DK162108B - Fremgangsmaade til fremstilling af lmw-heparin - Google Patents

Description

1 DK 162108 8

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til i fremstilling af lavmolekylær heparin (LMW-heparin) ved enzymatisk f

5 depolymerisering af heparin, hvilken fremgangsmåde er ejendomme- I

lig ved det i krav l's kendetegnende del angivne. j

Konventionel heparin er en heterogen blanding af muco-polysaccharider, der dækker et molekylvægtområde fra 5000 -50.000 dalton med en antalsmiddelmolekylvægt på ca. 10 - 14.000 10 dalton.

Heparin indvirker direkte eller indirekte på funktionen af adskillige proteiner, især enzymer fra koagulationskaskaden.

Adskillige faktorer, såsom fordelingen af funktionelle grupper i molekylet og molekylvægten, har indflydelse på effekten 15 af heparin. Det er således velkendt, at molekylvægten spiller en vigtig rolle med hensyn til heparinaktivitet, især inaktivering af thrombin og faktor Xa medieret af antithrombin III.

Antithrombinaktivitet kræver en mindsteheparinmole-kylvægt svarende til ca. 18 monosaccharider, d.v.s. en molekyl-20 vægt på ca. 5400 dalton, hvorimod anti faktor Xa aktivitet kan opnås med heparinmolekyler bestående af så få som 5-6 saccha-ridenheder svarende til en molekylvægt på 1500 - 1800 dalton.

En række andre effekter af heparin, f.eks. antithrombo-tisk effekt (heparinoligosaccharider indeholdende 18 monosaccha-25 rider eller mindre synes at have lav antithrombotisk aktivitet), indflydelse på ADP-induceret thrombocyt aggregering, biotilgængelighed efter subcutan indgift, inhibering med pladefaktor 4 (PF^) og histidinrig glycoprotein (HRG) (Thrombosis and Haemostasis 5S_ (1987), 190) såvel som aktivitet over for koaguleringsenzymer fra 30 det interne system, som er ansvarlig for dannelse af faktor Xa, påvirkes stærkt af heparins molekylvægt.

I de senere år har interessen samlet sig om heparin-fragmenter eller -fraktioner med et højt forhold mellem antifaktor Xa aktivitet og antithrombinaktivitet og med en molekylvægt 35 fra 4000 dalton til op imod 6000, da sådanne stoffer har vist sig

2 DK 162108 B

at have god antithrombotisk effekt og på samme tid ingen eller ringe tendens til at forårsage blødningskomplikationer. De udviser også forøget biotilgængelighed, især efter subkutan indgift.

Eftersom selektiviteten af heparinets virkning er 5 korreleret med molekylvægten, er det sandsynligt, at der er et relativt snævert molekylvægtområde indenfor hvilket, heparinakti-viteten er optimal.

En fremgangsmåde til fremstilling af LMW-heparin med en specifik, tilstræbt molekylvægt og en snæver molekylvægtforde-10 ling, d.v.s. lav polydispersitet ville derfor være fordelagtig.

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse muliggør opnåelse af et vilkårligt ønsket molekylvægtområde af et depolymeriseringsprodukt af heparin.

LMW-heparin kan fremstilles i lavt udbytte fra konven-15 tionel heparin ved fraktionering (DE offentliggørelsesskrift nr. 2.944.792 og nr. 2.945.595). Størstedelen af LMW-heparin fremstilles imidlertid ved depolymerisering af heparin enten ved kemiske eller enzymatiske fremgangsmåder eventuelt efterfulgt af fraktionering (jfr. A.A. Horner: Heparin, Chemistry and Clinical 20 Usage, V.V. Kakkar og D.P. Thomas (eds.) Academic Press (1976), side 37-48 og Perlin et al., Carbohydrate Research 18, (1971), 185-194.

Kemisk depolymerisering af heparin er beskrevet i offentliggjorte EP-patentansøgninger nr. 0037.319, 0076.279 og 25 0014.184, US patentskrift nr. 4.351.938 og GB patentskrift nr. 2.002.406.

Enzymatisk depolymerisering er beskrevet i US patentskrift nr. 3.766.167, GB patentskrift nr. 2.002.406, offentliggjort EP patentansøgning nr. 0014,184 og US patentskrift nr.

30 4.396.762.

Et væsentligt problem forbundet med alle de kendte batchdepolymeriseringsprocesser er at standse depolymeriserings-reaktionen ved den korrekte middelmolekylvægt. Ydermere resulterer depolymeriseringsreaktionen i heparinfragmenter med en 35 molekylvægt, der er mindre eller større end den ønskede, selv i mangel af sidereaktioner.

3 DK 162108 B

I de kendte depolymeriseringsprocesser til depolymeri-sering af heparin, hvor der anvendes uorganiske depolymerise-ringsreagenser (f.eks. salpetersyre og hydrogenperoxid), er der ingen præference med hensyn til størrelsen af det angrebne mole-5 kyle eller med hensyn til positionen indenfor molekylet af den binding, der spaltes. Ifølge R.J. Linhardt et al.,

Biochem.Biophys.Acta 702 (1982) 197-203 har heller ikke enzymet heparinase nogen præference, idet heparinasens virkemåde er endolytisk tilfældig.

10 Dette betyder, at polydispersiteten af en vilkårlig heparindepolymeriseringsblanding udvikles på en statistisk forudsigelig måde som en funktion af graden af depolymerisering. Især på det tidspunkt, hvor middelmolekylvægten er lige over den ønskede værdi, har en stor del af fragmenterne den ønskede molekyl-15 vægt. På grund af depolymeriseringens endolytisk tilfældige natur har fragmenterne imidlertid også en forholdsvis stor chance for at blive yderligere depolymeriseret til dannelse af fragmenter med en størrelse, der er mindre end ønsket.

