringstrykket over ultrafiltreringsmembranen som
måles ved manometer (14) kan økes som nødvendig ved delvis å lukke ventil (15). Enzymreaksjonstemperaturen kan reguleres ved en vannsirkuleringskappe (rundt reaktor 3 (ikke illustrert)). LMV-heparinfraksjonen som forlater depolymeriseringssonen i ultrafiltratet, blir analysert for å bestemme dens gjennomsnitts-molekylvekt og polydispersitet. En prøvetagingsinnretning (7), skjematisk angitt, tar automatisk prøver før filtratet passerer inn i oppsamleren (11). Prøvene passerer til instrumenter 8,9,10.
I den foretrukne illustrerte utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse blir tre parametere målt: refraktiv indeks
(RI), UV-absorps jon ved 235 nm (^35) °9 polydispersitet (D) .
RI og & 235 klir målt kontinuerlig eller i korte intervaller ved hjelp av henholdsvis en RI-detektor (8) og et spektrofotometer (9). D blir bestemt av og til ved GPC-HPLC-bestemmelse av Mn
og Mv ved kromatograferingsinstrument(er) (10). Data oppnådd fra prøvene blir tilført til en dataprosesseringsenhet (12) som beregner LMV-heparin-konsentrasjon c (g/liter) fra RI, antallsmidlere molekylvekt Mn(dalton) fra c og økningen i absorpsjon ved 235 nm (AA235^ ' enzYmaktivitet <NE) fra NE = ÅA235 X str<Sm~ hastighet, og polydispersitet D fra HPLC-data. Den prosesserende enhet regulerer prosessen basert på de beregnete parametere Mn,
D, c og NE ved å regulere substratkonsentrasjonen via blander
(1), strømhastighet (SPV) via pumpe (2), enzymaktivitet fra stamløsning (18) via en enzymtilsetningsventil (13) og/eller en reaksjonstemperatur-reguleringsinnretning (ikke vist), trykkfall over membranfilteret gjennom ventil (15) og retentat-sirkulasjons-strømmen gjennom sirkulasjonspumpe (4). Kontrollkretsene og det automatisk opererte utstyr, skjematisk vist i strømtavlen i
fig. 1, er konvensjonelle systemer og innretninger, og behøver derfor ikke beskrives her.
En kontinuerlig depolymeriseringsmåte for heparin i et labo-ratorie-skalasystem i. henhold til fig. 1 er heretter eksemplifi-sert.
Eksempel 1
Flavobacterium heparinum ble dyrket på et heparinholdig substrat, og heparinase fremstilt fra et homogenisert celle-konsentrat ved filtrering gjennom 100 kD og konsentrasjon på 30 kD ultrafiltere. Enzymet ble immobilisert på CNBr-aktivert Sepharose 4B i nærvær av heparin.
750 enheter av immobilisert heparinase, med en beregnet kapasitet for depolymerisering ca. 5-600 mg/h av heparin på MnfU ca. 11500, til LMV-heparin på Mn ca. 4 000 dalton ved romtemperatur, ble plassert i enzymreaktor (3). Systemet ble fylt med heparin-substratløsning (10 mg/ml, i 0,1 M natriumacetat, 0,005 M Ca-ace-tat pH 7,0), frigjort av oppfanget luft, og heparinsubstrat ble tilsatt til systemet ved en starthastighet på 60 ml/h ved romtemperatur.
Etter noen få minutter tilsvarte filtratstrømhastigheten nøyaktig substratstrømhastigheten. Fraksjoner på 10 ml ble opp-samlet i løpet av eksperimentet. Brytningsindeks, RI, ble målt kontinuerlig, og absorpsjon ved 235 nm, ^ 235' ble m^lt: ofte'
minst én gang pr. fraksjon, etter fortynning av prøvene med 1,7 M perklorsyre.
Antallsmidlere molekylvekt av produktet, Mn, ble beregnet
fra RI og A^cj-verdiene, og plottet mot f raks jonstall, som vist
i fig. 2.
