FI90090C - Foerfarande foer framstaellning av heparin med laog molekylvikt - Google Patents

Description

1 90090

Pienimolekyylipainoisen hepariinin valmistusmenetelmä

Esillä oleva keksintö koskee pienimolekyylipainoisen hepariinin (LMW-hepariinin) valmistusmenetelmää, jossa käytetään hepariinin entsymaattista depolymerointi a.

Tavanomainen hepariini on mukopolysakkaridi en heterogeeninen seos, joka kattaa molekyylipainoalueen 5000-50000 daltonia ja jonka lukukeskimääräinen molekyylipaino on noin 10-15000 dal-toni a.

Hepariini vaikuttaa suoraan tai epäsuorasti monien entsyymien toimintaan, erityisesti hyytymisjärjestelmän entsyymeihin.

Hepariinin vaikutuksiin vaikuttavat monet tekijät, kuten esimerkiksi toiminnallisten ryhmien jakaantuminen molekyylissä ja molekyylipaino. Täten on varmasti todettu, että viimeksi mainitulla seikalla on tärkeä osuus hepariinin aktiivisuudessa, erityisesti anti trombiini 111:n välittämässä trombiinin ja tekijä Xa:n inakti voitumisessa.

Anti trombiinin aktiivisuus edellyttää, että hepariinin vähim-mäismolekyylipaino vastaa noin 18 monosakkaridi a, esim. noin 5400 daltonia, kun taas antitekijä Xa:n aktiivisuus ilmenee hepariinimolekyylei 11ä, jotka ovat 5-6 sakkaridiyksikön suuruisia, kooltaan 1500-1800 daltonia.

Hepariinin molekyylipaino vaikuttaa voimakkaasti hepariinin muiden vaikutusten sarjaan, esimerkiksi antitromboottiseen tehoon (hepariinin oligosakkarideilla, jotka sisältävät mono-sakkarideja 18 tai sitä vähemmän, näyttää olevan heikko anti trombootti nen aktiivisuus), vaikutukseen, joka kohdistuu ADP:n indusoimaan trombosyyttien aggregaatioon, biologiseen hyväksikäytettävyyteen ihon alle suoritetun annostelun jälkeen, PF :n ja HRG:n inhiboitumiseen sekä aktiivisuuteen 4

2 9 0 G 9 O

sisäisen järjestelmän hyytyrnisentsyymeitä kohtaan, jotka entsyymit vastaavat tekijä Xa:n muodostumisesta.

Viime vuosina mielenkiinto on kohdistunut hepariinifragment-teihin tai -jakeisiin, joilla on korkea XaI/anti trombiiniak-tiivisuus ja joiden molekyylipaino on 4000 daltonista ylöspäin 6000 daltoniin saakka, koska sellaisilla aineilla on ilmoitettu olevan hyvä antitromboottinen teho ja samanaikaisesti vähän tai ei ollenkaan taipumusta aiheuttaa vuotokomp-likaatioita. Niiden biologinen hyväksikäytettävyys on myös kohonnut, eritysesti ihonalaisen annostelun jälkeen.

Koska hepariinin vaikutuksen seiektiivisyys korreloi molekyy-lipainon kanssa, on todennäköistä, että on olemassa suhteellisen kapea molekyylipainon alue, jolla hepariinin aktiivisuus on suotuisin.

Sen tähden menetelmä LMW-hepariinin valmistamiseksi, jolla hepariinilla on spesifinen, haluttu molekyylipaino ja kapea molekyylipainon jakauma, esimerkiksi vähäinen polydispergoi-tuminen, olisi edullinen.

Esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä tekee mahdolliseksi saada hepariinistä depolymerointi tuotteen mikä tahansa haluttu molekyylipainon alue.

LMW-hepariinia voidaan valmistaa alhaisin saannoin fraktioimalla tavanomaista hepariinia (DOS 2 944 792 ja 2 945 595). Melkein kaikki LMW-hepariinista valmistetaan kuitenkin hepariinin depolymeroinnin avulla, joka suoritetaan kemiallisin ja entsymaattisin menetelmin, minkä jälkeen suoritetaan frak-tiointi, jos se on tarpeen (vrt. A. Horner, Heparin, Kakkar, julkaisija Thomas, 1976, ja Periin et ai. Carbohydrate Res.