Hvis der ønskes en mere snæver molekylvægtfordeling i 20 LMW-heparinproduktet, skal depolymeriseringsblandingen fraktioneres, hvorved fragmenter med en højere eller lavere molekylvægt end ønsket frasepareres og kasseres. Dette betyder udbyttetab og spild af det dyre heparinudgangsmateriale.

Et af formålene med den foreliggende opfindelse er at 25 tilvejebringe en fremgangsmåde, hvorved der opnås en snæver molekylvægtsfordeling i LMW-heparindepolymeriseringsblandingen uden udbyttetab og uden spild af udgangsmateriale.

Et LMW-heparinprodukt med en snæver molekylvægtsfordeling kan fås fra en kontinuert proces ved at fjerne fragmenter 30 med den ønskede molekylvægt, så snart de er dannet, for at forhindre yderligere depolymerisering. Dette kan gøres ved kontinuert fraktionering af depolymeriseringsreaktionsblandingen, efterhånden som depolymeriseringsprocessen skrider frem, ved filtrering med et selektivt filtermedium, der tillader molekyler 35 med den ønskede molekylvægt at passere, medens materiale med højere molekylvægt (inklusive enzymet) recirkuleres til yderligere depolymerisering.

4 DK 162108 B

Adskillige forsøg viste imidlertid, at' molekylvægten for heparinfragmenter, der er i stand til at passere et ultrafiltrer i ngsmembr an, er stærkt afhængig af heparinkoncentrationen i retentatet. Højere heparinkoncentration i retentatet gav højere 5 molekylvægt af fragmenterne i filtratet.

Også andre parametre, såsom den gennemsnitlige molekylvægt og polydispersitet af retentatet, pH, ionstyrke og indhold af organiske modifikatorer i reaktionsblandingen så vel som filtrets areal sammenlignet med produktudtaget havde indflydelse på 10 filtratets molekylvægtfordeling.

Dette betyder, at det ikke er muligt kun at forlade sig på filtermediets egenskaber for at sikre en konstant, ønsket molekylvægt af LMW-heparinprodukt i filtratet. Et stort antal parametre må holdes på konstante niveauer i retentatet (d.v.s. i 15 depolymeriseringsreaktionsblandingen) for at opnå et produktfiltrat med konstante, ønskede molekylvægtegenskaber, d.v.s. middelmolekylvægt og polydispersitet.

På grund af fjernelse af materiale ved filtrering under den kontinuerte depolymeriseringsreaktion ville det være 20 kompliceret at beregne, etablere og opretholde de nødvendige konstante betingelser eller en stabil tilstand i depolymerise-ringsreaktionsblandingen.

Ifølge den foreliggende opfindelse er dette problem løst ved kontinuert eller hyppig måling af afvigelser fra de 25 ønskede værdier af Mn og polydispersitet D i filtratet, hvorpå let kontrollerbare procesparametre i depolymeriseringsblandingen, især substratkoncentration, substrattilsætningshastighed, enzymaktivitet, reaktionstemperatur, trykfald over membranfiltret og retentatrecirkulationsstrømmen, ændres kontinuert eller hyppigt 30 for at formindske eller holde afvigelserne fra de ønskede værdier inden for fastsatte grænser.

Ved at anvende den hurtige lysabsorptionsmåling er det blevet påvist, at en stabil depolymerisering af heparin kan opnås og opretholdes i lang tid, og man fandt ud af, hvilke operations-35 parametre, der umiddelbart kan kontrolleres. Det har desuden vist

5 DK 162108 B

sig muligt at opnå en konstant snæver molekylvægtsfordeling i filtratet fra en kontinuert depolymerisering af heparin med heparinase.

Den foreliggende opfindelse vedrører således en frem- ! 5 gangsmåde til fremstilling af lavmolekylær heparin (LMW-heparin) ved enzymatisk depolymerisering af heparin, og denne fremgangsmåde er ejendommelig ved, at en vandig opløsning af heparin kontinuert sættes til en i reaktor indeholdende heparinase, i hvilken heparinet underkastes j 10 en enzymatisk depolymerisering; depolymeriseret heparinopløsning kontinuert fjernes fra reaktoren og underkastes en ultrafiltrering til fremstilling af et retentat og et filtrat; i det mindste en del af retentatet recirkuleres til 15 reaktoren og LMW-heparinproduktet opsamles fra filtratet; idet stigningen i lysabsorptionen af filtratet, som følge af dannelsen af umættede nedbrydningsprodukter, måles kontinuert eller hyppigt under hele processen, og antalsmiddelmole-20 kylvægten, Mn, og polydispersiteten, D, af filtratet bestemmes kontinuert eller hyppigt, fortrinsvis i en indledende fase indtil depolymeriseringsreaktion har stabiliseret sig på et stabilt niveau, og idet eventuelle afvigelser fra de ønskede værdier korrigeres ved at justere procesparametrene af den enzymatiske de-25 polymeriseringsreaktion.

Den foreliggende opfindelse skal yderlige illustreres under henvisning til tegningen, hvor fig. 1 viser arbejdsgangen i en foretrukket udførelsesform for den kontinuerte heparindepolymeriseringsproces, 30 fig. 2 viser HPLC målinger på forskellige fraktioner opsamlet i løbet af den kontinuerte depolymerisering ifølge eksempel 1, fig. 3 viser molekylvægten af forskellige fraktioner under den kontinuerte depolymerisering ifølge eksempel 2, og 35 fig. 4 viser resultatet af målinger af depolymeriserin- gen ifølge eksempel 3.