HPLC-molekylvektanalyse ble utført på noen få fraksjoner. Resultatene bekrefter de beregnete Mn~verdier som det fremkommer fra fig. 2, og gir i tillegg figurer over midlere molekylvekt,
Mvf og polydispersitet, D (fra D = M /Mn). Idet den beregnete
M n svarer gr odt til M n-verdien som er målt ved HPLC, beviser det foreliggende eksempel at ligning (1) kan anvendes til beregning av Mn av LMV-heparinproduktet fra en kontinuerlig depolymeriseringsreaksjon.
RI, A235~prosedyren, gir nesten øyeblikkelig informasjon om status av prosessen og muliggjør at korrigerende målinger kan tas.
Det foreliggende eksempel illustrerer videre oppnåelsen av
en ønsket Mn av produktet ved å justere substratstrømhastigheten ved fiksert substrattilførsels-konsentrasjon.
Eksperimentet ble utført i tre faser.
1) Strømhastighet 60 ml/time: I denne fase økte Mn av produktet jevnt og nådde den ønskete verdi på 4000 dalton etter ca. 22 fraksjoner. 2) Strømhastighet 30 ml/time: Etter noen få tilleggsfrak-sjoner ble strømhastigheten redusert til 30 ml/time fra fraksjon nr. 27.
Som det sees fra fig. 2, er responsen en jevn minking av Mn. 3) Strømhastighet 60 ml/time: Når Mn av produktet hadde nådd en verdi på 3300 dalton i fraksjon nr. 4 3 og fortsatt minket, ble startstrømhastigheten på 60 ml/time gjenopptatt. Fallet i Mn stoppet og ble fulgt igjen av en jevn økning som jevnet seg ut ved fraksjon nr. 60. Fra dette punkt og gjennom resten av eksperimentet indikerte de små variasjoner i de observerte parametere at en stabil tilstand var oppnådd.
For sammenligning ble immobilisert heparinase anvendt for å depolymerisere heparin i reaksjoner som gjennomføres porsjonsvis. I ett eksperiment ble heparin depolymerisert til en antallsmidlere molekylvekt, Mn ca. 4000 dalton, sammenlignbar med Mn i "stabil tilstand"-produktfiltratet fra den kontinuerlige prosess.
I et annet eksperiment ble heparin depolymerisert til en vektmidlere molekylvekt, Mv, sammenlignbar med Mv i produktet fra den "stabile tilstand" fra den kontinuerlige prosess.
Mn og M -fordelinger ble analysert ved HPLC. Resultater
fra de to typer reaksjoner er gitt i tabellen nedenfor.
Det viser seg fra tabellen ovenfor at polydispersiteten
av LMV-heparinproduktet fra den kontinuerlige prosessen er merk-bart redusert sammenlignet med en masse-depolymeriseringsprosess. Det viser seg videre at de beregnete Mn~verdier er i godt samsvar med de målte M n-verdier for den kontinuerlige reaksjon.
Eksempel 2
Heparin ble depolymerisert til LMV-heparin ved immobilisert heparinase, ved å anvende apparatene og metodene for påvis-ning og beregning i eksempel 1.
Regulering av prosessen ble utført i to faser.
I fase 1, som i eksempel 1, ble regulering av substrat-strømhastighet som respons på avvik av Mn i produktfiltratet fra den ønskede verdi på omtrent 4000 dalton anvendt til å oppnå en stabil tilstand hvor substratstrømhastigheten tilsvarte den ønskede M n-verdi i filtratet,
Som det sees i tabell II og som illustrert i fig. 3, ble start-substratstrømhastigheten på 60 ml pr. time av 10 mg pr.
ml heparinsubstrat redusert trinnvis til 12 ml/time, hvilket tilsvarer en substrat-tilførselshastighet på 120 mg/time for å oppnå en stabil tilstand (I) som fra fraksjon nr. 78.
