NO167208B - Fremgangsmaate for fremstilling av heparin med lav molekylvekt (lmv-heparin). - Google Patents
Fremgangsmaate for fremstilling av heparin med lav molekylvekt (lmv-heparin). Download PDFInfo
- Publication number
- NO167208B NO167208B NO871783A NO871783A NO167208B NO 167208 B NO167208 B NO 167208B NO 871783 A NO871783 A NO 871783A NO 871783 A NO871783 A NO 871783A NO 167208 B NO167208 B NO 167208B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- heparin
- molecular weight
- lmv
- depolymerization
- average molecular
- Prior art date
Links
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 title claims description 68
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 title claims description 67
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 65
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 27
- 108010022901 Heparin Lyase Proteins 0.000 claims description 20
- 238000012691 depolymerization reaction Methods 0.000 claims description 14
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 13
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 5
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 4
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 claims description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 3
- 239000003055 low molecular weight heparin Substances 0.000 claims description 3
- 229940127215 low-molecular weight heparin Drugs 0.000 claims description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 8
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 4
- 239000002634 heparin fragment Substances 0.000 description 4
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000004019 antithrombin Substances 0.000 description 2
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 2
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 2
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 230000002367 endolytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 description 1
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000589565 Flavobacterium Species 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 102100023038 WD and tetratricopeptide repeats protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L calcium acetate Chemical compound [Ca+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001639 calcium acetate Substances 0.000 description 1
- 229960005147 calcium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000011092 calcium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000004836 empirical method Methods 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N heparin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 description 1
- 239000002565 heparin fraction Substances 0.000 description 1
- 229960001008 heparin sodium Drugs 0.000 description 1
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012872 hydroxylapatite chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000001151 other effect Effects 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000001448 refractive index detection Methods 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof
- C08B37/0078—Degradation products
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
Description
Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for produksjon av lavmolekylvekt-heparin (LMV-heparin) ved enzymatisk depolymerisering av heparin.
Konvensjonell heparin er en heterogen blanding av mucopoly-sakkarider som dekker et molekylvektområde fra 5000-50.000 dalton med en antallsmidlere molekylvekt på 10-14000 dalton.
Heparin virker direkte eller indirekte på funksjonen av en rekke proteiner, spesielt enzymene i koaguleringsprosessen.
Virkningene av heparin er influert av en rekke faktorer, slik som fordelingen av funksjonelle grupper i molekylet og molekylvekten. Således er det med sikkerhet bevist at den sistnevnte spiller en viktig rolle for aktiviteten av heparin, spesielt inaktivering av Thrombin og Faktor Xa formidlet ved Antithrombin III.
Antithrombin-aktivitet krever en minimums-heparinmolekylvekt som tilsvarer omtrent 18 monosakkarider, dvs. omtrent 5400 dalton, mens antifaktor Xa-aktivitet kan uttrykkes ved heparin-molekyler så små som 5-6 sakkaridenheter, 1500-1800 dalton.
En rekke andre virkninger av heparin, f.eks. antitrombotisk virkning (heparinoligosakkarider som inneholder 18 monosakkarider eller mindre, synes å ha dårlig antitrombotisk virkning) virker på ADP-indusert trombocytt-aggregering, biologisk tilgjengelighet etter s.c. administrering, inhibering av PF4 og HRG, såvel som virkningen mot koaguleringsenzymer i den intrinsiske syklus som er ansvarlig for dannelse av faktor Xa, er sterkt influert av molekylvekten til heparin.
I senere år er interessen blitt sentrert om heparin-fragmenter eller -fraksjoner med høy Xal/antitrombin-aktivitet med molekylvekt fra 4000 dalton til opptil 6000, siden slike stoffer er blitt rapportert å ha god antitrombotisk virkning og på samme tid ingen eller liten tendens til å forårsake blødnings-komplikasjoner. De viser også forbedret biologisk tilgjengelighet spesielt etter subkutan administrering.
Siden selektiviteten av heparinvirkning er korrelert med molekylvekten, er det sannsynlig at det eksisterer et relativt snevert molekylvektområde, hvor heparinaktivitet er optimal.