JJ3 185 (1971 ).

3 c>no9u

Hepariinin kemiallista depolymerointia kuvataan julkaistuissa EP-patenttihakemuksissa 0 037 319, 0 076 279 ja 0 014 184, US-patentissa 4 351 938 sekä GB-patentissa 2 002 406.

Entsymaattista depolymerointia kuvataan US-patentissa 3 766 167, GB-patentissa 2 002 406, julkaistussa EP-patentti-hakemuksessa 0 014 184 sekä EP-patentissa 4 396 762.

Pääasiallinen ongelma, joka on luonteenomainen kaikille erinä suoritetulle depolymerointimenetelmille, on polymerointi -reaktion pysäyttäminen oikean keskimääräisen molekyylipainon kohdalla. Ennen kaikkea, depolymerointireaktio antaa tulokseksi hepariinifragmentteja, jotka ovat pienempiä tai suurempia kuin haluttu molekyylipaino, vieläpä sivureaktioiden puuttuessa.

Hepariinin depolymerointiin käytetyissä, tunnetuissa depolymeroi nti reakti oi ssa , joissa käytetään epäorgaanisia depolymeroi nti reagensse ja {typpihappoa, vetyperoksidi a, jne.), ei ole mitään etusijaa käsiteltävän molekyylin koon tai pilkottavan sidoksen sijainnin suhteen molekyylin sisällä. R.J. Linhartd-tin et ai. mukaan, Biochem. Biophys. Acta 702 (1982) 197 -203, ei edes heparinaasientsyymi tee mitään eroa toimintatapansa suhteen, vaan se on satunnaisesti endolyyttinen.

Tämä tarkoittaa, että hepariinin jokaisen depolymerointiseok-sen polydispergoituminen kehittyy statistisesti ennustettavissa olevalla tavalla depolymerointi asteen funktiona. Erityisesti ajankohtana, jolloin keskimääräinen molekyylipaino on juuri halutun arvon yläpuolella, suurella osalla fragmentteja on haluttu molekyylipaino, mutta depolymeroinnin satunnaisen endolyyttisen luonteen vuoksi niillä on myös suhteellisesti suu rempi mahdollisuus depolymeroi tua edelleen, jolloin muodostuu fragmentteja, joiden koko on optimikoon alapuolella.

Eräpolymerointi pitäisi pysäyttää tänä ajankohtana.

4 ^ η G 90

Kuitenkaan ei tähän mennessä ole kehitetty tyydyttäviä menetelmiä hepariinin depolymeroinnin säätelemiseksi, niin että saadaan suuria saantoja ennalta määritettyä LMW-hepariini-valmistetta.

Esillä olevan keksinnön eräänä tarkoituksena on saada aikaan menetelmä heparinaasilla vettä sisältävässä väliaineessa suoritettavan hepariinin entsymaattisen depolymeroinnin säätelemiseksi. Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on edelleen saada aikaan menetelmä LMW-hepariinin valmistamiseksi, jolla hepariinilla on haluttu keskimääräinen molekyylipaino.

Esillä oleva keksintö koskee näin ollen menetelmää LMW-hepa-riinin valmistamiseksi, jossa menetelmässä hepariini depoly-meroidaan osittain heparinaasin avulla vettä sisältävässä väliaineessa, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että valon absorption lisäys, jonka saa aikaan tyydyttämättömien pilkkoutumis-LMW-tuotteiden muodostuminen heparinaasin vaikuttaessa hepariiniin, mitataan depolymerointireaktion aikana, reaktio pysäytetään kun absorption lisäys on saavuttanut arvon, joka vastaa haluttua lukukeskimääräistä molekyylipai-noa M„ sekä vastaavaa painokeskimääräistä molekyylipainoa M*,, ja LMW-hepariini otetaan talteen reaktioseoksesta.