Den antallsmidlere molekylvekt og polydispersiteten av LMV-hepar inproduktet fra den stabile tilstand funnet ved GPC-HPLC-analyse, var Mn = 4150 og D = 1,71, hvilket tilsvarer en vektmidlere molekylvekt Mv = 7100.
I den andre fase fra fraksjon nr. 114 ble forholdet mellom substrat-tilførselskonsentrasjon og substrat-tilførselshastighet forandret 25 ganger ved en fem gangers reduksjon av substrat-tilf ørselskonsentras jon til 2 mg heparin pr. ml og en fem gangers økning i substrat-strømhastighet til 60 ml/time, for derved å opprettholde substrat-tilførselshastigheten på 120 mg heparin pr. time.
Forandringene resulterte i en ny stabil tilstand (II)
fra fraksjon nr. 140 som sett fra tabell II og fig. 3.
Antallsmidlere molekylvekt Mn forble praktisk talt uforand-ret, men polydispersiteten av produktet ble betraktelig minket til den lave verdi på D = 1,55, hvilket tilsvarer Mv = 6450 som sees i tabell II og fig. 3.
Det kan i dataene fra eksemplene 1 og 2 grafisk illustrert
i henholdsvis fig. 2 og 3, sees at den kontinuerlige depolymerisering i henhold til den foreliggende oppfinnelse virket i ut-strakte perioder uten forstyrrelser, hvilket demonstrerer at det kontinuerlige depolymeriseringsreaksjonssystem er relativt stabilt. Følgelig betrakter praktisering av denne oppfinnelse ut-førelse av kontinuerlig depolymerisering av heparin uten kontroll av denne gjennom A„_,. eller lignende målinger, for eksempel kontroll gjennom HPLC molekylvektanalyse-måling. Imidlertid, som det allerede er blitt pekt på, utgjør kontroll gjennom A235~ måling den foretrukne praksis.
Det kan også sees i dataene fra eksempel 2 at nokså lave
polydispersibilitetsnivåer kan oppnås i LMV-heparinproduktet pro-dusert i henhold til oppfinnelsen, idet man oppnår (se fraksjoner 140 til 170) en polydispersibilitet i området 1-1,6 som er fore-, trukket i praktisering av denne oppfinnelse.
Claims (9)
1. Fremgangsmåte for produksjon av LMV-heparin ved enzymatisk depolymerisering av heparin ved: kontinuerlig tilførsel av en vandig løsning av heparin til
en heparinase-holdig reaktor og i denne underkasting av heparin for enzymatisk depolymerisering; fjerning av depolymerisert heparinløsning fra reaktoren,
så underkasting av løsningen av depolymerisert heparin for ultrafiltrering for derved å produsere et retentat og et filtrat; resirkulering av minst en del av retentatet til reaktoren,
og - oppsamling av et LMV-heparinprodukt fra filtratet;karakterisert ved at lysabsorpsjonen av filtratet måles kontinuerlig eller ofte, og antallsmiddelmolekylvekten (Mn) og polydispersiteten (D) av filtratet bestemmes kontinuerlig eller ofte, fortrinnsvis i en innledende fase inntil depolymeriseringsreaksjonen har stabilisert seg på et stabilt nivå, og at eventuelle avvik fra de ønskede verdier korrigeres ved å justere prosess-parametere i den enzymatiske depolymeriseringsreaksj on.
2. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, karakterisert ved at det foretas kontinuerlige eller hyppige RI- og A235-målinger på filtratet, idet måle-resultatene anvendes til å beregne antallsmidlere molekylvekt Mn av LMV-produktet i filtratet.
3. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, karakterisert ved at substrat-tilførsels-hastigheten reduseres hvis antallsmiddelmolekylvekten Mn av depolymerisert heparin i filtratet er høyere enn ønsket.
4. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, karakterisert ved at substrat-tilførsels-hastigheten økes hvis antallsmiddelmolekylvekten av depolymerisert heparin i filtratet er lavere enn ønsket.
5. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, karakterisert ved at forholdet mellom heparinsubstrat-tilførselskonsentrasjonen og substrat-strømhastigheten reduseres når polydispersiteten av det depolymeriserte heparin i filtratet er høyere enn ønsket.
6. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, karakterisert ved at forholdet mellom heparin-tilførselskonsentrasjonen og substrat-strømhastigheten økes når polydispersiteten av det depolymeriserte heparinfiltrat er lavere enn ønsket.
7. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, karakterisert ved at enzym-aktiviteten av heparinase varieres, idet den reduseres hvis molekylvekten av LMV-heparin-depolymeriseringsproduktet blir for lav og enzym-aktiviteten økes hvis molekylvekten av LMV-heparin-depolymerisa-sjonsproduktet blir for høy.
8. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, karakterisert ved at heparinase anvendes i immobilisert form.
9. Fremgangsmåte i henhold-til krav 1, karakterisert ved at det fremstilles et depolymerisasjonsprodukt med polydispersitet fra 1 til 1,6.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK196886A DK196886D0 (da) | 1986-04-30 | 1986-04-30 | Fremstilling af polysaccharider |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO871784D0 NO871784D0 (no) | 1987-04-29 |
| NO871784L NO871784L (no) | 1987-11-02 |
| NO167577B true NO167577B (no) | 1991-08-12 |
| NO167577C NO167577C (no) | 1991-11-20 |
Family
ID=8109192
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO871784A NO167577C (no) | 1986-04-30 | 1987-04-29 | Fremgangsmaate for fremstilling av lmv-heparin ved enzymatisk depolymerisering. |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0244235B1 (no) |
| JP (1) | JPS62283102A (no) |
| AT (1) | ATE84801T1 (no) |
| AU (1) | AU585709B2 (no) |
| CA (1) | CA1334080C (no) |
| DE (1) | DE3783644T2 (no) |
| DK (1) | DK196886D0 (no) |
| ES (1) | ES2052559T3 (no) |
| FI (1) | FI89943C (no) |
| GR (1) | GR3006929T3 (no) |
| IE (1) | IE60409B1 (no) |
| NO (1) | NO167577C (no) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK196986D0 (da) * | 1986-04-30 | 1986-04-30 | Novo Industri As | Fremstilling af polysaccharider |
| FR2663639B1 (fr) * | 1990-06-26 | 1994-03-18 | Rhone Poulenc Sante | Melanges de polysaccharides de bas poids moleculaires procede de preparation et utilisation. |
| USRE38743E1 (en) | 1990-06-26 | 2005-06-14 | Aventis Pharma S.A. | Mixtures of particular LMW heparinic polysaccharides for the prophylaxis/treatment of acute thrombotic events |
| FR2675806B1 (fr) * | 1991-04-23 | 1994-06-10 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Polysaccharides sulfates, procede de preparation, composition pharmaceutique et utilisation. |
| US5707973A (en) * | 1991-04-23 | 1998-01-13 | Rhone-Poulenc Rorer S.A. | Sulfated polysaccharids for treatment or prevention of thromboses |
| US5744457A (en) * | 1995-03-31 | 1998-04-28 | Hamilton Civic Hospitals Research Development Inc. | Compositions and methods for inhibiting thrombogenesis |
| US5763427A (en) * | 1995-03-31 | 1998-06-09 | Hamilton Civic Hospitals Research Development Inc. | Compositions and methods for inhibiting thrombogenesis |