6 DK 162108 B

Middelmolekylvægten af heparin eller en LMW-heparin kan angives som antalsmiddelmolekylvægten (Mn), d.v.s. vægt/antal molekyler, eller som vægtmiddelmolekylvægt (M ) eller peak mole-kylvægt (Mpea^)· Mw eller Mpeak anvendes normalt til karakterise-5 ring af heparin eller LMW-heparinprodukter.

Molekylvægten af produktet kan bestemmes på forskellig måde, f.eks. ved gelpermeationskromatografi (GPC/HPLC) (N.

Sugisaka, F.J. Petracek: Rapid molecular size characterization of heparins by high pressure liquid chromatography. Fed.Proc. 3j5 10 (1), 89-92, 1977), lavvinkellaserlysspredning (LALLS) (D.

Leacacheux, R. Panams, G. Brigand, G. Martin: Molecular weight distribution of carrageenans by size exclusion chromatography and low angle laser light scattering. Carbohydrate Polymers _5, 423-440, 1985), lawinkelrøntgenstrålespredning (S.S. Stivala, M.

15 Herbst, O. Kratky, I. Pilz: Physico-chemical studies of fractionated bovine heparin V, Arch.Biochem.Biophys. 127, 795-802, 1968), viskositetsmålinger og ligevægtscentrifugering (S.E. Lasker, S.S. Stivala: Physiochemical studies of fractionated bovine heparin I. Arch.Biochem.Biophys. 115, 360 - 372, 1966), og 20 osmotiske trykmålinger og dialyseækvilibrering (K.E. van Holde: Physical. Biochemistry, sektion 2.3, p. 39 - 47. Prentice-Hall,

Inc., New Jersey, 1971). Imidlertid vil en foretrukket metode være en med minimal forsinkelse, såsom en spektrofotometrisk bestemmelse af funktionelle grupper opstået i depolymeriserings-25 processen;

Den enzymatiske depolymeriseringsproces med heparinase egner sig til en spektrophotometrisk antalsmiddelmolekylvægtsbestemmelse (Mn), fordi den enzymatiske proces er eliminativ og danner eri reducerende endegruppe og en endegruppe, der består af 30 et J\ 4,5 umættet-iduronsyrederivat med en distinkt UV-absorption ved 230-235 nm. Den molære absorptionskoefficient for et antal LMW-heparinfragmenter af di-, tetra-, hexa- og oligosaccharider er beskrevet af Linker og Hovingh (Biochem. 11 (1972), 563 -568). Gennemsnitsværdien af den publicerede molære absorptions-35 koefficient er 5500.

7 DK 162108 B

En ligning som 1_ = 1_ + ^A235 (1) Μ H c · £ n n,u ζ, der giver sammenhængen mellem antalsmiddelmolekylvægt (Μβ), og 5 stigningen i absorption ved 235 nm kan nemt udledes.

I formel (1) er antalsmiddelmolekylvægten af det depolymeriserede produkt, Mn er antalsmiddelmolekylvægten af heparinsubstratet, c er substratkoncentrationen (g/1), ΔΑ235 er stigningen i absorptionen ved 235 nm, og £ er den molære absorp-10 tionskoefficient.

Beregning af Mn er mulig, når Mn af heparinsubstratet (M ), substratkoncentration (c, g/1) og absorptionskoefficien-Π f u ten (£) af de umættede depolymeriseringsprodukter er kendt, og &&235 m^l-es· 15 I en række forsøg blev heparin depolymeriseret med heparinase delvist renset med hydroxylapatitkromatografi ifølge Linker og Hovingh (Methods in Enzymology 28 (1972), 902 - 911).

Antalsmiddelmolekylvægten Mn blev beregnet ved at anvende ligningen (1) og anvende den publicerede værdi 20 af £ = 5500 og blev sammenlignet med Mn bestemt ved GPC-HPLC.

Det blev imidlertid gentagne gange konstateret, at den beregnede værdi af Μ (M (AA)) varierede fra den værdi for M , der blev fundet med HPLC (M (HPLC)), med op til 20%.

25 Omarbejdning af (1) til ΛΑ235 = c ·£ (1 ~ 1 ) (2) Μ M n n,u 1 2 3 4 5 6 muliggør beregning af absorptionsstigningen ΔΑ235 svaren<3e til 2 en ønsket antalsmiddelmolekylvægt M . Men forsøg viste igen, at 3 hvis depolymeriseringen blev standset ved den beregnede værdi 4 af ΔΑ235/ var den faktiske Mn bestemt ved HPLC betydeligt højere 5 end den ønskede M , hvis værdien af C = 5500 fundet af Hovingh og 6

Linker blev anvendt.

8 DK 162108 B

Det blev derfor konkluderet, at den dårlige overensstemmelse mellem Μ (ΛΑ) og M (HPLC) skyldtes anvendelsen af η n værdien af 5500 for£ .

5 Omarbejdning af ligning (1) til S = ΔA235 Mn * Mn,u (3) c (M - M ) n,u n 10 viser, at £ kan beregnes ved at anvende kendte værdier for c og Mn u og samtidigt målte værdier for ΔΑ235 °9 Mn(HPLC).

På denne måde fandtes en værdi for £ = 7600, som gav en god overensstemmelse mellem beregnet og observeret Mn(HPLC) i 15 en række forsøg.