Hepariinin depolymerointiseoksen keskimääräinen molekyyli-paino voidaan määrätä monilla tavoin, jotka perustuvat esimerkiksi GPC-HPLC:aan, viskositeettimittaukseen, vaionsiron-taan tai depolymerointimenetelmän aikana muodostuneiden toiminnallisten ryhmien kemialliseen tai fysikaalis-kemialli-seen määrittämiseen.

Useimmat mainituista menetelmistä, kuten esimerkiksi GPC-HPLC, ovat aikaa vieviä, eivätkä ne sovellu helposti suuressa mittakaavassa suoritettavaan valmistukseen ja itse asiassa pääosa tunnetuista menetelmistä, joita käytetään LMW-he-pariinin tuotantoon, perustuvat kokeellisiin menetelmiin, jotka ovat riippuvaisia lähtökoostumuksen ja reaktio-olosuh- s 90090 teiden huolellisesta säädöstä, jotta depolymerointireaktion päättyessä saadaan haluttu molekyylipaino. Kuitenkin, depo-lymerointireaktion aikana tapahtuvien väistämättömien muutosten, esimerkiksi entsyymiaktiivisuudessa tapahtuvien muutosten vuoksi lopputuotteen molekyylipaino voi vaihdella erästä toiseen ja tämä seikka tekee vaikeaksi saada tasaista tuotetta suurin saannoin.

Jos kunkin valmistuserän avulla on valmistettava tuotetta, jolla on oikea molekyylipaino, depolymerointireaktio täytyy pysäyttää välittömästi kun haluttu keskimääräinen molekyyli-paino on saavutettu depolymerointireaktioseoksessa. Tämä edellyttää, että keskimääräisen molekyylipainon muutosta täytyy seurata molekyylipainonmääritysmittauksin, joiden viiveaika on pieni tai joilla ei ole viiveaikaa.

Tähän mennessä ei ole käytössä mitään nopeaa, käytännöllistä menetelmää depolymerointireaktioseoksen (joka sisältää LMW-hepariinia) molekyylipainon määrittämiseksi. Esillä olevan keksinnön eräänä näkökohtana on antaa käyttöön sellainen menetelmä.

Hepariinin tai LMW-hepariinin keskimääräinen molekyylipaino voidaan ilmoittaa lukukeskimääräisenä molekyylipainona (M„) , esimerkiksi painona / moolien lukumäärä tai painokeskimää-räisenä molekyylipainona (M,,) tai käyrän huippua vastaavana molekyylipainona (Μ^ψ,*) . M*:a tai ^uip|)u:a käytetään tavallisesti luonnehtimaan hepariini- tai LMW-hepariinivalmis-.. . teitä.

. Kokeellisesti on varmistettu, että hepariinin tietyn depoly merointireaktioseoksen polydispergoituminen (D) , eli M* / M„, muuttuu säännöllisellä tavalla hepariinin entsymaattisen depolymerointireaktion kuluessa kuten on osoitettu kuvassa l.

6 C»009U

Esillä, oleva keksintö perustuu siihen, että on kehitetty nopea ja luotettava menetelmä M„:n määrittämiseksi heparinaa-silla suoritettavan hepariinin depolymeroinnin kuluessa.

Kuvan 1 esittäessä korrelaation Μ*:η ja M„:n välillä voidaan hepariinin depolymerointi LMW-hepariiniksi, jolla on tietty haluttu molekyylipaino M*, saavuttaa suorittamalla depolymerointi vastaavaan lukukeskimääräiseen molekyylipainoon M,,.

Entsymaattinen depolymerointireaktiomenetelmä, jossa käytetään heparinaasia, soveltuu spektrofotometriseen lukukeski-määräisen molekyylipa!non (MJ määrittämiseen, koska entsymaattinen menetelmä on poistava menetelmä, jossa muodostuu uusi pelkistävä pääteryhmä sekä yksi pääteryhmä, joka koostuu Δ4,5-tyydyttämättömän iduronihapon johdannaisesta, jolla on selvästi erotettava UV-abrorptio 230-235 rntussä. Linker ja Hovingh (Biochem. 11 (1972), 563-568) julkaisivat molaa-risen absorptiokertoimen monille LMW-hepariinifragmenteille, jotka olivat di-, tetra-, heksa- ja oligosakkarideja. Julkaistujen molaaristen absorptiokertoimien keskimääräinen arvo on 5500.