| US6001820A (en) * | 1995-03-31 | 1999-12-14 | Hamilton Civic Hospitals Research Development Inc. | Compositions and methods for inhibiting thrombogenesis |
| US5767269A (en) * | 1996-10-01 | 1998-06-16 | Hamilton Civic Hospitals Research Development Inc. | Processes for the preparation of low-affinity, low molecular weight heparins useful as antithrombotics |
| AP1390A (en) * | 1996-11-27 | 2005-04-15 | Aventis Pharmaceuticals Products Inc | Pharmaceutical composition comprising a compound having anti-Xa activity and a platelet aggregation antagonist compound. |
| CA2293595A1 (en) * | 1997-06-06 | 1998-12-10 | Hamilton Civic Hospitals Research Development, Inc. | Modified low molecular weight heparin that inhibits clot associated coagulation factors |
| JP2003504428A (ja) * | 1999-06-30 | 2003-02-04 | ハミルトン シビック ホスピタルズ リサーチ ディベロップメント インコーポレイテッド | クロット関連凝固因子を阻害するヘパリン組成物 |
| EP2284535A1 (en) | 2002-03-11 | 2011-02-16 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | Low molecular weight heparins |
| EP1582531A1 (en) | 2004-03-24 | 2005-10-05 | Aventis Pharma S.A. | Process for oxidizing unfractionated heparins and detecting presence or absence of glycoserine in heparin and heparin products |
| EP1792621B1 (en) | 2005-11-30 | 2012-04-04 | Istituto di Ricerche Chimiche e Biochimiche "G. Ronzoni" | Orally administrable heparin derivatives |
| US9139876B1 (en) | 2007-05-03 | 2015-09-22 | Momenta Pharmacueticals, Inc. | Method of analyzing a preparation of a low molecular weight heparin |
| CN102791742B (zh) | 2010-01-19 | 2014-12-24 | 动量制药公司 | 评价肝素制剂 |
| WO2012115952A1 (en) | 2011-02-21 | 2012-08-30 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | Evaluating heparin preparations |
| CN102690862B (zh) * | 2012-06-08 | 2015-01-28 | 上海太阳生物技术有限公司 | 抗凝血酶ⅲ(at-ⅲ)测定试剂盒(发色底物法) |
| BR112022000255A8 (pt) | 2019-07-09 | 2022-03-22 | Optimvia Llc | Métodos para sintetizar polissacarídeos anticoagulantes |
| CN111763702A (zh) * | 2020-07-13 | 2020-10-13 | 福州大学 | 一种制备硫酸乙酰肝素寡糖的方法 |
| EP4182452A4 (en) | 2020-07-14 | 2024-07-31 | Optimvia Llc | METHOD FOR THE SYNTHESIS OF NON-ANTICOAGULATING HEPARAN SULFATE |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4351938A (en) * | 1980-05-19 | 1982-09-28 | Riker Laboratories, Inc. | Anticoagulant substance |
| US4396762A (en) * | 1981-08-24 | 1983-08-02 | Massachusetts Institute Of Technology | Heparinase derived anticoagulants |
| DE3244214A1 (de) * | 1982-11-30 | 1984-05-30 | B. Braun Melsungen Ag, 3508 Melsungen | Verfahren zur reinigung und fraktionierung von heparin |
| DK196986D0 (da) * | 1986-04-30 | 1986-04-30 | Novo Industri As | Fremstilling af polysaccharider |
-
1986
- 1986-04-30 DK DK196886A patent/DK196886D0/da not_active Application Discontinuation
-
1987
- 1987-04-29 DE DE8787303835T patent/DE3783644T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1987-04-29 NO NO871784A patent/NO167577C/no not_active IP Right Cessation
- 1987-04-29 FI FI871909A patent/FI89943C/fi not_active IP Right Cessation
- 1987-04-29 EP EP87303835A patent/EP0244235B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-04-29 AT AT87303835T patent/ATE84801T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-04-29 ES ES87303835T patent/ES2052559T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-04-30 AU AU72253/87A patent/AU585709B2/en not_active Ceased