Skønt ligningen (1) gælder for en batch depolymerise-ringsproces, viste det sig, at Mn af produktfiltratet fra en kontinuert depolymeriseringsreaktion kan beregnes ved anvendelse af ligning (1) og en værdi af £ på 7600 forudsat, at systemet er 20 i eller tæt på en stabil tilstand. Afvigelser fra stabil tilstand formindsker nøjagtigheden af beregningen af Mr, men giver alligevel oplysning om i hvilken retning de nødvendige ændringer skal gå. I ligning (1) er M kendt, måles ved anvendelse af Π ψ U Z j j f.eks. et on-line spektrophotometer, og c kan findes ved måling 25 af brydningsindekset RI af filtratet ved anvendelse af en on-line kallibreret Ri-detektor eller ved måling af UV-absorption ved to forskellige bølgelængder, f.eks. 197 og 235 nm.

Da RI og måling giver næsten øjeblikkelig oplys ning om processens status, kan de nødvendige korrektioner af 30 procesparametrene udføres straks, når afvigelserne fra de ønskede værdier for molekylvægt eller polydispersitet iagttages.

Det er nærliggende for en fagmand, at tilvæksten i UV-absorption forårsaget af dannelse af umættede nedbrydningsprodukter ved heparinasepåvirkning af heparin kan måles ved andre 35 bølgelængder end 235 nm. Absorptionskoefficienten måles dog fortrinsvis ved 235 nm, da den har sit maksimum ved denne bølgelængde .

9 DK 162108 B

Depolymeriseringsreaktionen kan kontrolleres ved regulering af substrattilsætningshastigheden, substrattilsætningskoncentrationen i forhold til substratstrømningshastigheden og enzymaktiviteten. Ændringer i substrattilsætningshastigheden kan 5 opnås ved at ændre substratstrømmen eller substrattilsætningskoncentrationen eller begge. Ændringer i substrattilsætningskoncentrationen i forhold til substratstrømningshastigheden kan fås ved at ændre substrattilsætningskoncentrationen eller substratstrømningshastighed eller begge. Ved udtrykket substratstrømningshas-10 tighed forstås volumen substrat pr. tidsenhed (f.eks. liter/ti-me). Ved udtrykket substrattilsætningskoncentration forstås hepa-rinkoncentration i substrattilsætning til systemet (f.eks. mg/ml). Ved udtrykket substrattilsætningshastighed forstås vægt af heparin tilsat systemet per tidsenhed (f.eks. g/time). Sub-15 stratstrømningshastighed x substrattilsætningskoncentration = substrattilsætningshastighed.

Enzymaktiviteten kan øges ved tilsætning af enzym eller ved hævning af reaktionstemperaturen og kan mindskes ved at sænke reaktionstemperaturen eller ved at fjerne enzym fra reaktoren 20 (f.eks. hvis det er immobiliseret). Yderligere parametre, som kan anvendes til kontrol af depolymeriseringsreaktionen, er trykfaldet over membranfiltret eller retentatrecirkulationsstrømmen.

Ifølge den foreliggende opfindelse kan justeringerne af procesparametrene udføres som følger: 25 a) Hvis M af filtratet er højere end ønsket, kan substrattilsætningshastigheden mindskes ved formindskelse af substratstrømningshastigheden eller substrattilsætningskoncentrationen eller begge, eller enzymaktiviteten kan øges. Hvis er lavere end ønsket gælder det modsatte.

30 b) Hvis polydispersiteten af filtratet er højere end ønsket, kan substrattilsætningskoncentrationen i forhold til substratstrømningshastighed mindskes ved at mindske substrattilsætningskoncentrationen eller øge substratstrømningshastigheden eller begge. Hvis polydispersiteten er lavere end ønsket gælder 35 det modsatte.

10 DK 162108 B

c) Hvis Mn og polydispersiteten begge afviger fra de ønskede værdier, kan der foretages kombinationer af de ovenfor nævnte korrektioner.

Korrektionerne kan hensigtsmæssigt udføres som angivet 5 i de følgende eksempler, hvor eksempel 1 viser regulering af Mn alene, og eksempel 2 viser regulering af Mn og polydispersiteten i denne rækkefølge.

Den anvendte heparinase kan fremstilles på en i og for sig kendt måde som beskrevet af Hovingh og Linker (Methods in 10 Enzymology 28 (1972), 902 - 911 og J.Biol.Chem. 245 (1970), 6170 - 6175) ved dyrkning af Flavobacterium heparium på et heparin-holdigt substrat, høst og sprængning af cellerne og oprensning blandt andet ved kromatografi på hydroxyapatit.

LMW-heparinproduktet kan udfældes ved tilsætning af 15 alkohol (fortrinsvis 0,6 - 10 vol/vol), og det depolymeriserede produkt kan renses ved allerede kendte metoder, f.eks. blegning, sterilfiltrering og alkoholudfældning.

Heparindepolymeriseringsreaktionen udføres fortrinsvis ved en temperatur på 25 - 40°C og ved en pH-værdi på 6 - 8.

20 En heparinaseenhed defineres ifølge Hovingh og Linker (Methods in Enzymol., :28 (1972), 902 - 911).

For at sikre en hurtig tilbagemeldingskontrol af depolymeriseringsreaktionen afhængig af afvigelsen fra de ønskede værdier i middelmolekylvægten og polydispersitet fra de ønskede 25 værdier, kan processen udføres som vist i fig. 1. Fig. 1 viser en speciel udførelsesform af den foreliggende opfindelse, som især er anvendelig i forbindelse med enzymatisk depolymerisering af heparin til LMW-heparin med lav polydispersitet ved anvendelse af immobiliseret heparinase som hovedenzymkilde. Udstyr til supple-30 ring med flydende heparinase er dog også vist.

Heparinsubstrat af en forudbestemt ønsket koncentration tilvejebringes ved blanding af en heparingrundopløsning (16) med en puffer (17) i en mixer (1) og tilføres til en lukket kredsløbsreaktionszone ved hjælp af en doseringspumpe (2). Reaktions-35 zonen består af en retentatcirkulationspumpe (4), et ultrafilter (5), en enzymreaktor (3) og en shuntlinie med en ventil (6). Da reaktionszonen er lukket med undtagelse af substratfødelinien og

11 DK 162108 B

ultrafiltreringsmembranen, vil filtratstrømmen være lig med substratstrømmen. En hurtig retentatstrøm er ønskelig for at forhindre polarisering på ultrafiltreringsmembranen. Dette kunne dog være skadeligt for det immobiliserede enzymleje på grund af 5 det opståede trykfald over lejet. Hovedretentatstrømmen cirkuleres derfor gennem shuntlinien og ventilen (6), som åbnes og lukkes for at regulere trykfaldet over enzymlejet.

Filtreringstrykket over ultrafiltreringsmembranen måles med et manometer (14). Det kan om nødvendigt øges ved delvis 10 lukning af en ventil (15). Enzymreaktionstemperaturen kan reguleres ved en vandcirkulationskappe (rundt om reaktor 3 (ikke vist)). LMW-heparinfraktionen, der forlader depolymeriserings-zonen i ultrafiltratet, analyseres til bestemmelse af dens gennemsnitlige molekylvægt og polydispersitet. Et prøveapparat 15 (7), skematisk angivet, udtager prøver, inden filtratet passerer til en opsamler (11). Prøverne passerer til instrumenter 8, 9 og 10.

I den foretrukne illustrerede udførelsesform for den foreliggende fremgangsmåde måles tre parametre: brydningsindeks 20 (RI), UV-absorption ved 235 nm (A235^ °9 polydispersitet (D). RI og A235 m^les kontinuert eller med korte mellemrum ved hjælp af henholdsvis en Ri-detektor (8) og et spektrophotometer (9). D bestemmes lejlighedsvis ved GPL-HPLC bestemmelse af Mn og ved hjælp af kromatografiinstrumenter (10). De fra prøverne fremkomne 25 data indføres i en computer (12), som beregner LMW-heparinkoncen-tration c (g/liter) fra RI, antalsmiddelmolekylvægt Mn (Dalton) fra c og væksten i absorption ved 235 nm (ΛΑ235^' enzYmaktivitet (NE) fra NE = ΔΑ235 x strømni-n9shastighed og polydispersitet D fra HPLC data. Computeren regulerer processen baseret på de be-30 regnede parametre M^, D, c og NE ved regulering af substratkoncentration med mixer (1), strømningshastigheden (SFV) med en pumpe (2), enzymaktiviteten fra grundopløsningen (18) via en enzymtilsætningsventil (13) og/eller et reaktionstemperaturreguleringsapparat (ikke vist), trykfald over membranfilter gennem 35 ventil (15) og retentatcirkulationsstrømmen gennem cirkulationspumpen (4). Kontrolkredsløbene og det automatiske udstyr skema

12 DK 162108 B

tisk vist i strømningsdiagrammet på fig. 1 er konventionelle systemer og midler og behøver derfor ikke at blive beskrevet her.

En kontinuert metode til depolymerisering af heparin i 5 laboratorieskala ifølge fig. 1 skal beskrives i de følgende eksempler.

10 Eksempel 1

Flavobacterium heparinum blev dyrket på et heparinhol-digt substrat, og heparinase blev isoleret fra et homogeniseret cellekoncentrat ved filtrering gennem 100 KD og koncentrering på 15 30 KD ultrafiltre. Enzymet blev immobiliseret på CNBr aktiveret Sepharose 4B i nærvær af heparin.

750 enheder immobiliseret heparinase, der kan depolyme-risere ca. 5 - 600 mg/h heparin med Mn på ca. 11.500 til LMW-heparin med Mn på ca. 4000 dalton ved stuetemperatur, blev 20 anbragt i enzymreaktor (3). Systemet blev fyldt med heparin- substratopløsning (10 mg/ml i 0,1 M Na-acetat, 0,005 M Ca-acetat pH 7,0), befriet for indespærret luft, og heparinsubstratet blev tilsat systemet med en starthastighed på 60 ml/time ved stuetemperatur .

25 Efter få minutter svarede filtratets strømningshastig hed nøjagtigt til substratstrømningshastigheden. Prøver på 10 ml blev opsamlet i løbet af eksperimentet. Brydningsindeks, RI, blev målt kontinuert, og absorption ved 235 nm, ^35' blev m^lt hyppigt, mindst én gang pr. fraktion efter fortynding af prøverne 30 med 1,7 M perchlorsyre.

Antalsmiddelmolekylvægten af produktet, Mn blev beregnet fra RI- og ^235“værdierne, og afsat mod fraktionsnummer som vist i fig. 2.

HPLC-molekylvægtanalyse blev udført på nogle få frakti-35 oner. Resultatet bekræfter de beregnede værdier som det fremgår af fig. 2 og tilvejebringer ydermere tal for vægtmiddelmole-kylvægt, M^, og polydispersitet, D (fra D = M^/M^). Da den bereg-

13 DK 162108 B

nede M svarer godt til M værdien målt ved HPLC, viser det fore-liggende eksempel, at ligningen (1), hvor c* = 7600, kan anvendes til beregning af Mn af LMW-heparinproduktet fra en kontinuert depolymeriseringsreaktion.

5 RI, a23g-proceduren giver næsten øjeblikkelig informa tion om processtatus og tillader korrigerende forholdsregler.

Det foreliggende eksempel viser ydermere opnåelse af en ønsket Mn af produktet ved justering af substratstrømningshastigheden ved fastlagt substrattilsætningskoncentration.

10 Forsøget blev udført i tre faser: 1) Strømningshastighed 60 ml/time. I denne fase voksede Mn af produktet jævnt og nåede den ønskede værdi på 4000 dalton efter ca. 22 fraktioner.

2) Strømningshastighed 30 ml/time. Efter få yderlige-15 re fraktioner blev strømningshastigheden reduceret til 30 ml/time fra fraktion nr. 27. Som det fremgår af fig. 2, var svaret et stadigt fald i Mn· 3) Strømningshastighed 60 ml/time. Da Mn af produktet havde nået en værdi på 3300 dalton i fraktion nr. 43 og stadig 20 var faldende, blev den oprindelige strømningshastighed på 60 ml/time genoptaget. Faldet i Mr standsede og blev igen fulgt af en jævn stigning, som udjævnedes ved fraktion nr. 60. Fra dette punkt og under resten af forsøget viste små afvigelser i de iagttagne parametre, at et stabilt niveau var nået.

25 Som sammenligningsgrundlag anvendtes immobiliseret heparinase til depolymerisering af heparin i reaktioner af batch-typen. I et forsøg blev heparin depolymeriseret til en antals-middelmolekylvægt, Mn på ca. 4000 dalton, sammenlignelig med Mn i den "stabile tilstand"'s produktfiltrat fra den kontinuerte pro-30 ces.

I et andet forsøg blev heparin depolymeriseret til en vægtmiddelmolekylvægt, Mw sammenlignelig med af produktet fra den "stabile tilstand" i den kontinuerte proces.

Mn og fordelingerne blev analyseret ved HPLC. Resul-35 taterne fra de to reaktionstyper er anført i nedenstående tabel.

14 DK 162108 B

Tabel 1

Kontinuert reaktion ML ML D

w η n 5 Fraktion nr._(målt ved HPLC)_(beregn, fra RI og ^^) 65 6152 3734 1,65 3950 74 7365 4179 1,76 4120 84 6650 3979 1,67 3950 _94_6823 4114_1,66 4120_ 10 gennemsnit 6748 4002 1,69 4035 S.D.+500 S.D.±200 S.D.±0,05 S.D.±100

Batch-reaktion 1 (M ^4000) -n-

15 Prøve nr. M M„ D

—z.-w--n- 1 7894 3996 1,98 2 7507 3937 1,91 3 _7503 3897 1,93_ gennemsnit_7635_3943 1,94_ 20 _S .D. ±225 S .D . ±50 S.D.±0,04_

Batch-reaktion 2 (M *v6700) -w-

Μ M D

-w-_n- 25 6681 3175 2,10

Det fremgår, at polydispersiteten af LMW-heparinproduk- tet fra den kontinuerte proces er væsentligt reduceret sammenlig- 30 net med en batchdepolymeriseringsprocess. Det fremgår ydermere, at de beregnede Mn~værdier er i god overensstemmelse med de målte M -værdier for den kontinuerte reaktion, n

DK 162108 B

Eksempel 2

Heparin blev depolymeriseret til LMW-heparin med immo-biliseret heparinase under anvendelse af apparatur og fremgangs-5 måder til analysering og beregning som i eksempel 1. Procesregulering blev udført i to faser.

I den første fase, som i eksempel 1, blev regulering af substratstrømningshastighed i overensstemmelse med afvigelser af Mn i produktfiltratet fra den ønskede værdi på ca. 4000 anvendt 10 til opnåelse af en stabil tilstand, hvori substratstrømningshastigheden svarede til den ønskede Mn~værdi i filtratet.

Som det fremgår af tabel 2 og som vist i fig. 3 reduceredes den oprindelige substratstrømningshastighed på 60 ml i timen af 10 mg pr. ml heparinsubstrat trinvist til 12 ml i timen 15 svarende til en substrattilsætningshastighed på 120 mg i timen til opnåelse af en stabil tilstand (I) fra fraktion nr. 78.

Antalsmiddelmolekylvægt og polydispersitet af LMW- heparinproduktet i stabil tilstand fundet ved GPC-HPLC analyse var Mn = 4150 og D = 1,71 svarende til en gennemsnitsmolekylvægt 20 M = 7100. w I den anden fase fra fraktion nr. 114 blev forholdet mellem substrattilsætningskoncentration og substratstrømningshastighed ændret med en faktor 25 ved at reducere substrattilsætningskoncentration med en faktor 5 til 2 mg heparin pr. ml, og 25 ved at forøge substratstrømningshastigheden med en faktor 5 til 60 ml i timen, hvorved substrattilsætningshastigheden på 120 mg heparin i timen opretholdtes.

Ændringerne resulterede i en ny stabil tilstand (II) fra fraktion nr. 140, som det fremgår af tabel II og fig. 3.

30 Antalsmiddelmolekylvægten forblev praktisk taget uændret, men produktets polydispersitet var betydeligt reduceret til den lave værdi D = 1,55, svarende til M = 6450, som det ses w af tabel 2 og fig. 3.

16 DK 162108 B

Tabel 2

Frakt.nr.1) Substr. Strømn.has- Μ M D M

η n w _kone, (mg/ml) tighed (ml/t) (beregnet) (GPC-HPLC anal.) 51 10 60 3850 4300 1,73 7450 6 4300 4500 1,73 7800 7 - 30 4500 9 4700 4750 1,78 8450 10 - 18 4900 5000 1,76 8800 10 20 - - 4560 4450 1,79 7950 50 4100 4350 1,76 7650 75 4350 4700 1,78 8350 80 - 12 4300 4150 1,71 7100 100 - - 4150 1,69 7000 15 110 - - 4050 1,74 7050 115 2 60 4100 1,67 6725 130 - - 4250 1,65 7000 140 - - 4050 1,58 6400 150 - - 4150 1,55 6450 20 160 - - 4200 1,55 6500 170 - - 4500 4300 1,55 6650

Fraktionsstørrelse: 10 ml

17 DK 162108 B

Det fremgår af resultaterne fra eksemplerne 1 og 2, grafisk .illustreret i henholdsvis fig. 2 og fig. 3, at den kon-5 tinuerte depolymerisering ifølge den foreliggende opfindelse virkede i Lange perioder uden pauser, hvilket viser, at det kontinuerte depolymeriseringsreaktionsystem er relativt stabilt.

Det fremgår også af resultaterne fra eksempel 2, at der kan opnås ganske lave polydispersitetsniveauer i LMW-heparinpro-10 duktet fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse, idet der opnås en polydispersitet (se fraktioner 140 til 170) i området fra 1 - l.,6, hvilket er det foretrukne område.

15 Eksempel 3

Heparin blev depolymeriseret til LMW-heparin med opløst, dvs. ikke-immobiliseret, heparinase.

På grundlag af erfaringerne fra eksempel 1 og 2, anvendtes en forenklet udførelsesform, hvor koncentrationen af 20 depolymeriseret heparin i filtratet blev påregnet at være den samme som koncentrationen af heparin i fødeblandingen efter en forholdsvis kort tid til opnåelse af en stabil tilstand.

Monitoreringen skete i dette forsøg udelukkende ved absorptionsmåling.

25 Forsøget udførtes i samme apparatur som de to foregåen de eksempler, dog således at brydningsindeksdetektoren ikke blev benyttet under forsøget ((8) i fig. 1).

Substratkoncentrationen, c = 20 mg/ml, og substrattilførsel og filtratudtag = 3 ml/min. var konstante gennem hele 30 forsøget.

Ved forsøgets start var substratkoncentrationen i reaktoren 50 mg/ml.

Da fri heparinase ikke er så stabil som immobiliseret heparinase, vil der under forsøget ske et vist forbrug af hepa-35 rinase. Dette viser sig ved et fald i den målte absorptionstilvækst i filtratet, og reguleringen kan derfor ske ved lejlighedsvis at tilsætte enzym til erstatning af tabet af aktivitet og op-

18 DK 162108 B

retholdelse af den beregnede/ønskede værdi af ΔΑ235 ^ filtratet· Procesreguleringen skete i dette forsøg udelukkende ved regulering af enzymkoncentrationen.

Forsøget indeholdt to faser: 5 I første fase blev der indstillet til stabil tilstand svarende til den ønskede antalsmiddelmolekylvægt, som i dette forsøg var = 3600. Dette svarer til en absorptionstilvækst AA235 Pa 0,55 målt i filtratet efter fortynding 51 gange med 0,5 N HC1, beregnet ved anvendelse af ligning 2 ved indsættelse 10 af c = 20 mg/ml og £ = 7600.

Efter at den ønskede absorptionstilvækst i filtratet blev opnået, opretholdtes denne i den anden fase ved tilsætning af ekstra enzym fra beholder (18).

Prøverne udtaget til måling af absorptionstilvækst blev 15 efter forsøget analyseret ved HPLC til bestemmelse af molekylvægt og polydispersitet.

Resultaterne af absorptionsmåling og den ved ligning 1 beregnede antalsmiddelmolekylvægt i filtratet er anført i tabel 3 ligesom resultaterne af HPLC-analyserne. Absorption og HPLC-20 resultater er vist i fig. 4.

19 DK 162108 B

Tabel 3

Tir] ΛΑ Μ Μ μ D

lia ^ a235 n w n 5 fra

start beregn. HPLC HPLC

(timer) 0,25 0,015 10150 9622 6713 1,43 10 0,75 0,115 7600 8277 5460 1,52 1.25 0,190 6400 7410 4943 1,50 1.75 0,256 5600 6876 4594 1,50 2.25 0,311 5100 6748 4519 1,49 2.75 0,344 4800 6462 4406 1,47 15 3,25 0,368 4600 6438 4351 1,48 3.75 0,378 4500 6285 4327 1,45 4.25 0,381 4500 6340 4361 1,45 4.75 0,381 4500 6262 4361 1,44 20 5,0: Enzymtilsætning 5.25 0,382 4500 6252 4322 1,45 5.75 0,429 4200 5839 4082 1,43 6.25 0,476 3950 5673 3943 1,44 25 6,75 0,576 3500 5646 3856 1,46 7.25 0,527 3700 5423 3782 1,43 8.0 0,526 3700 5359 3768 1,42 9.0 0,504 3800 5488 3795 1,45 30 9,25: Enzymtilsætning 10.0 0,530 3700 5509 3715 1,48 11.0 0,566 3550 5033 3563 1,41 11.75 0,581 3450 5076 3559 1,43 35 13,0 0,544 3660 4975 3580 1,39 14.0 0,517 3750 5087 3673 1,39 15.0 0,505 3800 5294 3730 1,42

20 DK 162108 B

15,25: Enzymtilsætning 15,75 0,514 3750 5258 3723 1,41 17.0 0,552 3600 5022 3586 1,40 5 18,0 0,554 3600 5011 3577 1,40 19.0 0,542 3650 5084 3586 1,42 20.0 0,524 3700 5121 3627 1,41 21.0 0,509 3800 5022 3673 1,37 10 21,25: Enzymtilsætning 22.0 0,541 3650 4919 3524 1,40 23.0 0,573 3500 4769 3443 1,39 24.0 0,561 3550 5010 3612 1,39 15 25,0 0,524 3700 5054 3631 1,39 26.0 0,490 3900 5084 3615 1,41

Resultaterne viser, at der i de første 3 timer gradvis opstår bedre overensstemmelse mellem de ud fra Δ-^235 beregnede 20 M -værdier og de ved HPLC bestemte værdier.

Efter 3 timer opnås en stabil tilstand, hvorefter der var særdeles god overensstemmelse mellem beregnet og målt antalsmi ddelmoleky1vægt.

Efter ca. 5 timer blev det konstateret, at den målte 25 absorptionstilvækst var lavere end den beregnede, og der blev tilsat ekstra enzym. Efter 6,5 timer svarede absorptionstilvæksten til den ønskede. I de næste ca. 20 timer opretholdtes den tilsigtede absorptionstilvækst med god tilnærmelse, og filtratet blev opsamlet til senere oparbejdning.

30 Der blev i alt opsamlet 3,75 liter filtrat, som ved fældning med alkohol gav et LMW heparinprodukt med følgende molekylvægt s analyse: = 5300, Mn = 3700 og Mpea^ = 4500.

Polydispersiteten var 1,43.

Produktets molekylvægtsanalyse svarede udmærket til 35 analyserne på de udtagne prøver af filtratet, og der var navnlig en god overensstemmelse mellem produktets aktuelle antalsmiddelmolekylvægt og den ønskede værdi.

21 DK 162108 B

Det opnåede vægtudbytte af LMW-heparering beregnet på tilført heparin var i løbet af de 20 timer ca. 10% højere, end hvad der sædvanligvis opnåes ved en batchdepolymerisering.

Polydispersiteten på 1,43 var langt lavere end i pro-5 dukter fremkommet ved batchvis depolymerisering, med mindre disse underkastes en fraktionering og dermed følgende udbytteforringelse.

Claims (9)

5 22 DK 162108 B 10

1. Fremgangsmåde til fremstilling af LMW-heparin ved enzymatisk depolymerisering af heparin kendetegnet ved, at 15 en vandig opløsning af heparin kontinuert sættes til en reaktor indeholdende heparinase, i hvilken heparinet underkastes en enzymatisk depolymerisering; depolymeriseret heparinopløsning kontinuert fjernes fra reaktoren og underkastes en ultrafiltrering til fremstilling af 20 et retentat og et filtrat; i det mindste en del af retentatet recirkuleres til reaktoren og LMW-heparinproduktet opsamles fra filtratet; idet stigningen i lysabsorptionen af filtratet, som 25 følge af dannelsen af umættede nedbrydningsprodukter, måles kontinuert eller hyppigt under hele processen, og antalsmiddelmolekylvægten, Mn, og polydispersiteten, D, af filtratet bestemmes kontinuert eller hyppigt, fortrinsvis i en indledende fase indtil depolymeriseringsreaktion har stabiliseret sig på et sta-30 bilt niveau, og idet eventuelle afvigelser fra de ønskede værdier korrigeres ved at justere procesparametrene af den enzymatiske depolymeriseringsreaktion.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendete g-35 n e t ved, at lysabsorbtionen måles ved 235 nm, og at der desuden foretages kontinuerte eller hyppige målinger af filtra-

23 DK 162108 B tets brydningsindex RI, og at målingsresultaterne anvendes til beregning af antalsmiddelmolekylvægten Mn af LMW-produktet i filtratet. 5

3, Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg net ved, at substrattilsætningshastigheden sænkes, hvis antalsmiddelmolekylvægten Mn af depolymeriseret heparin i filtratet er højere end ønsket.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg net ved, at substrattilsætningshastigheden øges, hvis antalsmiddelmolekylvægten af depolymeriseret heparin i filtratet er lavere end ønsket.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at forholdet mellem heparinsubstrattilsætningskoncentra-tionen og substratstrømningshastighed mindskes, når polydispersi-teten af det depolymeriserede heparinfiltrat er højere end ønsket. 20

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at forholdet mellem heparinsubstrattilsætningskoncentra-tionen og substratstrømningshastigheden øges, når polydispersite-ten af det depolymeriserede heparinfiltrat er lavere end ønsket. 25

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at enzymaktiviteten af heparinase justeres, idet den mindskes, såfremt molekylvægten af LMW-heparindepolymeriseringspro-duktet bliver for lav, og enzymaktiviteten øges, hvis molekyl- 30 vægten af LMW-heparindepolymeriseringsproduktet bliver for høj.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at heparinase anvendes i immobiliseret form.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at procesparametrene justeres så det fremstillede LMW-heparinprodukt har en polydispersitet fra ca. 1 til ca. 1,6.