Yhtälö 1=1 + ΔΑ», (I)

Mn Mn,u C . € joka ilmaisee suhteen lukukeskimääräisen molekyylipainon (MJ ja absorption lisääntymisen välillä 235 nnussä, voidaan johtaa helposti. Kaavassa (1) ^ depolymeroidun valmisteen luku-keskimääräinen molekyylipaino, M„>u on hepariinisubstraatin lukukeskimääräinen molekyylipaino, c on substraatin konsent-raatio (g/1) , aA^j on absorption lisäys 235 nm:ssä ja e on molaarinen absorptiokerroin.

7 90090 M :n laskeminen on mahdollista, kun tunnetaan hepariini- substraatin (M ) M , substraatin konsentraatio (c, g/1 ) n. u n

sekä tyydyttyinä ttömi en tuotteiden absorpti okerroi n ja Λ A

23 5 mitataan.

Monissa kokeissa hepariini depolymeroitiin heparinaasi11 a, joka oli puhdistettu käyttämällä hydroksyy1iapatiittikroma -tografiaa Linkerin ja Hovinghin mukaisesti (Methods in Enzy-mology 28 (1972), 902-911).

Lukukeskimääräinen molekyy1ipaino M laskettiin käyttämällä n yhtälöä (1) sekä käyttämällä julkaistua arvoa ε * 5500, ja sitä verrattiin M :oon, joka oli määritetty GPC-HPLC:n avulla.

n

Siten havaittiin, että M :n laskettu arvo (M (ΔΑ)) erosi M :n n n n arvosta, joka oli saatu HPLC:a käyttämällä, aina 20 %:iin saakka.

Kaavan (1) uudelleenjärjestäminen muotoon iA235 ---'-Λ ,2) \ M M / \ n n, u / tekee mahdolliseksi laskea adsorption 1 isääntyminen ΔA, joka vastaa haluttua lukukeskimääräistä molekyylipainoa M .

n

Mutta kokeet osoittivat jälleen, että jos depolymerointi pysytettiin ΔΑ :n lasketussa arvossa, todellinen M , joka oli 235 n määritetty HPLC:11ä , oli huomattavasti korkeampi kuin haluttu M , jos käytettiin ε:η arvoa 5500, jonka Hovingh ja Linker n olivat määrittäneet.

Pääteltiin, että huono vastaavuus M (Δ A):n ja M (HPLC ):n vä- n n lilla aiheutui arvon ε = 5500 käytöstä.

Yhtälöin (1) uudelleenjärjestäminen muotoon 8 9 Π Ο ί. ϋ ΔΑ_„ .Μ .Μ ε = 235_η___η (3) c (Μ - Μ ) η, u η ilmaisee, että εvoidaan laskea käyttämällä tunnettuja c:n ja M :n arvoja sekä samanaikaisesti määritettyjä ΛΑ :n n,u 235 ja M (HPLC ):n arvoja, n Tällä tavalla saatiin ε:η arvo 7600, joka antoi monissa kokeissa hyvän korrelaation lasketun M (ΔΑ):n ja havaitun M:n(HPLC) välillä, n

Mahdollisuus laskea oikea M :n arvo helposti mitatun n AA :n perusteella on perusta kyseessä olevan keksinnön toteuttamiselle, jonka mukaisesti hepariinin eräpolymeroinnin annetaan tapahtua siihen saakka, kunnes ΔΑ :n laskettu 235 arvo saavutetaan, jolloin hepariinin depolymerointi keskeytetään ja reaktioseoksesta erotetaan halutut aineosat.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti käytetty heparinaasi valmistetaan sinänsä tunnetulla tavalla, kuten Hovingh ja Linker ovat kuvanneet (Methods in Enzymology 2j[ (1972 ), 902-911 ja J. Biol. Chem. 245 (1970), 6170-6175), viljelemällä Flavobacterium hepariumia hepariinia sisältävällä substraatilla, kokoamalla solut ja rikkomalla ne äänikäsitte-lyllä sekä puhdistamalla mm. hydroksiapatiiti 11 a suoritettavan kromatografian avulla. Hepariinin pilkkominen heparinaa-silla suoritetaan vettä sisältävässä väliaineessa, kuten esimerkiksi Hovingh ja Linker ovat kuvanneet (J. Biol. Chem.

240 (1965 ), 3724-3728). Kun depolymerointi seoksen haluttu Μη-arvo on saavutettu, heparinaasi inaktivoidaan tunnetuin keinoin, esimerkiksi alentamalla pH:a tai lyhyen lämpökäsittelyn avulla.

9 9 n o 9 o LMW-hepariinivai miste seostetaan sitten tunnetuin menetelmin, esimerkiksi aikoholisaostuksen avulla, ja puhdistetaan tunnetuin menetelmin, esimerkiksi valkaisemalla, sterii1isuodatuk-sella ja aikoholisaostuksei 1 a .

Absorption nousun lisääntyminen 230-235 nm:ssä, ΔΑ , joka _ ψ 235 vastaa valmisteen haluttua M :ä, lasketaan seuraavasti: w a) luetaan kuvasta 1 M , joka vastaa haluttua M :ä ja n w b) lasketaan M :a vastaava ΔΑ a):sta yllä esitetyn kaa- , n 235 van (2) avulla ja käyttämällä e:11 e arvoa 7600.

ΔΑ ^ mita*aan spektrofotometri11ä sen jälkeen, kun näyte on tehty happameksi, mieluummin pH < 2,5:k$i. On selvää, että UV-absorption nousu, jonka aiheuttaa tyydyttyinättömien hajoa-mi stuottei den muodostuminen heparinaasin vaikuttaessa hepa-riiniin, voidaan mitata muilla aallonpituuksilla kuin yllä on esitetty. Absorptiokerroin mitataan kuitenkin mieluummin 235 nm:ssä, koska sillä on maksiminsa tässä aallonpituudessa.

Depolymerointi pysäytetään, kun ΔΑ on saavuttanut laske- 235 tun arvon, jonka jälkeen LMW-hepariinivai miste seostetaan lisäämällä alkoholia (mieluummin 0,6-10 ti 1 av./ti 1 av.).

Hepariinin depolymerointireaktio suoritetaan mieluummin o 25-40 C:n lämpötilassa, pH 6-8:ssa. Vaikka kyseessä olevaa keksintöä valaistaan menetelmän avulla, jossa heparinaasia käytetään vapaassa muodossa, voidaan käyttää myös liikkumattomaksi tehtyä heparinaasia.

Esimerkki 1 valaisee näytteiden A:n ja ΔΑ:η mittausten avulla määritetyn M :n yhtäpitävyyttä HPLC-mittauksin saadun M:n kanssa (M (ΔΑ) suhteessa M (HPLC)-arvoon) hepariinin eräpo-n n lymeroinnin aikana.

10 9 π 0 ν ϋ

Esimerkki 1 2,5 g hepariinin natriumsuolaa, USP, M = 17300, M = 12400 daltonia, liuotettiin 25 ml:aan 0,l-moTaarista natriumase-taattia, 0,01-mol aarista kai siumasetaattia, pH 7,0.

Heparinaasia, 0,8 ml, 1500 yksikköä/ml , jonka spesifinen aktiivisuus oli 1050 yksikköä/mg, liuotettiin 25 ml:aan 0,1-mo-laarista natriumasetaattia.

Yhden heparinaasiyksikön Hovingh ja Linker määrittelevät julkaisussa Methods in Enzymol., 28^ (1972 ), 902-911 .

Hepariinisubstraatti ja entsyymi 1iuos sekoitettiin, ja seosta inkuboitiin varovaisesti sekoittaen vesihauteella, joka oli o termostoitu 30 C:een.

Näyte, joka otettiin välittömästi sekoittamisen jälkeen, laimennettiin 1,7-mol aari sei 1 a perkloorihapol1 a, jonka pH oli 2,5, se suodatettiin ja suodoksen absorptio mitattiin 235 nm:ssä.

Absorptiomittaus toistettiin useita kertoja, kuten on esitetty jäljempänä sijaitsevassa taulukossa, ja samanaikaisesti otettuja näytteitä kuumennettiin lyhyen aikaa kiehuvalla vesihauteella entsyymiaktiivisuuden tuhoamiseksi, näytteet jäähdytettiin, laimennettiin 5-kertaisesti 0,5-molaari sei 1 a natriumsulfaati11 a sekä suodatettiin ja analysoitiin GPC-HPLC-.llä.

GPC-HPLC-analyysi suoritettiin käyttämällä Watersin J-125-ja J-60-pylväitä peräkkäin ja eluenttina 0,5-molaarista natri umsulfaattia, 0,5 ml/min., eluointia tarkkailtiin taiteker-toimen määrityksen avulla, ja molekyylipaino laskettiin re-tentioajan mukaan käyttämällä ei suoraviivaista standardi käyrää, joka perustui dekstraani- ja hepariinifragmenttistandardeihin .

11 90090

Lukukeskimääräinen molekyy1ipaino M laskettiin yhtälöstä (1) käyttämällä hyväksi absorption nousua 235 nm:ssä,e * 7600, c = 50 ja M = 12400. n ,u

Tulokset esitetään alla sijaitsevassa taulukossa, ja kuten siitä voidaan nähdä, saatiin läheinen yhtäpitävyys lasketun ja lukukeskimääräisen molekyylipainon välille.

Taulukko 1

Aika A ΔΑ M (Δ A) M (HPLC) M (ΔΑ )/M (HPLC) 235 235 n n n n (tunteja) (daltonia) (daltonia) (ϊ) 0 4,5 0 - 1.0 28,83 24,33 6912 6750 102,4 2.0 47,67 43,17 5148 4661 110,4 3.0 63,43 58,93 4242 4261 99,6 3.5 70,03 65,53 3951 3863 102,3 4.0 77,5 73,00 3666 3830 95,7 4.5 83,2 78,7 3475 3565 97,5 5.5 94,4 89,9 3153 3145 100,3 22 242,5 238 1415 1405 100,7 101,1 + 4,4 (S.D. )

Esimerkki 2 Jäljempänä esitettyjen kokeiden tarkoituksena oli valmistaa LMW-hepariinia, jonka painokeskimääräinen molekyylipaino (M ) , w on 6500 +_ 500 daltonia.

Kuvan 1 perusteella lukukeskimääräinen molekyylipaino (M ), n joka vastaa M = 6500 daltonia, oli noin 3500 daltonia. w

12 S' Π o ;· O

Entsymaattista depolymerointi a varten valittiin viisi erilaista hepariinia (katso jäljempänä sijaitseva taulukko). Optisen tiheyden muutos 235 nmrssä (ΔΑ (laskettu)), joka 235 vastasi reaktioseoksen M :n arvoa 3500 daltonia (yhdessä ko- . n

keessa 3400 daltonia), laskettiin kullekin hepariinille yhtälöstä 2 käyttämällä konsentraation arvoa c = 50 mg/ml, ε = 7600 sekä kyseessä olevien hepariinierien M -arvoja (katso taulukko). n,U

Hepariinin entsymaattinen pilkkominen suoritettiin seuraavasti :

Hepariini liuotettiin konsentraationa 50 mg/ml 0,1-molaari- seen natriumasetaattipuskuriin pH 7,0, joka sisälsi vähäisiä määriä kalsiumia (0,0005 - 0,01 moolia). Liuos kuumennettiin o 30 C:een, ja heparinaasia lisättiin sellainen määrä, joka tarvittiin depolymeroimaan hepariini haluttuun M :n arvoon noin 48 tunnissa.

Optisen tiheyden muutos 235 nmrssä (ΛΑ ) mitattiin tois- 235 tuvasti reaktioseoksen näytteistä, sen jälkeen kun ne oli laimennettu 1,7-molaari sell a perkloorihapolla, pH 2,5. Kun ΔΑ oli yhtä suuri kuin ΔΑ (laskettu), entsymaatti-235 235 nen depolymerointi pysäytettiin.

Kun ΔΑ saavutti lasketun arvon, LMW-hepariinituote saos- bl}3 tettiin lisäämällä alkoholia ja depolymerointi tuote puhdistettiin tunnetuin menetelmin, esim. valkaisemalla, steriili-suodatuksen avulla sekä aikoholisaostuksel1 a. Viidestä itsenäisestä kokeesta saadut valmisteiden ominaisuudet esitetään alla seuraavassa taulukossa.

13 *'y n Ο Γ ϋ

Erä- Hepariinin Haluttu Käytetyn hepa-

Koe koko M tuot- M tuot- ΔΑ rinaasin määrä n,u n , 235 no teessä teessä (las- (NOVO-yksiköitä/ (g) (daltonia) (daltonia) kettu) g hepariinia) 1 1000 10100 3500 70,94 53 2 1000 12400 3500 77,93 65 3 1200 13900 3400 84,43 73 4 1000 11600 3500 75,81 60 5 1000 11200 3500 74,64 62

Lopullinen Tuotteen Tuotteen biolo- ΛΑ saanto % M M ginen aktiivi- 235 n w

Koe reaktioseok- (paino/ tuote- tuot- suus* no sessa paino) teessä teessä IU/mg (dalto- (dalto nia) n i a) 1 71,76 87,8 3690 6150 2 77,40 93,9 3840 6510 76 3 83,97 90,6 3710 6630 77 4 75,07 90,5 3660 6180 82 5 74,80 93,0 3610 6610 82 * Biologinen aktiivisuus amidolyyttisen antitekijä Xa:n määrityksessä, jossa käytetään vertai 1ustandardina ensimmäistä kansainvälistä LMW-hepariinistandardi a (National Institute for Biological Standards and Controls, London).

Edellä esitetystä käy ilmi, että lopullisten LMW-hepariin1- • valmisteiden painokeskimääräinen molekyylipaino (M ) on halu- w tulla alueella.

Claims (3)

14. o f G

1. Förfarande för framställning av LMW-heparin, vid vilket förfarande heparin depolymeriseras delvis med heparinas i ett vatten-innehällande medium, kännetecknat av att ökningen i 1jusabsorptionen förorsakad av bildning av omättade ned-brytnings-LMW-produkter under inverkan av heparinas pä heparin uppmätes under depolymerisationsreaktionen, reaktionen avstannas, när ökningen i absorptionen har uppnätt ett värde motsvarande den önskade talmedelmolekylvikten M„ och den mot-svarande viktmedelmolekylvikten M*, och LMW-heparin utvinnes frän reaktionsblandningen.

1. Menetelmä LMW-hepariinin valmistamiseksi, jossa menetelmässä hepariini osittain depolymeroidaan heparinaasilla vettä sisältävässä väliaineessa, tunnettu siitä, että va-lonabsorption lisäys, jonka saa aikaan tyydyttämättömien pilkkoutumis-LMW-tuotteiden muodostuminen heparinaasin vaikuttaessa hepariiniin, mitataan depolymerointireaktion aikana, reaktio pysäytetään kun absorption lisäys on saavuttanut arvon, joka vastaa haluttua lukukeskimääräistä molekyylipa!-noa M„ sekä vastaavaa painokeskimääräistä molekyylipainoa M*,, ja LMW-hepariini otetaan talteen reaktioseoksesta.

2. Förfarande enligt patentkravet l, kännetecknat av att ökningen i absorptionskoefficienten uppmätes vid 230-235 nm.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että absorptiokertoimen lisäys mitataan 230-235 nm:ssä.

3. Patenttivaatimuksen l mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että heparinaasia käytetään vapaassa muodossa.

3. Förfarande enligt patentkravet 1, kännetecknat av att heparinaset används i fri form.