- 1987-04-30 JP JP62104845A patent/JPS62283102A/ja active Granted
- 1987-04-30 CA CA000536095A patent/CA1334080C/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-05-11 IE IE115287A patent/IE60409B1/en not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-01-28 GR GR930400176T patent/GR3006929T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2052559T3 (es) | 1994-07-16 |
| JPS62283102A (ja) | 1987-12-09 |
| NO871784L (no) | 1987-11-02 |
| FI89943C (fi) | 1993-12-10 |
| EP0244235A3 (en) | 1988-09-28 |
| NO871784D0 (no) | 1987-04-29 |
| FI871909A0 (fi) | 1987-04-29 |
| DE3783644D1 (de) | 1993-03-04 |
| DE3783644T2 (de) | 1993-05-13 |
| NO167577C (no) | 1991-11-20 |
| CA1334080C (en) | 1995-01-24 |
| IE871152L (en) | 1987-10-30 |
| DK196886D0 (da) | 1986-04-30 |
| FI871909A (fi) | 1987-10-31 |
| AU585709B2 (en) | 1989-06-22 |
| JPH0542918B2 (no) | 1993-06-30 |
| ATE84801T1 (de) | 1993-02-15 |
| FI89943B (fi) | 1993-08-31 |
| EP0244235B1 (en) | 1993-01-20 |
| IE60409B1 (en) | 1994-07-13 |
| GR3006929T3 (no) | 1993-06-30 |
| EP0244235A2 (en) | 1987-11-04 |
| AU7225387A (en) | 1987-11-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO167577B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av lmv-heparin ved enzymatisk depolymerisering. | |
| US5106734A (en) | Process of using light absorption to control enzymatic depolymerization of heparin to produce low molecular weight heparin | |
| NO167208B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av heparin med lav molekylvekt (lmv-heparin). | |
| US9200087B2 (en) | Branched soluble glucose polymers for peritoneal dialysis | |
| CN102050888B (zh) | 一种依诺肝素钠的制备方法 | |
| BR112012003128B1 (pt) | Processos para recuperar um ácido inorgânico de licor residual aquoso, e para produzir celulose nanocristalina. | |
| NO334523B1 (no) | Fremgangsmåte for fremstilling av en steril høy molekylærvekts hyaluronsyreformulering | |
| Lukanin et al. | The effect of content of apple juice biopolymers on the concentration by membrane distillation | |
| KR101132114B1 (ko) | 히알루론산의 분자량을 조절하는 방법 | |
| HU226949B1 (en) | A process for preparing a hyaluronic acid fraction having a low polydispersion index | |
| EP3943513A1 (en) | Method for obtaining low-molecular-weight heparins by means of tangential flow filtration | |
| SK286327B6 (en) | Process for purifying high molecular weight hyaluronic acid | |
| CN1081642C (zh) | 制备淀粉降解产物的方法 | |
| JP2022180509A (ja) | ポリ硫酸ペントサン及びポリ硫酸ペントサンの製造方法 | |
| CN111511773A (zh) | 戊聚糖多硫酸酯以及含有戊聚糖多硫酸酯的药物 | |
| CN101671711A (zh) | 一种制备超低分子量肝素的方法 | |
| CN105820271A (zh) | 一种规模化小分子透明质酸钠的制备和纯化方法 | |
| KR101638662B1 (ko) | 히알루론산 및／또는 그의 염의 정제 방법 | |
| GB2342921A (en) | Demethoxylation of pectins, plant extracts containing PME and the uses thereof | |
| NO834346L (no) | Fremgangsmaate for rensing og fraksjonering av heparin | |
| CN114262387B (zh) | 一种抗性糊精的制备方法 | |
| DK162108B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af lmw-heparin | |
| CN115161361A (zh) | 酶分子机器技术制备无支链的直链半乳聚糖的方法及应用 | |
| K? dziora et al. | An attempt to application of continuous recycle membrane reactor for hydrolysis of oxidised derivatives of potato starch | |
| Suryadarma et al. | Determination of ultrafiltration resistance using series resistance model in inulin purification from red fruit (Pandanus conoideus L.) pedicel extract |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |