NO820136L - Fremgangsmaate for fremstilling av forbedret antikoagulerende substans - Google Patents

Description

Teknisk område

Foreliggende oppfinnelse angår partielle depolymeriser-

te heparinprodukter med bestemte analyserbare reduserende endegrupper,. anvendelse av disse som antikoagulanter og anti-trombosemidler og en fremgangsmåte for fremstilling av disse.

Kjent teknikk

Heparin er et mucopolysaccharid sammensatt av aminosuk-ker og uronsyrerester. Det kan erholdes fra kveg, svin, sau-er, hval eller andre pattedyrvev ved ekstraksjon med en opp-løsning av kaliumacetat, alkalisk ammoniumsulfat og lignende. Det kommersielle produkt (USP heparin) er tilgjengelig fra flere kilder, generelt som et alkalimetall eller jordalkalimetallsalt (vanligst som natriumheparin).

Heparin er sannsynligvis det mest effektive tilgjengelige medikament for behandling av omfanget av etablerte ven-øse og arterielle tromber og nylig har det også vært anvendt for forhindring av trombose. I begge behandlingsområder har blødning eller hæmorrhagia vært et hovedproblem, enkelte forskere har rapportert at forekomsten av hæmorrhagia er så høy som 35 %. Dette er virkelig hovedbegrensningen for den terapeutiske anvendelse av heparin, idet blødning finner sted ved ... et heparinniyå som bare er marginalt større enn det som kre-ves for å forhindre omfanget av tromber. Således ville et heparinprodukt med et øket forhold mellom antitrombotisk og hæmorregisk aktivitet representere et viktig fremskritt både når det gjelder terapi og profylakse.

Inntil for ca. 10 år siden var den antitrombotiske/ hæmorrhagiske effekt av heparin betraktet som likestillet med dets antikoagulerende effekt, dvs. dets effekt på blodlevring in vitro. I løpet av de siste 5 år er det imidlertid blitt klart at forskjellige heparinfraksjoner har forskjellig antikoagulerende virkninger, og at blødning kan økes ved en effekt på blodplatene, og at den nøyaktige antikoagulerende effekt som er ansvarlig for dets antitrombotiske egenskaper er uviss. Med andre ord kan forholdet mellom de antitrombotiske og hæmorrhagiske egenskaper av.heparin variere betydelig fra fraksjon til fraksjon.

Heparin er heterogent ved molekylærnivået, dvs. det inneholder polymere kjeder av varierende lengder og sammen-setning. Således vil et heparinekstrakt fra pattedyrvev kunne forventes å inneholde polymerkjeder varierende i molekylvekt fra muligens så lavt som 5000 til så høyt som 50000 dalton, og utgjøres av et utall monosaccharidenheter, innbefattet glucuronsyre, N-acetylglucosamin, N-sulfatert glucosamin, iduronsyre, o-sulfatert glucosamin og o-sulfatert iduronsyrerester. Ennvidere er der en mangfoldighet av mulige arrangementer av disse rester. Det følgende avsnitt og den etterfølgende formel fra en artikkel av Rosenberg og Rosenbert (i Drug Therapy, september 1979, sider 26 - 36, ved 28) er representative for den aktuelle informasjon på dette område: I løpet av de siste få tiår har forskere på dette område identifisert de forskjellige typer monosaccharider tilstede innen heparin, og fastslått bindingskonfigura-sjonene som forbinder disse elementer, og bestemt ar-rangementet av disse grupper i forhold til deres nærme-ste naboer. Det er f.eks. blitt vist at ikke-sulfaterte iduronsyrerester sjelden fremtrer, og at sulfaterte iduronsyregrupper er 4 - 5 ganger hyppigere enn gluco-ronsyrerester. Ennvidere utgjør N-sulfatert glucosamin ca. 90 % av hexosaminrestene, hvor N-acetylert glucosamin utgjør resten av den lille fraksjon av hexosamin-grupper. Ikke-sulfatert, ikke-acetylert glucosaminrester observeres sjelden i heparinpreparater.

Der har vært gjort et flertall forsøk på å korrelere strukturen av heparin med dets antikoagulerende egenskaper. Bare i det siste er det imidlertid erkjent at hva som tidligere ble angitt som "heparin", omfatter utal-lige mucopolysaccharidgrupper med svakt forskjellig

■primærsekvens.

Den ovenfor viste sekvens representerer bare én av de mange mulige arrangementer av hexosamin og uronsyrerester som kan foreligge innen polysaccharidkjeden -i heparin.

Således har heparin en betydelig grad av polydispersitet i molekylstørrelse, variasjoner i forholdet mellom gluco-ronsyre og induronsyre, vekslinger i mengden av sulfatester og.N-sulfatering, og forskjellig grad av N-acetylering. Forandringer i hvilke som helst av disse parametre har bare vært forbundet i meget begrenset grad med heparins antitrombotiske styrke. Følgelig har det vært antatt at dets antitrombotiske aktivitet ikke kunne spores tilbake til en enkel spesifikk heparinstruktur, og i alle tilfeller er ikke noe nøyaktig forhold•mellom strukturen og funksjonen for tiden kjent, selvom betydelig fremskritt nylig er blitt rapportert av Rosenberg og Lindahl.

Anstrengelser har vært gjort for å øke forholdet mellom den ønskede antitrombotiske aktivitet og den uønskede hæmorrhagiske egenskap av heparin ved kjemiske og/eller fysikalske modifikasjoner. Også lavmolekylære vektmodifikasjoner er blitt efterstrebet med det håb at de ville være oralt absor-berbare, og et flertall forsøk har vært gjort på å syntetise-re kjemiske forbindelser og polymerer (angitt heparinoider) med strukturer lik naturlig heparin, og som utviste ekviva-lente eller bedre egenskaper. Kanskje det mest relevante sett fra foreliggende oppfinnelses side er arbeidet hørende til: (1) fysikalsk separasjon av naturlige hepariner til aktive og inaktive former og fraksjoner varierende i molekylvekt og farmasøytiske egenskaper (Rosenberg and Lam. Proe.Nati. Acad. Sei., USA, Vol. 76, nr. 3, sider 1218 - 1222 , april 1979) ;

(2) enzymatisk depolymerisering (US patent 3.766.167, Laskar et al, under anvendelse av heparinase); (3) kjemisk depolymerisering (basekatalysert depolymerisering: Hirano et al, Connective Tissue Research, 1975, Vol. 3, sider 73 - 79, og salpetersyrlingdepolymerisering: Shively and Conrad, Biochemistry, Vol. 15, nr. 18 (1976) sider 3932 - 3942 og andre angitt deri; også Rosenberg og Rosenberg, ibid.). Imidlertid har ingen av de foregående metoder resultert i et praktisk produkt (og ingen gir noe løfte om dette). Således har den fysikalske fraksjonering og enzymatiske depolymerisering av naturlig heparin, (1) og (2) vært meget vanske-lige og har bare resultert i meget små mengder produkt. Disse kunne aldri gjøres tilgjengelige for offentligheten da den nødvendige bearbeidelse ville føre til en hundrefold økning i omkostningene sammenlignet med USP heparin. De kjemiske depolymeriseringsprosesser (3) har bare ført til produkter med meget lav midlere molekylvekt (f.eks. i området 1000 dalton eller lavere) som ikke har noen signifikant antitrombotisk aktivitet. Foreliggende oppfinnelse angår kjemisk partielt depolymerisert heparin med (1) en vektmidlere molekylvekt på fra 2000 til 7000 dalton, bestemt ved HPLC (høytrykksvæskekromato-grafi, som senere beskrevet) under anvendelse av 1,5 molar vandig natriumklorid som den mobile fase og dextraner som standard,

(2) en polydispersitet (D) på mindre enn 2.5, og

(3) analyserbare reduserende endegrupper av hvilke hoveddelen er anhydromannosegrupper, dvs.

Dette produkt er kjemisk entydig og viser seg å ha et forbedret forhold mellom antitrombotisk og hæmorrhagisk aktivitet sammenlignet med standard heparin. Dette demonstreres uttrykt ved en øket terapeutisk indeks som vil bli vist senere. Det kan administreres på samme måte som USP heparin. dvs. vanligvis intravenøst eller subcutant. Det fremstilles av naturlig heparin (vanligvis anvendes kommersielt USP heparin eller de ts ekvivalent som utgangsmateriale) med utmerkede utbytter (dvs. opp til kvantitativt). Den preparative prosess som omfatter regulert partiell depolymerisering av heparin med salpetersyrling representerer bare en minimal ytterligere omkostning sammenlignet med USP heparin. Det gir direkte et produkt med et overraskende snevert molekylvektområ-de som ikke krever ytterligere fraksjonering (dvs. med polydispersitet, D, under ca. 2,5 som tidligere angitt).

Også innbefattet er en metode for inhibering av koagu-leringenav blod (dvs. for behandling av omfanget av etablerte venøse og arterielle tromber og for forhindring av dannelsen av tromber) som omfatter blanding av et partielt depolymerisert heparin som ovenfor definert med blod.

Verdiene erholdt for molekylvektene av polymerene iføl-ge oppfinnelsen (og av naturlig forekommende heparin og andre kjemiske og fysikalske variasjoner derav) varierer til en viss grad med den bestemte testmetode som anvendes, og det er derfor nødvendig ved henvisning til testresultater, områder for verdier, etc. å spesifisere metoden (og også testbetin-gelsene). Høytrykksvæskekromatografimetoden beskrevet av Petracek og Sugisaka i Federation Proceedings, vol. 36, nr. 1, januar 1977, sider 89 - 92, er blitt funnet å være særlig på-litelig for bestemmelse av molékylvekter av polymerene, ifølge oppfinnelsen og er derfor blitt tilpasset her (hyppig angitt enkelt som HPLC).

Både 0,5 molar vandig natriumsulfat og 1,5 molar vandig natriumklorid har vært anvendt som den mobile fase for utfør-else av HPLC molekylvektbestemmelser, og andre salter og andre konsentrasjoner kan også anvendes. Selvom de absolutte verdier erholdt ved disse to systemer varierer, er der et bestemt forhold mellom dem, og en målt verdi i et system kan lett omdannes til det annet. Det 1,5 molare natriumklorid- systera foretrekkes fortiden. Selvom det er tilbøyelig til å være korrosivt for utstyr som kommer i kontakt med dette, har man funnet at omhyggelig utelukkelse av luft og andre oxyderende midler fra kontakt med systemet vil unngå dette problem.

Tre komplementære testverdier, alle basert på HPLC data (alle vel kjent for fagmannen) anvendes. Den første, tbpp-retensjonstid-molekylvekt, bestemmes hurtig og lett som de data som utvikles og anvendes hensiktsmessig ved overvåkning og/eller regulering av forløpet av depolymeriseringsreaksjonen. De andre, vektmidlere molekylvekt og antallsmidlere molekylvekt, tar lengere tid å beregne, men kan anvendes for å gi en mer meningsfull karakterisering av det polymere produkt.' Således er vektmidlere molekylvekt kanskje den beste enkle verdi for molekylvekten av en polymerprøve, og forholdet mellom vektmidlere molekylvekt og antallsmidlere molekylvekt, hensiktsmessig angitt som polydispersitet (D), er et génerelt anerkjent mål for den totale skarphet eller bredde for området av molekylvektene av polymerkjedene deri.

Den vektmidlere molekylvekt for kommersielt (USP) heparin som bestemt ved de forskjellige tilgjengelige analytiske metoder er angitt å ligge mellom 10000 og 25000 dalton. I motsetning til dette har produktene ifølge oppfinnelsen vektmidlere molekylvekter mellom 2000 og 7000 dalton, og vanligvis har 90 vekt% av polymerkjedene deri molekylvekter mindre enn 15000 dalton (alle ved HPLC under anvendelse av 1,5 molar vandig natriumklorid som den mobile fase og dextraner som standarden). Produktene ifølge oppfinnelsen med en vektmidlere molekylvekt på 4000 eller mindre er foretrukne på grunn av sine høyere terapeutiske indeks (den terapeutiske indeks her er forholdet mellom X aaktiviteten og ^ USP aktiviteten, som diskutert på neste side). Produktene ifølge oppfinnelsen med vektmidlere molekylvekter større enn 4000 danner en annen gruppe av produkter som er foretrukne på grunn av sin høyere spesifikke antitrombotiske aktivitet (høyere XSlaktivitet).

De analyserbare reduserbare endegrupper av de polymere kjeder av produktene ifølge oppfinnelsen resulterer av den partielle depolymeriseringsprosess, og består hovedsakelig av anhydromannose (dvs. 2,5-anhydromannose), iduronsyre og glu- curonsyregrupper (kommersielt USP heparin inneholder ingen slike endegruppedeler). Vanligvis er 51 - 90 % av disse grupper anhydromanhose. Selvom foreliggende oppfinnelse på ingen måte er begrenset av dette, kan følgende forklaring på nærvær av,disse grupper i produktene ifølge oppfinnelsen fo-reslåes.

Heparin er et carbohydrat og det er vel kjent at indi-viduelle carbohydratpolymerkjeder ikke inneholder mer enn én endegruppe som kan analyseres, dvs. den såkaldte reduserende endegruppe. Salpetersyrling er antatt å bryte heparinkjedene ved glycosidbindinger mellom N-sulfaterte glucosaminrester og uronsyregrupper deri (Rosenberg og Rosenberg, ibid., side 29). Ved den partielle nedbrytningsreaksjon ifølge oppfinnelsen

brytes bare noen av disse bindinger, og en slik kjedebrytning resulterer vanligvis i dannelsen av en analyserbar anhydro-mannosegruppe, selvom dannelse av andre endegrupper er blitt rapportert under visse betingelser (Shively og Conrad, ibid.).

Mengden av hver av disse typer endegrupper i polymerene ifølge oppfinnelsen (som hensiktsmessig kan angis i nanomol pr. milligram prøve) bestemmes ved følgende generelle prosedyre (også beskrevet av Shively og Conrad, Biochemistry

(1976), 15, 3932)

En oppløsning med kjent konsentrasjon av en heparinprø-ve som skal analyseres, fremstilles. En prøve av oppløsnin-gen reduseres med tritium-merket natriumborhydrid for å inn-føre en tritium-merket selektivitet i de tilgjengelige reduserende endegrupper i prøven. Efter destruksjon av overskudd av natriumborhydrid hydrolyser.es prøven med 1 normal svovelsyre og behandles med salpetersyrling for å omdanne den mer-kede reduserende endegruppe til en blanding av anhydromannitol, beta-l-glucoronosy1 anhydromannitol og alfa-l-idurono-syl anhydromannitol, hvor alle er merket med tritium, i an-hydromannitolresten. Disse separeres på papirkromatogrammer, og tritiummengden i de tre komponenter måles i en scintilla-sjonsteller under anvendelse av<14>C-glucose som indre standard. Av det totale tritium i disse tre produkter beregnes den molare mengde anhydromannose ved de reduserende ender. Uronsy- reendegruppene holdes i et separat kromatografisk system hvori 1-gulitolet (fra 1-glucuronsyre) og 1-idonitol (fra 1-iduronsyre) er fraskilt.

Den efterfølgende oversikt beskriver mer spesifikt rea-gensmengdq.r og de anvendte betingelser.

De vektmidlere molekylvekter for polymerene ifølge oppfinnelsen kan også beregnes direkte fra deres totale ende-gruppeanalyser (ved å anta at der er en enkel analyserbar endegruppe pr. polymerkjede). Ved anvendelse av denne metode ble de vektmidlere molekylvekter for polymerene ifølge eksempler 1-5 beregnet til å være fra 5400 til 6400 dalton. Det sammenlignbare område for molekylvekter målt ved HPLC metoden (på samme polymerer under anvendelse av 1,5 molar natriumklorid som den mobile fase) er 4600 - 5700 dalton, og ultra-sentrifugeringsanalyser indikerer molekylvekter i området 4800 - 6100 dalton.

Bortsett fra. sine endegrupper inneholder polymerene ifølge oppfinnelsen de samme monosaccharidenheter som naturlig forekommende heparin av hvilke de er fremstilt.

Som tidligere angitt synes produktet ifølge oppfinnelsen å ha en øket terapeutisk indeks sammenlignet med standard heparin.'"' Denne terapeutiske indeks er forholdet mellom to velkjente in vi tro antikoagulerende prosedyrer: Y.^eller anti-faktor X a prøven (som er beskrevet av Yin et al, J. Lab. Clin. Med., Vol. 81, nr. 2, februar 1973, sider 298 - 310) og USP prøven, det offisielt aksepterte kriterium for bestemmelse av styrken av kommersielt heparin som vanligvis foreskrives for forhindring og behandling av tromboser (beskrevet i United States Pharmacopeia XIX, sider 229 - 230). Andre arbeider innen området (Barrowcliffe, T. X., Johnson, E.A., Eggleton, C.A., Kemball-Cook, G. og Thomas, D.P., Anticoagulant Activitiesbf High and Low Molecular Weight Fractions, British Journal o- Haematology, 1979, 41, 573 - 583) har fore-slått at X2aktiviteten av heparinprøver korrelerer med deres profylakse av venøs trombose. På den annen side gir USP prø-ven et bredt mål for alle antikoagulerende effekter (dvs. innbefattende hæmorrhagisk såvel som antitrombotisk effekt). Selv om ingen in vitro prosedyre er tilgjengelig som måler enteri den antitrombotiske eller'den hæmorrhagiske egenskap alene er det således antatt at forholdet mellom X clog USP aktiviteten gir et meningsfullt antitrombotisk/hæmorrhagisk terapeutisk indeks.

For å oppnå, mer pålitelige og reproduserbare resultater utføres X aog UPS prøvene på produktene ifølge oppfinnelsen side ved side méd en kommersiell USP heparinkontroll. Den sistnevnte er blitt vurdert av United States Pharmacopeia med hensyn,, til sin USP prøve (styrke), og dets Xg og USP prø-ver er vanligvis definert som å være lik. Således korrigeres mindre daglige variasjoner i testene ved henvisning til den anslåtte verdi for heparinstandarden.

Produktene ifølge oppfinnelsen har vanligvis X ciakti-vitet på minst 100 IU (International Units) pr. milligram, og USP aktivitet på fra 30 til 60 IU pr. milligram sammenlignet med standard USP heparinkontroll. Forholdet mellom Xa'aktivitet og USP aktivitet for produktene ifølge oppfinnelsen er fortrinnsvis minst 3:1, og fortrinnsvis minst 3.5:1, sammenlignet med forholdet 1:1 for kommersielt USP heparin. Dette forhold angis her som den terapeutiske indeks.

En unntagelse fra den foregående er de produkter ifølge oppfinnelsen som har vektmidlere molekylvekter under 3500 (spesielt 3300 og lavere) bestemt ved HPLC under anvendelse av 1,5 molar natriumklorid som den mobile fase, hvori USP aktiviteten og X claktiviteten begge faller. Imidlertid faller USP aktiviteten hurtigere med molekylvekten enn X^ aktiviteten, med det resultat at disse lavmolekylære produkter har lavere styrke, men betydelig høyere terapeutisk indeks. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen omfatter omsetning av et heparinsalt med fra 5 til 100 ml av en vandig salpeter-syrlingoppløsning pr. gram heparinsalt, hvor den vandige oppløsning inneholder fra 5 til 80 mg salpetersyrling pr. gram heparinsalt under regulerte temperaturbetingelser i området fra 0 til 30°C og pH innen området fra 1,5 til 4, inntil heparinet er partielt depolymerisert til et produkt som har (1) en vektmidlere molekylvekt på.fra 2000 til 7000 dalton, bestemt ved HPLC under anvendelse av 1,5 molar vandig natriumklorid som den mobile fase og dextraner som standard, (2) polydispersitet (D) på mindre enn 2.5., og (3) analyserbare reduserende endegrupper hvor hoveddelen er

anhydromannosegrupper,

hvorefter depolymerisasjonsreaksjonen avsluttes, og det partielt depolymeriserte produkt gjenvinnes.

Reaksjonen kan utføres og avsluttes på to måter:

a. fullstendig forbruk av salpetersyrlingen (dvs. ved å be-grense mengden av salpetersyrling i begynnelsestilsetnin-gen slik at den er akkurat tilstrekkelig til å bringe de-polymerisasjonsreaksjohen til det ønskede punkt), eller

b. tilsette et moderat overskudd av salpetersyrling og avslutte reaksjonen (vanligvis ved å justere pH til 7 eller høyere) når „den ønskede polymerisasjonsgrad er oppnådd.

Den totale mengde av salpetersyrling (nitrit) tilsatt pr. gram heparin er spesielt viktig ia., da et overskudd vil nedbryte heparinet under dannelse av monomerer og oligomerer uten noen signifikant antikoagulerende aktivitet.

Den nødvendige mengde kan imidlertid ikke enkelt beregnes fra støkiometrien for blandingen, da bare endel av den tilsatte .salpetersyrling virkelig vil reagere med heparinet. Resten, f.eks. opp til 80 % eller mer av den tilsatte mengde tapes ved-,'spaltning eller ved at den ganske enkelt forlater reaksjonsblandingen. Reaksjonstemperaturen, pH og konsentrasjonen av salpetersyrlingen i den vandige oppløsning er alle viktige faktorer ved anvendelse av salpetersyrlingen og må omhyggelig reguleres og balanseres (hvilket vil bli diskutert senere). Mengden av salpetersyrling som er nødvendig for et gitt sett av betingelser bestemmes lett empirisk, eksempelvis ved å variere mengden av salpetersyrling i flere prøver hvori "de andre betingelser holdes konstant, og måle molekylvektene på de resulterende produkter.

Reaksjonen kan hensiktsmessig overvåkes ved analysering av forsvinningen av nitrit. Alternativt kan toppretensjonstid

-molekylvekt overvåkes eftersom reaksjonen forløper, og reaksjonen stoppes når tilnærmet denønskede molekylvekt er nådd. Det er funnet at toppretensjonstid-molekylvektene for disse

polymerer vanligvis er inntil 20 % mindre enn deres vektmidlere molekylvekt (vanligvis innen 10 %). Reaksjonen i metode b. avsluttes derfor vanligvis når en toppretensjonstid ca. 10 % over den ønskede vektmidlere molekylvekt er nådd (dvs. ved ca. 2000 - 8000 dalton).

Utgangsmaterialet for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan være hvilket som helst tilgjengelig heparin. Kommersielt USP heparin i seg selv, enten fremstilt av griseslim- hinne eller av kveglunge, er spesielt egnet. Vanligvis utnyt-tes forløperen i form av et salt, hensiktsmessig et alkalimetall eller jordalkalimetallsalt. USP heparin er generelt mest tilgjengelig som natriumsaltet, selvom kalsiumheparin også selges i enkelte land. Det bestemte salt som anvendes er ikke blitt funnet å betydelig påvirke prosessens forløp eller produktets kvalitet erholdt derfra.

Heparinsaltet kan tilsettes til det vandige medium enten før eller efter en reagenssyre (som etablerer den ønskede pH). Salpetersyrlingen dannes hensiktsmessig in situ ved tilsetning av en vandig oppløsning av et metallnitrit, f.eks. et alkalimetallnitrit slik som natriumnitrit, til den vandige syreoppløsning inneholdende heparinet (mengden av tilsatt metallnitrit justeres for å gi en 0,01 - 1 vekt%'s vandig opp-løsning av salpetersyrling). Normalt anvendes ca. 5 - 100 ml av den vandige salpetersyrlingoppløsning pr. gram heparin, hvor ca. 10 ml oppløsning pr. gram heparin er særlig foretrukket.

Det vandige reaksjonssystems temperatur opprettholdes ved et nivå hvor det forblir væskeformig (generelt ikke under -5°C , og vanligvis ved eller over 0°G). På den annen side er reaksjonshastigheten uønsket høy, og der er fare for pro-duktforringelse ved temperaturer over ca. 30°C.

Reaksjonen er relativt følsom for forandringer i pH (forløper f.eks. fullstendig i løpet av så kort tid som 5-10 minutter ved pH 1,5 og krever så meget som 10 - 18 timer ved pH 4). Ved balansering av faktorene for unødvendig lange re-aksjonstider med dem hvor man taper kontroll med reaksjonen og får uønsket nedbrytning av produktet, er man kommet frem til at det er fordelaktig å arbeide innen området pH 1,5-4.

pH opprettholdes i det ønskede område ved hjelp av en reagenssyre som ikke skal være så sterk eller så konsentrert at den vil reagere med heparin, men fortrinnsvis•ubetydelig sterkere enn salpetersyrlingen. I tillegg skal reagenssyren være istand til lett å kunne fjernes fra blandingen. Foretrukne er alkansyrer med 1-4 carbonatomer, og særlig foretrukket er eddiksyre. Andre syrer, spesielt uorganiske syrer slik sem fortynnet salt-syre eller svovelsyre kan imidlertid også anvendes.

Konsentrasjonen av salpetersyrlingen holdes fortrinnsvis innen området for heparinet som skal depolymeriseres i den vandige oppløsning. Lavere konsentrasjoner er ikke for-delaktige på grunn av de store væskevolumer som må håndteres. Høyere konsentrasjoner kan anvendes, men kan føre til lokali-serte uønskede bireaksjoner.

Vanligvis er 0,01 - 0,04 g salpetersyrling pr. gram heparin nødvendig for å bringe reaksjonen til det ønskede punkt selvom dette kan variere med forandringer i reaksjonsbetin-gelsene og avhengig til en viss "grad av produktets ønskede molekylvekt.. Den foretrukne temperatur er fra 15 til 30°C,

og det foretrukne pH område er 2,3 - 3,0. Den mest foretrukne pH er ca. 2,8. I en variasjon av prosessen kan reaksjonshastighetenøkes så meget som tre ganger ved å nedsette pH

fra 2,8 til 2,0. Dette utføres ved å anvende en større kon-sentrasjpn av reagenssyren i den vandige oppløsning av heparin (f.eks. ved å øke eddiksyrekonsentrasjonen fra 1 til 40%^.

For å avslutte depolymerisasjonsreaksjonen fullstendig fryses enten reaksjonsblandingen og lyofiliseres derefter, eller lyofiliseres umiddelbart. Lyofiliseringen fortsettes inntil produktet isoleres som et tørt pulver. Forsiktighet er nødvendig for å være sikker på at all syre er fjernet, for å forhindre gradvis spaltning av produktet. Produktet kan , også isoleres ved utfelling (efter justering av reaksjonsblan-dingens pH til 8 - 10) med e.t vannblandbart organisk oppløs-ningsmiddel av den type som anvendes som beskrevet innen faget for å isolere heparin (f.eks. aceton). Natriumklorid kan også innbefattes som et utfellingshjelpemiddel..

Produktet erholdes som et amorft hvitt pulver. Det er oppløselig i vann, da det erholdes som alkalimetall eller jordalkalimetallsalt. Som tidligere angitt er utbyttene av produkt fra denne prosess meget gode, varierende opp til praktisk talt kvantitative utbytter.

De efterfølgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

Prosentene i eksemplene er gitt på vektbasis, og molekylvektene er bestemt ved HPLC medmindre annet er angitt.

Eksempel 1

En prøve på 20 g heparin av handelskvalitet ble oppløst i 1 liter 1 vol%'s vandig eddiksyre. Til denne omrørte opp-løsning ble tilsatt 160 ml 0,4 %'s natriumnitritoppløsning. Efter omrøring ved ca. 20°C i 3 1/2 time ble oppløsningen fryst og derefter lyofilisert. Et utbytte på 19,8 g av et granulært hvitt fast materiale ble gjenvunnet. Den følgende informasjon ble erholdt vedrørende dette materiale: Molekylvektinformasjon (ved anvendelse av 1,5 M natriumklorid som bevegelig fase)

Eksempel 2

En prøve på 10 g av natriumheparin av handelskvalitet ble oppløst i 500 ml 1 vol%'s vandig eddiksyre. Til denne omrørte oppløsning ble tilsatt 80 ml 0,4 %'s natriumnitritoppløsning. Efter omrøring ved ca. 25°C i 3 1/2 time ble oppløsningen fryst og derefter lyofilisert. Et utbytte på 8,3 g av et dunaktig hvitt fast materiale ble gjenvunnet. Følgende informasjon ble erholdt vedrørende dette materiale:

Molekylvektinformasjon (ved anvendelse av 1,5 M natriumklorid som bevegelig fase) Biologisk informasjon

Analytisk informasjon

Kjernemagnetisk resonans spekter-analyse indikerte at ingen N-de-sulfatering hadde funnet sted, da

ingen topp var tilstede ved 62,5

ppm.

Eksempel 3

Under anvendelse av den prosedyre som er anvendt i eksempel 2 ble en 20 g1s prøve av natriumheparin partielt depolymerisert. Den følgende informasjon ble erholdt vedrørende det resulterende produkt: Molekylvektinformas jon (ved anvendelse av 1,5 M natrium klorid som bevegelig base) Analytisk informasjon . Kjernemagnetisk resonans spekter-analyse indikerte at ingen N-de-sulfatering hadde funnet sted, da ingen topp var tilstede ved 62,6 ppm.

Eksempel 4

Under anvendelse av den prosedyre, som er beskrevet i eksempel 2 ble en 20 g's prøve av natriumheparin partielt depolymerisert under dannelse av 18,5 g av et dunaktig hvitt fast produkt. Den følgende informasjon ble erholdt vedrørende dette materiale: Molekylvektinformasjon (ved anvendelse av 1,5 M natriumklorid som bevegelig fase)

Analytisk informasjon

Kjernemagnetisk resonans spekter-analyse indikerte at ingen N-de-sulfatering hadde funnet sted.

Eksempel 5

Under anvendelse av den prosedyre som er anvendt i eksempel 2 ble en 50 g's prøve av natriumheparin partielt depolymerisert under dannelse av 46,6 g dunaktig hvitt fast produkt. Den følgende informasjon ble erholdt vedrørende dette materiale:

Molekylvektinformasjon (ved anvendelse av 1,5 M natriumklorid som den bevegelige fase)

Eksempel 6

Produktene fra eksempler 1-5 ble analysert med hensyn til tilstedeværende reduserende endegrupper. Resultatene er vist i tabell I:

De vektmidlere molekylvekter av produktene ifølge eksempler 1-5 varierte fra 5400 til 6400 beregnet fra totalen av endegruppeanalysene.

Eksempel 7

Anvendelsen av prosessen ifølge oppfinnelsen hvori ende-punktet for depolymerisasjonsreaksjonen bestemmes av forsvinningen av salpetersyrlingen.

En prøve på 5 g natriumheparin av handelskvalitet ble oppløst i 250 ml 40 vol%'s vandig eddiksyre. Til denne omrør-te oppløsning ble tilsatt 20 ml 0,4 %'s vandig natriumnitrit-oppløsning. Oppløsningens pH var 1,8. Oppløsningen ble omrørt ved 20°C i 18 timer og derefter lyofilisert. USP styrken av det resulterende faste materiale er 43 enheter/mg, dets vektmidlere molekylvekt er 6600 dalton i 0,5 M natriumsulfatopp-løsning og 5500 dalton (anslått) i 1,5 M natriumklorid.

Den foregående prosedyre ble fulgt i to ytterligere for-søk med den unntagelse at volumet på den 0,4 %'s vandige natri-umnitritoppløsning ble variert. Resultatene er vist i tabell II, og hvor det foregående forsøk (forsøk A) er innbefattet

■

for sammenlignings skyld.

Hvert av de foregående produkter er innen oppfinnelsens ramme, dvs. de har en polydispersitet på mindre enn 2,5 og analyserbare reduserende endegrupper hvorav majoriteten er anhydromannosegrupper.

Eksempel 8

Anvendelsen av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen hvori det endelige endepunkt for depolymerisasjonen bestemmes ved forsvinningen av salpetersyrling, men som viser at prosessen kan stoppes ved mellomliggende punkter om ønsket, under dannelse av produkt med høyere molekylvekt.

En'prøve på 5 g natriumheparin av handelskvalitet ble oppløst i 250 ml 5 vol%'s vandig eddiksyre. Til denne omrør-te oppløsning ble tilsatt 40 ml 0,4 %'s natriumnitritoppløs-,ning. Denne oppløsnings pH er 2,5. Oppløsningen ble omrørt ved 20°C. Prøver på 25 ml ble fjernet periodevis som vist i den efterfølgende tabell III, fryst, derefter lyofilisert. USP styrkene og vektmidlere molekylvekter i 0,5 M natrium-sulfatoppløsning og den anslåtte vektmidlere molekylvekt i 1,5 M natriumklorid for disse forsøk er som følger:

I et lignende forsøk ble en prøve på 5 g heparin av handelskvalitet oppløst i 250 ml 1 vol%'s vandig eddiksyre. Til denne omrørte oppløsning ble tilsatt 40 ml 0,4 %'s vandig natriumnitritoppløsning. Denne oppløsnings pH var 2,8. Opp-løsningen ble omrørt ved 20°C. Prøver på 50 ml ble fjernet periodevis som i de foregående forsøk, fryst og derefter lyofilisert. Den sluttelige prøve er balansen av reaksjonsblandingen. De erholdte resultater (som i de foregående for-søk) fra disse forsøk er vist i tabell IV.

Det er således klart at reaksjonen kan følges og stoppes ved det ønskede punkt. Produktene fra forsøk A - D og H - I er innen oppfinnelsens ramme, dvs. som har polydispersitet på mindre enn 2,5 og analyserbare reduserende endegrupper hvorav majoriteten er anhydromannosegrupper.

Eksempel 9

Anvendelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen hvori depolymerisasjonsreaksjonen avsluttes når den ønskede grad av depolymerisering er blitt oppnådd. 10 g UPS heparin ble oppløst i 100 ml vann og avkjølt til 5°C, og en oppløsning av 160 mg natriumnitrit i 1,6 ml vann ble tilsatt. pH ble justert til 2.8, og reaksjonsblandingen omrørt uten ytterligere avkjøling i 1 1/2 time. Tem-peraturen efter endt reaksjon var 18°C. Reaksjonen ble avsluttet ved justering av pH til 8 under anvendelse av 4N na-triumhydroxyd. Det partielt depolymeriserte heparin ble isolert ved tilsetning av 1,2 g natriumklorid efterfulgt av 250 ml aceton. En sirupaktig olje utskiltes ved 0°C. Denne ble gjenvunnet ved dekantering av det klare øvre lag. Ved tritu-rering med methanol ble 10,1 g fast hvitt heparin gjenvunnet, med en USP styrke på 41 enheter/mg og en toppretensjonstid-molekylvekt på 6000 dalton (under anvendelse av 1,5 M natrium-;klorid som den bevegelige fase).

Den foregående prosedyre ble anvendt i to ytterligere forsøk med den unntagelse at natriumnitritmengden varierte. Resultatene er vist i tabell V, hvor det foregående forsøk (A) er innbefattet for sammenlignings skyld.

Disse produkter (forsøk A, B og C i tabell V) har alle polydispersiteter mindre enn 2,5 og analyserbare reduserbare endegrupper hvori en majoritet er anhydromannose.

Eksempel 10

Utførelse av depolymeriseringen av en prøve av USP heparin til fullførelse under anvendelse av prosedyren ifølge oppfinnelsen med anvendelse av et overskudd av salpetersyrling .

1 g USP heparin ble oppløst i 10 ml vann og avkjølt til -5°C, og en oppløsning på 2,3 g bariumnitrit (10 mmol) og 0,98 g svovelsyre (10 mmol) i 40 ml vann ble tilsatt (den sistnevnte oppløsning var også ved -5°C). Reaksjonsblandingen ble omrørt uten ytterligere avkjøling i 1 time. Reaksjonen ble avsluttet ved nøytralisering med natriumcarbonat, og depolymerisert heparinprodukt ble isolert ved lyofilisering. Produktet var 1,7 g av et lyst gult pulver med en vektmidlere molekylvekt på 1000 og en antallsmidlere molekylvekt på 900 (under anvendelse av 1,5 M' natriumklorid som den bevegelige fase).

Det ble ikke funnet å ha noen X clstyrke, og ingen USP styrke.

>

Claims (9)

1. Kjemisk partielt depolymerisert heparinprodukt, karakterisert ved at det har

(1) en vektmidlere molekylvekt på fra 2000 til 7000 dalton, bestemt ved HPLC under anvendelse av 1,5 molar vandig natriumklorid som den mobile fase og dextraner som standarden,

(2)i polydispersitet (D) på mindre enn 2.5, og

(3) analyserbare reduserende endegrupper hvorav en majoritet er anhydromannosegrupper.

2.. Heparinprodukt ifølge krav 1, karakterisert ved at.det .har en vektmidlere molekylvekt på 4000 eller mindre.

3. Heparinprodukt ifølge krav 1, karakterisert ved at det har en vektmidlere molekylvekt på større enn 4000.

4. Heparinprodukt ifølge krav 1, karakterisert ved at de analyserbare reduserende endegrupper er valgt fra anhydromannose, iduronsyre og glucuronsyre hvorav 51 - 90 % er anhydromannose.

5. Heparinprodukt ifølge krav 1, karakterisert ved at minst 90 vekt% har molekylvekt under 15000 dalton som bestemt ved HPLC under anvendelse av 1,5 molar vandig natriumklorid som den mobile fase og dextraner som standard.

6. Fremgangsmåte.ved fremstilling av et heparinprodukt ifølge krav 1, karakterisert ved at et heparinsalt omsettes med fra 5 til 100 ml av en vandig salpetersyr-lingoppløsning pr. g av heparinsaltet, idet den vandige opp-løsning holder fra 5 til 80 mg salpetersyrling pr. gram heparinsalt under regulerte temperaturbetingelser i området fra 0 til 30°C og pH i området fra 1,5 til 4, inntil heparinet er partielt depolymerisert til et produkt som har

(1) en vektmidlere molekylvekt på fra 2000 til 7000 dalton, som bestemt ved HPLC under anvendelse av 1,5 molar vandig natriumklorid som den mobile fase og dextraner som standard,

(2) en polydispersitet (D) på mindre enn 2.5, og

(3) analyserbare reduserende endegrupper hvorav majoriteten er anhydromannosegrupper, hvorpå depolymerisasjonsreaksjonen avsluttes og det partielt depolymeriserte produkt gjenvinnes.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at depolymerisasjonen utfø res i nærvær av en lavere al-kansyre.

8. Depolymerisasjonsprosess ifølge krav 6, karakterisert ved at depolymeriseringsreaksjonen avsluttes når toppretensjonstid/molekylvekten av heparinet når en ønsket verdi innen området 2500 - 8000 dalton når bestemt ved HPLC under anvendelse av 1,5 molar vandig natriumklorid som den mobile fase og dextranene som standard.

9. Metode for inhibering av koagulasjon av blod, karakterisert ved at et kjemisk partielt depolymerisert heparin ifølge krav 1 blandes med blod.