En fremgangsmåte for fremstilling av LMV-heparin med en spesifikk, ønsket molekylvekt og en snever moleky1vektfordeling, dvs. lav polydispersitet, ville derfor være fordelaktig.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen muliggjør oppnåelse av et hvilket som helst molekylvektområde for depolymeriserings-produkt fra heparin. LMV-heparin kan fremstilles i lavt utbytte fra konvensjonell heparin ved fraksjonering (DOS 2.944.792 og 2.945.595). Det meste LMV-heparin blir imidlertid fremstilt ved depolymerisering av heparin enten ved kjemiske eller enzymatiske fremgangsmåter, fulgt av fraksjonering, om nødvendig (kfr. A. Homer, Heparin, Kakkar, utg. Thomas, 1976 og Perlin et al. Carbohydrate Res.
18, 185 (1971.).
Kjemisk depolymerisering av heparin er beskrevet i publiserte EP-patentsøknader nr. 0037319, 0076279 og 0014184, US-patent nr. 4.351.938 og GB-patent nr. 2.002.406.
Enzymatisk depolymerisering er beskrevet i US-patent
nr. 3.766.167, GB-patent nr. 2.002.406, publisert EP-patentsøknad nr. 0014184, og US-patent nr. 4.396.762.
Et hovedproblem som følger med alle dé kjente depolymeri-seringsprosessene som gjennomføres porsjonsvis, er å stoppe depolymeriseringsreaksjonen ved den riktige gjennomsnittsmolekylvekt. Videre: resulterer depolymeriseringsreaksjonen i heparin-fragmenter med mindre eller større størrelse enn den ønskede molekylvekt, selv i fravær av sidereaksjoner.
I de kjente depolymeriseringsprosesser for depolymerisering av heparin som bruker uorganiske depolymeriseringsreagenser (salpetersyrling, hydrogenperoksyd, etc), eksisterer det ikke noe fortrinn når det- gjelder størrelse av molekyl som blir angrepet eller når det gjelder stilling inne i molekylet av bindingen som skal brytes. I henhold til R.J. Linhardt et al., Biochem. Biophys.Acta 702 (1982) 197-203 gjør selv ikke enzymet heparinase noen slik, distinksjon, idet virkningsmåten av heparinase er tilfeldig endolytisk.
Dette betyr at polydispersiteten av en hvilken som helst heparin-depolymeriseringsblanding utvikler seg på en statistisk forutsigbar måte som en funksjon av graden av depolymerisering. Spesielt på det tidspunktet når gjennomsnittsmnoleky1vekten ér like over den ønskede verdi, har en stor del av fragmentene den ønskede molekylvekt, men på grunn av den tilfeldige endolytiske natur av depolymeriseringen har de også en forholdsvis stor sjanse for å bli videre depolymerisert til å gi fragmenter av suboptimal størrelse. En depolymerisering gjennomført porsjonsvis bør stoppes omtrent på dette tidspunkt.
Imidlertid er det til nå på fagområdet ikke blitt utviklet tilfredsstillende metoder for å kontrollere depolymeriseringen av heparin for å oppnå høye utbytter av et forutbestemt LMV-hepaarinprodukt.
Et mål for denne oppfinnelse er å gi en fremgangsmåte for
å kontrollere en enzymatisk depolymerisering av heparin ved heparinase i en reaksjonsblanding i vandig medium. Det er et vidsere mål for den foreliggende oppfinnelse å gi en fremgangsmåte for produksjon av LMV-heparin med en ønsket gjennomsnitts-moleky1vekt.
Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av heparin med lav molekylvekt (LMV-heparin) hvorved heparin blir delvis depolymerisert med heparinase i et vandig medium, og den er karakterisert ved at økningen i lysabsorpsjon forårsaket av dannelse av umettede nedbrytningsr-LMV-produkter, ved innvirkning av heparinase på heparin, blir målt i løpet av depolymeriseringsreaksjonen, idet reaksjonen blir stoppet når økningen i lys-absorpsjon har nådd en verdi som tilsvarer den ønskede antallsmidlere molekylvekt Mn og den tilsvarende vektsmidlere molekylvekt Mw, og LMV-heparin blir utvunnet fra reaksjonsblandingen.
Gjennomsnittsmolekylvekten av en heparin-depolyraeri-seringsreaksjonsblanding kan bestemmes på en rekke måter,
basert på f.eks. GPC-HPLC, viskositetsmåling, lysspredning eller kjemisk eller fysisk-kjemisk bestemmelse av funksjonelle grupper dannet i depolymeriseringsprosessen.
De fleste av de nevnte fremgangsmåter, slik som GPC-HPLC, er tidkrevende og ikke lette å tilpasse til produksjon i stor skala, og faktisk er majoriteten av de kjente fremgangsmåter som anvendes ved fremstilling av LMV-heparin, basert på empiriske metoder som er avhengige av nøye kontroll og startsammensetning og reaksjonsbetingelser for å oppnå den ønskede molekylvekt ved slutten av depolymeriseringsreaksjonen. Imidlertid, på grunn av uunngåelige variasjoner i løpet av depolymeriseringsreaksjonen, f.eks. variasjoner i enzymaktivitet, kan molekylvekten av sluttproduktet varierer fra en porsjon til en annen og gjøre det vanskelig å oppnå et jevnt produkt med høyt utbytte.
Hvis et produkt med den riktige gjennomsnittsmolekylvekt skal produseres i hver produksjonsporsjon, må depolymeriseringsreaksjonen stoppes øyeblikkelig, når den ønskede gjennomsnittsmolekylvekt er nådd i depolymeriseringsreaksjonsblandingen. Dette krever at forandringen i gjennomsnittsmolekylvekt følges av målinger for molekylvektbestemmelse som har liten eller ingen forsinkelsestid.
Inntil nå har det ikke eksistert noen praktisk metode for molekylvektbestemmelse av en depolymeriseringsreaksjonsblanding (som inneholder LMV-heparin). Et aspekt av den foreliggende oppfinnelse gir en slik metode.
Gjennomsnittsmolekylvekten av heparin eller LMV-heparin kan gis som antallsmidlere molekylvekt (Mn), dvs. vekt/antall mol, eller som vektsmidlere molekylvekt (Mw,) eller toppmolekyl-vekt (Mt0pp)• Mw eller M^opp blir normalt anvendt for å karakterisere heparin eller LMV-heparinprodukter.
Det er blitt bekreftet eksperimentelt at polydispersiteten
(D), dvs. Mw/Mn av en gitt heparin-depolymeriseringsreaksjonsblanding forandrer seg på en konstant måte i løpet av den
enzymatiske depolymeriseringsreaksjon av heparin, som vist i
Fig. 1.
Den foreliggende oppfinnelse er basert på det faktura at det er blitt utviklet en rask og sikker metode for å bestemme Mn i løpet av depolymeriseringen av heparin med heparinase. Idet fig. 1 gir korrelasjonen mellom Mw og Mn, kan depolymeriseringen av heparin til LMV-heparin med en gitt, ønsket Mw, oppnås ved depolymerisering til en tilsvarende antallsmidlere molekylvekt Mn.
Den enzymatiske^ depolymeriseringsprosess som bruker heparinase, egner seg til måling av spektrofotometrisk, antallsmidlere molekylvekt (Mn), siden den enzymatiske prosess er eliminerende, idet den danner en reduserende endegruppe og en endegruppe som består av A4,5-umettet-iduronsyrederivat som har en distinkt UV-absorpsjon ved 230-235 nm. Den molare absorp-sjonskoeffisient for en rekke LMV-heparinfragmenter av di-, tetra-, heksa- og oligosakkarider ble publisert av Linker og Hovingh (Biochem. 11(1972), 563-568). Gjennomsnittsverdien av de publiserte molare absorpsjonskoeffisienter er 5500.
En ligning slik som
som gir relasjonen mellom antallsmidlere molekylvekt (Mn) og økning i absorpsjon ved 235 nm er lett å utlede.
I formel (1) er Mn antallsmidlere molekylvekt av det depolymeriserte produkt, Mn>u er antallsmidlere molekylvekt av heparinsubstratet, c er substratkonsentrasjonen (g/l), AA235 er økningen i absorpsjon ved 235 nm og c er den molare absorpsjons-koef f isient.
Beregning av Mn er mulig når Mn i heparinsubstratet (Mn,u)» substratkonsentrasjon (c, g/l) og,absorpsjonskoeffisienten (c) av de umettede depolymeriseringsprodukter er kjente og A<A>235 blir målt.
I en rekke eksperimenter ble heparin depolymerisert med delvis renset heparinase ved å anvendte hydroksylapatitt-kromatografering i henhold til Linker og Hovingh (Methods in Enzymology 28(1972) , 902-911).
Den antallsmidlere molekylvekt Mn ble beregnet ved å bruke ligning (1) og anvende den publiserte verdi av c = 5500 og sammenlignet med Mn, bestemt ved GPC-HPLC.
Det ble ved sammenligning imidlertid funnet at den beregnede verdi av Mn (Mn(AA)) var forskjellig fra verdien av Mn som ble funnet ved å bruke HPLC (Mn(HPLC)), med opp til 20%.
Omflytting av (1) til
muliggjør beregning av en absorpsjonsøkning AA235 som tilsvarer en ønsket antallsmidlere molekylvekt Mn. Men igjen viste eksperimenter at hvis depolymeriseringen ble stoppet ved den beregnede verdi av AA235» var c*en aktuelle Mn bestemt ved HPLC, betraktelig høyre enn den ønskede Mn, hvis verdien av c= 5500, funnet av Hovingh og Linker, ble anvendt.
Det ble konkludert at det dårlige samsvar mellom Mn(AA) og Mn(HPLC) var forårsaket av anvendelsen av verdien av c = 5500.
Omflytting av ligning (1) til
viser at c kan beregnes ved å bruke kjente verdier av c og Mn>u og samtidig bestemte verdier av AA235 og Mn(HPLC).
På denne måte ble en verdi av c = 7600 funnet, som ga nært samsvar mellom beregnet Mn(AA) og observert Mn(HPLC) i en rekke eksperimenter.
Muligheten for beregning av en riktig verdi av Mn, basert på en lettvint målt AA235 er basis for praksis av den foreliggende oppfinnelse i henhold til hvilken enzymatisk depolymerisering av heparin, gjennomført porsjonsvis, tillates å gå fram inntil den beregnede verdi av AA235 er nådd, hvoretter depolymeriseringsreaksjonen av heparin blir stoppet, og reaksjonsblandingen blir utformet.
Heparinasen som anvendes i henhold til den foreliggende oppfinnelse, fremstilles på en kjent måte, som beskrevet av Hovingh og Linker (Methods in Enzymology 28 (1972), 902-911 og J.Biol.Chem. 245 (1970), 6170-6175) ved å dyrke Flavobacterium heparium på et heparin-holdig substrat, celleinnhøsting og celleruptur ved ultralydbehandling og rensing ved hjelp av blant annet kromatografering på hydroksyapatitt.
Nedbrytningen av heparin med heparinase utføres i et vandig medium som beskrevet f.eks. av Hovingh og Linker (J.Biol.Chem. 240 (1965), 3724-3728). Når den ønskede Mn-verdi av depolymeriseringsblandingen er nådd, blir heparinasen inaktivert på kjent måte, f.eks. ved å senke pH eller ved en kort varmebehandling. LMV-heparinproduktet blir så utfelt på kjent måte, f.eks.
utfelling med alkohol og renset ved fremgangsmåter som er velkjent på fagområdet, f.eks. bleking, steril-filtrering og a1koholutfe11ing.
Beregning av økningen i absorpsjon ved 230-235 nm AA235 som tilsvarer den ønskede Mw av produktet, gjøres som følger:
a) avlesning på figur 1 av Mn som tilsvarer den ønskede
Mw og
b) beregning av AA235 som tilsvarer Mn fra a) ved hjelp av formel (2) ovenfor og ved å anvende verdien 7600
for c.
AA235 måles med spektrofotometer etter surgjøring av
prøven, fortrinnsvis til pH < 2,5. Det er innlysende for fagmannen på området at økningen i UV-absorpsjon forårsaket av dannelse av umettede nedbrytnihgsprodukter ved virkning av heparinase på heparin, kan måles ved andre bølgelengder enn det som er angitt her. Absorpsjonskoeffisienten blir imidlertid målt ved 235 nm fordi den har sitt maksimum ved denne bølge-lengde.
Depolymeriseringen stoppes når AA235 har nådd den beregnede verdi, hvoretter LMV-heparinproduktet blir utfelt ved tilsetning av alkohol (fortrinnsvis 0,6-10 vol/vol).
Heparin-depolymeriseringsreaksjonen blir fortrinnsvis
utført ved en temperatur på 25-40 °C og ved en pH på 6-8. Selv om den foreliggende oppfinnelse er illustrert ved hjelp av en prosess hvor heparinase anvendes i fri form, kan immobilisert heparinase også anvendes.
Eksempel 1 illustrerer samsvaret mellom Mn som bestemt ved
A og AA-målinger og ved HPLC-målinger (Mn (AA) til Mn (HPLC))
av prøver i løpet av en porsjonsvis depolymerisering av heparin.
Eksempel 1
2,5 g heparin-natrium (USP, Mw = 17300, Mn = 12400 dalton ble løst i 25 ml 0,1 M natriumacetat, 0,01 M kalsiumacetat,
pH 7,0.
Heparinase, 0,8 ml, 1500 u/ml, spesifikk aktivitet
1050 u/mg ble løst i 25 ml 0,1 M natriumacetat.
En heparinaseenhet er definert i henhold til Hovingh og Linker, Methods in Enzymol., 28(1972), 902-911.
Heparin-substratet og enzymløsningen ble blandet og
inkubert med svak røring i et vannbad, med termostat på 30°C.
En prøve tatt umiddelbart etter blanding ble fortynnet med 1,7 M perklorsyre, pH mindre enn 2,5, filtrert, og absorpsjonen ble målt ved 235 nm.
Absorpsjonsmålingen ble gjentatt en rekke ganger, som vist i tabellen nedenfor, og prøver som ble tatt samtidig, ble oppvarmet en kort stund i et kokende vannbad for å ødelegge enzymaktivitet, avkjølt, fortynnet 5 ganger med 0,5 M natriumsulfat og filtrertj og molekylvekten ble analysert ved GPC-HPLC.
GPC-HPLC-analysen ble utført ved å bruke Waters 1-125 og I-60-kolonner i serie med 0,5 M natriumsulfat som eluerings-middel, 0,5 ml/min., målt ved refraktiv indekspåvisning, og molekylvekten ble beregnet ut i fra tilbakeholdelsestid, ved å bruke en ikke-lineær standardkurve basert på dekstran og heparinfragmentstandarder.
Antallsmidlere molekylvekt, Mn, ble beregnet fra ligning (1) ved å anvende absorpsjonsøkningen ved 235 nm, c = 7600, c = 50 og Mn>u = 12400.
Resultatene er gitt i tabellen nedenfor, og som det sees, ble det oppnådd nært samsvar mellom de beregnede og observerte antallsmidlere molekylvekter.
Eksempel 2
Formålet med eksperimentene som er beskrevet nedenfor, var å produsere LMV-heparin med en vektsmidlere molekylvekt (Mw) på 6500 ± 500 dalton.
Fra figur 1 ble antallsmidlere molekylvekt (Mn) som tilsvarte Mw = 6500 dalton, funnet å være omtrent 3500 dalton.
Fem forskjellige hepariner (se tabellen nedenfor) ble
valgt for enzymatisk depolymerisering. Forandringen i optisk tetthet ved 235 Mn (AA235) (beregnet)) som tilsvarte en Mn i reaksjonsblandingen på 3500 dalton (i et eksperiment 3400 dalton) ble beregnet for hver heparin fra ligning 2 ved å anvende c = 50 mg/ml, c = 7600 og Mn u-verdiene av de aktuelle heparin-mengder (se tabell).
Den enzymatiske nedbrytning av heparinene ble utfort som følger: Heparin ble løst i en konsentrasjon på 50 mg/ml i 0,1 M natriumacetatbuffer, pH 7,0 som inneholdt spor av kalsium (0,0005 til 0,01 M). Løsningen ble oppvarmet til 30°C, og heparinase ble tilsatt i den mengde som var nødvendig for å depolymerisere heparin til den ønskede Mn i løpet av omtrent 48 timer.
Forandringen i optisk tetthet ved 235 nm (AA235) ble målt gjentatte ganger i prøver av reaksjonsblandinger etter fortynning med 1,7 M perklorsyre, pH under 2,5. Når A<A>235 var lik AA235 (beregnet), ble den enzymatiske depolymerisering stoppet.
Når AA235 hadde nådd den beregnede verdi, ble LMV-heparinproduktet utfelt ved tilsetning av alkohol,og det depolymeriserte produkt ble renset ved fremgangsmåter som er velkjente på fagområdet, f.eks. bleking, steril-filtrering og alkohol-utfelling. Karakteristika for produktene fra fem uavhengige eksperimenter er vist i den følgende tabell.
Det viser seg fra tabellen ovenfor at alle slutt-LMV-heparinproduktene har en vektsmidlere molekylvekt (Mw) innen det ønskede område.
Claims (3)
1. Fremgangsmåte for fremstilling av heparin med lav molekylvekt (LMV-heparin) hvorved heparin blir delvis depolymerisert med heparinase i et vandig medium, karakterisert ved at økningen i lysabsorpsjon forårsaket av dannelse av umettede nedbrytnings-LMV-produkter ved innvirkning av heparinase på heparin, blir målt i løpet av depolymeriseringsreaksjonen, idet reaksjonen blir stoppet når økningen i lys-absorpsjon har nådd en verdi som tilsvarer den ønskede antallsmidlere molekylvekt Mn og den tilsvarende vektsmidlere molekylvekt Mw, og LMV-heparin blir utvunnet fra reaksjonsblandingen.
2. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, karakterisert ved at økningen i absorpsjons-koeffisient måles ved 230-235 nm.
3. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, karakterisert ved at heparinasen anvendes i fri form.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK196986A DK196986D0 (da) | 1986-04-30 | 1986-04-30 | Fremstilling af polysaccharider |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO871783D0 NO871783D0 (no) | 1987-04-29 |
| NO871783L NO871783L (no) | 1987-11-02 |
| NO167208B true NO167208B (no) | 1991-07-08 |
| NO167208C NO167208C (no) | 1991-10-16 |
Family
ID=8109197
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO871783A NO167208C (no) | 1986-04-30 | 1987-04-29 | Fremgangsmaate for fremstilling av heparin med lav molekylvekt (lmv-heparin). |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0244236A3 (no) |
| JP (1) | JPS62283103A (no) |
| AU (1) | AU588102B2 (no) |
| CA (1) | CA1334081C (no) |
| DK (1) | DK196986D0 (no) |
| FI (1) | FI90090C (no) |
| NO (1) | NO167208C (no) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1214609B (it) * | 1985-05-17 | 1990-01-18 | Opocrin Spa | Esosaminoglicani solfati depolimerizzati ad attivita'antitrombotica, fibrinolitica, antinfiammatoria, loro procedimento di preparazione e composizioni farmaceutiche che li contengono. |
| DK196886D0 (da) * | 1986-04-30 | 1986-04-30 | Novo Industri As | Fremstilling af polysaccharider |
| IT1213384B (it) * | 1986-11-24 | 1989-12-20 | Lab Derivati Organici Mediolan | Processo per la preparazione controllata di gilcosaminoglicani a basso peso molecolare. |
| NL8900119A (nl) * | 1989-01-19 | 1990-08-16 | Akzo Nv | Werkwijze voor het afsplitsen van (delta)4-onverzadigd uronzuur in glycosaminoglycaan fragmenten. |
| USRE38743E1 (en) | 1990-06-26 | 2005-06-14 | Aventis Pharma S.A. | Mixtures of particular LMW heparinic polysaccharides for the prophylaxis/treatment of acute thrombotic events |
| DK0946185T4 (da) * | 1996-11-27 | 2010-08-30 | Aventis Pharma Inc | Farmaceutisk præparat, som omfatter en forbindelse med anti-Xa-aktivitet og en blodpladeaggregations antagonistforbindelse |
| US7056504B1 (en) | 1998-08-27 | 2006-06-06 | Massachusetts Institute Of Technology | Rationally designed heparinases derived from heparinase I and II |
| CA2402160C (en) | 2000-03-08 | 2012-02-14 | Massachusetts Institute Of Technology | Heparinase iii and uses thereof |
| ATE426805T1 (de) | 2000-09-12 | 2009-04-15 | Massachusetts Inst Technology | Verfahren und produkte, die mit niedermolekularem heparin assoziiert sind |
| CA2423469A1 (en) | 2000-10-18 | 2002-04-25 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and products related to pulmonary delivery of polysaccharides |
| EP2402753A1 (en) | 2002-03-11 | 2012-01-04 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | Analysis of sulfated polysaccharides |
| EP1582531A1 (en) | 2004-03-24 | 2005-10-05 | Aventis Pharma S.A. | Process for oxidizing unfractionated heparins and detecting presence or absence of glycoserine in heparin and heparin products |
| EP1792621B1 (en) | 2005-11-30 | 2012-04-04 | Istituto di Ricerche Chimiche e Biochimiche "G. Ronzoni" | Orally administrable heparin derivatives |
| WO2007140231A2 (en) * | 2006-05-25 | 2007-12-06 | Momenta Pharmaceutical, Inc. | Low molecular weight heparin composition and uses thereof |
| US9139876B1 (en) | 2007-05-03 | 2015-09-22 | Momenta Pharmacueticals, Inc. | Method of analyzing a preparation of a low molecular weight heparin |
| ES2817779T3 (es) | 2010-01-19 | 2021-04-08 | Momenta Pharmaceuticals Inc | Evaluación de preparaciones de heparina |
| WO2012115952A1 (en) | 2011-02-21 | 2012-08-30 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | Evaluating heparin preparations |
| CN103214596A (zh) * | 2013-05-14 | 2013-07-24 | 枣庄赛诺康生化股份有限公司 | 由肝素钠粗品直接生产低分子量肝素钠的方法 |
| CN103323416A (zh) * | 2013-07-04 | 2013-09-25 | 苏州良辰生物医药科技有限公司 | 一种肝素浓度的测定方法 |
| CN108117614B (zh) * | 2016-11-29 | 2020-09-04 | 北京碧澄生物科技有限公司 | 低分子量肝素 |
| WO2022015794A1 (en) | 2020-07-14 | 2022-01-20 | Optimvia, Llc | Methods for synthesizing non-anticoagulant heparan sulfate |
| CN114616340A (zh) | 2019-07-09 | 2022-06-10 | 奥普蒂姆维亚有限公司 | 合成抗凝血多糖的方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4351938A (en) * | 1980-05-19 | 1982-09-28 | Riker Laboratories, Inc. | Anticoagulant substance |
| US4396762A (en) * | 1981-08-24 | 1983-08-02 | Massachusetts Institute Of Technology | Heparinase derived anticoagulants |
| DK196886D0 (da) * | 1986-04-30 | 1986-04-30 | Novo Industri As | Fremstilling af polysaccharider |
-
1986
- 1986-04-30 DK DK196986A patent/DK196986D0/da not_active Application Discontinuation
-
1987
- 1987-04-29 FI FI871910A patent/FI90090C/fi not_active IP Right Cessation
- 1987-04-29 EP EP87303836A patent/EP0244236A3/en not_active Ceased
- 1987-04-29 NO NO871783A patent/NO167208C/no not_active IP Right Cessation
- 1987-04-30 AU AU72255/87A patent/AU588102B2/en not_active Ceased
- 1987-04-30 CA CA 536096 patent/CA1334081C/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-04-30 JP JP10484687A patent/JPS62283103A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA1334081C (en) | 1995-01-24 |
| JPS62283103A (ja) | 1987-12-09 |
| FI90090B (fi) | 1993-09-15 |
| FI871910A0 (fi) | 1987-04-29 |
| DK196986D0 (da) | 1986-04-30 |
| AU588102B2 (en) | 1989-09-07 |
| EP0244236A2 (en) | 1987-11-04 |
| EP0244236A3 (en) | 1988-09-28 |
| NO167208C (no) | 1991-10-16 |
| FI871910A (fi) | 1987-10-31 |
| AU7225587A (en) | 1987-11-05 |
| FI90090C (fi) | 1993-12-27 |
| JPH0542919B2 (no) | 1993-06-30 |
| NO871783D0 (no) | 1987-04-29 |
| NO871783L (no) | 1987-11-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO167208B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av heparin med lav molekylvekt (lmv-heparin). | |
| Zhang et al. | Wheat bran arabinoxylans: Chemical structure and film properties of three isolated fractions | |
| Wu et al. | Physicochemical characteristics and anticoagulant activities of low molecular weight fractions by free-radical depolymerization of a fucosylated chondroitin sulphate from sea cucumber Thelenata ananas | |
| US5106734A (en) | Process of using light absorption to control enzymatic depolymerization of heparin to produce low molecular weight heparin | |
| KR0185586B1 (ko) | 저 분자량 다당류 혼합물, 그의 제조 방법 및 그로 구성된 치료 조성물 | |
| NO820136L (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av forbedret antikoagulerende substans | |
| US10704068B2 (en) | Method of producing heparan sulfate having anticoagulant activity | |
| Fu et al. | Structure and activity of a new low-molecular-weight heparin produced by enzymatic ultrafiltration | |
| Gao et al. | Purification, structural characterization and anticoagulant activities of four sulfated polysaccharides from sea cucumber Holothuria fuscopunctata | |
| CA1334080C (en) | Process for the preparation of lmw-heparin | |
| NO300277B1 (no) | Fremgangsmåte for fremstilling av en blanding inneholdende N,O-sulfatert heparosan | |
| EP2729500A2 (en) | Process of extraction of hemicellulose from corn fiber | |
| HUT64087A (en) | Process for producing n,o-sulfated heparosanes of high molecular weigh and pharmaceutical compositions comprising such compounds | |
| Patova et al. | Physicochemical and rheological properties of gelling pectin from Sosnowskyi's hogweed (Heracleum sosnowskyi) obtained using different pretreatment conditions | |
| AU2005224415A1 (en) | Oligosaccharides, preparation method and use thereof, and pharmaceutical compositions containing same | |
| WO2012116048A1 (en) | Single step heparosan n-deacetylation and depolymerization for making bioengineered heparin | |
| Park et al. | Optical characteristics of carboxyl group in relation to the circular dichroic properties and dissociation constants of glycosaminoglycans | |
| Rychlý et al. | Unexplored capabilities of chemiluminescence and thermoanalytical methods in characterization of intact and degraded hyaluronans | |
| NZ202996A (en) | Production of low molecular weight heparin | |
| Wolff et al. | Production of clinical-type dextran-Partial hydrolytic depolymerization and fractionation of the dextran from Leuconostoc mesenteroides strain NRRL B-512 | |
| JP2004250592A (ja) | 紫外線照射による低分子化グリコサミノグリカンの製造方法 | |
| Melander et al. | Heterogeneous hydrolysis of hyaluronic acid in ethanolic HCl slurry | |
| DK156402B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af lmw-heparin | |
| Takahara et al. | Anticoagulant activity of enzymatically synthesized amylose derivatives containing carboxy or sulfonate groups | |
| CA3236567A1 (en) | Methods for the chemoenzymatic synthesis of low molecular weight heparin from low molecular weight heparosan |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |