JP2011169913A

JP2011169913A - 低分子量ヘパリンに関連する方法および生成物

Info

Publication number: JP2011169913A
Application number: JP2011098811A
Authority: JP
Inventors: Mallikarjum Sundaram; サンドラムマリカージャム; Ganesh Venkataraman; ヴェンカタラマンガネシュ; Zachary Shriver; シュライバーザチャリー; Dongfang Liu; リュードンファン; Yiwei Qi; ウェイキイ; Ram Sasisekharan; サシセカランラム
Original assignee: Massachusetts Institute of Technology
Current assignee: Massachusetts Institute of Technology
Priority date: 2000-09-12
Filing date: 2011-04-26
Publication date: 2011-09-01
Anticipated expiration: 2021-09-12
Also published as: US20060024664A1; EP1319183A2; DE60138115D1; EP2085780B1; US7687479B2; JP4911865B2; US20070161073A1; CY1110323T1; EP2085780A3; US8173384B2; WO2002023190A2; AU2001292618A1; US20100062468A1; US8512969B2; US20130017565A1; WO2002023190A3; ATE426805T1; US7399604B2; JP2004509339A; CA2422059A1

Abstract

【課題】多糖を特徴付け、使用するための方法および生成物の提供。
【解決手段】本発明は、多糖を特徴付け、そして使用するための方法および生成物に関する。低分子量ヘパリン生成物および使用方法が記載される。多糖調製物（ヘパリンのようなグリコサミノグリカンを含む）の純度および活性を特徴付けるための方法もまた、記載される。サンプルを分析する方法であって、該方法は、（Ａ）サンプル中の多糖に、実験的制限を適用し、シグネチャー成分を有する修飾された多糖を生成する工程、（Ｂ）該多糖が該サンプル中に存在することの指標として、該サンプル中の該シグネチャー成分の存在を検出する工程、および（Ｃ）該シグネチャー成分の存在または非存在を決定して、該サンプルを分析する工程、を包含する。
【選択図】図１

Description

（発明の背景）
凝固は、哺乳動物における正常な血液止血を維持する際に関与する生理学的経路である。血管損傷が生じる条件下では、凝固経路は、血液の喪失を防止するように凝血を形成するように刺激される。血管損傷が生じた直後、血小板は、損傷部位で凝集を開始して、漏出を停止させる物理的栓を形成する。さらに、損傷した血管は、血管収縮を起こし、その領域への血流を減少させ、そしてフィブリンが凝集し始めて、不溶性の網または血塊を形成し、これは、破裂した領域を覆う。凝固経路の不均衡が、過度の凝固に移動する場合、結果は、血栓の傾向の発生であり、これは、しばしば、心臓発作、発作、深い血管血栓症、および心筋梗塞として明らかである。凝固経路における不均衡に関連する障害を処置するための現在の治療は、多数の危険を伴い、注意深く制御されなければならない。

ヘパリン（マスト細胞によって生成される高度に硫酸化されたヘパリン様グリコサミノグリカン（ＨＬＧＡＧ））は、広範に使用される臨床的な抗凝固薬であり、第１の生体高分子薬物の１つであり、そして少数の炭水化物薬物の１つである。ヘパリンは、２つの機構を介してその効果を主に誘発し、その両方は、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）の特定の五糖配列（ポリマー内に含まれるＨ_{ＮＡｃ／Ｓ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}Ｉ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}）への結合を含む。第１に、五糖へのＡＴ−ＩＩＩの結合は、Ｘａ因子のその阻害を媒介するタンパク質におけるコンホメーション変化を誘導する。第２に、トロンビン（ＩＩａ因子）はまた、五糖ＡＴ−ＩＩＩ結合部位に近接した部位でヘパリンに結合する。ＡＴ−ＩＩＩ、トロンビンおよびヘパリンの間の三元複合体の形成は、トロンビンの不活化を生じる。ＡＴ−ＩＩＩ五糖結合部位のみを必要とするその抗Ｘａ活性と異なり、ヘパリンの抗ＩＩａ活性は、サイズ依存性であり、ＡＴ−ＩＩＩ、トロンビンおよびヘパリンの三元複合体の効率的な形成のために少なくとも１８の糖単位を必要とする。

ヘパリンの抗凝固特性に加えて、哺乳動物におけるその複雑性および広い分布により、ヘパリンが、広範なさらなる生物学的活性に関与し得るという示唆が導かれる。ヘパリン様グリコサミノグリカン（ＨＬＧＡＧ）（細胞表面および細胞外マトリクスの両方に存在する）は、グルコサミンおよびウロン酸（イズロン酸またはグルクロン酸のいずれか）から構成される二糖反復単位からなる、長さが可変性の複合体多糖の群である。ＨＬＧＡＧについての高度の複雑性は、それらの多分散および２つの異なるウロン酸成分の可能性だけでなく、二糖単位の４つの位置での異なる改変からも生じる。３つの位置（すなわち、ウロン酸のＣ２およびグルコサミンのＣ３、Ｃ６位）は、Ｏ−硫酸化され得る。さらに、グルコサミンのＣ２は、Ｎ−アセチル化またはＮ−硫酸化され得る。まとめると、これらの改変は、理論的に３２の可能性のある二糖単位を生じ得、ＤＮＡ（４塩基）またはタンパク質（２０アミノ酸）のいずれよりも、ＨＬＧＡＧを潜在的により情報の濃いものにする。この多量の可能性のある構造改変体は、ＨＬＧＡＧが以下を含む多数の多様な生物学的プロセスに関与することを可能にする：脈管形成（Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ．，Ｍｏｓｅｓ，Ｍ．Ａ．，Ｎｕｇｅｎｔ，Ｍ．Ａ．，Ｃｏｏｎｅｙ，Ｃ．Ｌ．＆Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．（１９９４）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９１，１５２４−８）、胚形成（Ｂｉｎａｒｉ，Ｒ．Ｃ．，Ｓｔａｖｅｌｅｙ，Ｂ．Ｅ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｗ．Ａ．，Ｇｏｄａｖａｒｔｉ，Ｒ．，Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ．＆Ｍａｎｏｕｋｉａｎ，Ａ．Ｓ．（１９９７）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２４，２６２３−３２；Ｔｓｕｄａ，Ｍ．，Ｋａｍｉｍｕｒａ，Ｋ．，Ｎａｋａｔｏ，Ｈ．，Ａｒｃｈｅｒ，Ｍ．，Ｓｔａａｔｚ，Ｗ．，Ｆｏｘ，Ｂ．，Ｈｕｍｐｈｒｅｙ，Ｍ．，Ｏｌｓｏｎ，Ｓ．，Ｆｕｔｃｈ，Ｔ．，Ｋａｌｕｚａ，Ｖ．，Ｓｉｅｇｆｒｉｅｄ，Ｅ．，Ｓｔａｍ，Ｌ．＆Ｓｅｌｌｅｃｋ，Ｓ．Ｂ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ４００，２７６−８０；およびＬｉｎ，Ｘ．，Ｂｕｆｆ，Ｅ．Ｍ．，Ｐｅｒｒｉｍｏｎ，Ｎ．＆Ｍｉｃｈｅｌｓｏｎ，Ａ．Ｍ．（１９９９）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２６，３７１５−２３．）およびアルツハイマー病におけるβ−原線維の形成（ＭｃＬａｕｒｉｎ，Ｊ．，Ｆｒａｎｋｌｉｎ，Ｔ．，Ｚｈａｎｇ，Ｘ．，Ｄｅｎｇ，Ｊ．＆Ｆｒａｓｅｒ，Ｐ．Ｅ．（１９９９）ＥｕｒＪＢｉｏｃｈｅｍ２６６，１１０１−１０．およびＬｉｎｄａｈｌ，Ｂ．，Ｗｅｓｔｌｉｎｇ，Ｃ．，Ｇｉｍｅｎｅｚ−Ｇａｌｌｅｇｏ，Ｇ．，Ｌｉｎｄａｈｌ，Ｕ．＆Ｓａｌｍｉｖｉｒｔａ，Ｍ．（１９９９）ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２７４，３０６３１−５）。

ヘパリンは、種々の臨床的状況において高度に有効であり、そして多数の他の状況において使用される可能性を有するが、ヘパリン治療に関連する副作用は、多くそして様々である。ヘパリン誘導性血小板減少症（ＨＩＴ）などの副作用は、種々のタンパク質についての結合ドメインを提供する、非分画ヘパリン（ＵＦＨ）の長鎖に主に関連しする。このことは、ＵＦＨの有効な代替物としての低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）の生成および利用における急増を導いた。それらのより予測可能な薬理学的作用、減少した副作用、持続された抗血栓活性、およびより優れたバイオアベイラビリティーに起因して、ヘパリンの代用としてＬＭＷＨに注目が集まっているが、現在、ＬＭＷＨ製造プロセスを標準化するための能力は限定されている。ＬＭＷＨは、ヘパリンに由来し、規定されていない構造を有して多分散および微小不均一性であるので、これらは、固有の可変性を有し、このことは、現在、これらの製造のための効率的なプロセスを妨げる。ヘパリンおよび他のグリコサミノグリカンを生成するための、一貫した、品質制御された、時間効率的な、濃度独立性の、かつ高度に再現性の方法を有することは、医学的および科学的の両方で有用である。

ヘパリンの分子バリエーション、構造的バリエーション、および活性バリエーションを特徴付ける試みにおいて、いくつかの技術が、ヘパリン調製の分析のために調査されてきた。勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）および強イオン交換ＨＰＬＣ（ＳＡＸ）は、ヘパリン調製の定性的分析および定量的分析のために使用されている。勾配ＰＡＧＥ方法は、分子量を決定する際に有用であり得るが、この方法は、分離ができず、特に、同一のサイズを有する異なる多糖の解析ができないという被害を被る。ＳＡＸ−ＨＰＬＣ（これは、紫外線吸光度の検出に依存する）は、しばしば、少量の構造的に重要なヘパリン由来オリゴ糖を検出するには、感度が不十分である。ヘパリンおよび他のグリコサミノグリカンを精製および分析するための現在の技術は、不充分である。改善された単離方法および分析方法のための非常に大きい臨床的必要性および科学的必要性が存在する。

（発明の要旨）
本発明は、いくつかの局面において、多糖調製物を特徴付けるための方法に関連する。複雑な多糖構造の結果として、多糖調製物の純度および／または活性を特徴付けることは困難であり、下手をすると不可能である。核酸サンプルおよびタンパク質サンプルとは異なり、多糖調製物は、一般的に、生物学的サンプル中の特定のレベルの活性を生成するためのそれらの能力に依存して特徴付けられる。これらのアッセイは、直接的な構造的特徴付けによって達成され得るレベルの正確さを達成しない。本発明のいくつかの局面に従って、多糖サンプルを分析および特徴付ける方法が提供される。この方法は、シグネチャー成分を有する改変された多糖を生成するためにサンプル中の多糖に実験的制限を適用する工程、多糖がこのサンプル中に存在する指標としてサンプル中のシグネチャー成分の存在を検出する工程、およびサンプルを分析するためのシグネチャー成分の存在または非存在を決定する工程を包含する。いくつかの実施形態において、シグネチャー成分は、既知の生物学的活性を有し、他の実施形態において、シグネチャー成分は、生物学的に不活性である。

サンプルに適用される実験的制限は、シグネチャー成分の存在または非存在の同定をもたらす任意の型の操作である。実験的制限は、例えば、以下の型の実験的制限のいずれか１つの単独または組み合わせであり得る：キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー、ゲル透過クロマトグラフィー、核磁気共鳴、外酵素または内酵素を用いる消化のような酵素を用いる改変、化学的消化または化学的改変。

シグネチャー成分は、サンプルについての情報を提供するために使用され得る。使用のいくつかは、シグネチャー成分が活性または不活性の生物学的成分であるか否かに依存する。例えば、シグネチャー成分が活性な生物学的成分であり、サンプルが多糖のバッチであるいくつかの場合、このシグネチャー成分は、バッチ中のシグネチャー成分の量を決定することによってそのバッチの純度をモニターするために使用され得る。他の実施形態において、この分析の方法は、サンプル中の活性成分の存在をモニタリングするための方法であり、ここで、サンプル中のシグネチャー成分の存在は、サンプル中の活性成分を示す。他の実施形態において、分析の方法は、サンプル中のシグネチャー成分の量を決定することによって、サンプル中の活性成分の量を決定するための方法である。この方法はまた、少なくとも２つのサンプルに対して行なわれ得、その結果、少なくとも２つのサンプルの各々におけるシグネチャー成分の相対量が決定され、そしてシグネチャー成分の最も高い相対レベルが最も活性なサンプルを示す。

シグネチャー成分が不活性な生物学的サンプルであるいくつかの場合において、その分析の方法は、サンプル中の活性成分の存在をモニタリングするための方法であり得、ここで、サンプル中のシグネチャー成分の存在は、活性成分を欠くサンプルを示す。

これらの方法はまた、生物学的に活性な分子を同定するためのいくつかの実施例において有用である。例えば、シグネチャー成分は、ライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。

従って、いくつかの実施例において、シグネチャー成分は、多糖の生物学的に活性な一部である。多糖の生物学的に活性な一部としては、ヘパリンのＡＴ−ＩＩＩ結合ドメインの四糖、ヘパリンのＦＧＦ結合ドメインの四糖、ΔＵＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}；ΔＵＨ_{ＮＳ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}；ΔＵＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ}；およびΔＵＨ_{ＮＳ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ}が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、多糖は、グリコサミノグリカン（例えば、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）、ヘパリン、生物工学的に調製されたヘパリン、化学的に改変されたヘパリン、合成ヘパリン、およびヘパラン硫酸）である。

別の実施形態において、サンプル中の多糖は、その多糖と同一のサイズの多糖の参照データベースと比較され、ここで、参照データベースの多糖もまた、サンプル中の多糖と同じ実験的制限に供され、ここで、比較は、サンプル多糖の組成分析を提供する。

いくつかの好ましい実施形態において、サンプルは薬学的生成物である。他の実施形態において、サンプルは、生物学的なサンプル（例えば、血液サンプル）である。

多糖サンプルの品質を評価するための方法が、本発明の他の局面に従って提供される。この方法は、多糖サンプル中の成分を同定する工程、成分の量の定量的値を決定する工程であって、この成分の定量的値がその多糖サンプルの品質を示す、工程を包含する。１つの実施形態において、この方法は、多糖サンプル中の少なくとも２つの成分を同定する工程、および多糖サンプルの品質を評価するために少なくとも２つの成分の各々の量の定量的値を決定する工程を包含する。

定量的値は、種々の異なる方法によって計算され得、サンプルが、成分を同定するためにどのように処理されるかに依存する。例えば、定量的値は、サンプルがキャピラリー電気泳動によって処理される場合、曲線の下の面積として、応答係数として、またはサンプル中に存在する各画分のパーセント相対量として、計算され得る。

１つの実施形態において、サンプル中に存在する各画分のパーセント相対量を計算する工程は、以下の式：
ＰＲＡ＝ＲＦ×ＡＵＣ_％Ｒ
に従って決定され、ここで、
ＰＲＡ＝各画分のパーセント相対量
ＲＦ＝応答係数
ＡＵＣ_％Ｒ＝パーセント相対ＡＵＣ［（１００×ＡＵＣ_Ｃ）／ＡＵＣ_Ｔ）］
ＡＵＣ_Ｃ＝１つの成分についての曲線下の面積
ＡＵＣ_Ｔ＝全ての成分についての曲線下の面積の合計
である。

別の実施形態において、データ構造を作成するためのコンピューター実行方法は、コンピューター読み出し可能な媒体に実体的に具体化され、多糖の成分の定量的値を示し、この方法は、上の計算を実行する動作を含む。

１つの実施形態において、成分は、シグネチャー成分ΔＵＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}、ΔＵＨ_{ＮＳ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}；ΔＵＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ}；またはΔＵＨ_{ＮＳ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ}である。

別の局面において、本発明は、グリコサミノグリカンの組成物を生成する方法に関連する。この方法は、第１のより高い分子量の画分および単離されたＬＭＷＨの第２の画分を生成するために溶媒中にてサンプルを含むグリコサミノグリカンの塩の沈澱を実施する工程、および濃縮されたＬＭＷＨ調製物を生成するために単離されたＬＭＷＨの第２の画分を処理する工程を包含する。好ましい実施形態において、沈澱工程において使用される塩は、二価のカチオンおよび弱アニオンの塩である。先行技術は、一般的に、塩沈澱を使用してヘパリンを単離する方法が使用される場合、第１の画分は、ＬＭＷＨを生成するために処理されるべきであり、第２の画分は、処分されるべきであることを教示する。第２の画分は、実際に、生物学的に活性なＬＭＷＨの好ましい供給源を含むことが発見された。

いくつかの実施形態において、二価のカチオンおよび弱アニオンの塩は、以下を含む群の中より選択される；バリウム、カルシウム、マグネシウム、ストロンチウム、銅、ニッケル、カドミウム、亜鉛、水銀、ベリリウム、ニッケル、パラジウム、白金、鉄、およびスズ。他の実施形態において、二価のカチオンおよび弱アニオンの塩は、二価の原子価を有する周期表のカチオン元素の酢酸塩である。

ＬＭＷＨ画分の成分は、沈澱において使用される温度および溶媒の型を操作することによってさらに変更され得る。例えば、１つの実施形態において、沈澱は、０℃〜７０℃の範囲の温度で実施され得る。他の実施形態において、混合物の温度は、７０℃、６０℃、５０℃、４０℃、３０℃、２５℃、２０℃、１５℃、１０℃、５℃、３℃、２℃、１℃、または０℃である。なお他の実施形態において、沈澱は、４℃の温度で実行される。好ましくは、溶媒は、極性溶媒である。極性溶媒としては、Ｈ_２Ｏ、エタノールと混合したＨ_２Ｏ、アセトンと混合したＨ_２Ｏ、またはＨ_２Ｏ、エタノール、およびアセトンの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、沈澱において使用される極性溶媒は、９９：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、６５：３５、５５：４５、５０：５０、４５：５５、３５：６５、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５、または１：９９の範囲で、容量対容量のＨ_２Ｏ：エタノール比を有する。他の実施形態において、沈澱において使用される極性溶媒は、９９：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、６５：３５、５５：４５、５０：５０、４５：５５、３５：６５、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５、または１：９９の範囲で、容量対容量のＨ_２Ｏ：アセトン比を有する。１つの実施形態において、極性溶媒は、Ｈ_２Ｏ、エタノール、およびアセトンの混合物である。

１つの実施形態において、濃縮されたＬＭＷＨ調製物を得るために第２の画分の処理の工程は、酵素的消化（例えば、ヘパリナーゼＩＩＩを用いる消化）である。他の実施形態において、濃縮されたＬＭＷＨ調製物を得るための第２の画分の処理は、化学的分解である。いくつかの実施形態において、化学的分解の方法は、Ｈ_２Ｏ_２またはＣＵ^＋およびＨ_２Ｏ_２を用いる酸化的脱重合、亜硝酸イソアミルまたは亜硝酸を用いる脱アミノ切断、アルカリ処理またはヘパリナーゼによるヘパリンのベンジルエステルを用いるβ除去切断を含む群より選択される。他の実施形態において、濃縮されたＬＭＷＨ調製物を得るための第２の画分の処理は、精製されたＬＭＷＨ調製物を生成するための精製工程である。この方法は、薬学的なキャリア中に精製されたＬＭＷＨ調製物を処方する工程をさらに包含し得る。

他の実施形態において、グリコサミノグリカンは、ヘパリン、ヘパリンアナログ、ＬＭＷＨ、生物工学的ヘパリン、化学的に改変されたヘパリン、または合成ヘパリンからなる群より選択される。

少なくとも１５０ＩＵ／ｍｇの抗Ｘａ活性を有するＬＭＷＨ調製物および／または５より大きい抗Ｘａ因子：抗ＩＩａ因子活性の比を有するＬＭＷＨ調製物を含む組成物は、本発明の他の局面に従って、提供される。いくつかの実施形態において、ＬＭＷＨ調製物が単離され、そして他の実施形態において、それは合成である。いくつかの実施形態において、少なくとも１５０ＩＵ／ｍｇの抗Ｘａ活性を有するＬＭＷＨ調製物は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の抗Ｘａ因子：抗ＩＩａ因子活性の比を有する。

他の局面において、組成物は、少なくとも１５％の二硫酸化二糖、７５％未満の三硫酸化二糖、３〜５％の単硫酸化二糖、および少なくとも２％の４〜７の４糖を有するＬＭＷＨ調製物である。

組成物は、皮下送達、静脈内送達、エアロゾル送達、または経口送達のような方法によって、被験体への治療的送達のために処方され得る。

いくつかの実施形態において、ＬＭＷＨ調製物は、少なくとも３．５％、４．０％、または５．０％のΔＵＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}、ΔＵＨ_{ＮＳ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}；ΔＵＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ}；またはΔＵＨ_{ＮＳ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ}を含む。

ある状態を有する被験体を処置するための方法が、本発明の他の局面に従って提供される。この方法は、同定されたレベルのＡＴ結合配列を有するＬＭＷＨの組成物を選択する工程であって、このＡＴ結合配列のレベルが被験体において処置される状態に依存して選択される工程、および同定されたレベルのＡＴ結合配列を有するＬＭＷＨの組成物の有効量を被験体に投与する工程を包含する。

いくつかの実施形態において、被験体は、静脈もしくは動脈の血栓閉塞性疾患を有するか、または静脈もしくは動脈の血栓閉塞性疾患を発症する危険性がある。これらの被験体に投与されるＬＭＷＨ調製物は、少なくとも３．５％、４．０％、または５．０％のΔＵＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}、ΔＵＨ_{ＮＳ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}；ΔＵＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ}；またはΔＵＨ_{ＮＳ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ}を含み得る。他の実施形態において、ＬＭＷＨの組成物は、少なくとも１５０ＩＵ／ｍｇの抗Ｘａ活性を有するＬＭＷＨ調製物である。なお他の実施形態において、ＬＭＷＨの組成物は、５より大きい抗Ｘａ因子：抗ＩＩａ因子の活性比を有するＬＭＷＨ調製物である。

他の局面において、本発明は、以下を包含するプロセスによって調製されるＬＭＷＨ調製物を含む組成物を含む：ヘパリン調製物を得る工程、およびヘパリナーゼＩ、ヘパリナーゼＩＩ、およびヘパリナーゼＩＩＩを使用するヘパリン調製物の徹底的な消化を実施する工程。

他の局面において、本発明は、以下を備える多糖サンプルを分析するためのキットに関連する：多糖のシグネチャー成分を同定するためのコントロール組成物、および多糖に特徴的なシグネチャー成分を有する改変された多糖を生成するために多糖サンプルに実験的制限を適用するための、そしてシグネチャー成分の存在または非存在を同定するためのコントロール組成物と改変された多糖を比較するための指示書。いくつかの実施形態において、このキットはまた、多糖サンプルに実験的制限を適用するための組成物（例えば、外酵素または内酵素）を備える。なお別の他の実施形態において、この指示書は、サンプル中の多糖のシグネチャー成分を定量するための工程を含む。

本発明の制限の各々は、本発明の種々の実施形態を包含し得る。従って、いずれか１つのエレメントまたはエレメントの組み合わせを含む、本発明の制限の各々は、本発明の各局面に含まれ得ることが理解される。
例えば本願発明は、以下を提供する。
（項目１）サンプルを分析する方法であって、該方法は、以下：
（Ａ）サンプル中の多糖に、実験的制限を適用し、シグネチャー成分を有する修飾された多糖を生成する工程、
（Ｂ）該多糖が該サンプル中に存在することの指標として、該サンプル中の該シグネチャー成分の存在を検出する工程、および
（Ｃ）該シグネチャー成分の存在または非存在を決定して、該サンプルを分析する工程、
を包含する、方法。
（項目２）前記シグネチャー成分が、既知の生物学的活性を有する、項目１に記載の方法。
（項目３）前記シグネチャー成分が、生物学的に不活性である、項目１に記載の方法。
（項目４）前記サンプルに適用される前記実験的制限が、キャピラリー電気泳動である、項目１に記載の方法。
（項目５）前記サンプルに適用される前記実験的制限が、高圧液体クロマトグラフィーである、項目１に記載の方法。
（項目６）前記サンプルに適用される前記実験的制限が、ゲル透過クロマトグラフィーである、項目１に記載の方法。
（項目７）前記サンプルに適用される前記実験的制限が、核磁気共鳴である、項目１に記載の方法。
（項目８）前記サンプルが、多糖のバッチであり、そして前記シグネチャー成分が、該バッチ中のシグネチャー成分の量を決定することによって、該バッチの純度をモニタリングするために使用される、項目１に記載の方法。
（項目９）前記分析方法が、前記サンプル中の活性成分の存在をモニタリングするための方法であり、ここで、該サンプル中の前記シグネチャー成分の存在は、該サンプル中の活性成分を示す、項目２に記載の方法。
（項目１０）前記分析方法が、前記サンプル中の活性成分の存在をモニタリングするための方法であり、ここで、該サンプル中の前記シグネチャー成分の存在は、特定の活性を欠くサンプルを示す、項目３に記載の方法。
（項目１１）前期分析方法が、前記サンプル中のシグネチャー成分の量を決定することによって、該サンプル中の活性成分の量を決定するための方法である、項目２に記載の方法。
（項目１２）前記方法が、少なくとも２つのサンプルに対して実行され、ここで、該少なくとも２つのサンプルの各々におけるシグネチャー成分の相対的な量が決定され、ここで、シグネチャー成分の最も高い相対的レベルが、最も活性なサンプルを示す、項目２に記載の方法。
（項目１３）前記シグネチャー成分を使用して、生物学的に活性な分子を同定する工程をさらに包含する、項目２に記載の方法。
（項目１４）前記シグネチャー成分が、ライブラリーをスクリーニングするために使用される、項目１３に記載の方法。
（項目１５）前記シグネチャー成分が、多糖の生物学的に活性な部分である、項目１に記載の方法。
（項目１６）前記多糖の生物学的に活性な部分が、ヘパリンのＡＴ−ＩＩＩ結合ドメインの四糖である、項目１５に記載の方法。
（項目１７）前記多糖の生物学的に活性な部分が、ヘパリンのＦＧＦ結合ドメインの四糖である、項目１５に記載の方法。
（項目１８）前記サンプルに適用される前記実験的制限が、外酵素による消化である、項目１に記載の方法。
（項目１９）前記サンプルに適用される前記実験的制限が、内酵素による消化である、項目１に記載の方法。
（項目２０）前記サンプルに適用される前記実験的制限が、化学的消化である、項目１に記載の方法。
（項目２１）前記サンプルに適用される前記実験的制限が、化学的修飾である、項目１に記載の方法。
（項目２２）前記サンプルに適用される前記実験的制限が、酵素による修飾である、項目１に記載の方法。
（項目２３）項目１に記載の方法であって、前記サンプル中の前記多糖が、該多糖と同一のサイズの多糖の参照データベースと比較され、ここで、該参照データベースの該多糖もまた、該サンプル中の該多糖と同じ実験的制限に供され、ここで、該比較が、該サンプルの多糖の組成分析を提供する、方法。
（項目２４）前記多糖が、グリコサミノグリカンである、項目１に記載の方法。
（項目２５）前記多糖が、低分子量ヘパリンである、項目１に記載の方法。
（項目２６）前記多糖が、ヘパリンである、項目１に記載の方法。
（項目２７）前記多糖が、生物工学的に調製されるヘパリンである、項目１に記載の方法。
（項目２８）前記多糖が、化学的に修飾されたヘパリンである、項目１に記載の方法。
（項目２９）前記多糖が、合成ヘパリンである、項目１に記載の方法。
（項目３０）前記多糖が、ヘパラン硫酸である、項目１に記載の方法。
（項目３１）前記サンプルが、薬学的生成物である、項目１に記載の方法。
（項目３２）前記サンプルが、生物学的サンプルである、項目１に記載の方法。
（項目３３）前記サンプルが、血液サンプルである、項目１に記載の方法。
（項目３４）前記シグネチャー成分が、ΔＵＨ _{ＮＡＣ，６Ｓ} ＧＨ _{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ} 、ΔＵＨ _{ＮＳ，６Ｓ} ＧＨ _{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ} ；ΔＵＨ _{ＮＡＣ，６Ｓ} ＧＨ _{ＮＳ，３Ｓ} ；またはΔＵＨ _{ＮＳ，６Ｓ} ＧＨ _{ＮＳ，３Ｓ} のいずれか１つに対応するピークのうちの１つである、項目１に記載の方法。
（項目３５）多糖サンプルを分析するためのキットであって、該キットは、
（Ａ）多糖のシグネチャー成分を同定するためのコントロール組成物、ならびに
（Ｂ）実験的制限を多糖サンプルに適用して、該多糖に特徴的なシグネチャー成分を有する修飾された多糖を生成する工程、そして該修飾された多糖を、該コントロール組成物に対して比較して、該シグネチャー成分の存在または非存在の同定する工程、に関する指示書、
を備える、キット。
（項目３６）前記多糖が、グリコサミノグリカンである、項目３５に記載のキット。
（項目３７）前記多糖が、低分子量ヘパリンである、項目３５に記載のキット。
（項目３８）前記多糖が、ヘパリンである、項目３５に記載のキット。
（項目３９）前記多糖が、ヘパラン硫酸である、項目３５に記載のキット。
（項目４０）前記多糖が、生物工学的に調製されるヘパリンである、項目３５に記載のキット。
（項目４１）前記多糖が、化学的に修飾されたヘパリンである、項目３５に記載のキット。
（項目４２）前記多糖が、合成ヘパリンである、項目３５に記載のキット。
（項目４３）実験的制限を前記多糖サンプルに適用するための組成物をさらに備える、項目３５に記載のキット。
（項目４４）前記組成物が、外酵素である、項目４３に記載のキット。
（項目４５）前記組成物が、内酵素である、項目４３に記載のキット。
（項目４６）前記シグネチャー成分が、ヘパリンのＡＴ−ＩＩＩ結合ドメインの四糖である、項目４３に記載のキット。
（項目４７）前記シグネチャー成分が、ヘパリンのＦＧＦ結合ドメインの四糖である、項目４３に記載のキット。
（項目４８）前記シグネチャー成分が、ΔＵＨ _{ＮＡＣ，６Ｓ} ＧＨ _{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ} 、ΔＵＨ _{ＮＳ，６Ｓ} ＧＨ _{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ} ；ΔＵＨ _{ＮＡＣ，６Ｓ} ＧＨ _{ＮＳ，３Ｓ} ；またはΔＵＨ _{ＮＳ，６Ｓ} ＧＨ _{ＮＳ，３Ｓ} のいずれか１つに対応するピークのうちの１つである、項目４３に記載のキット。
（項目４９）前記指示書が、前記サンプル中の前記多糖の前記シグネチャー成分を定量するための工程を含む、項目３５に記載のキット。
（項目５０）多糖サンプルの品質を評価するための方法であって、該方法は、
該多糖サンプル内の成分を同定し、該成分の量の定量的な値を決定する工程であって、該成分の定量的な値が、該多糖サンプルの品質を示す、工程、
を包含する、方法。
（項目５１）前記方法が、前記多糖サンプル内の少なくとも２つの成分を同定する工程、および該少なくとも２つの成分の各々の量の定量的な値を決定して、該多糖サンプルの品質を評価する工程を包含する、項目５０に記載の方法。
（項目５２）前記定量的な値が、前記サンプルがキャピラリー電気泳動によって処理される場合に、曲線下の面積として計算される、項目５１に記載の方法。
（項目５３）前記定量的な値が、応答係数として計算される、項目５１に記載の方法。
（項目５４）前記定量的な値が、前記サンプル中に存在する各画分の相対的な量の％として計算される、項目５１に記載の方法。
（項目５５）項目５１に記載の方法であって、前記サンプル中に存在する各画分の相対的な量の％を計算する前記工程が、以下の等式：
ＰＲＡ＝ＲＦ×ＡＵＣ _％Ｒ
に従って決定され、ここで、
ＰＲＡ＝各画分の相対的な量の％
ＲＦ＝応答係数
ＡＵＣ _％Ｒ＝ＡＵＣの相対的な％［（１００×ＡＵＣ _Ｃ）／ＡＵＣ _Ｔ）］
ＡＵＣ _Ｃ＝１つの成分についての曲線下の面積
ＡＵＣ _Ｔ＝全ての成分についての曲線下の面積の合計、
である、方法。
（項目５６）多糖の成分の定量的な値を示す、コンピューター読み取り可能な媒体中に実体的に具体化されるデータ構造を生成するための、コンピューターが実行する方法であって、該方法は、項目５５に記載の計算を実行する作動を包含する、方法。
（項目５７）前記成分が、ΔＵＨ _{ＮＡＣ，６Ｓ} ＧＨ _{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ} 、ΔＵＨ _{ＮＳ，６Ｓ} ＧＨ _{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ} ；ΔＵＨ _{ＮＡＣ，６Ｓ} ＧＨ _{ＮＳ，３Ｓ} ；またはΔＵＨ _{ＮＳ，６Ｓ} ＧＨ _{ＮＳ，３Ｓ} のいずれか１つに対応するピークのうちの１つである、項目５０に記載の方法。
（項目５８）グリコサミノグリカンの組成物を生成する方法であって、該方法は、
（Ａ）溶媒中で、グリコサミノグリカン含有サンプルの塩沈殿を実行して、第一の高分子量画分、および単離されたＬＭＷＨの第二の低分子量画分を生成しする工程、ならびに
（Ｂ）該単離されたＬＭＷＨの第二の画分を処理して、濃縮ＬＭＷＨ調製物を生成する工程、
を包含する、方法。
（項目５９）前記沈殿工程で使用される塩が、二価のカチオンと弱アニオンとの塩である、項目５８に記載の方法。
（項目６０）前記塩が、バリウム、カルシウム、マグネシウム、ストロンチウム、銅、銀、金、ニッケル、カドミウム、亜鉛、水銀、ベリリウム、パラジウム、白金、鉄または錫を含む群の中からの元素より選択される、項目５８に記載の方法。
（項目６１）前記二価のカチオンと弱アニオンとの塩が、二価の価を有する周期表の元素のカチオンの酢酸塩である、項目５９に記載の方法。
（項目６２）前記二価のカチオンと弱アニオンとの塩が、酢酸バリウム、酢酸カルシウム、酢酸マグネシウム、酢酸ストロンチウム、酢酸銅、酢酸ニッケル、酢酸カドミウム、または塩化カルシウムを含む群の中から選択される、項目５８に記載の方法。
（項目６３）前記二価のカチオンと弱アニオンとの塩が、酢酸バリウムである、項目５８に記載の方法。
（項目６４）前記二価のカチオンと弱アニオンとの塩が、酢酸カルシウムである、項目５８に記載の方法。
（項目６５）前記沈殿が、０℃〜７０℃の範囲の温度で実行される、項目５８に記載の方法。
（項目６６）前記沈殿が、４℃の温度で実行される、項目５８に記載の方法。
（項目６７）前記溶媒が、極性溶媒である、項目５８に記載の方法。
（項目６８）前記極性溶媒が、Ｈ _２Ｏ、エタノールと混合したＨ _２Ｏ、アセトンと混合したＨ _２Ｏ、またはＨ _２Ｏ、エタノールおよびアセトンの組み合わせである、項目６７に記載の方法。
（項目６９）前記極性溶媒が、Ｈ _２Ｏ、エタノールおよびアセトンの混合物である、項目６７に記載の方法。
（項目７０）前記第二の画分を処理して、前記濃縮ＬＭＷＨ調製物を得る工程が、酵素的消化である、項目５８に記載の方法。
（項目７１）前記酵素的消化に使用される酵素が、ヘパリナーゼＩＩＩである、項目７０に記載の方法。
（項目７２）前記第二の画分を処理して、前記濃縮ＬＭＷＨ調製物を得る工程が、化学的分解である、項目５８に記載の方法。
（項目７３）前記化学的分解方法が、Ｈ _２Ｏ _２、またはＣＵ ^＋およびＨ _２Ｏ _２による酸化的脱重合；亜硝酸イソアミルまたは亜硝酸による脱アミノ的切断；アルカリ処理またはヘパリナーゼによる、ヘパリンのベンジルエステルによるβ脱離的切断、を包含する、項目７２に記載の方法。
（項目７４）前記グリコアミノグリカンが、ヘパリン、ヘパリンアナログ、ＬＭＷＨ、生物工学的ヘパリン、化学的に修飾されたヘパリン、または合成ヘパリンからなる群より選択される、項目５８に記載の方法。
（項目７５）前記第一の画分を処理して、前記濃縮ＬＭＷＨ調製物を得る工程が、精製ＬＭＷＨ調製物を生成するための精製工程である、項目５８に記載の方法。
（項目７６）薬学的キャリア中に前記精製ＬＭＷＨ調製物を処方する工程をさらに包含する、項目７５に記載の方法。
（項目７７）前記濃縮ＬＭＷＨ調製物が、インタクトなＡＴ結合ドメインを含有するＬＭＷＨ調製物である、項目５８に記載の方法。
（項目７８）前記第二の画分を、処理工程の前にイオン交換クロマトグラフィーに供する工程をさらに包含する、項目５８に記載の方法。
（項目７９）少なくとも１５０ＩＵ／ｍｇの抗Ｘａ活性を有するＬＭＷＨ調製物を含有する、組成物。
（項目８０）前記ＬＭＷＨ調製物が、１より大きい抗Ｘａ因子：抗ＩＩａ因子の活性比を有する、項目７９に記載の組成物。
（項目８１）前記ＬＭＷＨ調製物が、３より大きい抗Ｘａ因子：抗ＩＩａ因子の活性比を有する、項目７９に記載の組成物。
（項目８２）前記ＬＭＷＨ調製物が、４より大きい抗Ｘａ因子：抗ＩＩａ因子の活性比を有する、項目７９に記載の組成物。
（項目８３）前記ＬＭＷＨ調製物が、５より大きい抗Ｘａ因子：抗ＩＩａ因子の活性比を有する、項目７９に記載の組成物。
（項目８４）前記ＬＭＷＨ調製物が、単離されたＬＭＷＨ調製物である、項目７９に記載の組成物。
（項目８５）前記ＬＭＷＨ調製物が、合成ＬＭＷＨ調製物である、項目７９に記載の組成物。
（項目８６）前記ＬＭＷＨ調製物が、皮下送達のために処方される、項目７９に記載の組成物。
（項目８７）前記ＬＭＷＨ調製物が、静脈内送達のために処方される、項目７９に記載の組成物。
（項目８８）前記ＬＭＷＨ調製物が、エアロゾル送達のために処方される、項目７９に記載の組成物。
（項目８９）前記ＬＭＷＨ調製物が、経口送達のために処方される、項目７９に記載の組成物。
（項目９０）前記ＬＭＷＨ調製物が、少なくとも３．５％のΔＵＨ _{ＮＡＣ，６Ｓ} ＧＨ _{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ} 、ΔＵＨ _{ＮＳ，６Ｓ} ＧＨ _{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ} ；ΔＵＨ _{ＮＡＣ，６Ｓ} ＧＨ _{ＮＳ，３Ｓ} ；またはΔＵＨ _{ＮＳ，６Ｓ} ＧＨ _{ＮＳ，３Ｓ} を含む、項目７９に記載の組成物。
（項目９１）前記ＬＭＷＨ調製物が、ΔＵＨ _{ＮＡＣ，６Ｓ} ＧＨ _{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ} 、ΔＵＨ _{ＮＳ，６Ｓ} ＧＨ _{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ} ；ΔＵＨ _{ＮＡＣ，６Ｓ} ＧＨ _{ＮＳ，３Ｓ} ；またはΔＵＨ _{ＮＳ，６Ｓ} ＧＨ _{ＮＳ，３Ｓ} に対応するピークのうちの１つの、少なくとも４．０％を含む、項目７９に記載の組成物。
（項目９２）前記ＬＭＷＨ調製物が、ΔＵＨ _{ＮＡＣ，６Ｓ} ＧＨ _{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ} 、ΔＵＨ _{ＮＳ，６Ｓ} ＧＨ _{ＮＥ，３Ｓ，６Ｓ} ；ΔＵＨ _{ＮＡＣ，６Ｓ} ＧＨ _{ＮＥ，３Ｓ} ；またはΔＵＨ _{ＮＳ，６Ｓ} ＧＨ _{ＮＳ，３Ｓ} に対応するピークのうちの１つの、少なくとも５．０％を含む、項目７９に記載の組成物。
（項目９３）５より大きい抗Ｘａ因子：抗ＩＩａ因子の活性比を有するＬＭＷＨ調製物を含む、組成物。
（項目９４）ある状態を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、
（Ａ）同一レベルのＡＴ結合配列を有するＬＭＷＨの組成物を選択する工程であって、ＡＴ結合配列のレベルが、該被験体の処置されるべき状態に依存して選択される、工程、および
（Ｂ）該同一レベルのＡＴ結合配列を有するＬＭＷＨの組成物の有効量を、被験体に投与する工程、
を包含する、方法。
（項目９５）前記被験体が、静脈または動脈の血栓塞栓疾患を有するか、またはこれらを発症する危険性がある、項目９４に記載の方法。
（項目９６）前記ＬＭＷＨの組成物が、ΔＵＨ _{ＮＡＣ，６Ｓ} ＧＨ _{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ} 、ΔＵＨ _{ＮＳ，６Ｓ} ＧＨ _{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ} ；ΔＵＨ _{ＮＡＣ，６Ｓ} ＧＨ _{ＮＳ，３Ｓ} ；またはΔＵＨ _{ＮＳ，６Ｓ} ＧＨ _{ＮＳ，３Ｓ} に対応するピークのうちの１つの、少なくとも３．５％を含むＬＭＷＨ調製物である、項目９５に記載の方法。
（項目９７）前記ＬＭＷＨの組成物が、ΔＵＨ _{ＮＡＣ，６Ｓ} ＧＨ _{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ} 、ΔＵＨ _{ＮＳ，６Ｓ} ＧＨ _{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ} ；ΔＵＨ _{ＮＡＣ，６Ｓ} ＧＨ _{ＮＳ，３Ｓ} ；またはΔＵＨ _{ＮＳ，６Ｓ} ＧＨ _{ＮＳ，３Ｓ} に対応するピークのうちの１つの、少なくとも４．０％を含むＬＭＷＨ調製物である、項目９５に記載の方法。
（項目９８）前記ＬＭＷＨの組成物が、ΔＵＨ _{ＮＡＣ，６Ｓ} ＧＨ _{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ} 、ΔＵＨ _{ＮＳ，６Ｓ} ＧＨ _{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ} ；ΔＵＨ _{ＮＡＣ，６Ｓ} ＧＨ _{ＮＳ，３Ｓ} ；またはΔＵＨ _{ＮＳ，６Ｓ} ＧＨ _{ＮＳ，３Ｓ} に対応するピークのうちの１つの、少なくとも５．０％を含むＬＭＷＨ調製物である、項目９５に記載の方法。
（項目９９）前記ＬＭＷＨの組成物が、少なくとも１５０ＩＵ／ｍｇの抗Ｘａ活性を有するＬＭＷＨ調製物である、項目９５に記載の方法。
（項目１００）前記ＬＭＷＨの組成物が、５より大きい抗Ｘａ因子：抗ＩＩａ因子の活性比を有するＬＭＷＨ調製物である、項目９５に記載の方法。
（項目１０１）少なくとも１５％の二硫酸化二糖、７５％未満の三硫酸化二糖、３〜５％の一硫酸化二糖、および少なくとも２％の４〜７個の四糖を有するＬＭＷＨ調製物を含有する、組成物。

図１は、ＡＴ−１０の（ＲＧ）_１９Ｒとのプロトン化複合体のＭＡＬＤＩ質量スペクトルである。図２は、ＡＴ−１０のヘパリナーゼ処理を示す。（Ａ）ＡＴ−１０の不完全なヘパリナーゼＩ処理。この研究で使用される条件下で、ヘパリナーゼＩは、Ｉ_２Ｓを含むグリコシド連結を切断する。（Ｂ）ヘパリナーゼＩでの徹底的な消化由来のＡＴ−１０フラグメントのＭＡＬＤＩ質量スペクトル。（Ｃ）ヘパリナーゼＩで処理したタグ化ＡＴ−１０のＭＡＬＤＩ質量スペクトルは、５つのフラグメントを示す：５７６．７Ｄａ（±Ｄに割り当て可能）の分子量を有するフラグメント、１０３７．９（^＊）および１１５４．０Ｄａの分子量を有する２つの四糖、および１６７１．４（１６１５．３の質量＋５６．１の質量タグ）の分子量を有する質量タグ化五糖。結合効率は、約９０％であったので、未標識の五糖（１６１５．１の質量）が見られる。図３は、亜硝酸を用いるＡＴ−１０の徹底的な分解を示す。Ｈ_ＮＳ残基における亜硝酸切断は、無水マンノース（Δ＝９７．１Ｄａ）を残す。サンプルをイズロニダーゼ（上）、グルコサミン６−Ｏスルファターゼ（中）およびグルクロニダーゼ（下）でその順番で処理した場合の、分解プロフィールの質量スペクトルを、挿入中に示す。図４は、ＡＴ−１０の部分的な亜硝酸分解を示すＭＡＬＤＩ質量スペクトルである。図５は、この研究で使用された３つの多糖モデル化合物の構造を示す。（Ａ）五糖１（Ｐｅｎｔａ１）は、完全なインタクトのＡＴ−ＩＩＩ結合部位を含む配列Ｈ_{ＮＳ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}Ｉ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ，ＯＭｅ}を有し、そして１５０８．２の計算分子量を有する。ヘパリナーゼＩ、ヘパリナーゼＩＩ、またはヘパリナーゼＩＩＩの切断に潜在的に供され得る２つのグリコシド切断を、Ａ．１およびＡ．２と標識する。（Ｂ）五糖２（Ｐｅｎｔａ２）（配列Ｈ_{ＮＳ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，６Ｓ}Ｉ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ，ＯＭｅ}を有しそして１４２．８１の計算分子量を有する）は、Ｐｅｎｔａ１と構造的に同一であり、内部クルコサミン上により少ない３−Ｏ硫酸化が存在し、従って、完全なＡＴ−ＩＩＩ部位を含まない。Ｐｅｎｔａ１を用いるように、ヘパリナーゼ切断に潜在的に供され得る結合を、Ｂ．１およびＢ．２と標識する。（Ｃ）ヘパリナーゼ由来の五糖（Ｈｅｘａ１）（配列ΔＵ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}ＩＨ_{ＮＡｃ，６Ｓ，}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}を有する）をまた、この研究において使用した。Ｈｅｘａ１（計算分子量１６１４．３）は、部分的にインタクトなＡＴ−ＩＩＩ結合部位のみを含む：ＡＴ−１０と同様に、これは、還元末端Ｉ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}二糖単位を欠失している。Ｐｅｎｔａ１およびＰｅｎｔａ２を用いるように、潜在的な切断の部位を、Ｃ．１、Ｃ．２と標識する。図６は、Ｐｅｎｔａ１の（Ａ）ヘパリナーゼＩ、（Ｂ）ヘパリナーゼＩＩ、および（Ｃ）ヘパリナーゼＩＩＩの消化産物のＭＡＬＤＩ質量スペクトルである。ヘパリナーゼＩとヘパリナーゼＩＩの両方は、Ｇ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ} ^↓Ｉ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}結合（部位Ａ．２）においてＰｅｎｔａ１を切り取り、五硫酸化三糖および三硫酸化二糖産物を得る。Ｐｅｎｔａ１は、ヘパリナーゼＩＩＩによって切断可能ではない。図７は、（ＲＧ）_１９Ｒと複合体化したＰｅｎｔａ２の（Ａ）ヘパリナーゼＩ、（Ｂ）ヘパリナーゼＩＩ、および（Ｃ）ヘパリナーゼＩＩＩの消化産物のＭＡＬＤＩ質量スペクトルである。図８は、（ＲＧ）_１９Ｒと複合体化したＨｅｘａ１の（Ａ）ヘパリナーゼＩ、（Ｂ）ヘパリナーゼＩＩ、および（Ｃ）ヘパリナーゼＩＩＩの消化産物のＭＡＬＤＩ質量スペクトルである。図９は、ｐＨ６．０Ｉ＝０．０２５における全長ヘパリン（黒丸）またはＡＴ−１０（黒菱形）のいずれかでのＡＴ−ＩＩＩの蛍光滴定を示す。データを、最初のＡＴ−ＩＩＩ蛍光に対する糖の導入の際のＡＴ−ＩＩＩ蛍光（Ｉ／Ｉ_０）対添加された多糖の濃度の比としてプロットする。このデータを非線形回帰によって適合し、Ｋ_Ｄを決定した。ヘパリンについて、測定されたＫ_Ｄ値は、１０ｎＭであったが、ＡＴ−１０について、この値は、８００ｎＭであった。挿入は、ｐＨ７．４Ｉ＝０．１５でのＡＴ−ＩＩＩへのヘパリンの結合を示す。３６ｎＭの測定されたＫ_Ｄは、ＡＴ−ＩＩＩについてのヘパリンの親和性の他の決定と好都合に一致する。図１０は、ＡＴ−１０十糖の機能的分析およびＡＴ−ＩＩＩ結合五糖に対する比較を示す。ＡＴ−１０十糖（黒三角）のインビトロ抗凝固活性を、合成五糖（白四角）またはエノキサパリン（ｅｎｏｘａｐａｒｉｎ）（黒四角）（ヘパリンの化学的切断を介して生成された低分子量ヘパリン）の両方と比較した。３つの化合物の活性を、精製されたＸａ因子を使用して（Ａ）抗ＩＩａ活性、（Ｂ）抗Ｘａ活性、（Ｃ）抗Ｘａ活性のいずれかを測定することによって、または（Ｄ）Ｈｅｐ試験を介して評価した。また、活性化された部分的なトロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）およびトロンビン時間（ＰＴ）を測定し、ここで、抗Ｘａ活性：抗ＩＩａ活性の高い比と一貫して、いかなる化合物も有意な活性を示さなかった。図１１Ａおよび１１Ｂは、ブタ腸粘膜由来のＵＦＨの組成分析のグラフを示す。ＵＦＨを、ヘパリナーゼＩ、ヘパリナーゼＩＩ、およびヘパリナーゼＩＩＩで消化し、そしてキャピラリー電気泳動（ＣＥ）に供した。従って、ピーク１（図９Ａ）は、三硫酸化二糖ΔＵ_２Ｓ，Ｈ_{ＮＳ，６Ｓ}として確認された。ピーク２、３、および４は、二硫酸化二糖であり、ピーク５、６、および７は、単硫酸化二糖である。ピーク８は、四糖ΔＵＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}である。これらに加えて、図９Ｂに示されるように、硫酸化糖よりもはるかにゆっくりと移動する少量の非硫酸化二糖が存在する。図１２は、ＡＴ−１０五糖ΔＵ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}ΔＵ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}ΔＵ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}ＩＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}の徹底的な消化のＣＥトレースを示す。ヘパリンの徹底的な消化におけるピーク８の四糖は、ΔＵＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}と同じ質量および移動時間を有する。図１３は、ΔＵＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}含量の関数としてのＵＦＨの異なる画分についての抗Ｘａ活性のグラフである。％のΔＵＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}の関数としての抗Ｘａ因子活性のプロットは、ｒ＝０．９１を有する直線を与える。

（詳細な説明）
本発明は、多糖生物学の分野において新規の発展を導いたいくつかの発見を含む。多糖の特徴付けにおける主要な問題のうちの１つは、その構造多様性から生じる。この構造多様性は、多糖に関する配列−機能の関連性を研究することを困難にする要素のうちの１つである。規定された多糖の化学合成が、生物学的な活性に対する相対的な寄与を研究する際に使用されている（例えば、ヘパリン五糖配列における特定の改変の高親和性ＡＴ−ＩＩＩ結合（Ｄｅｓａｉ，Ｕ．Ｒ．，Ｐｅｔｉｔｏｕ，Ｍ．，Ｂｊｏｒｋ，Ｉ＆Ｏｌｓｏｎ，Ｓ．Ｔ．（１９９８）Ｊ
ＢｉｏｌＣｈｅｍ２７３，７４７８−８７．）。しかし、このような合成方法は、複雑であり、そして他の生物学的配列の研究に広範に適用されていない。目的のタンパク質と多糖の親和性分別および引続く特徴付けを含む代替アプローチが、親和性を決定する多糖の硫酸化パターンに関するいくつかの全体的な情報を提供している（Ｐａｒｔｈａｓａｒａｔｈｙ，Ｎ．，Ｇｏｔｏｗ，Ｌ．Ｆ．，Ｂｏｔｔｏｍｓ，Ｊ．Ｄ．，Ｋｕｔｅ，Ｔ．Ｅ．，Ｗａｇｎｅｒ，Ｗ．Ｄ．＆Ｍｕｌｌｏｙ，Ｂ．（１９９８）ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２７３，２１１１１−４．；Ｓａｓａｋｉ，Ｔ．，Ｌａｒｓｓｏｎ，Ｈ．，Ｋｒｅｕｇｅｒ，Ｊ．，Ｓａｌｍｉｖｉｒｔａ，Ｍ．，Ｃｌａｅｓｓｏｎ−Ｗｅｌｓｈ，Ｌ．，Ｌｉｎｄａｈｌ，Ｕ．，Ｈｏｈｅｎｅｓｔｅｒ，Ｅ．＆Ｔｉｍｐｌ，Ｒ．（１９９９）ＥｍｂｏＪ１８，６２４０−８．；ならびにＫｒｅｕｇｅｒ，Ｊ．，Ｐｒｙｄｚ，Ｋ．，Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ，Ｒ．Ｆ．，Ｌｉｎｄａｈｌ，Ｕ．＆Ｓａｌｍｉｖｉｒｔａ，Ｍ．（１９９９）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ９，７２３−９．）。

本発明は、１つの局面において、多糖サンプルを特徴付けるための新規方法に基づく。多糖配列が、迅速かつ正確に配列決定されて、多糖のシグネチャー成分を同定し得ることが、発見された。このシグネチャー成分は、以前可能ではなかった様式で多糖サンプルを特徴付けるために使用され得る。薬品等級の多糖の分析は、米国薬局方（ＵＳＰ）および他の国定の薬局方によって管理される。一般的に、多糖に必要とされる分析の型は、機能的アッセイであり、そしていくつかの場合、非常に一般的な構造アッセイである。市販のヘパリン調製物の活性／純度を決定するために現在使用されているアッセイは、インビトロ凝集アッセイおよび細菌エンドトキシンについての試験である。ヘパリンの量は、ＵＳＰ参照標準（単位／ｍｌとして規定される）または未分別ヘパリンについての第五国際標準（ＷＨＯ−５）（国際単位／ｍｌとして規定される）と比較して、２０℃で１時間維持した場合に１ｍｌのヒツジ血漿に半分の血塊を生じさせる量であるとして、決定される。（Ｌｉｎｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｊ．＆Ｇｕｎａｙ，Ｎ．Ｓ．（１９９９）ＳｅｍｉｎＴｈｒｏｍｂＨｅｍｏｓｔ２５，５−１６．）。他（非多糖）薬物についての厳格な規制必要条件と比較して、これらの特徴付け標準は、時代遅れである。

本発明の方法は、これらのサンプルを特徴付けるためのよりさらに正確な方法を提供する。この方法は、多糖を含むサンプルを操作して、シグネチャー成分の存在または非存在を同定する工程を包含する。サンプル中に存在するシグネチャー成分の量が、決定され得る。シグネチャー成分の量は、サンプルの正確な特徴付けを提供する。

従って、いくつかの局面において、本発明は、シグネチャー成分を有するサンプル中の多糖に実験的制限を適用して改変多糖を生成し、多糖がそのサンプル中に存在することの指標としてサンプル中のシグネチャー成分の存在を決定し、そしてそのサンプルを分析するためにシグネチャー成分の存在または非存在を決定することによって、サンプルを分析する方法である。

「多糖」は、互いに連結された単糖から構成されるポリマーである。多くの多糖において、多糖の基本的な構築ブロックは、実際は二糖単位であり、この二糖は、反復しても反復しなくてもよい。従って、多糖に関して使用される場合、単位は、多糖の基本的な構築ブロックをいい、そして単量体構築ブロック（単糖）または二量体構築ブロック（二糖）を含み得る。

多糖サンプルを特徴付けるための方法は、ヘパリン様グリコサミノグリカン（ＨＬＧＡＧ）の実験的な分析に基づいて開発されたが、本明細書中に教示される特性は、他の多糖にまで及び得る。本発明の方法は、例としてＨＬＧＡＧに関して考察されるが、本方法は、ＨＬＧＡＧに限定されない。従って、１つの実施形態において、分析される多糖サンプルとしては、ＨＬＧＡＧまたはグリコサミノグリカンが挙げられる。本明細書中に使用される場合、用語「ＨＬＧＡＧ」および「グリコサミノグリカン」は、交換可能に使用されて、ヘパリン様構造およびヘパリン様特性を有する分子のファミリーをいう。これらの分子としては、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）、ヘパリン、生物工学的に調製されたヘパリン、化学的に改変されたヘパリン、合成ヘパリン、および硫酸ヘパランが挙げられるが、これらに限定されない。用語「生物工学的ヘパリン」は、化学的に改変された天然の供給源の多糖から調製されたヘパリンを含み、そして、Ｒａｚｉら、Ｂｉｏｃｈｅ．Ｊ．１９９５Ｊｕｌ１５；３０９（Ｐｔ２）：４６５−７２に記載される。化学的に改変されたヘパリンは、Ｙａｔｅｓら、ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＲｅｓ（１９９６）Ｎｏｖ２０；２９４：１５−２７に記載され、そして当業者に公知である。合成ヘパリンは、当業者に周知であり、そしてＰｅｔｉｔｏｕ，Ｍ．ら、ＢｉｏｏｒｇＭｅｄＣｈｅｍＬｅｔｔ．（１９９９）Ａｐｒ１９；９（８）：１１６１−６に記載される。

以下の実施例に示されるように、ＡＴ−ＩＩＩ分別した十糖（ＡＴ−１０）（これは、ＨＬＧＡＧのシグネチャー成分として使用され得る）の配列が、特性コード化命名法／質量分析法（ＰＥＮ−ＭＡＬＤＩ）、米国特許出願第０９／５５７，９９７および同第０９／５５８，１３７（２０００年４月２４日出願）（これらは、共通した発明者を有する）ならびにＶｅｎｋａｔａｒａｍａｎ，Ｇ．，Ｓｈｒｉｖｅｒ，Ｚ．，Ｒａｍａｎ，Ｒ．＆Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８６，５３７−４２．に記載される配列決定方法論を用いて、同定された。積分グリカン配列決定（ＩｎｔｅｇｒａｌＧｌｙｃａｎＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＩＧＳ）（Ｔｕｒｎｂｕｌｌ，Ｊ．Ｅ．，Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｊ．Ｊ．＆Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，Ｊ．Ｔ．（１９９９）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９６，２６９８−７０３．）および十糖の陽子核磁気共鳴（^１ＨＮＭＲ）分析は、ＰＥＮ−ＭＡＬＤＩの結果と一致している。この配列決定戦略の順応性はまた、本発明者らがオリゴ糖（存在する場合）の汚染に関する配列情報を引き出し得るという事実によってもまた、実証される。化学的な複合体ＡＴ−ＩＩＩ分別多糖の配列決定（稀有であるグルコサミンの３−Ｏ−硫酸化を含む）は、目的の他のＨＬＧＡＧオリゴ糖（例えば、増殖因子結合特性を有するＨＬＧＡＧ）の分析に延長され得る方法論を確立した。これらの型の配列についての直接的な配列決定方法論は、この重要な分子クラスの構造−機能研究を可能にした。

ＨＬＧＡＧおよび他の多糖全てが、シグネチャー成分を有する。「シグネチャー成分」は、特定の多糖に存在し、かつその特定の多糖の特徴である、オリゴ糖である。選択されるシグネチャーの特性は、研究される多糖の型およびその多糖に適用される実験的制限の型に依存し得る。このシグネチャーは、特定の実験的制限によって操作される特定の多糖の再生可能なエレメントである。例えば、同定され、かつ有用であることが実証されたＨＬＧＡＧのいくつかのシグネチャーは、ΔＵＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}、ΔＵＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}；ΔＵＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ}；またはΔＵＨ_{ＮＳ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ}である。ＨＬＧＡＧを含むサンプルが、へパリナーゼ処理後にキャピラリー電気泳動に供される場合、このシグネチャーが同定され、そして定量化され得る。

このシグネチャー成分は、生物学的に活性であっても不活性であってもよい。重要な情報は、シグネチャー成分から誘導され得る（このシグネチャー成分が活性な成分であるか不活性な成分であるかに関わらない）。生物学的活性を有するシグネチャーは、特定の生物学的機能を生成することが公知のオリゴ糖である。例えば、ＨＬＧＡＧの四糖であるΔＵＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}、ΔＵＨ_{ＮＳ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}；ΔＵＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ}；またはΔＵＨ_{ＮＳ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ}は、第Ｘａ因子の阻害を生じる抗凝固性活性を保有する配列の一部であることが公知である。従って、サンプル中のこの成分の存在は、ＨＬＧＡＧの抗凝固性活性の直接的な指標である。

生物学的活性を有するシグネチャーが、種々の目的のために使用され得る。例えば、これらの型のシグネチャーは、多糖調製物のバッチ間変動性をモニタリングするのに有用である。各バッチの純度は、そのバッチ中の活性なシグネチャー成分の量を決定することによって、決定され得る。これらのシグネチャーはまた、サンプル中のシグネチャー成分の存在がそのサンプル中の活性な成分を示す場合、サンプル中の活性な成分の存在をモニタリングするのに有用である。例えば、シグネチャー成分は、加工手順を通して活性成分を追跡するために使用され得る。この方法を用いて、各分離工程後に生成物を試験し、生物学的に活性な成分を含む画分を決定し得る。サンプル中の活性な成分の量はまた、そのサンプル中のシグネチャー成分の量を決定することによって、定量され得る。

この方法はまた、どのサンプルが最も高い活性を有するかを決定するためか、またはサンプルの純度を比較するために、少なくとも２つのサンプルに対して実行され得る。この場合、少なくとも２つのサンプルの各中のシグネチャー成分の相対量が決定される。シグネチャー成分の最も高い相対レベルが、最も活性なサンプルを示す。

さらに、この活性なシグネチャーは、化合物または化合物ライブラリーをスクリーニングすることによって生物学的に活性な分子を同定するために使用され得る。ライブラリーとしては、例えば、ファージディスプレイライブラリー、コンビナトリアルライブラリー、ペプトイドおよび非ペプチド合成部分のライブラリーが挙げられる。ファージディスプレイは、シグネチャー成分と相互作用するペプチド（ヒト抗体を含む）を同定する際に特に有効であり得る。簡単に言うと、従来の手順を用いて４〜約８０アミノ酸残基の挿入物を提示するファージライブラリー（例えば、ｍ１３、ｆｄ、またはλファージを使用する）を調製する。例えば、挿入物は、完全に縮重したアレイまたは偏ったアレイを提示し得る。次いで、シグネチャー成分に結合する挿入物保有ファージを選択し得る。このプロセスは、シグネチャー成分に結合するファージの数回の再選択を通して、繰り返され得る。回を繰り返すことによって、特定の配列を保有するファージの富化が導かれる。ＤＮＡ配列分析を実施して、発現ポリペプチドの配列を同定し得る。シグネチャー成分に結合する配列の最小線状部分が、決定され得る。最小線状部分およびその上流または下流の１つ以上のさらなる縮重残基の一部または全てを含む挿入物を含む偏りライブラリーを用いて、この手順を繰り返し得る。酵母ツーハイブリッドスクリーニング方法もまた、シグネチャー成分に結合するポリペプチドを同定するために使用され得る。既知のシグネチャー成分に基づく、ペプチドおよび非ペプチドのライブラリーは、当業者によって容易に作製され得る。商業企業（例えば、ＡｒＱｕｌｅ（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）は、模倣化合物の生成のためのカスタムライブラリーを調製する。

多糖の生物学的に活性な部分の例としては、ヘパリンのＡＴ−ＩＩＩ結合ドメインの４糖、ヘパリンのＦＧＦ結合ドメインの四糖、ΔＵＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}、ΔＵＨ_{ＮＳ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}、ΔＵＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ}、またはΔＵＨ_{ＮＳ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ}であるが、これらに限定されない。

生物学的に不活性であるシグネチャーは、特定の公知の生物学的機能と関連しないオリゴ糖である。これらのオリゴ糖は、いくつかの生物学的機能を有し得るが、分析される特定の機能を有し得ない。例えば、オリゴ糖は、腫瘍細胞増殖の阻害を実際に引き起こし得るが、凝固カスケードに対するいかなる効果も有し得ない。多糖サンプルが抗凝固目的に有用な多糖の存在またはこのような多糖の量を同定する目的のために評価される場合、検出されるオリゴ糖は、生物学的に不活性なシグネチャーであると考えられる。一方、多糖サンプルは、腫瘍細胞増殖を予防するのに有用な多糖の存在またはこのような多糖の量を同定する目的のために評価され、検出されるオリゴ糖は、生物学的に活性なシグネチャーであると考えられる。

生物学的に不活性であるシグネチャーは、生物学的に活性なシグネチャーと同じ目的のうちのいくつか、ならびに他の目的のために使用され得る。生物学的に不活性なシグネチャーはまた、多糖調製物のバッチ間の変動性をモニターするために使用され得る。２つのバッチは互いに比較されるので、不活性なシグネチャーおよび活性なシグネチャーの両方が使用され得る。サンプル中のシグネチャー成分の存在が、特定の活性を欠くサンプルを示すか、または低いレベルのこの活性を有するサンプルを示す場合、不活性なシグネチャー成分はまた、そのサンプル中の活性な成分の存在をモニタリングするために使用され得る。従って、不活性なシグネチャー成分の存在が活性な成分の存在と反比例する場合、不活性な成分の存在は、そのサンプルの活性に関する重要な情報を提供し得る。例えば、不活性なシグネチャー成分が、多糖の活性成分の分解産物である場合、不活性な成分の存在は、不活性な成分が存在しなかったというよりも、活性な成分のうちのいくつかが分解し、ゆえにそのサンプルは活性が低いということを示す。

本明細書中に使用される場合、「実験的制限」は、サンプルの改変を生じさせてシグネチャーの検出を可能にする、多糖サンプルに対して実行される生物学的プロセスである。実験的制限としては、分離方法（例えば、質量分析法、キャピラリー電気泳動、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ゲル透過クロマトグラフィー、核磁気共鳴）；酵素消化（例えば、外酵素、内酵素）；化学消化；化学改変；化学ピーリング（すなわち、単糖単位の除去）；ならびに酵素改変（例えば、硫酸ヘパリンスルホトランスフェラーゼを用いた特定の位置における硫酸化）が挙げられるが、これらに限定されない。

シグネチャーは、使用される実験的制限と一貫する任意の手段によって同定され得る。例えば、シグネチャー成分の分子量は、質量分析法を含む幾つかの方法によって決定され得る。多糖の分子量を決定するための質量分析法の使用は、当該分野で周知である。質量分析法は、生成されたフラグメント（例えば、酵素切断による）の質量を報告する際のその精度（±１ダルトン）に起因して、そしてまた、ｐＭのサンプル濃度のみを必要とすることに起因して、多糖を特徴付けるための強力なツールとして使用されている。例えば、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）は、刊行物（例えば、Ｒｈｏｍｂｅｒｇ，Ａ．Ｊ．ら、ＰＮＡＳ，ＵＳＡ，ｖ．９５，ｐ．４１７６−４１８１（１９９８）；Ｒｈｏｍｂｅｒｇ，Ａ．Ｊ．ら、ＰＮＡＳ，ＵＳＡ，ｖ．９５，ｐ．１２２３２−１２２３７（１９９８）；およびＥｒｎｓｔ，Ｓ．ら、ＰＮＡＳ，ＵＳＡ，ｖ．９５，ｐ．４１８２−４１８７（１９９８）（これらの各々は、参考として本明細書によって援用される））中に、多糖フラグメントの分子量を同定することについて記載されている。当該分野で公知の質量分析法の他の型（例えば、エレクトロスプレー−ＭＳ）、高速原子衝撃質量分析法（ＦＡＢ−ＭＳ）および衝突活性化脱離質量分析法（ＣＡＤ）もまた使用して、多糖フラグメントの分子量を同定し得る。

質量分析データは、多糖シグネチャー成分単独に関する情報を確認するため、または多糖が酵素または化学物質によって分解を引き起こした後に多糖シグネチャー成分に関する情報を確認するための価値のあるツールであり得る。多糖の分子量が同定された後、それは、他の既知多糖の分子量に対して比較され得る（例えば、米国特許出願０９／５５７，９９７および同０９／５５８，１３７（２０００年４月２４日出願）の方法を用いて）。これらの特許出願に示されるように、分子量を比較するための１つの技術は、質量ラインを生成し、そして未知の多糖の分子量をその質量ラインに対して比較し、同じ分子量を有する多糖の部分集団を決定することである。「質量ライン」は、情報データベースであり、好ましくは、多糖の分子量に基づいて、特有の配列を有する多糖の各可能な型に関する情報を保存する、グラフまたはチャートの形式である。質量分析法データは、１Ｄａの精度までフラグメントの質量を示すので、長さは、その質量ライン上の質量を調べることによって、フラグメントに対して独自に割り当てられ得る。さらに、二糖よりも長い特定の長さのフラグメント内において、スルフェート基（８０．０６Ｄａ）と置換された２つのアセテート基（８４．０８Ｄａ）を示す、最小４．０２Ｄａの質量の差異が存在することが、質量ラインから決定され得る。従って、多糖フラグメントの多数のスルフェートおよび多数のアセテートは、質量分析法データから質量によって決定され得、そしてこのような数が、多糖フラグメントに対して割り当てられ得る。

分子量に加えて、シグネチャー成分の他の特性が決定され得る。置換基または化学単位（総置換基または化学単位の、量および型）の組成比は、当該分野で公知の方法論（例えば、キャピラリー電気泳動）を用いて決定され得る。多糖は、最初の実験的制限（例えば、酵素分解または化学分解）に供されて、多糖をより小さいフラグメントの分離し得る。次いで、これらのフラグメントは、第２の実験制約に供され得、すなわち、これらは、キャピラリー電気泳動を用いて分離されて、多糖中に存在する置換基または化学単位の量および型を決定し得る。あるいは、多糖は、事前の酵素分解なしで、単一の実験的制限（例えば、キャピラリー電気泳動）に供され得る。

キャピラリーゲル電気泳動の方法において、反応サンプルは、小さい直径のゲル充填キャピラリーによって分析され得る。小さい直径（５０μｍ）のキャピラリーは、電気泳動の間に生成された熱の効率的な消散を可能にする。従って、高いフィールド強度を、過度のジュール熱（４００Ｖ／ｍ）を伴わずに使用し得、分離時間を１反応実行あたり約２０分に低下させ、ゆえに、従来のゲル電気泳動を超えた分解を増大させる。さらに、多くのキャプラリーが並行して分析され得、生成された多糖情報の増幅を可能にする。

シグネチャー成分を評価するための他の方法もまた、利用され得る。例えば、他の方法としては、粘性（Ｊａｎｄｉｋ，Ｋ．Ａ．，Ｇｕ，Ｋ．およびＬｉｎｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｊ．，（１９９４），Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，４：２８４−２９６）または総ＵＶ吸光度（Ｅｒｎｓｔ，Ｓ．ら（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１５：５８９−５９７）のようなパラメーターに依存する方法が挙げられる。

ＨＬＧＡＧフラグメントは、ヘパリンリアーゼ酵素（ヘパリナーゼ）のような酵素または亜硝酸を用いて分解され得、そしてこれらはまた、スルフェート基を上記に言及した位置に移動させるかまたはスルフェート基をそれらの位置から取り除く異なる酵素を用いて改変され得る。改変酵素は、外溶解性かつ非進展的である酵素であり、このことは、これらの酵素が非還元末端に一度だけ作用し、そしてその鎖の残りを連続して改変することなく、そのヘパリン鎖を離れさせることを意味する。二糖単位中の改変可能な位置の各々について、改変酵素が存在する。スルフェート基を添加する酵素はスルホトランスフェラーゼと呼ばれ、そしてスルフェート基を取り除く酵素は、スルファターゼと呼ばれる。改変酵素としては、２−Ｏスルファターゼ／スルフォトランスフェラーゼ、３−Ｏスルファターゼ／スルフォトランスフェラーゼ、６−Ｏスルファターゼ／スルフォトランスフェラーゼおよびＮ−デアセチラーゼ−Ｎ−スルホトランスフェラーゼが挙げられる。これらの酵素の機能は、これらの名称から明らかであり、例えば、２−Ｏスルホトランスフェラーゼは、スルフェート基をイズロン酸の２−Ｏ位に転移させ（２−Ｏスルフェートグルクロン酸は、ＨＬＧＡＧ鎖中で希少な頻度である）、そして２−Ｏスルファターゼは、スルフェート基をイズロン酸の２−Ｏ位から取り除く。

ＨＬＧＡＧ分解酵素としては、ヘパリナーゼ−Ｉ、ヘパリナーゼ−ＩＩ、ヘパリナーゼ−ＩＩＩ、Ｄ−グルクロニダーゼおよびＬ−イズロニダーゼ、改変バージョンのｓｏｆヘパリナーゼ、これらの改変体および機能的に活性なフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来の３つのヘパリナーゼは、ＬＭＷＨ（５，０００〜８，００Ｄａ）および超低分子量ヘパリン（約３，０００Ｄａ）の生成のために使用されている酵素ツールである。ヘパリナーゼＩは、２−Ｏ硫酸化ウロン酸においてＨＬＧＡＧの高度に硫酸化された領域を切断し、一方ヘパリナーゼＩＩは、より広い基質特異性を有し、そして２−Ｏ硫酸化ウロン酸および２−Ｏ非硫酸化ウロン酸の両方を含むグリコシド連結を切断する（Ｅｒｎｓｔ，Ｓ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．，Ｃｏｏｎｅｙ，Ｃ．Ｌ．＆Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ．（１９９５）ＣｒｉｔＲｅｖＢｉｏｃｈｅｍＭｏｌＢｉｏｌ３０，３８７−４４４）。ヘパリナーゼＩとは対照的に、ヘパリナーゼＩＩＩは、主に、ＨＬＧＡＧの硫酸化にある領域（すなわち、非硫酸化ウロン酸を含むグリコシド連結）を切断する（Ｅｒｎｓｔ，Ｓ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．，Ｃｏｏｎｅｙ，Ｃ．Ｌ．＆Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ．（１９９５）ＣｒｉｔＲｅｖＢｉｏｃｈｅｍＭｏｌＢｉｏｌ３０，３８７−４４４）。ヘパリナーゼの基質特異性への複数の調査は、ＨＬＧＡＧに関する構造−機能関係を発展させるためのツールとして、その有用性が高まっている。いくつかの特許および特許出願は、ヘパリナーゼの有用な改変ならびにヘパリナーゼの改変体およびフラグメントを記載する。（米国特許第６，２１７，８６３Ｂ１号ならびに係属出願０９／３８４，９５９および０９／８０２，２８５を含む）。他の改変および改変体もまた、有用である。薬理学的ＬＭＷＨの生成因子としてのこれらのヘパリナーゼの有用性を最大化するために、より詳細な理解が必要とされる。本発明の発見は、これらの詳細のいくつかを提供する（下に記載する）。

名前を挙げるとすると、グルクロニダーゼおよびイズロニダーゼは、それぞれ、グルクロン酸およびイズロン酸の後でグリコシド連結にて切断する。亜硝酸は、Ｎ硫酸化ヘキソサミン後のグリコシド連結においてランダムにクリップし、６員環ヘキソサミン環を５員環無水マンニトール環に変換する。

シグネチャー成分の存在を同定することによって多糖を分析するための方法は、多糖の定性的評価（例えば、シグネチャー成分が存在するかしないかにかかわらず）、または定量的評価（例えば、シグネチャー成分の量は、異なるサンプルを比較するためのサンプル品質（例えば、活性、純度）を示すため、または異なるサンプルと簡単に比較するために、表される）。いくつかの局面において、この方法は、多糖サンプル中の成分を同定する工程、および成分の量の定量的な値を決定する工程によって実行される。いくつかの実施形態において、本方法は、少なくとも２つの成分を同定および定量する工程を包含する。

定量的な値は、任意の平均値、例えば、サンプルをキャピラリー電気泳動、レセプター因子（ＲＦ）、またはサンプル中に存在する各画分の相対量のパーセントによって処理される場合、曲線下の面積（ＡＵＣ）を決定することによって、計算され得る。これらの型の計算を行う方法は、以下の実施例の節に詳細に記載される。簡単に言うと、ＡＵＣがＣＥスペクトルから直接計算され得る。応答係数は、コントロールオリゴ糖と同じ応答を与えるシグネチャーの量である。ＲＦは、例えば、吸光度に関して計算され得、そしてコントロールサンプルの吸光度と比較される。サンプル中に存在する各画分の相対量のパーセントは、以下の式：
ＰＲＡ＝ＲＦ×ＡＵＣ_％Ｒ
ここで、
ＰＲＡ＝各画分の相対的な量の％、
ＲＦ＝応答係数
ＡＵＣ_％Ｒ＝ＡＵＣの相対的な％［（１００×ＡＵＣ_ｃ）／ＡＵＣ_Ｔ］］
ＡＵＣ_ｃ＝１成分についての曲線下の面積
ＡＵＣ_Ｔ＝全成分についての曲線下の面積の合計
に従って、決定され得る。

このデータは、個別に処理されるかまたはコンピューターによって処理され得る。例えば、多糖の成分の定量的な値を表す、コンピューター読み取り可能な媒体中に実体的に具体化される、データ構造を作成するためのコンピューターによる実行方法が、本発明に従って実行され得る。定量的な決定が、上記の計算を実行することによってなされる。

コンピュータープログラムとして上記を実行し得るコンピューターシステムは、典型的には、使用者へ情報を表示する出力デバイスおよび使用者からの入力を受け取る入力デバイスの両方に接続された主要ユニットを含む。この主要ユニットは、一般的に相互接続機構を介して記憶システムに接続されたプロセッサーが含む。入力デバイスおよび出力デバイスの両方はまた、相互接続機構を介してこのプロセッサーおよび記憶システムに接続され得る。

１以上の出力デバイスが、コンピューターシステムに接続され得る。出力デバイスの例としては、陰極線管（ＣＲＴ）ディスプレイ、液晶表示器（ＬＣＤ）、プリンター、連絡デバイス（例えば、モデム）およびオーディオ出力が挙げられる。１以上の入力デバイスがまた、コンピューターシステムに接続され得る。入力デバイスの例としては、キーボード、キーパッド、トラックボール、マウス、ペンおよびタブレット、連絡デバイス、ならびにデータ入力デバイス（例えば、センサー）が挙げられる。本明細書中で開示される内容は、コンピューターシステムと組合わせて使用される特定の入力デバイスもしくは出力デバイス、または本明細書中に記載される入力デバイスもしくは出力デバイスに限定されない。

コンピューターシステムは、コンピュータープログラム可能な言語（例えば、Ｃ＋＋、Ｊａｖａ（登録商標）または他の言語（例えば、スクリプト言語またはアセンブリ言語））を使用してコンピュータープログラム可能な、一般用途のコンピューターシステムであり得る。コンピューターシステムはまた、特別にプログラムされた、特別な目的のハードウェア（例えば、Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ＳｐｅｃｉｆｉｃＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＣｉｒｃｕｉｔ（ＡＳＩＣ）のような）を含み得る。一般用途のコンピューターシステムにおいて、プロセッサーは、典型的には、市販のプロセッサーであり、Ｘ８６シリーズプロセッサー、Ｃｅｌｅｒｏｎプロセッサー、およびＰｅｎｔｉｕｍ（登録商標）プロセッサー（Ｉｎｔｅｌより入手可能）、ならびにＡＭＤおよびＣｙｒｉｘからの類似のデバイス、６８０Ｘ０シリーズマイクロプロセッサー（Ｍｏｔｏｒｏｌａから入手可能）、ＩＢＭからのＰｏｗｅｒＰＣマイクロプロセッサーおよびＤｉｇｉｔａｌＥｑｕｉｐｍｅｎｔＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＡｌｐｈａ−シリーズプロセッサーがその例である。多くの他のプロセッサーが、利用可能である。このようなマイクロプロセッサーは、オペレーティングシステムと呼ばれるプログラムを実行する。このプログラムは、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）ＮＴ、Ｌｉｎｕｘ、ＵＮＩＸ（登録商標）、ＤＯＳ、ＶＭＳおよびＯＳ８がその例であり、これは、他のコンピュータープログラムの実行を制御し、スケジューリング、デバッギング、入力／出力制御、計算（ａｃｃｏｕｎｔｉｎｇ）、編集、記憶割当て、データ管理およびメモリー管理、ならびに連絡制御および関連サービスを提供する。プロセッサーおよびオペレーティングシステムは、高レベルにプログラムされている言語におけるアプリケーションプログラムが書き込まれ得るコンピュータープラットホームを規定する。

メモリーシステムとしては、典型的にはコンピューター読み取り可能な記録媒体および書き込み可能な揮発性記録媒体が挙げられ、磁気ディスク、フラッシュメモリーおよびテープがその例である。このディスクは、「フレキシブルディスク」のような取り外し可能ディスクであっても、ハードドライブとして公知の永久的なディスクであっても良い。ディスクは、信号が記録される多くのトラック、典型的には、二進法の形態（すなわち、１または０の配列として翻訳された形態）を有する。このような信号は、マイクロプロセッサーによって実行されるアプリケーションプログラム、またはアプリケーションプログラムによって処理されるディスク上に保存される情報を規定し得る。典型的には、操作において、プロセッサーは、非揮発性の記録媒体から集積回路メモリーエレメントに読み取られるデータを生じる。この集積回路メモリーエレメントは、典型的には、揮発性のランダムアクセスメモリー（例えば、ダイナミックランダムアクセスメモリー（ＤＲＡＭ）またはスタティックメモリー（ＳＲＡＭ））である。集積回路メモリーエレメントは、典型的には、ディスクで行うよりもプロセッサーによる情報へのより速いアクセスを可能にする。プロセッサーは、一般的には、集積回路メモリー内のデータを操作し、次いで、処理が完了した後にディスクにデータをコピーする。ディスクと集積回路メモリーエレメントとの間のデータの動きを管理するための種々の機構が、公知であり、本明細書中に開示される内容は、このような機構に限定されない。さらに、本明細書中に開示される内容は、特定のメモリーシステムに限定されない。

本明細書中に開示される内容は、特定のコンピュータープラットホーム、特定のプロセッサーまたは特定の高レベルにプログラムされた言語に限定されない。さらに、コンピューターシステムは、マルチプロセッサーコンピテントシステムであっても、コンピューターネットワークにわたって接続された多様なコンピューターを含んでもよい。図１中の各モジュール（例えば、１１０、１２０）は、コンピュータープログラムの別々のモジュールであっても、別々のコンピュータープログラムであってもよいことが理解されるべきである。このようなモジュールは、別々のコンピューター上で操作可能であり得る。データ（例えば、１０４、１０６、１１０、１１４および１１６）は、メモリーシステムに記憶されても、コンピューターシステム間で送信されてもよい。本明細書中に開示される内容は、ソフトウェアまたはハードウェアまたはファームウェア、あるいはこの組合わせを使用するいずれの特定の実行にも限定されない。このシステムの種々のエレメントは、個々にかまたは組合わせて、機械読み取り可能な記憶デバイスにおいて具体的に体系化されたコンピュータープログラム製品として、コンピュータープロセッサーによって実行され得る。この処理の種々の工程は、入力を操作しかつ出力を生成することによって機能を実行するために、コンピューター読み取り可能な媒体において具体的に体系化されたコンピュータープロセッサーを実行するプログラムによって行われ得る。このようなシステムを実行するために適切なコンピューターをプログラミングする言語としては、手続き型プログラミング言語、オブジェクト指向プログラミング言語およびこの２つの組み合わせが挙げられる。

ＬＭＷＨ組成物を調製するための改善された方法はまた、本発明に従って見出された。臨床使用のために低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）を精製する現在の方法は、グリコサミノグリカン混合物の沈殿および１〜１４，０００Ｄａのサイズの範囲のヘパリンフラグメントを含む画分の回収を含む。ヘパリンの精製に利用される標準的な方法は、Ｎ．Ｖｏｌｐｉ，ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ１２９０（１９９６）２９９−３０７において利用される：
．．．ヘパリンの移動の遅い成分および移動の速い成分を、以前に報告したように、異なる温度でバリウム塩として精製した。精製したウシ腸粘膜ヘパリンを、水に溶かし、そして酢酸バリウム（５％）を攪拌しながら徐々に添加した（この溶液のｐＨを、６．０〜７．０に調整した）。５０〜７０℃に加熱した後、この溶液を、室温（２０〜２５℃）に２４時間放置した。得られた沈殿物を、水に可溶化にし、ＡｍｂｅｒｌｉｔｅＩＲ−１２０樹脂上でそのナトリウム塩に変換した。粗精製の移動の遅いヘパリン種のナトリウム塩を、２．０倍容のアセトンを用いる沈殿によって回収し、そして乾燥した。上清を、５℃で２４時間維持し、そして沈殿物を、５℃での遠心分離によって回収した。移動の速い種のバリウム塩を、移動の遅い種について報告したように精製した。

この方法論によって得られた生成物は、患者に投与した場合に多くの問題点が存在するヘパリンフラグメントの雑多な混合物である。この問題点は、生成物の雑多な性質およびこの混合物中の活性成分のレベルを定量する能力の欠如に起因する。対照的に、本明細書中に記載される新規な精製戦略は、定量可能かつ際限成可能であり、それゆえに先行技術の生成物に関連する副作用の多くを欠いたＬＭＷＨの実質的に純粋な画分を提供する。驚くことに、先行技術の方法では実際に破棄されていた移動の速い成分（第二画分）といわれる画分が顕著な量の治療活性を有することが、本発明に従って発見された。従って、本発明の方法は、類似の型の沈殿反応を含むが、以前は破棄されていた物質の単離および操作を含む。

一般には、本発明の方法は、二価カチオンおよび弱アニオンの塩を用いる、ＨＬＧＡＧサンプルの沈殿を含む。いくつかの実施形態において、二価カチオンおよび弱アニオンの塩は、以下を含む群より選択される：バリウム、カルシウム、マグネシウム、ストロンチウム、銅、ニッケル、カドミウム、亜鉛、水銀、ベリリウム、ニッケル、パラジウム、白金、鉄またはスズ。いくつかの実施形態において、二価カチオンおよび弱アニオンの塩は、二価の原子価を有する、周期表のカチオンの元素の酢酸塩である。好ましい実施形態において、二価カチオンおよび弱アニオンの塩は、酢酸バリウムである。他の実施形態において、二価カチオンおよび弱アニオンの塩は、酢酸カルシウムまたは塩化カルシウムである。いくつかの実施形態において、当業者に公知である他の酢酸塩沈殿法が使用され得る。

沈殿は、０℃〜７０℃の温度範囲で実施され得る。沈殿についての温度は、０℃、２℃、５℃、１０℃、１５℃、２０℃、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃もしくは７０℃であり得るか、またはこの範囲内の任意の温度であり得る。好ましい実施形態において、沈殿の温度は、４℃である。他の実施形態において、沈殿の温度は、１８℃〜２２℃の範囲の温度を含む室温である。

沈殿において使用される溶媒は、極性溶媒である。いくつかの実施形態において、極性溶媒はＨ_２Ｏ、エタノール、アセトン、エタノール混合Ｈ_２Ｏ、アセトン混合Ｈ_２Ｏ、アセトンである。いくつかの実施形態において、極性溶媒は、９９：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、６５：３５、５５：４５、５０：５０、４５：５５、３５：６５、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５または１：９９の範囲のＨ_２Ｏ：エタノールの容量対容量の比を有する。他の実施形態において、極性溶媒は、９９：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、６５：３５、５５：４５、５０：５０、４５：５５、３５：６５、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５または１：９９の範囲のＨ_２Ｏ：アセトンの容量対容量の比を有する。さらに他の実施形態において、極性溶媒は、Ｈ_２Ｏ、エタノールおよびアセトンの混合物である。

沈殿工程に続いて、サンプル（第二画分）は、さらに処理される前に、必要に応じてイオン交換処理に供され得る。いくつかの例において、サンプルは、アンバーライトＩＲ−１２０カラムのようなイオン交換カラム中を通される。この型のカラムの使用は、沈殿工程で使用した塩を除去しナトリウムのような別のイオンに置換するために有用である。

グリコサミノグリカン含有サンプルは、グリコサミノグリカンまたはＨＬＧＡＧで構成される少なくとも１つの画分であるサンプルである。上記で検証されるように、用語グリコサミノグリカンまたはＨＬＧＡＧとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ヘパリン、ヘパリンアナログ、ＬＭＷＨ、生物工学的ヘパリン、化学修飾されたヘパリンまたは合成ヘパリン。

グリコサミノグリカンは、温度、溶媒および酵素について本明細書中で記載される条件を変化させることによって特定のサイズのヘパリンに分画され得る。温度変化の結果の例は、限定されることを意図しないが、温度に基づく沈殿画分の含有量における変化を例示する。５％ｗ／ｖ酢酸バリウムを４℃で使用することにより、ＦＤＡによって規定されるようなＬＭＷＨから構成される第二画分を生じる。この画分は、抗凝固についての高い活性、および低い硫酸化量（＜７０％）を有する。４℃で上清中に残った画分は、超低分子量ヘパリンとして分類され得る。４℃での沈殿と対照的に、４℃で実施した沈殿物が生じる第二画分よりも高いＭＷヘパリン（ＭＷ：１０，０００〜１４，０００）、高い硫酸化量（＞８５％）および抗凝固についてのより低い活性を有する第一画分を、室温での沈殿によって生じる。

別の非限定的な例は、５％酢酸バリウムの代わりに５％の酢酸カルシウムまたは酢酸マグネシウムを使用することである。４℃にて、この変化は、第一画分（高分子量ヘパリン）の沈殿を生じるが、上清中に第二画分（低分子量ヘパリン）を残す。次いで、第二画分は、エタノールまたはアセトンのような極性溶媒を添加することによって上清より沈殿され得る。

一般に、より大きい分子量および／またはより強い電荷の画分は、より少量の極性溶媒（例えば、エタノールまたはアセトン）を用いて、より高い温度で沈殿する。温度の低下および／または極性溶媒の量の増加は、より低い分子量、より弱い電荷およびより高い抗凝固活性を有する画分の沈殿を生じる。沈殿パラメータは、当業者によって過度の実験を要することなく変更され得る。

沈殿に続いて、第二画分（ＬＭＷＨ画分）を処理して、濃縮したＬＭＷＨ沈殿物を生成する。用語「濃縮した（濃縮された）ＬＭＷＨ調製物」は、第二の単離された画分からあれこれ変更された調製物をいう。処理工程は、分離工程または沈殿のような精製工程を含み得る。ＬＭＷＨ調製物の処理はさらに、濃縮したＬＭＷＨ調製物を得るための酵素的消化または化学的消化によって達成され得る。１つの実施形態において、この画分は消化され、そして消化に使用された酵素は、ヘパリナーゼＩＩＩまたはその機能的に活性な改変体もしくはフラグメントである。用語ヘパリナーゼを一般的に使用して、ネイティブなヘパリナーゼに加えてその機能的に活性な改変体およびフラグメントを包含する。米国特許第６，２１７，８６３号Ｂ１ならびに係属中の出願０９／３８４，９５９号および同０９／８０２，２８５号を含むいくつかの親特許および親特許出願は、ヘパリナーゼの有用な修飾および改変体およびフラグメントを記載する。ヘパリナーゼＩＩＩは、ヘパリンの脱重合を引き起こす。使用されるヘパリナーゼＩＩＩの濃度、および使用される時間（部分的消化対徹底的な消化）に依存して、特定の分子量および／または電荷のヘパリンを得る。例えば、限定されることを意図しないが、１モル等量のヘパリナーゼＩＩＩでのヘパリンの部分消化は、より長い消化時間での反応よりも、より大きい分子量および／またはより強い電荷の画分を生じる。また、ヘパリナーゼＩＩＩのモル等量の増加は、より小さいモル等量のヘパリナーゼＩＩＩが使用される場合よりも、より低い分子量および／またはより弱い電荷の画分を生じる。いくつかの実施形態において、特定の分子量、電荷および／または生物学的活性のヘパリンを得るために、ヘパリナーゼＩＩＩの濃度および消化物の長さは、本明細書中に記載されるような塩、温度、および溶媒組成物と組合わせて使用され得る。

あるいは、第二画分を化学的に分解して、濃縮したＬＭＷＨ調製物を取得し得る。１つの実施形態において、この画分は、以下が挙げられるがこれらに限定されない群より選択される方法を使用して化学的に分解される：Ｈ_２Ｏ_２、もしくはＣＵ^＋およびＨ_２Ｏ_２を用いる酸化的脱重合、亜硝酸イソアミルもしくは亜硝酸での脱アミノ切断、アルカリ処理によるヘパリンのベンジルエステルを用いるβ−脱離切断、あるいはヘパリナーゼによる方法。

Ｖｏｌｐｉ参考文献において移動の速いヘパリンといわれる沈殿物の第二画分は、Ｖｏｌｐｉ参考文献によって移動の遅いヘパリンといわれる第一画分とは異なる。第二画分の平均分子量は、８，０００ダルトンであり、第一画分の平均分子量は１４，０００ダルトンである。さらに、第二画分は、８，０００Ｄａ未満の平均分子量のヘパリン亜種として規定されるＬＭＷＨを有する１００％ＬＭＷＨから構成され、ここで、少なくとも６０％の分子が、８，０００Ｄａ未満の分子量を有する。この規定を使用すると、第一画分は０％ＬＭＷＨである。

本発明はまた、ＬＭＷＨ調製物の組成物を含む。ＬＭＷＨの組成物は、種々の分子量の分子の混合物である。上記のように、雑多な混合物は、分子量が変動し得るが、８，０００Ｄ未満の平均分子量を有するフラグメントを含む。４，０００〜６，０００ダルトンの範囲の分子量を有するＬＭＷＨの化合物の組成物は、例えば、平均サイズが４，０００〜６，０００Ｄａの範囲である種々のＫＭＷＨの混合物である。いくつかの実施形態において、サンプル中の４，０００〜６，０００ＤａであるＬＭＷＨのパーセントは、サンプル中の成分の２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％である。

いくつかの局面において、この組成物は、少なくとも１５０ＩＵ／ｍｇの抗Ｘａ活性を有するＬＭＷＨ調製物である。いくつかの実施形態において、ＬＭＷＨ調製物は、１、２、３、４または５より大きい、抗Ｘａ因子：抗ＩＩａ因子の活性比を有する。

他の局面において、この組成物は、５より大きい、抗Ｘａ因子：抗ＩＩａ因子の活性比を有するＬＭＷＨ調製物である。なお他の局面において、この組成物は、少なくとも３．５％のΔＵＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}、ΔＵＨ_{ＮＳ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}；ΔＵＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ}；またはΔＵＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ}を有するＬＭＷＨ調製物である。いくつかの実施形態において、ＬＭＷＨ調製物は、少なくとも４．０％、４．５％、５．０％、５．５％、６．０％、６．５％、７．０％、８．０％、９．０％、１０．０％、１５．０％または２０．０％のΔＵＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}、ΔＵＨ_{ＮＳ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}；ΔＵＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ}；またはΔＵＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ}を有する。

本発明のＬＭＷＨ組成物は、必要に応じて薬学的に受容可能なキャリア中に処方され得る。この組成物はさらに、特定の送達デバイス中に処方され得る。よって、本発明のいくつかの実施形態において、この組成物は、静脈内、皮下、経口、エアロゾルまたは他の粘膜の送達形態に具体的に処方される。いくつかの実施形態において、この組成物は、以下に記載されるような徐放性デバイス中に処方される。

本発明の開示の観点から、当業者は、ＬＭＷＨ組成物の実質的に純粋な調製物を生成し得る。ＬＭＷＨ調製物は、ＨＬＧＡＧ供給源より調製される。本明細書中で使用される場合、「ＨＬＧＡＧ供給源」は、標準的技術（酵素的分解などを含む）を使用してＬＭＷＨを生成するために操作され得る、ヘパリン様グリコサミングリカン組成物をいう。上記のように、ＨＬＧＡＧとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：単離されたヘパリン、化学修飾されたヘパリン、生物工学で調製されたヘパリン、合成ヘパリン、硫酸ヘパランおよびＬＭＷＨ。よって、ＨＬＧＡＧは、天然の供給源より単離され得、直接合成、変異誘発などによって調製される。いくつかの実施形態において、ＨＬＧＡＧは、実質的に純粋であり得る。本明細書中で使用される場合、用語「実質的に純粋」は、この意図された使用に対して実用的かつ適切な程度に、他の物質を実質的に含まない。特に、多糖は、実質的に純粋であり、そして例えば、薬学的調製物を生成するに有用であるようにその宿主環境の他の生物学的構成物を実質的に含まないことを意味する。

本明細書中で使用される場合、ＬＭＷＨ調製物は、８０００Ｄａ未満の平均分子量（ＭＷ）を有しかつ全分子の少なくとも６０％について８０００Ｄａ未満のＭＷを有する、硫酸化ＧＡＧの塩である。規定によって、ＬＭＷＨ調製物は、ＨＬＧＡＧサンプルより生成され得る。用語ＬＭＷＨは、ＬＭＷＨ（例えば、ＳＲ９０１０７Ａ）として直接合成される多糖を包含しない。ＳＲ９０１０７Ａは、約１５００Ｄａの分子量を有する合成多糖である。ＨＬＧＡＧの供給源より調製されるのではなく低分子量化合物として直接調製される、これらの型の化合物は、ＬＭＷＨのクラス内に入るとみなされない。しかし、用語ＬＭＷＨは、ＬＭＷＨを生成するように処理される合成ＨＬＧＡＧを含まない。

いくつかの異なる方法が、ＬＭＷＨの商業的調製物のために使用されている。直接サイズ分画を使用して、実験規模でＬＭＷＨ（Ｆｒａｘｉｐａｒｉｎ）を調製してきたが、その貧弱な収量は工業規模でのこの使用を一般に否定した。工業生成目的のために、多くの化学的処理または酵素的処理が利用されてきた。化学的処理は、部分的な亜硝酸脱重合（Ｆｒａｇｍｉｎ）、Ｈ_２Ｏ_２での酸化的切断（ＮｏｒｍｉｆｌｏおよびＦｌｕｘｕｍ）、Ｃｕ^＋＋およびＨ_２Ｏ_２での酸化的切断、またはベンジル化に続くβ−脱離およびアルカリ加水分解によって（Ｅｎｏｘａｐａｒｉｎ）のような広範な反応を利用する。ヘパリナーゼＩ（Ｌｏｇｉｐａｒｉｎ）による部分的β−脱離脱重合を使用するＬＭＷＨを生成するための酵素的方法もまた、記載されている。

本発明に従って生成されるＬＭＷＨは、先行技術のＬＭＷＨ調製物を超えて機能的特性を改善された。本発明の組成物の１つの利点は、抗凝固活性の量が治療目的について変更され得ることである。処置されるべき被験体および／またはその被験体の状態に依存して、この化合物の抗凝固活性を増加または減少させることが所望され得る。例えば、被験体が急性の凝固事象を起こしている場合、抗凝固活性を有するＬＭＷＨ調製物（例えば、少なくとも１５０ＩＵ／ｍｇの活性を有する組成物の１つ）を、被験体に投与することがしばしば所望される。他の被験体は、血栓の障害が発生する危険にさらされ得るのみである。低い抗凝固活性を有するＬＭＷＨ調製物をこれらの被験体に投与することが、一般に所望される。サンプル中の切断されていないＡＴ結合領域（例えば、構造ΔＵ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}Ｉ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}Ｉ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}ＩＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ、６Ｓ}を有する１０糖、または４糖ΔＵＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}、ΔＵＨ_{ＮＳ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}；ΔＵＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ}；またはΔＵＨ_{ＮＳ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ}（もしくは関連化合物）のパーセントを同定する能力は、組成物を特定の量の切断されていないインタクトなＡＴ結合領域とともに処方し得る。既知のパーセントのインタクトなＡＴ結合領域を有するＬＭＷＨを調製するこの能力は、ＬＭＷＨの治療組成物の活性を定量する方法を提供する。よって、本発明の方法は、処置された被験体および障害に依存して、当業者がＬＭＷＨの適切な組成物を調製または同定することを可能にする。

本明細書中で使用される場合、語「インタクト」は、切断されていなくて完全であることを意味する。用語「ＡＴ結合領域」は、ＡＴ−ＩＩＩと特異的に相互作用するＨＬＧＡＧの領域をいう。ＡＴ結合領域は、以下の構造ΔＵ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}Ｉ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}Ｉ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}ＩＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ、６Ｓ}を有する１０糖化合物および４糖ΔＵＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}、ΔＵＨ_{ＮＳ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}；ΔＵＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ}；およびΔＵＨ_{ＮＳ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ}を含む。いくつかの実施形態において、ＬＭＷＨ調製物は、組成物であって、この組成物中の多糖配列の少なくとも２０％がインタクトなＡＴ結合領域である。他の実施形態において、この組成物中の多糖配列の少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％または５５％がインタクトなＡＴ結合領域である。上記で検証したように、処置のための組成物中のインタクトなＡＴ−１０の最適なパーセントは、処置下の医療状態に依存して変化する。より高レベルの活性は、抗凝固活性が所望されない、癌について処置下である患者においてよりも、血液−血餅形成の危険性のある患者に所望され得る。

他の局面において、この組成物は、＞１５％の二硫酸化二糖、＜７５％の三硫酸化二糖、３〜５％の単硫酸化二糖、＞２％の４−７四糖を有するＬＭＷＨ調製物である。ＬＭＷＨ調製物は、少なくとも６０％の鎖が＜８，０００のＭＷを有するものの、＜８，０００の平均ＭＷを有する。これらの特性を有するＬＭＷＨ調製物は、＞１５０ＩＵ／ｍｇの抗ＸＡ活性および＞１．５の抗Ｘａ／ＩＩＡ値を有する。これらの特性を有する組成物は、上記の方法によって調製され得る。画分２のＬＭＷＨ調製物としていわれる物質は、これらの特性を有する組成物である。画分１の組成物は、＜１５％の二硫酸化二糖、＞７５％の三硫酸化二糖、０〜３％の単硫酸化二糖、０〜２％の４−７四糖、および８０００〜１４０００の平均ＭＷを有するヘパリン物質である。画分１物質は、＜１５０ＩＵ／ｍｇの抗ＸＡ活性および＜２の抗Ｘａ／ＩＩＡ値を有する。

ＬＭＷＨ調製物中のＡＴ結合領域の量は、種々の実験パラメーターによって操作され得る。本発明の方法は、識別特性成分を使用してＬＭＷＨ調製物の品質制御を可能にすることによって、ＬＭＷＨの豊富な調製物の単離を生じる改善された単離手順を提供することによって、そしてヘパリナーゼの切断特異性に対する新たな役割を提供することによって、ＬＭＷＨ調製物中のＡＴ結合領域の量の制御を可能にする。これらの特性の最初の２つは、上記に詳細に検証される。

インタクトなＡＴ結合領域を有するＬＭＷＨを調製する際のヘパリナーゼの役割は、先行技術に記載されている。特に、インタクトなＡＴ−ＩＩＩ結合部位を含む公開された配列は、ΔＵ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}ＩＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ、６Ｓ}Ｉ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}Ｉ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}（Ｔｏｉｄａ，Ｔ．，Ｈｉｌｅｍａｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｅ．，Ｖｌａｈｏｖａ，Ｐ．Ｉ．＆Ｌｉｎｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｊ．（１９９６）ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２７１，３２０４０−７）として記載される。さらに、３−Ｏサルフェートを含む四糖は、ヘパリナーゼのいずれによっても切断可能ではないことが先行技術に示されている（Ｙａｍａｄａ，Ｓ．，Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｋ．，Ｓｕｇｉｔａ，Ｍ，Ｓｕｇａｈａｒａ，Ｋ．，Ｋｈｏｏ，Ｋ．Ｈ．，Ｍｏｒｒｉｓ，Ｈ．Ｒ．＆Ｄｅｌｌ，Ａ．（１９９３）ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２６８，４７８０−７）。このことは、３−Ｏ硫酸化グルコサミンを有する結合が切断に耐性であることを示唆する。驚くことに、これら先行技術の開示が正しくないことが発見された。実施例において、本発明者らは、ＡＴ−１０の実際の構造がΔＵ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}Ｉ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}Ｉ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}ＩＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ、６Ｓ}であり、よってインタクトなＡＴ−ＩＩＩ結合部位を含まないことを、種々の物理化学技術によって決定的に示した。このＡＴ−１０構造の再解釈の観点から、本発明者らは、ＡＴ結合性である３−Ｏスルフェート含有オリゴ糖に対するヘパリナーゼＩ〜ＩＩＩの作用を再試験するように努めた。ＡＴ−１０（超ＬＭＷＨ、ＭＷ＝２７６９．３Ｄａ）がヘパリンの制御されたヘパリナーゼＩ切断に由来することを考慮して、本発明者らはまた、確立された生物分析技術を使用して、オリゴ糖の機能的帰結を試験するように努めた。ヘパリナーゼの作用および機能的帰結の両方をこのように理解することは、臨床使用に対するＬＭＷＨの効果的で最適な生成を必要とする。

従って、実施例に示されるように、ヘパリナーゼＩおよびＩＩがＨＬＧＡＧのＡＴ結合領域を実際に切断してインタクトなＡＴ結合領域の消失を生じるが、ヘパリナーゼＩＩＩが切断しなかったことを見出した。さらに、グリコシド連結の還元末端でのグルコサミン３−Ｏ硫酸化が、ヘパリナーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩの切断に対する耐性を与えることを見出した。部分的なＡＴ−ＩＩＩ結合部位のみを含むヘパリンオリゴ糖の生物学的帰結および薬理学的帰結の試験は、このようなオリゴ糖が顕著な抗Ｘａ活性を有するが、インタクトなＡＴ−ＩＩＩ部位を含むヘパリン様グリコサミノグリカンの機能的属性のいくつかを欠くことを示す。従って、例えば、上記の精製方法によってＨＬＧＡＧの調製物が生成される場合、この調製物は、ヘパリナーゼによる酵素的切断によってより高いかまたはより低い抗凝固活性を有するようにさらに修飾され得る。この調製物がヘパリナーゼＩおよび／またはＩＩによる酵素的消化に供される場合、抗凝固活性は減少される。この調製物がヘパリナーゼＩＩＩで処理される場合、抗凝固活性は、増強される。

これらの方法はまた、より広いクラスの化合物に対してあてはまる。本発明の教示を使用して、広範な種々の多糖開始材料から特定の多糖治療薬を開発し得る。一旦、活性成分が多糖において同定されると、その活性成分は、サンプルの品質制御に対する識別特性として使用され得、そして特定の治療活性について増強されかつ副作用の原因である領域を除去された治療組成物を生成および同定するために、使用され得る。

組成物は、治療的に被験体に投与され得る。本明細書中で使用される場合、被験体は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたはげっ歯類である。

特にＨＬＧＡＧおよびＬＭＷＨは、多くの治療有用性を有する。本発明のＬＭＷＨ組成物は、任意の型の状況を処置するために使用され得、ここで、ＬＭＷＨ治療は、有用な療法として同定された。従って、本発明は、ＬＭＷＨ治療が有用である種々のインビトロ法、インビボ法およびエキソビボ法において有用である。例えば、ＬＭＷＨ組成物は、凝固の阻止、癌細胞増殖および転移の阻害、新脈管形成の阻止、新生血管形成の阻止、乾癬の阻止に有用である。ＬＭＷＨ組成物はまた、品質が制御されたサンプルのようなインビボアッセイにおいて使用され得る。

これらの障害の各々は、当該分野において周知であり、そして、例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＩｎｔｅｒｎａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ（ＭｃＧｒａｗＨｉｌｌ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ）（これは、参考として援用される）に記載される。

従って、ＬＭＷＨ調製物は、凝固関連障害を処置または阻止するために有用である。本明細書中で使用される場合、「凝固関連疾患」は、心筋または大脳の梗塞形成について見られるような組織への血液供給を担う血管のブロックに起因する組織への血液供給の妨害より生じる局所炎症により特徴付けられる状態をいう。大脳虚血性発作または大脳虚血は、脳への血液供給がブロックされる虚血状態の形態である。脳への血液供給におけるこの妨害は、種々の原因より生じ得、この原因としては、血管自体の内因性ブロックまたは閉塞、遠く離れて起こる閉塞の供給源、不適切な脳血流を生じる灌流圧の減少または血液粘度の上昇、あるいはクモ膜下腔または大脳内組織において破裂した血管が挙げられる。

本発明の方法はまた、大脳虚血を処置するためにも有用である。大脳虚血は、一過性または持続性のいずれかの欠損を生じ得、そして大脳虚血を被った患者における神経学的損傷の重篤度は、その虚血事象の強度および持続期間に依存する。一過性の虚血発作は、脳への血流が一時的にのみ妨害されるものであり、そして２４時間未満の間にしばしば清浄化される一時的な神経学的欠損を生じる。ＴＩＡの徴候としては、以下が挙げられる：顔または指の麻痺または愚鈍、はっきり話す能力の喪失および／または他者の話を理解する能力の喪失、視覚の喪失または不明瞭な視覚、およびめまいの感覚。持続的な大脳虚血発作（発作（ｓｔｒｏｋｅ）ともいう）は、いずれかの血栓塞栓症により生じる脳への血流におけるより長い妨害によって生じる。発作は、ニューロンの喪失を生じ、典型的には、改善され得るが完全には消散しない神経学的欠損を生じる。血栓塞栓症性の発作は、血栓または塞栓による頭蓋外または頭蓋内の血管の閉塞に起因する。発作が血栓症または塞栓症によって生じるか否かを識別することはしばしば困難であるので、用語「血栓塞栓症」を使用して、これらの機構のいずれかによって生じる発作をカバーする。

いくつかの実施形態において、本発明の方法は、ＬＭＷＨを使用する急性血栓塞栓症性発作の処置に関する。急性の発作は、脳への血液供給を妨害する虚血事象より生じる神経学的傷害を含む医療症候群である。

有効量のＬＭＷＨ調製物単独、または発作の処置のための別の治療薬との組合わせは、発作により生じるインビボでの脳の傷害を減少するに十分な量である。脳傷害の減少は、本発明の処置のない血栓塞栓症性発作を被っている被験体において生じたであろう脳に対する傷害の阻止である。いくつかの生理学的パラメータを使用して、脳傷害の減少を評価し得る。このパラメータは、例えば、前処置した患者のパラメータ、未処置の発作患者もしくは血栓溶解剤単独で処置した発作患者と比較して、より小さい梗塞サイズ、改善された局所的脳血流、および頭蓋内圧の減少を含む。

薬学的ＬＭＷＨ調製物は、単独で使用しても、凝固と関連する疾患を処置するための治療薬と組合わせて使用してもよい。凝固と関連する疾患の処置に有用な治療薬の例としては、抗凝固剤、抗血小板剤、および血栓溶解剤が挙げられる。

抗凝固剤は、血液成分の凝固を阻止し、よって血塊形成を阻止する。抗凝固薬としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ヘパリン、ワルファリン、クマジン、ジクマロール、フェンプロクーモン、アセノクマロール、エチルビスクマセテート（ｂｉｓｃｏｕｍａｃｅｔａｔｅ）およびインダンジオン誘導体。

抗血小板剤は、血小板凝集を阻害し、しばしば一過性の虚血発作または発作の被る患者において血栓塞栓症性発作を阻止するために使用される。抗血小板剤としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：アスピリン、チエノピリジン誘導体（例えば、チクロポジン（ｔｉｃｌｏｐｏｄｉｎｅ）およびクロピドグレール（ｃｌｏｐｉｄｏｇｒｅｌ）、ジピリダモールおよびスルフィンピラゾン）およびＲＧＤ模倣物ならびに抗トロンビン剤（例えば、ヒルジン、しかしこれに限定されない）。

血栓溶解剤は、血栓塞栓症性発作を生じる血栓を溶解する。血液溶解剤は、急性の静脈性血栓塞栓症および肺塞栓の処置において使用され、そして当該分野において周知である（例えば、Ｈｅｎｎｅｋｅｎｓら、ＪＡｍＣｏｌｌＣａｒｄｉｏｌ；ｖ．２５（７ｓｕｐｐ），ｐ．１８Ｓ−２２Ｓ（１９９５）；Ｈｏｌｍｅｓら、ＪＡｍＣｏｌｌＣａｒｄｉｏｌ；ｖ．２５（７ｓｕｐｐｌ），ｐ．１０Ｓ−１７Ｓ（１９９５）を参照のこと）。血栓溶解剤としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：プラスミノーゲン、ａ_２−アンチプラスミン、ストレプキナーゼ、アンチストレプラーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）およびウロキナーゼ。本明細書中で使用される場合、「ｔＰＡ」は、ネイティブなｔＰＡおよび組換えｔＰＡ、ならびにネイティブなｔＰＡの酵素活性または線溶活性を残すｔＰＡの改変型形態を含む。ｔＰＡの酵素活性は、プラスミノーゲンをプラスミンに変換する分子の能力を評価することによって測定され得る。ｔＰＡの線溶活性は、当該分野において公知のインビトロ血栓溶解活性（例えば、精製した血塊溶解アッセイ（Ｃａｒｌｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６８，４２８−４３５（１９８８）によって記載される）およびその改変型形態（Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｗ．Ｆ．ら、１９９１、上述）、これらは、その全体が参考として本明細書中に援用される）のいずれかによって決定され得る。

１つの実施形態において、ＬＭＷＨ調製物は、新脈管形成を阻害するために使用される。新脈管形成を阻害するための有効量のＬＭＷＨ調製物は、その処置の必要な被験体に投与される。本明細書中で使用される場合、新脈管形成は、新血管の不適切な形成である。新血管の生成を生じる内皮細胞の伸長および増殖を引き起こす、内皮細胞に対してマイトジェンである一群の増殖因子を、内皮細胞が分泌する場合に、「新脈管形成」はしばしば、腫瘍において生じる。いくつかの血管形成性マイトゲンは、内皮細胞増殖因子に関連するヘパリン結合ペプチドである。新脈管形成の阻害は、動物モデルにおいて腫瘍退行を引き起こし、これは、治療的抗癌剤としての使用を示唆する。新脈管形成を阻害するための有効量は、腫瘍への血管増殖の数を減少するに十分なＬＭＷＨ調製物の量である。この量は、腫瘍および新脈管形成の動物モデルにおいて評価され得、これらの多くは、当該分野において公知である。

ＬＭＷＨ調製物はまた、眼疾患に関連する新生血管形成を阻害するために有用である。別の実施形態において、ＬＭＷＨ調製物は、乾癬を処置するために投与される。乾癬は、慢性炎症によって引き起こされる一般的な皮膚科の疾患である。ＬＭＷＨ含有組成物はまた、癌細胞増殖および転移を阻害し得る。従って、本発明の方法は、被験体において腫瘍細胞の増殖または転移を処置および／または阻止するに有用である。本明細書中で使用される場合、用語「阻止」および「阻止する」は、生物学的影響（例えば、新脈管形成または癌もしくは腫瘍細胞の増殖もしくは転移）を完全にかまたは部分的に阻害すること、および生物学的影響（例えば、新脈管形成または癌もしくは腫瘍細胞の増殖もしくは転移）における任意の増加を阻害することをいう。

癌は、悪性または非悪性の癌であり得る。癌または腫瘍としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：胆道癌；脳癌；乳癌；子宮頸癌；絨毛癌；結腸癌；子宮内膜癌；食道癌；胃癌；上皮内新生物；リンパ腫；肝癌；肺癌（例えば、小細胞および非小細胞）；黒色腫；神経芽腫；口腔癌；卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；直腸癌；肉腫；皮膚癌；精巣癌；甲状腺癌；および腎癌、ならびに他の癌腫および肉腫。

処置を必要とする被験体は、癌の発生の可能性の高い被験体であり得る。これらの被験体としては、例えば、遺伝的異常を有する被験体（この遺伝的異常の存在は、癌の発生の可能性が高いことと相関関係を有する）、および癌を引き起こす薬剤（例えば、タバコ、石綿、もしくは他の化学毒素）に暴露された被験体または癌について以前に処置されかつ現在寛解している被験体が挙げられる。

本発明のＬＭＷＨを含む組成物の有効量は、このような処置の必要のある被験体に投与される。有効量は、細胞の増殖もしくは転移において所望の低下を生じる量、または医学的に受容可能ではない他の副作用を引き起こすことなく凝固を阻止する量である。このような量は、もはや慣用的な実験で決定され得る。投与の様式に依存して、１ｎｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲の投与量が、効果的であると考えられる。インタクトなＬＭＷＨの効果的なパーセントは、もはや慣用的な実験で決定し得る。絶対量は、種々の因子（投与が他の処置方法との組合わせであるか否か、投与量の数、ならびに個々の患者のパラメータ（例えば、年齢、身体的状態、サイズおよび体重）を含む）に依存し、そして慣用的実験で決定され得る。最大用量、すなわち、信頼できる医療判断に従う最も安全な投与量が使用されることは、一般に好ましい。投与の様式は、吸入、経口、皮下、静脈などを含む医学的に受容可能な任意の様式であり得る。

本発明のいくつかの局面において、ＬＭＷＨを含む組成物の有効量は、障壁を越える腫瘍細胞の侵入を阻止するに有効な量である。癌の侵入および転移は、細胞接着特性の変化（これは、形質転換した細胞が細胞外マトリクス（ＥＣＭ）を介して浸潤および移動し、そして足場非依存的増殖特性を獲得することを可能にする）を含む複合プロセスである。Ｌｉｏｔｔａ，Ｌ．Ａ．ら、Ｃｅｌｌ６４：３２７−３３６（１９９１）。これらの変化のいくつかは、膜結合細胞骨格および細胞内シグナル伝達分子を含む細胞／ＥＣＭ接着点であり接着斑（ｆｏｃａｌａｄｈｅｓｉｏｎ）にて生じる。転移性疾患は、腫瘍細胞の播種性病巣が腫瘍細胞の増殖および繁殖を支持する組織に播種する場合に生じる。そしてこの二次的な腫瘍細胞の伸展は、多数の癌に関連する罹患率および死亡率の原因である。従って、本明細書中で使用される場合、用語「転移」は、最初の腫瘍部位から離れた、腫瘍細胞の浸潤および移動をいう。

腫瘍細胞の障壁は、インビトロでの人工の障壁またはインビボでの天然の障壁であり得る。インビトロの障壁としては、膜で覆われた細胞外マトリクス（例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ）が挙げられるがこれに限定されない。よって、ＬＭＷＨ組成物は、Ｐａｒｉｓｈ，Ｃ．Ｒ．ら、「ＡＢａｓｅｍｅｎｔ−ＭｅｍｂｒａｎｅＰｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙＡｓｓａｙｗｈｉｃｈＣｏｒｒｅｌａｔｅｓｗｉｔｈｔｈｅＭｅｔａｓｔａｔｉｃＰｏｔｅｎｔｉａｌｏｆＴｕｍｏｕｒＣｅｌｌｓ」、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９２）５２：３７８−３８３に記載されるようなＭａｔｒｉｇｅｌ浸潤アッセイ系において腫瘍細胞浸潤を阻害する能力について試験され得る。Ｍａｔｒｉｇｅｌは、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（例えば、ｂＦＧＦに結合しｂＦＧＦを局在化させるパーレカン（ｐｅｒｌｅｃａｎ））、ビトロネクチンならびに形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）およびプラスミノーゲン活性化因子インヒビター１型（ＰＡＩ−１）として公知のセルピンを含む再構成された基底膜である。転移についての他のインビトロアッセイおよびインビボアッセイは、先行文献に記載されている。例えば、１９９９年８月１０日に発行された米国特許第５，９３５，８５０号（参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。インビボでの障壁は、被験体の身体中に存在する細胞性障壁をいう。

本発明の別の局面に従って、循環するヘパリンの枯渇を必要とする被験体を処置するための方法を提供する。この局面において、有効量のヘパリナーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩ（またはその改変型）の組み合わせが使用される。例えば、開心術または血液透析を受ける被験体はしばしば、手術または血液透析の結果としての、医学的に受容可能でない量の血中ヘパリンの枯渇を必要とする。ヘパリナーゼＩまたはＩＩとヘパリナーゼＩＩＩとの組み合わせの使用によって、適切な量の治療的に活性体（ａｃｔｉｖｅ）（抗凝固因子機能）は、凝固カスケードの適切なバランスを得るために被験体に投与され得る。ヘパリナーゼの組み合わせの有効量は、完全な枯渇を引き起こすことなく、そして医学的に受容可能ではない任意の他の副作用を引き起こすことなく、循環するヘパリンレベルにおける所望の減少を生じる量である。

一般に、治療的に有用な量のヘパリナーゼの組合わせは、もはや慣用的な実験で決定し得る。投与の様式に依存して、１ｎｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲の投与量が効果的であると考えられている。絶対量は、種々の因子（投与が他の処置方法との組合わせであるか否か、投与量の数、ならびに個々の患者のパラメータ（例えば、年齢、身体的状態、サイズおよび体重）を含む）に依存し、そして慣用的実験で決定され得る。最大用量、すなわち、信頼できる医療判断に従う最も安全な投与量が使用されることは、一般に好ましい。投与の様式は、経口、皮下、静脈などを含む医学的に受容可能な任意の様式であり得る。

一般に、治療目的のために投与される場合、本発明の処方物は、薬学的に受容可能な溶液にて適用される。このような調製物は、薬学的に受容可能な濃度の塩、緩衝化剤、保存薬、適合性キャリア、アジュバントおよび必要に応じて他の治療成分を含み得る。

本発明の組成物は、それ自体で（生で（ｎｅａｔ））かまたは薬学的に受容可能な塩の形態で投与され得る。医薬において使用される場合、この塩は、薬学的に受容可能であるべきであるが、非薬学的に受容可能な塩は、その薬学的に受容可能な塩を調製するために便利に使用され得、そして、本発明の範囲からは除外されない。このような薬理学的および薬学的に受容可能な塩としては、以下の酸より調製される塩が挙げられるがこれらに限定されない：塩酸、臭化水素、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、蟻酸、マロン酸、琥珀酸、ナフタレン−２−スルホン酸および硫酸ベンゼンスルホン酸。また、薬学的に受容可能な塩は、アルカリ金属の塩またはアルカリ土塁金属の塩（例えば、カルボン酸基のナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩）として調製され得る。

適切な緩衝化剤としては、以下が挙げられる：酢酸および塩（１〜２％Ｗ／Ｖ）；クエン酸および塩（１〜３％Ｗ／Ｖ）；ホウ酸および塩（０．５〜２．５％Ｗ／Ｖ）；ならびにリン酸および塩（０．８〜２％Ｗ／Ｖ）。適切な保存薬としては、以下が挙げられる：塩化ベンズアルコニウム（０．００３〜０．０３％Ｗ／Ｖ）；クロロブタノール（０．３〜０．９％Ｗ／Ｖ）；パラベン（０．０１〜０．２５％Ｗ／Ｖ）およびチメロサール（０．００４〜０．０２％Ｗ／Ｖ）。

本発明は、１以上の薬学的に受容可能なキャリアおよび必要に応じて他の治療成分と一緒にＬＭＷＨ調製物を含む、医療用途のための薬学的組成物を提供する。本明細書中で使用される場合および以下でより十分に記載される場合、用語「薬学的に受容可能なキャリア」は、１以上の適合性の固体または液体の充填剤、希釈剤、またはヒトまたは他の動物への投与に適切なカプセル化物質を意味する。本発明において、用語「キャリア」は、適用を容易にするように活性成分が組合わせられている、天然または合成の有機成分または無機成分を示す。薬学的組成物の成分もまた、所望の薬学的効力を実質的に損なう相互作用がないような様式で、本発明のＬＭＷＨと、および互いに混合され得る。

非経口投与に適切な組成物は、多糖の滅菌水性調製物を都合よく含み、これは、レシピエントの血液と等張であり得る。利用され得る受容可能なビヒクルおよび溶媒としては、水、リンガー液および等張塩化ナトリウム溶液が挙げられる。さらに、滅菌した不揮発性油は、溶媒または懸濁媒体として簡便に利用される。この目的のために、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の刺激のない不揮発性油が利用され得る。さらに、オレイン酸のような脂肪酸は、注入可能な注入可能な調製物における使用を見出す。皮下、筋肉内、腹膜内、静脈内などの投与に適切なキャリア処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに見出され得る。

種々の投与経路が利用可能である。選択された特定の様式は、もちろん選択されたＬＭＷＨの特定のパーセント、処置される特定の状態および治療効果に必要とされる投薬量に依存する。一般的にいうと、本発明の方法は、医学的に受容可能な任意の投与様式、つまり医学的に受容可能ではない不利な影響を引き起こすことなく効果的レベルの生物学的効果を生成する任意の様式を使用して実施され得る。

治療における使用について、有効量のＬＭＷＨ調製物を投与して、ＬＭＷＨを所望の表面（例えば、粘膜表面、全身性表面）に送達する任意の様式によって、被験体に投与され得る。本発明の薬学的組成物を「投与すること」は、当業者に公知の任意の方法によって達成され得る。好ましい投与経路としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：経口、非経口、筋肉内、鼻腔内、気管内、吸入、眼、膣および直腸。

経口投与について、化合物（すなわち、ＬＭＷＨ調製物）は、活性化合物を当該分野において周知の薬学的に受容可能なキャリアと組合わせることによって、容易に処方され得る。このようなキャリアによって、本発明の化合物を、処置されるべき被験体による経口摂取のための錠剤、丸剤、糖剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、懸濁液、懸濁物などとして処方し得る。経口使用のための薬学的調製物は、固体賦形剤として得られ得る（必要に応じて、所望ならば適切な補助剤を添加した後、錠剤または糖剤核を得るために、生じる混合物を粉砕し、顆粒の混合物をプロセスする）。適切な賦形剤は、特に充填剤（例えば、糖（乳糖、蔗糖、マンニトールまたはソルビトールを含む））；セルロース調製物（例えば、ダイズデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチントラガントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。所望ならば、崩壊剤（例えば、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウム））が、添加され得る。必要に応じて、経口処方物はまた、内部酸性条件を中和するための生理食塩水または緩衝液中に処方されても、いずれのキャリアもなしに投与されてもよい。

糖剤核は、適切なコーティングを有して提供される。この目的のために、濃縮された糖溶液が使用され得、これは、必要に応じて、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポル（ｃａｒｂｏｐｏｌ）ゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタニウム、ラッカー溶液、ならびに適切な有機溶媒または溶媒混合物を含み得る。染料または顔料は、活性成分用量の異なる組合せを同定もしくは特徴付けるために、錠剤、または糖剤コーティングに添加され得る。

経口的に使用され得る薬学的調製物としては、ゼラチンでできた押出し（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ）カプセル、ならびにゼラチンおよび可塑剤（例えば、グリセロールまたはソルビトール）でできた柔らかい封印されたカプセルが挙げられる。この押出しカプセルは、活性成分を、充填剤（例えば、乳糖）、結合剤（例えば、デンプン）および／または潤滑剤（例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウム）ならびに必要に応じて安定化剤と混合して含み得る。柔らかいカプセルにおいて、活性化合物は、適切な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィン、もしくは液体ポリエチレングリコール）中に溶解または懸濁され得る。さらに、安定化剤が添加され得る。経口投与のために処方されたミクロスフェアもまた使用され得る。このようなミクロスフェアは、当該分野において十分規定されている。経口投与のための全ての処方物は、このような投与に適切な投薬量であるべきである。

頬投与について、組成物は、簡便な様式で処方された錠剤またはロゼンジの形態をとり得る。

吸入による投与について、本発明に従う使用のための化合物は、適切な噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガス）の使用とともに、加圧されたパックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー調製物の形態で簡便に送達され得る。加圧されたエアロゾルの場合、投薬量単位は、計量された量（ｍｅｔｅｒｅｄａｍｏｕｎｔ）を送達するための値を提供することによって決定され得る。呼吸器または吸入器における使用のための、例えば、ゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物の粉末混合物および乳糖またはデンプンのような適切な粉末ベースを含んで処方され得る。

全身性に送達されることが所望される化合物は、注入（例えば、ボーラス注射または連続注入）による非経口投与のために処方され得る。注射のための処方物は、添加した保存薬を有する単位投薬量形態（例えば、アンプル中または多用量容器中）で示され得る。組成物は、懸濁物、溶液または油性もしくは水溶性のビヒクル中のエマルジョンのような形態をとり得、そして、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤のような処方剤を含み得る。

非経口投与のための薬学的処方物としては、水溶性形態での活性化合物の水溶液が挙げられる。さらに、活性化合物の懸濁物は、適切な油性注射懸濁物として調製され得る。適切な親油性溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油（例えば、ゴマ油）もしくは合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリド）、またはリポソームが挙げられる。水性注射懸濁物は、懸濁物の粘度を増加させる物質（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストラン）を含み得る。必要に応じて、懸濁物はまた、適切な安定化剤、または高度に濃縮された溶液の調製物に対する化合物の溶解性を増加させ得る薬剤を含み得る。

あるいは、活性化合物は、使用前に適切なビヒクル（例えば、パイロージェンを含まない滅菌水）とともに構成されるための粉末形態であり得る。

化合物はまた、直腸用または膣用の組成物（例えば、坐剤または貯留浣腸（例えば、慣用的な坐剤ベース（例えば、ココアバターまたは他のグリセリド）を含む））中に処方され得る。

先に記載された処方物に加えて、この化合物はまた、蓄積（ｄｅｐｏｔ）調製物として処方され得る。このような長期作用処方物は、適切なポリマー材料もしくは疎水性材料（例えば、受容可能なオイル中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂とともに、あるいは乏しい可溶性の誘導体（例えば、乏しい可溶性の塩）として処方され得る。

薬学的組成物はまた、適切な固体またはゲル相のキャリアまたは賦形剤を含み得る。このようなキャリアまたは賦形剤の例としては、限定しないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールのようなポリマーが挙げられる。

適切な液体または固体の薬学的調製物形態は、例えば、吸入、マイクロカプセル化、コクリート化（ｅｎｃｏｃｈｌｅａｔｅｄ）、微視的金粒子上へのコーティング、リポソーム中への含有、噴霧、エアロゾル、皮膚への移植のためのペレット、または皮膚へ引っ掻かれる鋭い物体上への乾燥のための水溶液または生理食塩水溶液である。薬学的組成物としてはまた、顆粒、粉末、錠剤、コーティングされた錠剤、（マイクロ）カプセル、坐剤、シロップ、エマルジョン、懸濁液、クリーム、ドロップまたは活性化合物の長引いた放出を伴う調製物が挙げられ、この調製物には、賦形剤ならびに添加剤および／または補助剤（例えば、崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨潤剤、潤滑剤、矯味矯臭剤、甘味料または可溶化剤）が、上記のように通常使用される。薬学的組成物は、種々の薬物送達系における使用に適切である。薬物送達についての方法の手短な総説について、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）（これは、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。

組成物は、簡便に、単位投薬形態で提供され得、薬学の分野で周知な方法のいずれかによって調製され得る。全ての方法が、活性なＬＭＷＨを１つ以上の補助成分を構成するキャリアと関連させる工程を包含する。一般的に、組成物は、多糖を、液体キャリア、微細分割固体キャリア、またはその両方と均一にそして密接に関連させ、次いで、必要な場合、製品を成形することによって調製される。多糖は、凍結されて保存され得る。

他の送達系としては、時間放出送達系、遅延放出送達系または持続放出送達系が挙げられ得る。このような系は、本発明のＬＭＷＨの反復投与を回避し得、被験体および医師に対して利便性を増加する。多くの型の放出送達系が、当業者に利用可能であり、そして公知である。それらは、ポリ乳酸およびポリグリコール酸、ポリ無水物およびポリカプロラクトンのようなポリマーベースの系；コレステロールのようなステロール、コレステロールエステルおよび脂肪酸または中性脂肪（例えば、モノ−、ジおよびトリグリセリド）を含む脂質である非ポリマー系；ヒドロゲル放出系；シラスティック系；ペプチドベースの系；ワックスコーティング；従来の結合剤および賦形剤を使用する圧縮錠剤、部分的に融合した移植片などを含む。特定の例としては、限定しないが、（ａ）多糖がマトリクス内の形態で含まれる浸食（ｅｒｏｓｉｏｎａｌ）系（米国特許第４，４５２，７７５号（Ｋｅｎｔ）；同第４，６６７，０１４号（Ｎｅｓｔｏｒら）；ならびに同第４，７４８，０３４号および同第５，２３９，６６０号（Ｌｅｏｎａｒｄ）に見出される）ならびに（ｂ）活性成分が制御された速度でポリマーを通って浸透する拡散系（米国特許第３，８３２，２５３号（Ｈｉｇｕｃｈｉら）および同第３，８５４，４８０号（Ｚａｆｆａｒａｎｉ）に見出される）が挙げられる。さらに、ポンプベースのハードウェア送達系が使用され得、そのうちのいくつかは、移植のために適合される。

癌処置を受けている患者に投与される場合、ＬＭＷＨ組成物は、他の抗癌剤を含むカクテルで投与され得る。この組成物はまた、放射線治療の副作用を処置する薬剤（例えば、制吐薬、放射線保護剤など）を含むカクテルで投与され得る。

本発明の化合物と同時投与され得る抗癌薬としては、限定しないが、以下が挙げられる：Ａｃｉｖｉｃｉｎ；Ａｃｌａｒｕｂｉｃｉｎ；ＡｃｏｄａｚｏｌｅＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ；Ａｃｒｏｎｉｎｅ；Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ；Ａｄｏｚｅｌｅｓｉｎ；Ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎ；Ａｌｉｔｒｅｔａｍｉｎｅ；Ａｍｂｏｍｙｃｉｎ；ＡｍｅｔａｎｔｒｏｎｅＡｃｅｔａｔｅ；Ａｍｉｎｏｇｌｕｔｅｔｈｉｍｉｄｅ；Ａｍｓａｃｒｉｎｅ；Ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ；Ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ；Ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ；Ａｓｐｅｒｌｉｎ；Ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ；Ａｚｅｔｅｐａ；Ａｚｏｔｏｍｙｃｉｎ；Ｂａｔｉｍａｓｔａｔ；Ｂｅｎｚｏｄｅｐａ；Ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ；ＢｉｓａｎｔｒｅｎｅＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ；ＢｉｓｎａｆｉｄｅＤｉｍｅｓｙｌａｔｅ；Ｂｉｚｅｌｅｓｉｎ；ＢｌｅｏｍｙｃｉｎＳｕｌｆａｔｅ；ＢｒｅｑｕｉｎａｒＳｏｄｉｕｍ；Ｂｒｏｐｉｒｍｉｎｅ；Ｂｕｓｕｌｆａｎ；Ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ；Ｃａｌｕｓｔｅｒｏｎｅ；Ｃａｒａｃｅｍｉｄｅ；Ｃａｒｂｅｔｉｍｅｒ；Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ；Ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ；ＣａｒｕｂｉｃｉｎＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ；Ｃａｒｚｅｌｅｓｉｎ；Ｃｅｄｅｆｉｎｇｏｌ；Ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ；Ｃｉｒｏｌｅｍｙｃｉｎ；Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ；Ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ；ＣｒｉｓｎａｔｏｌＭｅｓｙｌａｔｅ；Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ；Ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ；Ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ；Ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ；ＤａｕｎｏｍｂｉｃｉｎＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ；Ｄｅｃｉｔａｂｉｎｅ；Ｄｅｘｏｒｍａｐｌａｔｉｎ；Ｄｅｚａｇｕａｎｉｎｅ；ＤｅｚａｇｕａｎｉｎｅＭｅｓｙｌａｔｅ；Ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ；Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ；Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ；ＤｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ；Ｄｒｏｌｏｘｉｆｅｎｅ；ＤｒｏｌｏｘｉｆｅｎｅＣｉｔｒａｔｅ；ＤｒｏｍｏｓｔａｎｏｌｏｎｅＰｒｏｐｉｏｎａｔｅ；Ｄｕａｚｏｍｙｃｉｎ；Ｅｄａｔｒｅｘａｔｅ；ＥｆｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ；Ｅｌｓａｍｉｔｒｕｃｉｎ；Ｅｎｌｏｐｌａｔｉｎ；Ｅｎｐｒｏｍａｔｅ；Ｅｐｉｐｒｏｐｉｄｉｎｅ；ＥｐｉｒｕｂｉｃｉｎＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ；Ｅｒｂｕｌｏｚｏｌｅ；ＥｓｏｒｕｂｉｃｉｎＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ；Ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ；ＥｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔｅＳｏｄｉｕｍ；Ｅｔａｎｉｄａｚｏｌｅ；Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ；ＥｔｏｐｏｓｉｄｅＰｈｏｓｐｈａｔｅ；Ｅｔｏｐｒｉｎｅ；ＦａｄｒｏｚｏｌｅＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ；Ｆａｚａｒａｂｉｎｅ；Ｆｅｎｒｅｔｉｎｉｄｅ；Ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ；ＦｈｉｄａｒａｂｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔｅ；Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ；Ｆｌｕｒｏｃｉｔａｂｉｎｅ；Ｆｏｓｑｕｉｄｏｎｅ；ＦｏｓｔｒｉｅｃｉｎＳｏｄｉｕｍ；Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ；ＧｅｍｃｉｔａｂｉｎｅＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ；Ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ；ＩｄａｒｕｂｉｃｉｎＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ；Ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ；Ｉｌｍｏｆｏｓｉｎｅ；ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＡｌｆａ−２ａ；ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＡＩｆａ−２ｂ；ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＡｌｆａ−ｎ１；ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＡｌｆａ−ｎ３；ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＢｅｔａ− Ｉａ；ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＧａｍｍａ− Ｉｂ；Ｉｐｒｏｐｌａｔｉｎ；ＩｒｉｎｏｔｅｃａｎＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ；ＬａｎｒｅｏｔｉｄｅＡｃｅｔａｔｅ；Ｌｅｔｒｏｚｏｌｅ；ＬｅｕｐｒｏｌｉｄｅＡｃｅｔａｔｅ；ＬｉａｒｏｚｏｌｅＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ；ＬｏｍｅｔｒｅｘｏｌＳｏｄｉｕｍ；Ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ；ＬｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ；Ｍａｓｏｐｒｏｃｏｌ；Ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ；ＭｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ；ＭｅｇｅｓｔｒｏｌＡｃｅｔａｔｅ；ＭｅｌｅｎｇｅｓｔｒｏｌＡｃｅｔａｔｅ；Ｍｅｌｐｈａｌａｎ；Ｍｅｎｏｇａｒｉｌ；Ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ；Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ；ＭｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅＳｏｄｉｕｍ；Ｍｅｔｏｐｒｉｎｅ；Ｍｅｔｕｒｅｄｅｐａ；Ｍｉｔｉｎｄｏｍｉｄｅ；Ｍｉｔｏｃａｒｃｉｎ；Ｍｉｔｏｃｒｏｍｉｎ；Ｍｉｔｏｇｉｌｌｉｎ；Ｍｉｔｏｍａｌｃｉｎ；Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ；Ｍｉｔｏｓｐｅｒ；Ｍｉｔｏｔａｎｅ；ＭｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ；ＭｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃＡｃｉｄ；Ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ；ＮｏｇａｌａｍｙｃｉｎＯｒｍａｐｌａｔｉｎ；Ｏｘｉｓｕｒａｎ；Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ；Ｐｅｇａｓｐａｒｇａｓｅ；Ｐｅｌｉｏｍｙｃｉｎ；Ｐｅｎｔａｍｕｓｔｉｎｅ；ＰｅｐｌｏｍｙｃｉｎＳｕｌｆａｔｅ；Ｐｅｒｆｏｓｆａｍｉｄｅ；Ｐｉｐｏｂｒｏｍａｎ；Ｐｉｐｏｓｕｌｆａｎ；ＰｉｒｏｘａｎｔｒｏｎｅＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ；Ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ；Ｐｌｏｍｅｓｔａｎｅ；ＰｏｒｆｉｍｅｒＳｏｄｉｕｍ；Ｐｏｒｆｉｒｏｍｙｃｉｎ；Ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ；ＰｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ；Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ；ＰｕｒｏｍｙｃｉｎＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ；Ｐｙｒａｚｏｆｕｒｉｎ；Ｒｉｂｏｐｒｉｎｅ；Ｒｏｇｌｅｔｉｍｉｄｅ；Ｓａｆｉｎｇｏｌ；ＳａｆｎｇｏｌＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ；Ｓｅｍｕｓｔｉｎｅ；Ｓｉｍｔｒａｚｅｎｅ；ＳｐａｒｆｏｓａｔｅＳｏｄｉｕｍ；Ｓｐａｒｓｏｍｙｃｉｎ；ＳｐｉｒｏｇｅｒｍａｎｉｕｍＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ；Ｓｐｉｒｏｍｕｓｔｉｎｅ；Ｓｐｉｒｏｐｌａｔｉｎ；Ｓｔｒｅｐｔｏｎｉｇｒｉｎ；Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ；Ｓｕｌｏｆｅｎｕｒ；Ｔａｌｉｓｏｍｙｃｉｎ；ＴｅｃｏｇａｌａｎＳｏｄｉｕｍ；Ｔｅｇａｆｕｒ；ＴｅｌｏｘａｎｔｒｏｎｅＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ；Ｔｅｍｏｐｏｒｆｉｎ；Ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ；Ｔｅｒｏｘｉｒｏｎｅ；Ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ；Ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ；Ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ；Ｔｈｉｏｔｅｐａ；Ｔｉａｚｏｆｕｒｉｎ；Ｔｉｒａｐａｚａｍｉｎｅ；ＴｏｐｏｔｅｃａｎＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ；ＴｏｒｅｍｉｆｅｎｅＣｉｔｒａｔｅ；ＴｒｅｓｔｏｌｏｎｅＡｃｅｔａｔｅ；ＴｒｉｃｉｒｉｂｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔｅ；Ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ；ＴｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅＧｌｕｃｕｒｏｎａｔｅ；Ｔｒｉｐｔｏｒｅｌｉｎ；ＴｕｂｕｌｏｚｏｌｅＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ；ＵｒａｃｉｌＭｕｓｔａｒｄ；Ｕｒｅｄｅｐａ；Ｖａｐｒｅｏｔｉｄｅ；Ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ；ＶｉｎｂｌａｓｔｉｎｅＳｕｌｆａｔｅ；ＶｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅＳｕｌｆａｔｅ；Ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ；ＶｉｎｄｅｓｉｎｅＳｕｌｆａｔｅ；ＶｉｎｅｐｉｄｉｎｅＳｕｌｆａｔｅ；ＶｉｎｇｌｙｃｉｎａｔｅＳｕｌｆａｔｅ；ＶｉｎｌｅｕｒｏｓｉｎｅＳｕｌｆａｔｅ；ＶｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅＴａｒｔｒａｔｅ；ＶｉｎｒｏｓｉｄｉｎｅＳｕｌｆａｔｅ；ＶｉｎｚｏｌｉｄｉｎｅＳｕｌｆａｔｅ；Ｖｏｒｏｚｏｌｅ；Ｚｅｎｉｐｌａｔｉｎ；Ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ；ＺｏｒｕｂｉｃｉｎＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ。

ＬＭＷＨ組成物はまた、標的化分子に連結され得る。標的化分子は、特定の細胞または組織に特異的であり、そしてＬＭＷＨをその細胞または組織に方向づけるために使用され得る任意の分子または化合物である。好ましくは、標的化分子は、癌細胞または腫瘍と特異的に相互作用する分子である。例えば、標的化分子は、腫瘍抗原を認識し、そして特異的に相互作用するタンパク質または他の型の分子であり得る。

腫瘍抗原としては、以下が挙げられる：Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ１Ｖ）、アデノシンデアミナーゼ−結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、シクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−−Ｃ０１７−１Ａ／ＧＡ７３３、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）ならびにその免疫原性エピトープＣＡＰ−１およびＣＡＰ−２、ｅｔｖ６、ａｍｌ１、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）ならびにその免疫原性エピトープＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２、およびＰＳＡ−３、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｔ細胞レセプター／ＣＤ３−ζ鎖、腫瘍抗原のＭＡＧＥファミリー（例えば、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｘｐ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ３（ＭＡＧＥ−Ｂ３）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ４（ＭＡＧＥ−Ｂ４）、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＭＡＧＥ−Ｃ３、ＭＡＧＥ−Ｃ４、ＭＡＧＥ−Ｃ５）、腫瘍抗原のＧＡＧＥファミリー（例えば、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７、ＧＡＱＥ−８、ＧＡＧＥ−９）、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ−１、ＮＡＧ、ＧｎＴ−Ｖ、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、チロシナーゼ、ｐ５３、ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ２１ｒａｓ、ＲＣＡＳ１、フェトプロテイン、Ｅ−カドヘリン、カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ｇｐ１００^{Ｐｍｅｌ１１７}、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−１、ＣＴ−７、ｃｄｃ２７、腺腫様結腸ポリポーシスタンパク質（ＡＰＣ）、ホドリン、Ｐ１Ａ、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ３７、Ｉｇ−イディオタイプ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２およびＧＤ２ガングリオシド、ヒトパピローマウイルスタンパク質のようなウイルス産物、腫瘍抗原のＳｍａｄファミリー、ｌｍｐ−１、ＥＢＶコード核抗原（ＥＢＮＡ）−１、およびｃ−ｅｒｂＢ−２。

ＭＨＣクラスＩ分子およびＭＨＣクラスＩＩ分子のいずれかまたは両方に結合する腫瘍抗原の例は、以下の参考文献を参照のこと：Ｃｏｕｌｉｅ、ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ１３：３９３−４０３、１９９５；Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１４５３−１４５７、１９９２；Ｃｈａｕｘら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：２９２８−２９３６、１９９９；Ｆｕｊｉｅら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ８０：１６９−１７２、１９９９；Ｔａｎｚａｒｅｌｌａら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５９：２６６８−２６７４、１９９９；ｖａｎ
ｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２１３４−２１４０、１９９４；Ｃｈａｕｘら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：７６７−７７８、１９９９；Ｋａｗａｓｈｉｍａら、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５９：１−１４、１９９８；Ｔａｈａｒａら、Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５：２２３６−２２４１、１９９９；Ｇａｕｇｌｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：９２１−９３０、１９９４；ｖａｎｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：３０３８−３０４３、１９９４；Ｔａｎａｋａら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５７：４４６５−４４６８，１９９７；Ｏｉｓｏら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ８１：３８７−３９４，１９９９；Ｈｅｒｍａｎら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ４３：３７７−３８３、１９９６；Ｍａｎｉｃｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：８７１−８７６、１９９９；Ｄｕｆｆｏｕｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：３３２９−３３３７、１９９９；Ｚｏｒｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：６０２−６０７、１９９９；Ｈｕａｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１６２：６８４９−６８５４、１９９９；Ｂｏｅｌら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２：１６７−１７５、１９９５；ＶａｎｄｅｎＥｙｎｄｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：６８９−６９８、１９９５；ＤｅＢａｃｋｅｒら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５９：３１５７−３１６５、１９９９；Ｊａｇｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：２６５−２７０、１９９８；Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１６１：３５９６−３６０６、１９９８；Ａａｒｎｏｕｄｓｅｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ８２：４４２−４４８、１９９９；Ｇｕｉｌｌｏｕｘら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：１１７３−１１８３、１９９６；Ｌｕｐｅｔｔｉら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：１００５−１０１６、１９９８；Ｗｏｌｆｅｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：７５９−７６４、１９９４；Ｓｋｉｐｐｅｒら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：５２７−５３４、１９９６；Ｋａｎｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１３４３−１３４８，１９９５；Ｍｏｒｅｌら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ８３：７５５−７５９、１９９９；Ｂｒｉｃｈｎｒｄら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：２２４−２３０、１９９６；Ｋｉｔｔｌｅｓｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：２０９９−２１０６、１９９８；Ｋａｗａｋａｍｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
１６１：６９８５−６９９２、１９９８；Ｔｏｐａｌｉａｎら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：１９６５−１９７１、１９９６；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ５８：２９６−３０１、１９９８；Ｋａｗａｋａｍｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：３９６１−３９６８、１９９５；Ｔｓａｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：１７９６−１８０２、１９９７；Ｃｏｘら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６４：７１６−７１９、１９９４；Ｋａｗａｋａｍｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．ＡｃａｄＳｃｉ．ＵＳＡ９１：６４５８−６４６２、１９９４；Ｓｋｉｐｐｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：５０２７−５０３３、１９９６；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３０３−３０８、１９９７；Ｃａｓｔｅｌｌｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：１７３９−１７４８、１９９９；Ｋａｗａｋａｍｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：３４７−３５２、１９９４；Ｃａｓｔｅｌｌｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：３６３−３６８、１９９５；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ７５：４５１−４５８、１９９８；Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：１１３１−１１４０、１９９６；Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ１８４：２２０７−２２１６、１９９６；Ｐａｒｋｈｕｒｓｔら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ５８：４８９５−４９０１、１９９８；Ｔｓａｎｇら、Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ８７：９８２−９９０、１９９５；Ｃｏｒｒｅａｌｅら、Ｊ．ＮａｔｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ８９：２９３−３００、１９９７；Ｃｏｕｌｉｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：７９７６−７９８０，１９９５；Ｗｏｌｆｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６９：１２８１−１２８４、１９９５；Ｒｏｂｂｉｎｓら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：１１８５−１１９２、１９９６；Ｂｒａｎｄｌｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：２５０１−２５０８、１９９６；ｔｅｎＢｏｓｃｈら、Ｂｌｏｏｄ８８：３５２２−３５２７、１９９６；Ｍａｎｄｒｕｚｚａｔｏら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：７８５−７９３、１９９７；Ｇｕｅｇｕｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：６１８８−６１９４、１９９８；Ｇｊｅｒｔｓｅｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ７２：７８４−７９０、１９９７；Ｇａｕｄｉｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：１７３０−１７３８、１９９９；Ｃｈｉａｒｉら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５９：５７８５−５７９２、１９９９；Ｈｏｇａｎら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５８：５１４４−５１５０、１９９８；Ｐｉｅｐｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：７５７−７６５、１９９９；Ｗａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２８４：１３５１−１３５４、１９９９；Ｆｉｓｋら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ１８１：２１０９−２１１７、１９９５；Ｂｒｏｓｓａｒｔら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５８：７３２−７３６、１９９８；Ｒｅｏｐｋｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：１４７０４−１４７０７、１９９６；Ｉｋｅｄａら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ６：１９９−２０８，１９９７；Ｒｏｎｓｉｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１６３：４８３−４９０、１９９９；Ｖｏｎｄｅｒｂｅｉｄｅら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１０：６７３−６７９，１９９９。これらの抗原および他の抗原は、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６０１に開示される。

実施された実験の以下の説明は、例示であり、特許請求される本発明の範囲を制限しない。

（実施例）
（実施例１：部分的アンチトロンビンＩＩＩ結合部位を有する３−Ｏスルフェート含有十糖の配列決定）
（導入部）：
ヘパリンおよびヘパランスルフェートグリコサミノグリカンは、増殖因子、酵素、およびモルフォゲンと相互作用し、そしてそれらの活性を調節する、重要なクラスの分子を表す。このクラスの分子についての多くの生物学的機能のうち、その最も重要な機能の１つは、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）との相互作用である。特定のヘパリン５糖配列（Ｎ硫酸化、６−Ｏ硫酸化グルコサミン上に異常な３−Ｏスルフェートを含む）に結合するＡＴ−ＩＩＩは、凝固カスケードにおける特定のプロテアーゼを阻害するＡＴ−ＩＩＩ能力を１０００倍増加する。この様式において、ヘパリン様グリコサミノグリカン（ＨＬＧＡＧ）は、血液凝固の調節において重要な生物学的および薬理学的役割を果たす。最近、配列決定方法論が、この重要なクラスの分子のさらなる構造−機能関係に対して、開発された（２０００年４月２４日に出願され、同一の発明者を有する、米国特許出願第０９／５５７，９９７号および同第０９／５５８，１３７号（これらは、参考として援用される）ならびにＶｅｎｋａｔａｒａｍａｎ，Ｇ．，Ｓｈｒｉｖｅｒ，Ｚ．，Ｒａｍａｎ，Ｒ．＆Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８６，５３７−４２）。この方法論は、ＨＬＧＡＧの大量の情報内容（性質）を扱うための性質コード命名法スキーム（ＰＥＮ）と、マトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）ならびにピコモル量のＨＬＧＡＧオリゴ糖を迅速に配列決定するための実験的制約としての酵素的分解および化学的分解とを組み合わせる。上記ＰＥＮ−ＭＡＬＤＩアプローチを使用して、本発明者らは、本研究において使用される十糖の配列が、ΔＵ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}Ｉ_２ＳＨＮ_Ｓ，６ＳＩ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}ＩＨ_{ＮＡｃ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}（±ＤＤＤ４−７）であることを見出した。本発明者らは、完全グリカン配列決定および一次元プロトン核磁気共鳴を使用して、本発明者らの結果を確認した。さらに、本発明者らは、このアプローチが、柔軟であり、オリゴ糖混合物からの配列情報を導き得ることを示した。従って、この方法論は、重要な生物学的活性を有するヘパリン／ヘパランスルフェートのような多糖における他の異常な配列の分析を可能にし、そしてこれらのヘパリン／ヘパランスルフェートのこれらの薬理学的に重要な基の構造的分析のための基礎を提供する。

（方法）
略語：ＨＬＧＡＧ、ヘパリン様グリコサミノグリカン；ＡＴ−ＩＩＩ、アンチトロンビンＩＩＩ；ＡＴ−１０、ヘパリンの部分消化から単離されたＡＴ−ＩＩＩ画分十糖；ＩＧＳ、完全グリカン配列決定；ＰＥＮ、性質コード命名法；ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、マトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析；ＣＥ、キャピラリー電気泳動；以下のようなＨＬＧＡＧ配列の略語、Ｉ、α−Ｌ−イズロン酸；Ｇ、β−Ｄ−グルクロン酸；ΔＵ、Δ^４，５ウロン酸；２Ｓ、３Ｓおよび６Ｓ、それぞれ、２−Ｏ、３−Ｏ、または６−Ｏ硫酸化；ＮＳおよびＮＡｃ、グルコサミンのＮ−硫酸化およびＮ−アセチル化。

（材料）。十糖ＡＴ−１０は、以前の研究において使用される同じ糖である（Ｒｈｏｍｂｅｒｇ，Ａ．Ｊ．，Ｓｈｒｉｖｅｒ，Ｚ．，Ｂｉｅｍａｎｎ，Ｋ．＆
Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ．（１９９８）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄ
ＳｃｉＵＳＡ９５，１２２３２−７およびＥｒｎｓｔ，Ｓ．，Ｒｈｏｍｂｅｒｇ，Ａ．Ｊ．，Ｂｉｅｍａｎｎ，Ｋ．＆Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ．（１９９８）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９５，４１８２−７）。オリゴ糖を、１０〜３５μＭの濃度で脱イオン水中に溶解した。Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のヘパリナーゼＩ〜ＩＩＩを、先に記載のように精製した。外酵素α−Ｌ−イズロネート２−Ｏスルファターゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、β−Ｄ−グルクロニダーゼおよびＮ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼは、ＯｘｆｏｒｄＧｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。亜硝酸ナトリウムの４０％水溶液を、ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌから購入した。組成分析のための二糖標準は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。

（組成分析）。オリゴ糖の組成分析を、先に記載のように、ＡＴ−１０の３０μＭサンプルの徹底的な消化、続くキャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって完了した（Ｒｈｏｍｂｅｒｇ，Ａ．Ｊ．，Ｅｒｎｓｔ，Ｓ．，Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ．＆Ｂｉｅｍａｎｎ，Ｋ．（１９９８）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９５，４１７６−８１）。簡単に述べると、１ｎｍｏｌのオリゴ糖に、２００ｎＭのヘパリナーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩの２５ｍＭ酢酸ナトリウム、１００ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭ酢酸カルシウム緩衝液ｐＨ７．０を添加した。反応を３０℃で一晩進行させ、次いで、５０ｍＭトリス／ホスフェート１０μＭデキストランスルフェートｐＨ２．５の電気泳動緩衝液を用いて、逆の極性でＣＥにより分析した。

（消化）。ヘパリナーゼＩ消化を、短くまたは徹底的に、のいずれかで消化した。短い消化について、５０ｎＭヘパリナーゼＩを、分析の前に１０分間基質とともにインキュベートした。徹底的な消化は、２００ｎＭ酵素を用いて一晩で完了した。酵素反応は、１０μＭオボアルブミン、１μＭデキストランスルフェート、５ｍＭ酢酸カルシウムおよび１０ｍＭエチレンジアミン緩衝液（ｐＨ７．０）を含む緩衝液中の１μＬの酵素溶液を、４μＬの基質水溶液に添加することによって行った；消化を、先に記載のように、室温で進行させた（Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎ，Ｇ．，Ｓｈｒｉｖｅｒ，Ｚ．，Ｒａｎｉａｎ，Ｒ＆Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８６，５３７−４２およびＲｈｏｍｂｅｒｇ，Ａ．Ｊ．，Ｅｒｎｓｔ，Ｓ．，Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ．＆Ｂｉｅｍａｎｎ，Ｋ．（１９９８）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９５，４１７６−８１）。部分的な亜硝酸切断は、公開された手順の改変を使用して完了した（Ｔｕｒｎｂｕｌｌ，Ｊ．Ｅ．，Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｊ．Ｊ．＆Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，Ｊ．Ｔ．（１９９９）ＰｒｏｃＮａｔｌ
ＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９６，２６９８−７０３）。外酵素消化は、同時にまたは連続的に、のいずれかで完了した。最終の酵素濃度は、２０〜４０ミリ単位／ｍＬの範囲であり、そして消化を３７℃で実行した。

（質量分析法）。質量スペクトル分析は、遅延抽出を伴う線形モードのＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＶｏｙａｇｅｒＥｌｉｔｅｒｅｆｌｅｃｔｒｏｎ飛行時間機器で実行された。消化物からのサンプルは、０．５μＬの反応混合物を取り出し、そしてそれを二倍モル過剰のベーシックペプチド（ＲＧ）_１９Ｒ（（Ｍ＋Ｈ）^＋イオンの計算質量＝４２２６．８）を含む、４．５μＬのマトリクス溶液（３０％アセトニトリル中の１２ｍｇ／ｍＬカフェイン酸）に添加することによって調製した。ＨＬＧＡＧオリゴ糖に特異的にキレートするベーシックペプチドの添加および質量スペクトル収集パラメーターによって、さらなる精製の必要なしに、直接的なサンプル分析が可能である（Ｒｈｏｍｂｅｒｇ，Ａ．Ｊ．，Ｅｒｎｓｔ，Ｓ．，Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ．＆Ｂｉｅｍａｒｍ，Ｋ．（１９９８）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ
９５，４１７６−８１）。サンプルを標的上にスポットし、そして質量スペクトルを、先に概説されたパラメーターを使用して集めた（Ｒｈｏｍｂｅｒｇ，Ａ．Ｊ．，Ｅｒｎｓｔ，Ｓ．，Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ．＆Ｂｉｅｍａｒｍ，Ｋ．（１９９８）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９５，４１７６−８１）。ベーシックペプチドの（Ｍ＋Ｈ）^＋イオンおよび１：１ペプチド：糖複合体の（Ｍ＋Ｈ）^＋が、それぞれの質量スペクトルにおいて観測され、糖の質量は、１：１複合体の（Ｍ＋Ｈ）^＋イオンの測定されたｍ／ｚ値から、そのペプチドの（Ｍ＋Ｈ）^＋イオンの測定されたｍ／ｚ値を引くことによって決定される（Ｊｕｈａｓｚ，Ｐ．＆Ｂｉｅｍａｎｎ，Ｋ．（１９９５）ＣａｒｂｏｈｙｄｒＲｅｓ２７０，１３１−４７）。プレート上の全てのスペクトルを、同一機器パラメーター下で、（ＲＧ）_１９Ｒの標準および配列Ｉ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}Ｉ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}Ｉ_２ＳＭａｎ_６Ｓ（１６５５．４の計算された質量）の亜硝酸誘導六糖とのその複合体を使用して、外部から較正した。この方法論は、効率的な複合体化を確実にするための糖の十分な硫酸化を必要とする。このように、小さな過小硫酸化（ｕｎｄｅｒｓｕｌｆａｔｅｄ）糖（すなわち、単糖および二糖）は、この方法論では観測されない（Ｊｕｈａｓｚ，Ｐ．＆Ｂｉｅｍａｎｎ，Ｋ．（１９９５）ＣａｒｂｏｈｙｄｒＲｅｓ２７０，１３１−４７）。

（完全グリカン配列決定）。電気泳動分離を使用する完全グリカン配列決定（ＩＧＳ）を、記載されるように行った（Ｔｕｒｎｂｕｌｌ，Ｊ．Ｅ．，Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｊ．Ｊ．＆Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，Ｊ．Ｔ．（１９９９）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９６，２６９８−７０３）。部分的亜硝酸切断条件を、２５ｍＭＨＣｌおよび２．５ｍＭ亜硝酸ナトリウム、ならびに５分、１０分、２０分、３０分、１２０分、および２４０分の停止時点を使用することによって改変した。

（^１ＨＮＭＲ分光法）。^１ＨＮＭＲ分光法を、以前に記載される条件を使用して行った（Ｎａｄｋａｒｎｉ，Ｖ．Ｄ．，Ｔｏｉｄａ，Ｔ．，ＶａｎＧｏｒｐ，Ｃ．Ｌ．，Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，Ｒ．Ｌ．，Ｗｅｌｌｅｒ，Ｊ．Ｍ．，Ｈａｎｓｅｎ，Ｋ．Ｐ．，Ｃａｌｄｗｅｌｌ，Ｅ．Ｅ．＆Ｌｉｎｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｊ．（１９９６）ＣａｒｂｏｈｙｄｒＲｅｓ２９０，８７−９６）。ＡＴ−１０を、イオン交換クロマトグラフィーに供して、常磁性不純物を除いた。ＡＧ
５０Ｗ−Ｘ８（Ｂｉｏ−ＲａｄＪａｐａｎＴｏｋｙｏ）のカラム（１ｃｍ×１０ｃｍ）を、５ｍＬの０．１ＭＮａＯＨでの処理によってナトリウム形態に転換し、そして使用の前に１２時間、水で洗浄した。ＮＭＲ実験のためのサンプルを、カラムに適用し、２０ｍＬの水で溶出し、そして凍結乾燥した。次いで、サンプル（約１ｍｇ）を９９．８％Ｄ_２Ｏ（Ｍｅｒｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から３回凍結乾燥し、そして５ｍｍチューブ中でのＮＭＲ分光法のために０．５ｍＬの１００％Ｄ_２Ｏ（ＡｌｄｒｉｃｈＪａｐａｎ、Ｔｏｋｙｏ）中に溶解させた。ＡＴ−１０の１Ｄ ^１ＨＮＭＲ分光法を、５−ｍｍフィールド勾配調製可能プローブを備えるＪＥＯＬＧＳＸ５００Ａ分光器で２９８Ｋで行った。

（結果）
（配列決定方法論への導入）
最近、±１Ｄａより良い精度で、ＨＬＧＡＧ複合体オリゴ糖（二糖〜十糖）の質量の決定を可能にするマトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）が開発された（Ｊｕｈａｓｚ，Ｐ．＆Ｂｉｅｍａｎｎ，Ｋ（１９９５）ＣａｒｂｏｈｙｄｒＲｅｓ２７０、１３１−４７およびＪｕｈａｓｚ，Ｐ．＆Ｂｉｅｍａｎ，Ｋ（１９９４）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ
ＵＳＡ９１，４３３３−７）。個々のＨＬＧＡＧの得られる分子質量測定の精度に起因して、フラグメントの長さならびに置換基の数および種類の独特の割り当てが、特に、オリゴ糖が十四糖以下である場合、可能である（Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎ，Ｇ．，Ｓｈｒｉｖｅｒ，Ｚ．，Ｒａｍａ，Ｒ．＆Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８６，５３７−４２）。さらに、ＭＡＬＤＩ−ＭＳは、オリゴ糖の酵素分解または化学分解時に生成されるオリゴ糖フラグメントを検出し得る（Ｒｈｏｍｂｅｒｇ，Ａ．，Ｓｈｒｉｖｅｒ，Ｚ．，Ｂｉｅｍａｎｎ，Ｋ．＆Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ．（１９９８）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９５，１２２３２−７；Ｅｒｎｓｔ，Ｓ．，Ｒｏｍｂｅｒｇ，Ａ．Ｊ．，Ｂｉｅｍａｎｎ，Ｋ．＆Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ．（１９９８）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９５，４１８２−７；およびＲｈｏｍｂｅｒｇ，Ａ．Ｊ．，Ｅｒｎｓｔ，Ｓ．，Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ．＆Ｂｉｅｍａｎｎ，Ｋ．（１９９８）Ｐｒｏｃ
ＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９５，４１７６−８１）。最後に、ＭＡＬＤＩ−ＭＳの感度は、１００フェムトモルという少量の物質が容易に検出され得るような感度である。

ＭＡＬＤＩ−ＭＳ実験技術に加えて、１６進数コード系を使用する、３２個の二糖単位を表すための性質コード命名法（ＰＥＮ）が開発された（Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎ，Ｇ．，Ｓｈｒｉｖｅｒ，Ｚ．，Ｒａｍａ，Ｒ．＆Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８６，５３７−４２）。ＰＥＮの開発は、ＨＬＧＡＧの大量の情報内容（性質）を扱うのに必要である。１６進数のそれぞれは、特定の構築ブロック単位上のスルフェートの分布の観点からそれ自体明らかにする内部論理（ｉｎｔｅｒｎａｌｌｏｇｉｃ）に基づいて導かれ、各二糖単位を同定するために無作為に単純に割り当てられない。この系は、単純な数学演算または２進演算を使用して配列の迅速な操作を可能にし、従って、複合体多糖の大量の情報に対する操作を提供する点で、ＨＬＧＡＧについて重要である。さらに、ＨＬＧＡＧにおける内在的構造的多様性が、性質の違い（荷電スルフェート基およびアセテート基の位置）から生じ、それによってＰＥＮをＨＬＧＡＧの自然な割り当てスキームにする。これは、ＤＮＡのヌクレオチドおよびまたはタンパク質のアミノ酸を表すために使用されるアルファベットコード（これらは、単なる識別子として役立ち、そしてこれらの生体高分子のいかなる情報（性質）もコードせず、それらの化学的不均質性をとらえない）と正反対である。

１６進数コード系は、英数字０〜９およびＡ〜Ｆを含む。二糖単位が、改変され得る４つの位置（すなわち、２−Ｏ、Ｎ−、３−Ｏおよび６−Ｏ）を有するので、これらの化学位置の１つに１６進数コードの４つの２進位取りのそれぞれを割り当てることが直接的である。さらに、それぞれの位置で二つのみの改変が可能である（２−Ｏ、３−Ｏおよび６−Ｏは、硫酸化されるかまたはそのままであり得、そしてＮ−位は、硫酸化されるかまたはアセチル化される^＊）ので、２進数系の使用は、単純なオン状態またはオフ状態としてこれらの改変をとらえる。例えば、所与の二糖単位において、２−Ｏ位が硫酸化される場合、１の２進数値が割り当てられる。逆に、所与の二糖の２−Ｏ位が、硫酸化されない場合、０の２進数値が割り当てられる。（^＊いくつかのわずかなＨＬＧＡＧ配列が非置換Ｎ−位を有し、これは、余分のビットを加えることによってＰＥＮ系で考慮され得る。しかし、本発明者らの研究において、組成分析（以下を参照）を含む最初の実験は、二糖を含むフリーアミンの存在を示さなかった）。

英数字を用いて二糖を同定するために、４つの２進数位置を以下の様式で割り当てた：２−Ｏ位が最も左の２進数位置に、続いて、６−Ｏ、３−ＯおよびＮ−位でその順番で割り当てた。それぞれの場合において、上で概説されるように、２進数コード１は、硫酸化位置を表すために使用され、そして０は、２−Ｏ、６−Ｏおよび３−Ｏの場合には、硫酸化されていない位置、Ｎの位置の場合には、アセチル化を表すために使用された。

ウロン酸の異性体状態（すなわち、イズロン酸対グルクロン酸）をコードするために、本発明者らは、二糖単位を＋／−と示した。この方法において、イズロン酸含有単位に対する正の１６進法コードおよびグルクロン酸含有単位に対する負の１６進法コードを割り当て得る。従って、同一の１６進法コードであるが異符号である二糖単位は、ウロン酸の異性体状態においてのみ異なる同一の硫酸化パターンを有する。表１は、本研究で示す二糖単位に対するＰＥＮの使用を概説する。

（表１：本研究において使用した二糖単位に対するＰＥＮの誘導）

ＡＴ−１０に生じる二糖単位について誘導された１６進法コードを、表１に示す。列１は、ウロン酸の異性体状態についてコードする二進位である。列２〜５は、二糖単位の２−Ｏ、６−Ｏ、３−ＯおよびＮ−位での修飾をコードする。列６は、列２〜５における二進の桁によって示される１６進法コードを示す。列７は、列６中のコードによって示される二糖単位である。列８は、配列中に存在する二糖単位の算出した理論質量を示す。これらの二糖に対する化学修飾または酵素修飾について、以下の命名を使用する：Δ^４−５不飽和結合（ΔＵ）を有するウロン酸＝±；質量タグを有する還元末端二糖単位＝^ｔ；５員無水マンノース環を有する二糖単位＝’。

従って、ＰＥＮ−ＭＡＬＤＩによるＨＬＧＡＧオリゴ糖の配列割り当てについてのストラテジーは、以下の工程を実質的に含む。第一に、インタクトなオリゴ糖のＭＡＬＴＩ−ＭＳを使用して、このオリゴ糖に存在するスルフェートおよびアセテートの長さおよび総数を割り当てる。次いで、組成分析を使用して、二糖基礎単位（ｂｕｉｌｄｉｎｇｂｌｏｃｋ）の数および型を決定する。この情報を用いて、マスターリストは、二糖単位を含む実行可能な配列全てを構成する。この様式において、所定の配列がどんなに独特であり得ても、この分析から排除される配列はない。実験的拘束およびこれらの拘束を満たさない配列が排除される場合、酵素的消化または化学的分解から生成された二糖フラグメントの質量を、適用する。反復様式において、実験的拘束から絶えず減少する実行可能な配列のマスターリストへ移すことによって、最小の材料を使用する独特な配列解に迅速に到達し得る。重要なことに、別々の実験拘束を用いる多重経路を使用して、配列の収束し得、割当て精度を保障する。

（ＡＴ−１０の分析）
ＡＴ−１０、および酵素的処理または化学的処理のいずれかに基づくＡＴ−１０由来のオリゴ糖を、基本ペプチド（ＲＧ）_１９Ｒとの非共有結合複合体としてＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いて検出する（Ｒｈｏｍｂｅｒｇ，Ａ．Ｊ．，Ｅｒｎｓｔ，Ｓ．，Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ．＆Ｂｉｅｍａｎｎ，Ｋ．（１９９８）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９５，４１７６−８１およびＪｕｈａｓｎ、Ｐ．＆Ｂｉｅｍａｎｎ，Ｋ．（１９９５）ＣａｒｂｏｈｙｄｒＲｅｓ２７０，１３１−４７）。この方法論を使用して、（ＲＧ）_１９Ｒの（Ｍ＋Ｈ）^＋イオン、およびペプチド：糖複合体についての（Ｍ＋Ｈ）^＋イオンの２種を観察する。１：１の糖：ペプチド複合体の（Ｍ＋Ｈ）^＋値からのペプチドの（Ｍ＋Ｈ）^＋値を差し引くことによって、オリゴ糖の分子量を得た。表２は、本研究において観察された全てのフラグメント、これらの算出した実験的に誘導された質量値、およびＡＴ−１０の配列割当て後のフラグメントの推定された構造を列挙する。図１は、ＡＴ−１０の主要成分がｍ／ｚ値６９９９．３を有することを示す。プロトン化ペプチドのｍ／ｚ値が差し引かれる場合、このオリゴ糖の質量についての実験値が、２７７０．２であることを見出す。これは、１３のスルフェート基および１つのアセテート基を有する二糖に対して独特に割り当てられ得る。ＡＴ−１０の質量スペクトルは、１２のスルフェート基および１つのアセテート基を有するオリゴ糖に対応する、質量２６９０．１の別の種（本明細書中以降では、夾雑物という）の存在を示す。

（表２：質量スペクトルにおけるピークｍ／ｚ値およびその推定構造）
^＊ｄは、セミカルバジド質量タグを示す（Δ＝５６．１ダルトン）。

糖と基本ペプチド（ＲＧ）_１９Ｒとのプロトン化１：１複合体のｍ／ｚ値を、列１に示す。列２は、このプロトン化１：１複合体から、スペクトル中で観察されるプロトン化ペプチドの値を差し引くことによって得られる、観察された多糖の質量を示す。質量スペクトルにおける対応するピークについて推定された糖の化学構造を、列３に示す。この推定構造について算出された理論質量を、列４に示す。観察された質量（列２）が常に算出された質量（列４）の±１ダルトン以内であることに注意せねばならない。

ＣＥを使用する組成分析は、ΔＵ_２Ｓ−Ｈ_{ＮＳ，６Ｓ}（±Ｄ）、ΔＵ−Ｈ_{ＮＡＣ，６Ｓ}（±４）、ΔＵ−Ｈ_{ＮＳ，６Ｓ}（±５）およびΔＵ−Ｈ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}（±７）に対応するそれぞれ２．９０：１．００：１．０５：０．１５の相対比での、４つの二糖の基礎単位の存在を示す。従って、このサンプルの組成分析は、２つの種（一方は主要（約８５％）であり、もう一方は少数（約１５％）である）が存在することを確認した。ＡＴ−１０は、３：１：１の比である基礎単位ΔＵ_２Ｓ−Ｈ_{ＮＳ，６Ｓ}（±Ｄ）、ΔＵ−Ｈ_{ＮＡＣ，６Ｓ}（±４）およびΔＵ−Ｈ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}（±７）でできている二糖でなければならない。一緒になって、ＣＥおよびＭＡＬＴＩ−ＭＳデータを使用して、ＡＴ−１０についての実行可能な配列のマスターリストを構築した。本発明者らは、３２０個の配列がＣＥおよびＭＳデータの両方を計上し得ることを見出す（表２）。これら３２０個の配列は、単一の解で集束するまで実験的拘束に基づいて配列が除去されるマスターリストを構成する。

さらに、組成分析は、ΔＵ−Ｈ_{ＮＳ，６Ｓ}（±５）の存在を除いてＡＴ−１０に構造的に類似する夾雑物が存在することを確認した。ＣＥデータより、夾雑物の組成は、逐次減法から２：１：１：１の相対比であるΔＵ_２Ｓ−Ｈ_{ＮＳ，６Ｓ}（±Ｄ）、ΔＵ−Ｈ_{ＮＡＣ，６Ｓ}（±４）、ΔＵ−Ｈ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}（±７）およびΔＵ−Ｈ_{ＮＳ，６Ｓ}（±５）であることが決定された。

配列実行のマスターリストを構築した場合、ＰＥＮ−ＭＡＬＤＩ、ＩＧＳ（Ｔｕｒｎｂｕｌｌ，Ｊ．Ｅ．，Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｊ．Ｊ．＆Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，Ｊ．Ｔ．（１９９９）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９６，２６９８−７０３）およびＮＭＲ分析の組み合わせを使用して、ＡＴ−１０を配列決定し、次いで、夾雑物の配列を分析した。

（ＡＴ−１０のＭＡＬＤＩ−ＭＳ配列決定）
組成物データから生成した３２０個の実行可能な配列のリストより、本発明者らは、ＡＴ−１０の配列を割り当てるために、ヘパリナーゼＩおよび亜硝酸それぞれの使用を含む一連の実験的拘束を使用した。

ヘパリナーゼＩを用いるＡＴ−１０の短時間の（不完全な）消化は、分子量５５７．７、１０７３．９、１１５５．６、１６１４．６および２１９２．２の５つのフラグメントを生じた（図２ａ）。質量５７７．７を有するフラグメントは、±Ｄに対応する。１１５５．６フラグメントは、以下の構造の１つを有する必要のある六硫酸化六糖に対応する：±ＤＤ、±Ｄ−Ｄ、±Ｄ７、±Ｄ−７、±７Ｄまたは±７−Ｄ。１６１４．６を有するフラグメントは、七硫酸モノアセチル化六糖に対応し、そして２１９２．２を有するフラグメントは、十硫酸化モノアセチル化八糖に対応する。１０７３．９での最後のピークは、明らかに夾雑物に対して割り当てられた（分析については以下を参照のこと）。３２０個の配列のリストがシュミレートされたヘパリナーゼＩ消化によって形成されるこれらのフラグメントに対して検索された場合、これは、５２個の配列に減少した（表２）。

ヘパリナーゼＩによる基質消化の速度は、サイズ依存的である（Ｌｉｎｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｊ．，Ｔｕｒｎｂｕｌｌ，Ｊ．Ｅ．，Ｗａｎｇ，Ｈ．Ｍ．，Ｌｏｇａｎａｔｈａｎ，Ｄ．＆Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，Ｊ．Ｔ．（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２９，２６１１−７）。ＡＴ−１０中の２−Ｏ硫酸化イズロン酸含有結合を全て同定するために、ＡＴ−１０を、全ての感受性結合の完全な切断を生じる条件下でヘパリナーゼＩで処理した。これらの条件下で、夾雑物由来の六糖および四糖は、インタクトなままであった（表２ｂ）。しかし、六硫酸化四糖（図２ａから質量１１５５．６）を切断した。よって、この糖は、配列±ＤＤを有する。ＡＴ−１０についての５２個の実行可能な配列割当てのうち、２８個のみが、ヘパリナーゼＩの徹底的な消化データを満たし得る。

次に、ＡＴ−１０を、セミアルバジドで処理して、アノマー位でセミカルバゾンを得た。この様式において、質量タグ（Δ＝５６．１）を導入して、非還元末端に対抗させるように還元末端由来のフラグメントを差別化した。ヘパリナーゼＩでのタグ化ＡＴ−１０の処理によって、５つのフラグメントを得た（図２ｃ）。ヘパリナーゼＩ処理の非誘導体化ＡＴ−１０との比較より（図２ａ）、七硫酸化モノアセチル化六糖は、タグ化されたようであり、よって、ＡＴ−１０の還元末端由来であるはずである。２８個の残りの配列に対するこの拘束の適用は、１２個を除くを排除した（表３）。
（表３：ＡＴ−１０配列の収束）

十糖サンプルを配列決定するために使用した逐次戦略を、表３に示す。３２０個^＊の配列のマスターリストからの配列を排除するための実験的拘束の適用を、最終配列に収束させるために使用した。実験的拘束を満たした配列の数を、左側のボックスに示した。右側のボックスは、表の最初の括弧に示した質量について形成された実行可能なフラグメントとともに実験的拘束を満たす配列を示す。

表３中の１２個の残りの配列の検査は、最初の差異が還元末端六糖の同定にあることを示す。従って、ＡＴ−１０の亜硝酸消化およびエキソ酵素の賢明な使用を介して、還元末端四糖の配列を決定した。第一に、タグ化したＡＴ−１０を、亜硝酸で徹底的に処理し、そして２種が容易に検出可能であった（図３）。質量１０１３．８を有する一方は、４つのスルフェートおよび１つのアセテートを有するタグ化した無水マンノース四糖に対応する。質量９５８．８を有する他方は、タグ化されていない同一の四糖に対応する。両方が、以下の配列の１つを張り当てられた：±４７、±４−７、±４−Ｄ。従って、この情報に基づいて、実行可能な配列の半分を、ＡＴ−１０について６個のみの実行可能な配列解を残して排除し得た（表３）。

ＡＴ−１０の還元末端で２つの二糖単位の独特な異性体状態を割当てるために、以下の実験的拘束を使用した：徹底的な亜硝酸消化を、非還元末端でイズロン酸を特異的に剪定するエキソ溶解性（ｅｘｏｌｙｔｉｃ）酵素α−イズロニダーゼとともにインキュベートした。１７８．０によるスペクトルにおける移動は、ウロン酸を４、その異性体状態を＋（すなわち、ＩＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}または＋４）として確認した。３つの配列のみが、観察されたフラグメント（すなわち、±７ＤＤ４−Ｄ、±ＤＤＤ４−７、±ＤＤＤ４７）を示し得た。

^＊３±Ｄｓ、±４および±７の組成を有する実行可能な十糖全てを得るために、本発明者らは、全ての実行可能な方法において十糖を得るために上記の二糖を整列するしなければならない。また、各二糖単位は、イズロン酸またはグルクロン酸に対応して＋または−であり得る。実行可能な配列の数＝^５Ｃ_３（５位での整列３Ｄｓ）^＊２Ｃ_１（２つの残りの位置での４つの整列）^＊２^４（糖がヘパリナーゼ由来であるので、非還元末端以外の全ての位置において＋または−とみなすために）＝１０^＊２^＊１６＝３２０
これら最後の３つの選択肢を区別するため、および還元末端二糖を同定するために、イズロニダーゼ処理産物を、先ず６−ＯスルファターゼおよびＮ−デアセチラーゼで処理して、ヘキソサミンを除き、還元末端二糖のみを残した。β−グルクロニダーゼでのこのサンプルの処理によって、単糖への分解を生じた。このことは、還元末端二糖を−７（Ｇ−Ｈ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}）と同定した。従って、ＡＴ−ＩＩＩの分画化十糖の推定配列は、±ＤＤＤ４−７（ΔＵ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}Ｉ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}Ｉ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}ＩＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}）である。注目すべきは、この配列が同一の様式において生成された十糖に対する配列割当てと一致しない事実である（Ｔｏｉｄａ，Ｔ．，Ｈｉｌｅｍａｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｅ．，Ｖｌａｈｏｖａ，Ｐ．Ｉ．＆Ｌｉｎｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｊ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，３２０４０−７）。従って、本発明者らは、他の分析法を使用して本発明の配列割当てを確認することを探索した。

（ＡＴ−１０のＩＧＳ配列決定）
ＡＴ−１０をまた、最近確立された技術であるＩｎｔｅｇｒａｌＧｌｙｃａｎＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＩＧＳ）を使用して配列決定した。これは、還元末端を蛍光でタグ化した糖の電気的分離を使用する。糖の部分的な亜硝酸切断およびエキソ酵素的消化は、配列が決定され得るラダーを生成した。ＰＥＮ−ＭＡＬＤＩデータに従って、蛍光タグ化サンプルの電気泳動的分析は、単一の主要な十糖を生成したが、さらに、より小さな夾雑物もまた、明らかであった。部分的亜硝酸切断の産物は、十糖、八糖、六糖および四糖であり、二糖産物は観察されなかった。この結果は、ＮＳ部分およびＮＡｃ部分の全ての位置を規定し、還元末端に近接する位置にたった１つのＮ−アセチル化二糖を有する。エキソ酵素の異なる組み合わせでのこれらの産物の処理に起因するゲルシフトは、３つの位置でのイズロン酸残基（そのうちの２つが２−Ｏ−硫酸化されている）および６−Ｏ−硫酸化グルコサミン残基の３つの位置での存在を示した。非還元末端は、完全に２−Ｏ−硫酸化されていたが、非還元末端グルコサミン残基上の６−Ｏ−スルフェートの存在を確認し、そしてこの還元末端単糖上の硫酸化パターンの詳細は、この分析において得られなかった。このデータは、ＡＴ−１０の構造をΔＵ_２ＳＨ_{ＮＳ，±６Ｓ}Ｉ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}Ｉ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}ＩＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＡＣ／ＮＳ，±３Ｓ，±６Ｓ}と規定する。独立した配列決定手法由来のこのデータは、ＰＥＮ−ＭＡＬＤＩ分析と完全に一致した。

（ＡＴ−１０夾雑物の配列分析）
質量スペクトルデータをまたＣＥ組成分析と組合わせて使用して、ＡＴ−１０の１２硫酸化１アセチル化夾雑物について提唱した配列に到達し得た。上記で述べたように、ヘパリナーゼＩ消化（図２ａ）は、この夾雑物に対してのみ割当て可能な８硫酸化四糖（±Ｄ±５、±７±５または±５±７）に対応するピークを１０７３．９のｍ／ｚで得た。この四糖フラグメントは、この夾雑物の還元末端由来ではなかった。なぜなら、±５を含有する標識糖は、この条件下で見出されなかったからである。さらに、タグ化十糖のヘパリナーゼＩ消化は、両方の夾雑物およびＡＴ−１０に対する還元末端において４−７を配列する。ヘパリナーゼＩ消化において観察されたＤ５四糖またはＤ−５四糖の位置を配列するために、十糖を、イズロン酸２−Ｏで処理した後にヘパリナーゼＩで処理した。これらの条件下で、５硫酸化四糖は、（スルフェートの消失によって生じる１０７３．９から９９３．９までの）質量で８０Ｄａ減少した。従って、この四糖は、夾雑物の非還元末端由来であるはずである。まとめると、この情報は、この夾雑物の配列が±Ｄ５Ｄ４−７または±Ｄ−５Ｄ４−７であることを示唆する。

ＡＴ−１０およびこの夾雑物についての割当ては、この十糖が亜硝酸で不完全に分解される場合に確認された（図４）。還元末端で無水マンノースを有するＡＴ−１０（質量２６７３．０）を、Ａｔ−１０の亜硝酸切断より生じるフラグメントである（質量２２０９．２、２１１３．２および１６３３．２）として完全に観察した。さらに、質量１０５７．９を有する種は、ΔＵ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}Ｉ_２ＳＭａｎ_６Ｓよりのみ得られ、ＡＴ−１０の非還元末端の独特な質量シグネチャーを提供する。重要なことに、これらの種の全てが、ＡＴ−１０または夾雑物のいずれかに対して割当てられ得る。

（ＡＴ−１０のＮＭＲスペクトルの解釈）
ＡＴ−１０のＮＭＲスペクトルを、表６に示す。本発明者らの分析と一致して、Ｈ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}のαＨ−１、αＨ−２およびαＨ−３の小さなシグナル（それぞれ、５．４５ｐｐｍ、３．４５ｐｐｍおよび４．５０ｐｐｍ）は、Ｈ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}として還元末端単糖単位を割り当てることを可能にする。この場合において、還元末端Ｈ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}残基のアノマー性プロトンは、α−配置とβ−配置とに分けられなければならない。Ｈ_ＮＳ残基のアノマー性プロトンのα−配置は、アノマー性効果に基づいてプロトン性溶媒（例えば、重水素）中で優勢（約９５％）である。さらに、２つのＩ_２Ｓ部分の存在が、検出され得た。驚くことに、この２つのＩ_２Ｓのアノマー性シグナル（通常、約５．２０ｐｐｍで共鳴する）が、シフトした。これは、おそらく^１Ｃ_４から^２Ｓ_０への内部Ｉ_２Ｓ部分のコンフォーメーションにおける変化から生じる。また、オリゴ糖がＨ_{ＮＳ，６Ｓ}のＨ−２プロトンの統合値ならびにそれぞれ３．２７ｐｐｍおよび３．３８ｐｐｍで観察されるＧ残基に基づく３つのＨ_{ＮＳ，６Ｓ}および１つの非硫酸化Ｇ残基を含むことが確認され得る。２．１ｐｐｍでのＨ_{ＮＡｃ，６Ｓ}残基の１つのＮ−アセチル化メチルシグナルの存在は、このオリゴ糖が１つのＨ_{ＮＡｃ，６Ｓ}残基を含むことを完全に示す。約４．３ｐｐｍおよび３．９ｐｐｍでの６−Ｏ−硫酸化Ｈ_ＮＹ残基（Ｙ＝ＡｃまたはＳ）のＨ−６プロトンに対応するシグナルの存在は、このオリゴ糖の全てのＨ_ＮＹ残基がＣ−６でＯ−硫酸化されていることを確認する。まとめると、このデータは、ＡＴ−１０サンプル中の主要な種の配列割当てをΔＵ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}Ｉ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}Ｉ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}ＩＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}とし得る。

（要約）
本実施例において、いくつかの厳密な分析技術が複合体ＨＬＧＡＧオリゴ糖の構造に対して収束されるように使用され得ることを、示した。さらに、２つの配列決定手順（すなわち、ＩＧＳおよびＰＥＮ−ＭＡＬＤＩ）を使用する配列割当てが同一であることを示した。これは、十糖の部分的および徹底的な亜硝酸処理においてほぼ明らかである（図３）。重要なことに、本発明者らの分析によって、現在、ゲル電気泳動およびＭＡＬＴＩ−ＭＳで観察される十糖、八糖、六糖および四糖に対して以下の配列（すなわちＤＤＤ４−７、ＤＤ４−７、Ｄ４−７および亜硝酸耐性四糖４−７）を割当てることが可能になった。次の実施例において、部分的にインタクトなＡＴ−ＩＩＩ結合部位の機能的帰結およびＡＴ−ＩＩＩ結合部位に対するヘパリナーゼの酵素的作用を調査した。

さらに、ＰＥＮ−ＭＡＬＤＩ手法が十分に高感度であり、そしてオリゴ糖混合物についての配列情報を決定し得ることを区別化することが実証された。ＰＥＮ−ＭＡＬＤＩを使用したＡＴ−１０についての単一の解への収束は多数の直交する実験的拘束（Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎ，Ｇ．，Ｓｈｒｉｖｅｒ，Ｚ．，Ｒａｍａｎ，Ｒ．＆Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８６，５３７−４２）を使用して可能であり、よって、単一の実験的拘束（例えば、亜硝酸切断）に対する信頼性を最小化する。最後に、示した実施例は、生物学的および薬理学的に関連するオリゴ糖についての決定的な配列情報を得るためのＰＥＮ−ＭＡＬＤＩの値を例示する。

（実施例２：ヘパリンにおけるアンチトロンビンＩＩＩ結合部位の、ヘパリナーゼによる切断、および低分子量ヘパリンの生成におけるその関連）
（導入）
ヘパリンは、臨床的抗凝集剤として５０年以上も使用され、最も効果的な公知の薬理学的薬剤の１つとされてきた。ヘパリン活性の多くは、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）を結合するその能力について見出され得る。ヘパリンの制御された崩壊によってヘパリンに由来する低分子ヘパリン（ＬＭＷＨ）は、多くの一連の副作用なしにヘパリンの抗トロンビン活性の多くを維持する。ＬＭＷＨの臨床的意義は、これを生成させる臨床的手段および酵素的手段を理解および発達させる必要性を強調させてきた。低分子量ヘパリンの生成について使用される基本的な酵素的道具は、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のヘパリナーゼ、特にヘパリナーゼＩおよびＩＩである。五糖モデル化合物および六糖モデル化合物を使用して、本発明者らは、ヘパリナーゼＩおよびＩＩ（ヘパリナーゼＩＩＩではない）がＡＴ−ＩＩＩ結合部位を切断することを示す。さらに、本発明者らは、グリコシド結合の還元末端でのグルコサミン３−Ｏ硫酸化がヘパリナーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩに対する耐性を付与することを本明細書中に示す。最後に、本発明者らは、ヘパリンオリゴ糖の生物学的および薬理学的な帰結を試験する。本発明者らは、このようなオリゴ糖がインタクトなＡＴ−ＩＩＩ部位を含むＨＬＧＡＧの機能的特性のいくつかを欠くことを示す。

（方法）
（材料）
ペンタ（Ｐｅｎｔａ）１および２を、Ｄｒ．ＲｏｂｅｒｔＲｏｓｅｎｂｅｒｇ，ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＢｉｏｌｏｇｙ，ＭＩＴより惜しみなく供与された。ヘキサ（Ｈｅｘａ）１を、ヘパリンのヘパリナーゼＩ消化を使用して生成した（Ｅｒｎｓｔ，Ｓ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．，Ｃｏｏｎｅｙ，Ｃ．Ｌ．＆Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ．（１９９５）ＣｒｉｔＲｅｖＢｉｏｃｈｅｍ
ＭｏｌＢｉｏｌ３０，３８７−４４４）。ヘパリンを、ＣｅｌｓｕｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃｉｎｎｃｉｎａｔｉ，ＯＨ）より購入し、モル濃度のストックを、平均分子量１３，０００Ｄａに基づいて算出した。エノキサシンを、ＡｖａｎｔｉｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）より購入した。

消化。ヘパリナーゼＩ消化物を、記載のように（Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎ，Ｇ．，Ｓｈｒｉｖｅｒ，Ｚ．，Ｒａｍａｎ，Ｒ．＆Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８６，５３７−４２およびＲｈｏｍｂｅｒｇ，Ａ．Ｊ．，Ｅｒｎｓｔ，Ｓ．，Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ．＆Ｂｉｅｍａｎｎ，Ｋ．（１９９８）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９５，４１７６−８１）行った。ヘパリナーゼＩＩまたはヘパリナーゼＩＩＩの反応を、１０μＭオボアルブミン、１μＭ硫酸デキストラン、および１０ｍＭ
エチレンジアミン、ｐＨ７．０中で、室温にて本質的に同じ方法で行った。短時間の消化を、５０ｎＭ酵素を用いて１０分間で行う一方で、徹底的な消化を、２００ｎＭ酵素を用いて一晩にわたって行った。上記で概説したパラメーターを用いて質量スペクトルを集め（Ｓｈｒｉｖｅｒ，Ｚ．，Ｒａｍａｎ，Ｒ．，Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎ，Ｇ．，Ｄｒｕｍｍｏｎｄ，Ｋ．，Ｔｕｒｎｂｕｌｌ，Ｊ．，Ｔｏｉｄａ，Ｔ．，Ｌｉｎｈａｒｄｔ，Ｒ．，Ｂｉｅｍａｎｎ，Ｋ．＆Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ．（２０００）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２０００Ｓｅｐ１２；９７（１９）：１０３５９−６４もまた参照のこと）、プロトン化（ＲＧ）_１９Ｒおよび配列Ｉ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}Ｉ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}Ｉ_２ＳＭａｎ_６Ｓの亜硝酸誘導体化六糖とのその複合体についてのシグナルを用いることによって外部較正した。

平衡蛍光力価測定実験。ヒトＡＴ−ＩＩＩのＡＴ−１０十糖またはヘパリンいずれかを用いた力価測定を、Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ２機器（ＳｐｅｘＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて２５℃で行った（Ｍｅａｇｈｅｒ，Ｊ．Ｌ．，Ｂｅｅｃｈｅｍ，Ｊ．Ｍ．，Ｏｌｓｏｎ，Ｓ．Ｔ．＆Ｇｅｔｔｉｎｓ，Ｐ．Ｇ．（１９９８）Ｊ．ＢｉｏｌＣｈｅｍ２７３，２３２８３−９およびＤｅｓａｉ，Ｕ．Ｒ．，Ｐｅｔｉｔｏｕ，Ｍ．，Ｂｊｏｒｋ，Ｉ．＆Ｏｌｓｏｎ，Ｓ．Ｔ．（１９９８）Ｊ．ＢｉｏｌＣｈｅｍ２７３，７４７８−８７）。ｐＨ７．４もしくは６．０のいずれかに合わせた２０ｍＭリン酸ナトリウム（０．１ｍＭＥＤＴＡおよび０．１％ＰＥＧ８０００含有）中で、測定を行った。ｐＨ７．４の緩衝液を用いて、塩化ナトリウムを１００ｍＭに終濃度まで添加した。

蛍光発光スペクトルを、２８０ｎｍ励起波長および５秒の積分時間を用いて３００〜４００ｎｍから集めた。簡潔には、力価測定実験を、以下のように行った。十糖もしくはヘパリンいずれかのアリコートを、ＡＴ−ＩＩＩの１μＭ溶液に添加し、この溶液を、１分間にわたり平衡に到達させ、発光スペクトルを集めた。連続的な糖アリコートの追加および蛍光シグナルをタンパク質希釈について計算するために調節した。

十糖の活性の生物学的測定。インビトロでの抗凝固活性を、米国薬局方に従って、以前に記載のように決定した（Ｈｏｐｐｅｎｓｔｅａｄｔ，Ｄ．Ａ．，Ｊｅｓｋｅ，Ｗ．Ｐ．，Ｗａｌｅｎｇａ，Ｊ．Ｍ．，Ｆｕ，Ｋ．，Ｙａｎｇ，Ｌ．Ｈ．，Ｉｎｇ，Ｔ．Ｓ．，Ｈｅｒｂｅｒｔ，Ｊ．Ｍ．＆Ｆａｒｅｅｄ，Ｊ．（１９９９）ＴｈｒｏｍｂＲｅｓ９６，１１５−２４およびＤｉｅｔｒｉｃｈ，Ｃ．Ｐ．，Ｐａｉｖａ，Ｊ．Ｆ．，Ｃａｓｔｒｏ，Ｒ．Ａ．，Ｃｈａｖａｎｔｅ，Ｓ．Ｆ．，Ｊｅｓｋｅ，Ｗ．，Ｆａｒｅｅｄ，Ｊ．，Ｇｏｒｉｎ，Ｐ．Ａ．，Ｍｅｎｄｅｓ，Ａ．＆Ｎａｄｅｒ，Ｈ．Ｂ．（１９９９）ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ１４２８，２７３−８３）。トロンビン（ＦＩＩａ）および第Ｘａ因子（ＦＸａ）生成阻害アッセイを、本質的に以下に記載のように行った。完結には、この研究に用いたＡＴ−１０十糖、ＥｎｏｘａｐａｒｉｎＬＭＷＨまたは合成ＡＴ−ＩＩＩ結合五糖（Ｐｅｎｔａ１）のいずれかを、指定した濃度で滅菌生理食塩水に溶解した。このサンプルに、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で１：８希釈した等量のフィブリノゲン除去血漿を添加した。別のサンプルで、同じ濃度のヘパリンオリゴ糖およびアクチンを、ＳｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅＴＨまたはＦＸａのいずれかに１：１の比で添加した。このようにして、内因性のＩＩａ生成およびＸａ生成を測定した。さらに、トロンビンおよびＦＸａの外因性の生成の阻害を計算するために、トロンボプラスチンＣを、ＳｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅＴＨまたはＦＸａいずれかで１：６希釈した。すべてのサンプルに関して、光学密度を４０５ｎｍで測定し、結果を、補充していない生理食塩水コントロールと比較した場合の％阻害として表した。これらのアッセイに関して、トロンビン試薬（Ｆｉｂｒｉｎｄｅｘ）を、ＯｒｔｈｏＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪ）から入手し、第Ｘａ因子を、ＥｎｚｙｍｅＲｅｓｅａｒｃｈ（ＳｏｕｔｈＢｅｎｄ，ＩＮ）から入手した。ＳｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅＴＨおよびＦＸａを、ＡｍｅｒｉｃａｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ（Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ，ＣＴ）から入手した。
全血データをまた用いて、ＡＴ−１０の抗凝固活性を決定した。このアッセイ、活性化部分的トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）およびプロトロンビン時間（ＰＴ）を、以前に報告したものと同様の様式で行った（Ｄｉｅｔｒｉｃｈ，Ｃ．Ｐ．，Ｐａｉｖａ，Ｊ．Ｆ．，Ｃａｓｔｒｏ，Ｒ．Ａ．，Ｃｈａｖａｎｔｅ，Ｓ．Ｆ．，Ｊｅｓｌｃｅ，Ｗ．，Ｆａｒｅｅｄ，Ｊ．，Ｇｏｒｉｎ，Ｐ．Ａ．，Ｍｅｎｄｅｓ，Ａ．＆Ｎａｄｅｒ，Ｈ．Ｂ．（１９９９）ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ１４２８，２７３−８３）。ＡＰＴＴ試薬を、ＯｒｇａｎｏｎＴｅｋｎｉｋａ（Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）から入手し、ＨｅｐＴｅｓｔ試薬を、Ｈａｅｍａｃｈｅｍ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。
（結果：）
ＡＴ−ＩＩＩ結合部位に対するヘパリナーゼの酵素作用：
以前に、本発明者らは、ＡＴ−１０に対するヘパリナーゼＩおよびＩＩの基質特異性を調査した（Ｒｈｏｍｂｅｒｇ，Ａ．Ｊ．，Ｓｈｒｉｖｅｒ，Ｚ．，Ｂｉｅｍａｎｎ，Ｋ．＆Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ．（１９９８）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９５，１２２３２−７およびＥｒｎｓｔ，Ｓ．，Ｒｈｏｍｂｅｒｇ，Ａ．Ｊ．，Ｂｉｅｍａｎｎ，Ｋ．＆Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ．（１９９８）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９５，４１８２−７）。しかし、これらの研究を、公開された構造（Ｔｏｉｄａ，Ｔ．，Ｈｉｌｅｍａｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｅ．，Ｖｌａｈｏｖａ，Ｐ．Ｉ．＆Ｌｉｎｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｊ．（１９９６）ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２７１，３２０４０−７）を前提として行った。本明細書中に記載の新たに決定されたＡＴ−１０の構造に鑑みると（Ｓｈｒｉｖｅｒ，Ｚ．，Ｒａｍａｎ，Ｒ．，Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎ，Ｇ．，Ｄｒｕｍｍｏｎｄ，Ｋ．，Ｔｕｒｎｂｕｌｌ，Ｊ．，Ｔｏｉｄａ，Ｔ．，Ｌｉｎｈａｒｄｔ，Ｒ．，Ｂｉｅｍａｎｎ，Ｋ．＆Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ．（２０００）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２０００Ｓｅｐ１２；９７（１９）：１０３５９−６４もまた参照のこと）、本発明者らは、高親和性ＡＴ−ＩＩＩ結合に重要な３−Ｏ硫酸を含むオリゴ糖に対するヘパリナーゼＩ、ＩＩ，およびＩＩＩの酵素作用を再試験した。これらの研究に関して、本発明者らは、３つのオリゴ糖、２つの五糖（Ｐｅｎｔａ１およびＰｅｎｔａ２、図５）および六糖（Ｈｅｘａ１、図５）を用いた。五糖を合成して誘導体化した一方、Ｈｅｘａ１をヘパリナーゼＩによるヘパリンの処理によって誘導体化したという事実に注意のこと。結果として、Ｐｅｎｔａ１またはＰｅｎｔａ２とは異なり、Ｈｅｘａ１は、非還元末端にΔ^４，５ウロン酸を含む。さらに、Ｐｅｎｔａ１およびＰｅｎｔａ２は、内部グルコサミン残基上の３−Ｏ硫酸の存在（Ｐｅｎｔａ１）および非存在（Ｐｅｎｔａ２）によってのみ互いに異なる（図５）。本明細書中で用いられるストラテジーは、本質的に、それぞれ、徹底的な消化条件下でのヘパリナーゼＩ、ＩＩ、またはＩＩＩを用いた糖各々の処理、続いて得られた生成物の質量分析による同定を含む。糖基質および生成物の計算された質量、それらの正体、および観察された質量を、表４に示す。

（表４：ＨＬＧＡＧオリゴ糖の化学構造およびｍ／ｚ値）

表４の第１列に示されるものは、糖と塩基性ペプチド（ＲＧ）_１９Ｒとのプロトン化した１：１複合体のｍ／ｚ値である。第２列は、プロトン化した１：１複合体の質量からプロトン化した塩基性ペプチドの質量を引くことにより得られた糖の観察された質量を示す。質量スペクトルにおける対応するピークの糖の化学構造を、第３列に示す。第４列は、この化学構造について計算された理論的質量を示す。観察された質量が、計算された質量の±１Ｄａ以内にあることに注意のこと。

Ｐｅｎｔａ１の場合、ヘパリナーゼＩＩＩではなく、ヘパリナーゼＩおよびＩＩのみが、このオリゴ糖を、Ｉ_２Ｓ含有グリコシド結合（図５の結合Ａ．２）での切断の指標である、質量９１６．７の５硫酸化三糖および質量５９１．３の３硫酸化二糖に切断する（図６）。図６に示されたデータは、３−Ｏ含有結合が、ヘパリナーゼＩ、ＩＩまたはＩＩＩの切断に耐性であることを示す。この耐性は、長さとは無関係であるようである。ＡＴ−１０の構造に関する以前の理解（Ｔｏｉｄａ，Ｔ．，Ｈｉｌｅｍａｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｅ．，Ｖｌａｈｏｖａ，Ｐ．Ｉ．＆Ｌｉｎｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｊ．（１９９６）Ｊ．ＢｉｏｌＣｈｅｍ２７１，３２０４０−７）に基づいて、十分な長さがあれば、ヘパリナーゼＩＩが３−Ｏ硫酸含有糖を切断することが報告された（Ｒｈｏｍｂｅｒｇ，Ａ．Ｊ．，Ｓｈｒｉｖｅｒ，Ｚ．，Ｂｉｅｍａｎｎ，Ｋ．＆Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ．（１９９８）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９５，１２２３２−７）。ＡＴ−１０十糖の新たに決定された構造（Ｓｈｒｉｖｅｒ，Ｚ．，Ｒａｍａｎ，Ｒ．，Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎ，Ｇ．，Ｄｒｕｍｍｏｎｄ，Ｋ．，Ｔｕｒｎｂｕｌｌ，Ｊ．，Ｔｏｉｄａ，Ｔ．，Ｌｉｎｈａｒｄｔ，Ｒ．，Ｂｉｅｍａｎｎ，Ｋ．＆Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ．（２０００）
ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２０００Ｓｅｐ１２；９７（１９）：１０３５９−６４もまた参照のこと）および図６に示されたデータに鑑みて、以前の知見は、再解釈されなければならず、本明細書中で、ヘパリナーゼＩＩが、還元末端付近の３−Ｏ硫酸グルコサミンを伴う結合を切断しないことが結論付けられる。さらに、ヘパリナーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩの作用にこの結合が耐性であることは、完全に、Ｐｅｎｔａ２のヘパリナーゼＩ、ＩＩ、およびＩＩＩ処理により示される３−Ｏ硫酸の存在に起因する（図７）。この場合、すべてのヘパリナーゼは、この基質を効率的に切断する。Ｐｅｎｔａ１を用いた場合、ヘパリナーゼＩは、Ｉ_２Ｓ含有結合で切断し、質量８３７．３の三糖および質量５９１．９の二糖を生じる（図５における結合Ｂ．２での切断）。逆に、ヘパリナーゼＩＩおよびＩＩＩはともに、すぐに切断可能な硫酸化されていないＧ含有結合（図５の結合Ｂ．１）で切断する。ヘパリナーゼＩＩＩは、この結合のみを切断し、質量１４２８．３の四糖および単糖を生じる（認められなかった）。ヘパリナーゼＩＩは、結合Ｂ．２およびＢ．１で切断し、Ｐｅｎｔａ
２を１つの単糖および２つの二糖に還元する。この二糖のうちの一方が観察され、質量５９２．０を有する（図７）。

３−Ｏ硫酸化糖に対するヘパリナーゼの基質特異性をさらに調査するために、本発明者らは、Ｈｅｘａ１（３−Ｏ硫酸含有のヘパリナーゼＩ由来六糖）を用いた（図８）。Ｈｅｘａ１をまた、この研究のための基質として選択した。なぜなら、ＨｅｘａＩがＡＴ−１０の非還元末端短縮を示し、還元末端に同じＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}部分を含むからである。本発明者らは、Ｈｅｘａ１がヘパリナーゼＩＩおよびＩＩＩでの切断に感受性であるが、ヘパリナーゼＩでの切断には感受性でないことを見出している。Ｈｅｘａ１のヘパリナーゼＩＩまたはＩＩＩいずれかによる切断が、Ｇ含有結合で生じるのではなく、むしろＩ含有結合（図５におけるＣ．２ではなくＣ．１での切断）で生じるという事実に注意のこと。ヘパリナーゼＩＩでの切断の場合、生成物は、質量１０３６．５の四糖および質量５７７．４の二糖である。ヘパリナーゼＩＩＩでの切断については、同じ生成物、すなわち、質量１０３６．１の四糖および質量５７７．８の二糖が観察される。これらの結果により、還元末端付近の３−Ｏ硫酸を伴う結合が、ヘパリナーゼ作用（ヘパリナーゼＩＩを含む）から保護されるという本発明者らの評価が確認される。Ｈｅｘａ１のヘパリナーゼＩＩおよびＩＩＩ両方での処理の場合、ヘパリナーゼ耐性四糖（配列ΔＵＨ_{ＮＡｃ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}を有する）が形成される。この四糖がさらなるヘパリナーゼ切断に耐性であるということは、以前の観察（Ｙａｍａｄａ，Ｓ．，Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｋ．，Ｓｕｇｉｕｒａ，Ｍ．，Ｓｕｇａｈａｒａ，Ｋ．，Ｋｈｏｏ，Ｋ．Ｈ．，Ｍｏｒｒｉｓ，Ｈ．Ｒ．＆Ｄｅｌｌ，Ａ．（１９９３）ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２６８，４７８０−７）と一致する。また、ヘパリナーゼＩの公知の基質特異性と一致して、Ｈｅｘａ１（これはＩ_２Ｓ結合を含まない）は、この酵素により切断されない。
これらの研究に鑑みて、いまや、ヘパリナーゼＩおよびＩＩが、Ｈ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ} ^↓Ｉ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}結合でＡＴ−ＩＩＩ部位を切断し得ることは明らかであり、ここでこの切断可能な結合は、矢印で示される（Ｐｅｎｔａ１のＡ．２およびＰｅｎｔａ２のＢ．２、図５）。さらに、ＡＴ−１０についての新たに割り当てられた構造に対して、本発明者らは、還元末端グルコサミン、すなわち、Ｈ_{ＮＳ，６Ｓ} ^↓ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}上の３−Ｏ硫酸を伴う結合が、ヘパリナーゼＩＩまたはＩＩＩいずれによっても切断可能でないことを見出している（Ｐｅｎｔａ１のＡ．１およびＰｅｎｔａ２のＢ．１、図５）。さらに、本発明者らは、この阻害が、完全に、通常でない３−Ｏ硫酸改変に起因することを見出している。最後に、ヘパリナーゼＩの酵素作用についての本発明者らの以前の研究をまとめると、ＡＴ−１０構造は、ヘパリナーゼＩが、ヘパリン／ヘパランオリゴ糖上で、エキソ分解性処理様式で作用するという事実を補強する（Ｅｒｎｓｔ，Ｓ．，Ｒｈｏｍｂｅｒｇ，Ａ．Ｊ．，Ｂｉｅｍａｎｎ，Ｋ．＆Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ．（１９９８）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９５，４１８２−７）。

ＡＴ−１０十糖へのＡＴ−ＩＩＩ結合：本発明者らの、本明細書中およびＳｈｒｉｖｅｒ，Ｚ．，Ｒａｍａｎ，Ｒ．，Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎ，Ｇ．，Ｄｒｕｍｍｏｎｄ，Ｋ．，Ｔｕｒｎｂｕｌｌ，Ｊ．，Ｔｏｉｄａ，Ｔ．，Ｌｉｎｈａｒｄｔ，Ｒ．，Ｂｉｅｍａｎｎ，Ｋ．＆Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｒ．（２０００）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２０００Ｓｅｐ１２；９７（１９）：１０３５９−６４で報告したＡＴ−１０の配列分析は、この十糖が、インタクトなＡＴ−ＩＩＩ結合五糖配列を含むのではなく、むしろ非還元末端三糖ユニットのみを含むことを明らかにした。本発明者らは、この配列割り当てを拡張し、ＡＴ−１０のＡＴ−ＩＩＩ結合親和性を測定することによりこの結果に機能的関係を与えようとした。ｐＨ７．４、Ｉ＝０．１５において、ＡＴ−１０は、ＡＴ−ＩＩＩに対してほとんど親和性を有さなかった（図９）。逆に、同じ条件下で、豚腸粘膜ヘパリンは、３６ｎＭの見かけのＫ_ＤでＡＴ−ＩＩＩを結合した。ＡＴ−ＩＩＩに対するＡＴ−１０の親和性を正確に測定するために、力価測定を、ｐＨ６．２の代わりに、糖へのＡＴＩＩＩ結合を促進することが公知の条件で行った。これらの条件下で、ＡＴ−１０は、ＡＴ−ＩＩＩを０．８μＭの見かけのＫ_Ｄで結合したが、全長ヘパリンのＫ_Ｄは１０ｎＭに減少した。このＡＴ−１０について測定されたＫ_Ｄは、短縮化還元末端を有する類似の糖に匹敵する（０．３〜２μＭのＫ_Ｄ値と測定されている）（Ｄｅｓａｉ，Ｕ．Ｒ．，Ｐｅｔｉｔｏｕ，Ｍ．，Ｂｊｏｒｋ，Ｉ．＆Ｏｌｓｏｎ，Ｓ．Ｔ．（１９９８）ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２７３，７４７８−８７）。従って、この力価測定実験の結果は、部分的にインタクトなＡＴ−ＩＩＩ五糖結合配列を含むＡＴ−１０と一致する（Ｄｅｓａｉ，Ｕ．Ｒ．，Ｐｅｔｉｔｏｕ，Ｍ．，Ｂｊｏｒｋ，Ｉ．＆Ｏｌｓｏｎ，Ｓ．Ｔ．（１９９８）ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２７３，７４７８−８７）。五糖配列、すなわちＨ_{ＮＡｃ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}の非還元末端における３つの糖ユニットは、主に、ＡＴ−ＩＩＩのネイティブな状態の結合を担う一方で、還元末端二糖ユニットＩ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}（これは、ＡＴ−１０にはない）は、活性な、コンホメーションが変化したＡＴ−ＩＩＩの結合に重要である。ＡＴ−１０について測定されたＫ_Ｄ（ｐＨ６．０、Ｉ＝０．０５で０．８μＭ）は、全長ヘパリンのＫ_Ｄより約１００倍高く、このことにより、ＡＴ−１０が、インタクトなＡＴ−ＩＩＩ五糖配列を含まないことが確認される。ＡＴ−１０について観察されたＡＴ−ＩＩＩ親和性の減少は、以前の研究では、五糖のみが全長ヘパリンと類似の親和性を有することが示されていた（Ｄｅｓａｉ，Ｕ．Ｒ．，Ｐｅｔｉｔｏｕ，Ｍ．，Ｂｊｏｒｋ，Ｉ．＆Ｏｌｓｏｎ，Ｓ．Ｔ．（１９９８）ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２７３，７４７８−８７）ので、単にサイズの問題に起因するのではないはずである。次に、ＡＴ−ＩＩＩと十糖との間の結合相互作用を測定して、本発明者らは、部分的ＡＴ−ＩＩＩ結合部位のみを含むＨＬＧＡＧオリゴ糖の機能的結論を明確にしようとした。
ＡＴ−１０の生物学的活性：インタクトなＡＴ−ＩＩＩ部位を含まないオリゴ糖について予測され得るように、ＡＴ−１０の生物学的活性は、ｅｎｏｘａｐａｒｉｎ（ここでＬＭＷＨの例として用いられる）または五糖であるＰｅｎｔａ１のいずれよりも小さい（図１０）。トロンビン活性のＡＴ−ＩＩＩによるヘパリン媒介性阻害の公知の機構と一致して、十糖も五糖も有意な抗ＩＩａ活性を有さない（図１０ａ）。五糖の場合、この活性の欠如は、完全に、そのサイズが、ＡＴ−ＩＩＩ／ＩＩａ複合体の形成のテンプレートとして作用するには不十分であることに起因している。十糖については、このサイズ制限はまた、あり得る説明であるが（なぜなら、厳密な生化学的研究により、少なくとも１８の単糖ユニットを有するオリゴ糖が、効率的な複合体形成に重要であることが示されているからである）（Ｐｅｔｉｔｏｕ，Ｍ．，Ｈｅｒａｕｌｔ，Ｊ．Ｐ．，Ｂｅｒｎａｔ，Ａ．，Ｄｒｉｇｕｅｚ，Ｐ．Ａ．，Ｄｕｃｈａｕｓｓｏｙ，Ｐ．，Ｌｏｒｍｅａｕ，Ｊ．Ｃ．＆Ｈｅｒｂｅｒｔ，Ｊ．Ｍ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ３９８，４１７−２２）、インタクトなＡＴ−ＩＩＩ部位の欠如はまた、その減少した抗ＩＩａ活性に寄与し得る。
これらの結果は、血清からの第Ｘａ因子（図１０ｂ）または精製第Ｘａ因子（図１０ｃ）を用いて、この３つの抗Ｘａ活性を試験することにより確認され、拡張されている。以前に示されたように、ＡＴ−ＩＩＩによる第Ｘａ因子の阻害には、ＡＴ−ＩＩＩにおけるコンホメーション変化にのみ付随した五糖モチーフの結合が必要である。抗Ｘａアッセイにおいて、ｅｎｏｘａｐａｒｉｎおよび五糖はともに、十糖より顕著に高い活性を有する。ｅｎｏｘａｐａｒｉｎおよび合成五糖のＩＣ_５０値は、それぞれ、６６ｎＭおよび３９ｎＭであるが、ＡＴ−１０のＩＣ_５０値は、２８０ｎＭであり、１０倍高い。これらの値は、ＡＴ−ＩＩＩ蛍光力価測定実験において決定されたヘパリンと比較して、ＡＴ１０のＡＴ−ＩＩＩに対する低い親和性と一致する（図９）。十糖が抗Ｘａ活性を有するということは、驚くべきことではない。なぜなら、非還元三糖ユニット（十糖に存在する）が、主に、ＡＴ−ＩＩＩへのヘパリンの最初の結合を担うからである。還元末端二糖ユニット、すなわち、Ｉ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}（ＡＴ−１０にはない）は、コンホメーションが変化した抗トロンビンＩＩＩに結合して、これを安定化すると予測される。ＨｅｐＴｅｓｔ測定（図１０ｄ）により、類似の結果が得られた。すなわち、ｅｎｏｘａｐａｒｉｎおよび五糖が、ＡＴ−１０十糖より有意に高い活性を有した。まとめると、十糖の抗ＩＩａ活性および抗Ｘａ活性は、五糖およびｅｎｏｘａｐａｒｉｎと比較して、ＡＴ−ＩＩＩ力価測定実験、ならびにヘパリンが凝固カスケードを阻害する機構の公知の薬力学とよく一致する。

要約すると、この実施例において、ヘパリナーゼＩおよびＩＩが、ＡＴ−ＩＩＩ結合部位を切断し、オリゴ糖の還元末端において三糖ユニットを遊離することが示される。本発明者らはまた、ヘパリナーゼＩＩＩが、内部グルコサミン残基上に３−Ｏ硫酸が存在するので、ＡＴ−ＩＩＩ部位を切断しないことを実証する。従って、ＬＭＷＨの生成のためにヘパリナーゼＩまたはＩＩを使用することは、確実にＬＭＷＨフラグメントにおけるインタクトな抗トロンビンＩＩＩ部位を保持するように、極度の用心を必要とする。実際に、本明細書中で示した結果は、ヘパリナーゼＩまたはＩＩが、ヘパリンの薬理学的用量の中和に理想的な薬剤であり得ることを示す。

（実施例３：ヘパリンの組成分析法の開発および構造的特徴づけ）
（緒言）
ＵＦＨを精製し、その成分を同定するために、ＵＧＨを、徹底的に消化し、キャピラリー電気泳動およびＭＡＬＤＩ質量分析を用いて分析した。キャピラリー電気泳動（ＣＥ）は、ヘパリンの二糖組成分析のための高い分解能を有する、非常に感度の高い方法である。ＵＦＨおよびＬＭＷＨの二糖構成ブロックを定量するためにＣＥを用いる組成分析法（ＣＡＭ）を開発した。この方法は、１μｇ未満のヘパリンを用い、時間効率がよく（各ＣＥの実行は、２５分の長さである)、濃度非依存性であり、高再現性である。この方法の１つの利点は、品質制御プロセスとしてのその有効性であり、異なるＬＭＷＨの組成におけるバッチ間変化を最小にするに役立ち得る。

従って、オフラインＭＡＬＤＩ質量分析と合わせたＣＥは、ＵＦＨおよびＬＭＷＨの徹底的な消化において独特の四糖を同定するために用いられてきた。この四糖（これは、グリコサミノグリカンのＡＴ−ＩＩＩ結合五糖ドメインの一部を形成する）は、ヘパリナーゼＩ、ＩＩまたはＩＩＩでのさらなる消化に耐性である。この独特の四糖の利用が、ヘパリンの抗Ｘａ因子の直接測定において抗凝固活性を媒介したことを以下に示す。

（方法）
化合物および材料：ＵＦＨを、ＣｅｌｓｕｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）から購入し、ストックのモル濃度を、１３，０００Ｄａの平均分子量に基づいて計算した。二糖標準物質を、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。ヘパリナーゼＩおよびＩＩＩは、組換えヘパリナーゼである。ヘパリナーゼＩＩは、以前に記載のように（Ｓｈｒｉｖｅｒｅｔａｌ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９８，２７３，２２９０４−２２９１２）精製したＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のものである。

組成分析：ＵＦＨを、ヘパリナーゼＩ、ヘパリナーゼＩＩ、およびヘパリナーゼＩＩＩから作製した酵素カクテルを用いて徹底的な脱重合に供した。Ｈ_２Ｏ中の１０μｇ／μ１濃度のＵＦＨ（９μｌ）を、２５ｍＭ酢酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０）中のヘパリナーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩの各々１００ｎＭからなる酵素カクテル１μｌを用いて、３７℃で１２時間消化した。１μｌの消化物を９μｌのＨ_２Ｏで希釈することにより、ＣＥサンプルを調製した。このサンプルを、５０ｍＭトリス／リン酸、１０μＭ硫酸デキストラン（ｐＨ２．５）の泳動緩衝液を用いた逆極性におけるＣＥにより分析した。５７ｎＬの各サンプルを、ＣＥに注入し、泳動時間は、２５分であった。各サンプルを、二連で消化し、実験を各サンプルにつき２回繰り返し、１サンプルにつき４回の読み取りを得た。８つの得られたピークのすべてを集め、集めたサンプルの純度をＣＥに再注入することによりチェックし、それらの質量を、オフラインＭＡＬＤＩ質量分析により測定した。ピーク１〜７の正体を、それらの移動時間と、標準的な市販の二糖の移動時間とをマッチングさせることによりさらに確認した。例えば、ピーク１のＣＥスペクトルを、ＵＦＨの総酵素消化物のＣＥ分析から集め、ピーク１のＭＡＬＤＩ質量スペクトルを生成した。質量スペクトルを、以前に概説したパラメーターを用いて集め、プロトン化（ＲＧ）_１９Ｒおよび配列Ｉ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}Ｉ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}Ｉ_２ＳＭａｎ_６Ｓの亜硝酸誘導体化六糖とのその複合体についてのシグナルを用いることにより外部較正した。

（結果）
図１１Ａに認められるように、８つのピークがＣＥスペクトルにおいて認められる。１〜８と表示されたピークの各々は、異なるサンプルにおいて同じ移動時間を有する。各ピークの収集およびＣＥへの再注入による各サンプルの純度チェックの後、それらの質量を、オフラインＭＡＬＤＩ質量分析により測定した。ピーク１は、３硫酸化ヘパリン二糖ΔＵ_２Ｓ，Ｈ_{ＮＳ，６Ｓ}と同じ質量を有する。Ｓｉｇｍａから市販されるΔＵ_２Ｓ，Ｈ_{ＮＳ，６Ｓ}は、同一のＣＥ条件下でピーク１と同じ移動時間を有する。これにより、ピーク１がΔＵ_２Ｓ，Ｈ_{ＮＳ，６Ｓ}と同定される。同様に、２〜７に由来する７つのピークの正体を、ＵＦＨの消化物の組成分析において、確立した。この結果を図３Ａおよび３Ｂ、６Ａおよび６Ｂに示す。各ピークの正体を、それらの移動時間と、標準的な市販の二糖の移動時間とをマッチングすることによりさらに確認した。ピーク２、３、および４は、２硫酸化二糖であり、ピーク５、６、および７は、モノ硫酸化二糖である。
ピーク２のわずかなＣＥおよびＭＡＬＤＩ質量スペクトルを生成した。このピークは、ΔＵ_２Ｓ，Ｈ_ＮＳと同じ質量を有する。また、Ｓｉｇｍａから市販されるΔＵ_２Ｓ，Ｈ_ＮＳは、同一のＣＥ条件下でピーク２と同じ移動時間を有する。このことにより、ピーク２がΔＵ_２Ｓ，Ｈ_ＮＳであることが確認される。

ピーク３のわずかなＣＥおよびＭＡＬＤＩ質量スペクトルを生成した。これは、ΔＵ，Ｈ_{ＮＳ，６Ｓ}と同じ質量を有する。また、Ｓｉｇｍａから市販されるΔＵ_，Ｈ_{ＮＳ，６Ｓ}は、同一のＣＥ条件下でピーク３と同じ移動時間を有する。このことにより、ピーク３がΔＵ，Ｈ_{ＮＳ，６Ｓ}であることが確認される。

ピーク５のわずかなＣＥを生成した。これは、ΔＵ，Ｈ_ＮＳと同じ質量を有する。また、Ｓｉｇｍａから市販されるΔＵ，Ｈ_ＮＳは、同一のＣＥ条件下でピーク５と同じ移動時間を有する。このことにより、ピーク５がΔＵ，Ｈ_ＮＳであることが確認される。

ピーク６のわずかなＣＥを生成した。これは、ΔＵ_２Ｓ，Ｈ_ＮＡＣと同じ質量を有する。また、Ｓｉｇｍａから市販されるΔＵ_２Ｓ，Ｈ_ＮＡＣは、同一のＣＥ条件下でピーク６と同じ移動時間を有する。このことにより、ピーク６がΔＵ_２Ｓ，Ｈ_ＮＡＣであることが確認される。

ピーク７のわずかなＣＥを生成した。これは、ΔＵ，Ｈ_{ＮＡＣ，６Ｓ}と同じ質量を有する。また、Ｓｉｇｍａから市販されるΔＵ，Ｈ_{ＮＡＣ，６Ｓ}は、同一のＣＥ条件下でピーク７と同じ移動時間を有する。このことにより、ピーク７は、ΔＵ，Ｈ_{ＮＡＣ，６Ｓ}であることが確認される。

７つの二糖に加えて、ヘパリナーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩでのヘパリンの徹底的な消化における１つの四糖（ピーク８）もまた同定された。この四糖を単離し、その質量を、ＭＡＬＤＩ質量分析により決定した。これは、ＣＥにおいて四糖ΔＵＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}（これは、以前、構造が決定された十糖ΔＵ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}Ｉ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}Ｉ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}ＩＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}の一部であった）と同じ移動時間を有した。これにより、四糖ΔＵＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}としてピーク８の確認を導く。このピークは、ヘパリナーゼＩ、ＩＩまたはＩＩＩでのさらなる消化に耐性である。

ピーク１〜８に加えて、少量の硫酸化されていない二糖は、図１１Ｂに示されるように、硫酸化糖よりもはるかにゆっくりと移動した。硫酸化されていない二糖は、表５（下記）に示されるように、ＵＦＨの２％未満を構成すると予測される。

図１２は、ＡＴ−１０五糖であるΔＵ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}ΔＵ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}ΔＵ_２ＳＨ_{ＮＳ，６Ｓ}ＩＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}の徹底的な消化のＣＥ追跡を示す。ヘパリンの徹底的な消化における四糖８は、ΔＵＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}と同じ質量および移動時間を有する。このことにより、ピーク８は、ΔＵＨ_{ＮＡｃ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}と確認される。

（実施例４：二糖１〜７のＵＶ応答）
（緒言）
二糖（１−７）の各々のＵＶ応答係数（ＲＦ）を、徹底的な消化からの二糖の成分をさらに同定するために決定した。二糖についてのＲＦは、１ｎｇのΔＵ_２Ｓ，Ｈ_{ＮＳ，６Ｓ}と同じ応答を与える二糖の量（ｎｇ）と規定される。

（方法）
応答係数の決定：異なる二糖についてのＲＦを、二糖各々の５７ｎｇのＵＶ応答を測定し、表５に示されるように、これを、ΔＵ_２Ｓ，Ｈ_{ＮＳ，６Ｓ}のＵＶ応答と正規化することにより計算した。

（結果）
７つの二糖（１〜７）の各々は、異なる程度のＡ_２３２ＵＶ応答を有する。この四糖についてのＡ_２３２ＵＶ吸光度の測定を可能にするには、四糖８（ΔＵＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}）の量は不十分であった。四糖は、二糖より低いＡ_２３２ＵＶ吸光度を有することが予測され、従って、ΔＵＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}が二糖、すなわち１（ΔＵ_２Ｓ，Ｈ_{ＮＳ，６Ｓ}）の最小の応答と同じ応答を有すると想定されている。

表５において、ピーク１〜８についての応答係数（ＲＦ）を計算した。第２列は、１ｎｇ／ｎＬ濃度を５７ｎＬ（すなわち、５７ｎｇの市販の標準的二糖（１〜７））注入した場合の２３２ｎＭでのＵＶ吸光度を与える。本発明者らは、十分な量でサンプルを利用することができなかったので、既知の濃度の８について２３２ｎＭでＵＶ吸光度を測定できなかった。８は、７つの二糖（すなわち、１）の最小の応答と同じ応答を有すると想定される。第３列は、７つのピークの各々についてのＲＦを与え、二糖についてのＲＦは、１（ΔＵ_２Ｓ，Ｈ_{ＮＳ，６Ｓ}）の１ｎｇと同じ応答を与えるｎｇの分数として規定される。

（実施例５：ヘパリンにおける硫酸化されていない糖の決定）
（緒言）
ヘパリンは硫酸化グリコサミノグリカンとして分類されているが、これは、微量の硫酸化されていない糖を含む。ヘパリンにおける硫酸化されていない糖の量を決定するための手順を行った。この決定の後に、ピーク１〜８について計算したＲＦを用いて、ＣＥにより測定されたＡＵＣからヘパリンの硫酸化構成ブロックの重量％を予測し得る。

（方法）
酵素カクテルを用いた徹底的消化に供した既知の重量のヘパリンを、ＣＥに注入した。図１１におけるピーク１〜８について測定された曲線下の面積（ＡＵＣ）を、ピーク１〜８の既知の量についての応答を用いて、硫酸化糖の重量に変換した。ＣＥに注入したヘパリン糖の総量と、硫酸化二糖および硫酸化四糖の総量との間の差異は、ＵＦＨの完全な消化における硫酸化されていない糖の量を与える。％相対的ＡＵＣとＲＦとをかけて、ΔＵ_２Ｓ，Ｈ_{ＮＳ，６Ｓ}に関して、較正された相対濃度またはピーク１〜８の％相対ＡＵＣを与える。

（結果）
表６は、ヘパリンにおける硫酸化されていない糖の予測を示す。表６に示されるように、硫酸化されていない糖は、ヘパリンの２％未満を構成することが決定された。硫酸化されていない糖は、以下に説明されるように、ヘパリンの組成分析表を作成する際に考慮されない。表７の第１列は、ピーク１〜８について測定されたＡＵＣを与える。第２列は、％相対ＡＵＣを与える。％相対ＡＵＣとＲＦとをかけて、ΔＵ_２Ｓ，Ｈ_{ＮＳ，６Ｓ}に関して、較正された相対濃度またはピーク１〜８の％相対ＡＵＣを与える。次いで、これらを正規化して、二糖ピーク１〜７および四糖ピーク８の重量％を得る。本明細書中で実証されるように、この組成分析表の作成は、ＣＥにより分析されるヘパリン消化物の濃度または重量とは無関係である。

表６は、ヘパリナーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩでのＵＦＨの徹底的な消化における硫酸化されていない糖の量の予測を示す。ピーク１〜７は、図２〜６に説明されるように、既知の二糖として示される。ピーク８は、四糖ΔＵＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}（これは、ヘパリナーゼＩ、ＩＩまたはＩＩＩのいずれかによるさらなる消化にも耐性である）である。第２列は、ＵＦＨの１ｎｇ／ｎＬ濃度の組成分析消化物を５７ｎＬ注入した場合のピークの各々について測定された曲線下の面積（ＡＵＣ）を与える。第３列は、１ｎｇ／ｎＬ濃度の７つの市販の標準的二糖（１〜７）の各々を５７ｎＬ注入した場合の２３２ｎＭでのＵＶ吸光度を与える。第４列は、種々の硫酸化糖の重量をｎｇで与える。これらの合計（５５．９ｎｇ）とヘパリン注入の量（５７×１＝５７ｎｇ）との間の差異は、ＵＦＨの組成分析消化物に存在する硫酸化されていない糖の量を与える。

（実施例６：機器の確認および消化の完全性）
（緒言）
機器の再現性を確認し、組成分析消化物が、使用される酵素濃度の下で実際に完全であるか否かを確認するために、ＵＨＦのサンプルを、二連で消化し、ＣＤにより２回分析した。次いで、結果を比較して、実行の間に変動性があるか否かを決定した。

（方法）
ＵＨＦを実施例１Ａの方法に記載のように、１μｌまたは５μｌのいずれかの酵素カクテル（ＥＣ）で消化した。各サンプルを、二連で消化し、各消化物をＣＥにより２回分析した。

（結果）
同じサンプルの２連の分析の比較（ＵＦＨ１／１とＵＦＨ１／２、ＵＦＨ
２／１とＵＦＨ２／２、およびＵＦＨ３／２とＵＦＨ３／２）により、良好な機器の再現性が示された。ＵＦＨ１／１もしくはＵＦＨ１／２と、ＵＦＨ２／１もしくはＵＦＨ２／２とのいずれかの比較により、最小限の実行間の変動性しかないことが示される。１μｌのＥＣで消化したＵＦＨと、５μｌのＥＣで消化したＵＦＨとを比較すると、漸増酵素量が、容易に認知できるほどには、二糖プロフィールを変化しないことが示される。このことにより、図１１に示されるように、徹底的な消化が、１μｌのＥＣを用いることにより達成されることが確認される。図１１および表７に概説されるプロトコルにより、ＣＥによって行われたＬＭＷＨの組成分析を用いて、ＬＭＷＨの異なるバッチを厳密に比較し得る。

表７は、ＵＦＨについての組成分析の値を示す。曲線下の面積（ＡＵＣ）は、図１１に示される酵素カクテルで消化したＵＦＨのＣＥスペクトルから各ピークについて測定した。表６に示される各糖について計算された応答係数を用いて、酵素消化物におけるそれらの較正相対濃度を計算した。最後の列は、ＵＦＨの構成ブロックの各々の重量パーセントを与える。硫酸化されていない糖（これは、ＵＦＨの２％未満を構成する）は、この組成分析表を作成する際には考慮に入れない。本明細書中で実証されるように、この方法により示される組成分析表の作成は、ＣＥにより分析したヘパリン消化物の濃度または重量とは無関係である。

（実施例７：ヘパリンのＡＴ−ＩＩＩ媒介性抗Ｘａ因子抗凝固作用の有効性の決定：ＩＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}と抗Ｘａ活性との間の相関関係）
（緒言）
ΔＵＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}四糖のＣＡＭによる定量は、ヘパリンのＡＴ−ＩＩＩ媒介性抗Ｘａ因子抗凝固作用の有効性を予測する際にさらなる役割を有する。ΔＵＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}は、ＡＴ−ＩＩＩ結合五糖の一部である。ΔＵＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}の定量は、ヘパリンに存在するＡＴ−ＩＩＩ結合五糖の量を決定する尺度である。従って、これは、ヘパリンのＡＴ−ＩＩＩ結合五糖ドメインに依存する、ヘパリンの抗Ｘａ因子媒介性抗凝固の直接的な測定に役立つ。

（方法）
ＵＦＨをＰ１０サイズ排除カラムによりサイズ分画した。組成分析を、得られた画分に対して行って、ΔＵＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}含有量を予測した。これらの画分をまた、それらの抗Ｘａ因子活性についてアッセイした。

（結果）
それらのΔＵＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}の関数としての異なる画分の抗Ｘａ因子活性のプロットは、図１１に示されるように、直線を生じる（ｒ＝０．９１）。このことは、ヘパリンの抗Ｘａ因子媒介性抗凝固作用が、それらのΔＵＨ_{ＮＡＣ，６Ｓ}ＧＨ_{ＮＳ，３Ｓ，６Ｓ}含有量から直接測定され得ることを示す。データはまた、表８に示される。

表８は、図１１に概説されるプロトコルによりＣＥによって行われたＵＦＨの組成分析を示し、表７は、ＬＭＷＨの異なるバッチを厳密に比較するために用いられ得る。ＵＦＨを、１μｌまたは５μｌのいずれかの酵素カクテル（ＥＣ）で消化した。各サンプルを、二連で消化し、各消化物をＣＥにより二連で分析した。全てのサンプルにおいて、糖ピーク１〜８は、同じ移動時間を有した。同じサンプルの２連の分析の比較（ＵＦＨ１／１とＵＦＨ１／２、ＵＦＨ２／１とＵＦＨ２／２、およびＵＦＨ３／１とＵＦＨ３／２）により、良好な機器再現性が示される。ＵＦＨ１／１もしくはＵＦＨ１／２と、ＵＦＨ２／１もしくはＵＦＨ２／２とのいずれかの比較により、最小限の実行間の変動性しかないことが示される。１μｌのＥＣで消化したＵＦＨと、５μｌのＥＣで消化したＵＦＨとを比較すると、漸増酵素量により、容易に認知できるほどには、二糖プロフィールは変化しないことが示される。このことにより、図１１に示されるように、徹底的な消化が、１μｌのＥＣを用いることにより達成されることが示される。

（実施例８：ＬＭＷＨ画分の生成および生物学的活性の特徴づけ）
（方法）
ＬＭＷＨ画分ＭＳ５７−１〜ＭＳ５７−４およびＭＳ５９−１〜ＭＳ５９−４を、２００μｇのヘパリナーゼＩＩＩで（上記のように）ＵＦＨを処理し、得られた生成物をＰ１０カラムを通すことにより調製した。

ＬＭＷＨ画分ＭＳ５６−１〜ＭＳ５６−４を、１０００μｇのヘパリナーゼＩＩＩでＵＦＨを処理し、得られた生成物をＰ１０カラムに通すことにより調製した。

ＬＭＷＨ画分ＭＳ６０−１〜ＭＳ６０−３、およびＭＳ５５−１〜ＭＳ５５−４を、２００μｇのヘパリナーゼＩＩＩで画分２を処理し、得られた生成物をＰ１０カラムに通すことにより生成した。

ＬＭＷＨ画分ＭＳ６６−１およびＭＳ６６−２を、１０００μｇのヘパリナーゼＩＩＩで画分２を処理し、得られた生成物をＰ１０カラムに通すことにより調製した。

画分１は、上記のＶｏｌｐｉ参考文献に記載されるように、室温で酢酸バリウムでＵＦＨを処理する際に沈殿した高分子量ヘパリンである。

画分２は、４℃で酢酸バリウムで処理したヘパリンを保持する際に沈殿した低分子量の第２の画分である。これは、本発明の方法に従って用いられる画分である。

ＭＳ５５−２の皮下吸収プロフィールおよびインビボ吸収プロフィールを測定した。ＭＳ５５−２の吸収プロフィールを、市販のＬＭＷＨＡｒｄｅｐａｒｉｎ、およびＥｎｏｘａｐａｒｉｎの吸収プロフィールと比較した。種々のヘパリン種の抗Ｘａ活性もまた、それらのインビトロ生物学的活性についてアッセイした。

（結果）
表９は、本発明に従って調製したＬＭＷＨ調製物およびコントロール画分１の組成分析および機能分析を提供する。この表は、種々の画分の分子量、インビトロ活性、および組成を列挙する。

ＭＳ５５−２は、匹敵する吸収相および排除相、ならびにＴ_ｍａｘにおいて明らかなように、ｅｎｏｘａｐａｒｉｎと非常に類似の薬物動態を示した。バイオアベイラビリティーおよびピーク濃度は、皮下注射により試験された３つのＬＭＷＨ全ての中で比較可能であった。ＩＶ経路により投与された場合、最初の抗Ｘａ活性は、Ａｒｅｄｅｐａｒｉｎと比較して、ＭＳ５５−２についてはるかに大きい。再び、２つのＬＭＷＨ間のバイオアベイラビリティーは、ほとんど同一であった。ａｒｄｅｐａｒｉｎおよびＭＳ５５−２はともに、抗Ｘａ活性において指数関数的な減少を示し、従って、第１次薬物動態の後に排除が続く。

ＭＳ５５−２の抗Ｘａ活性は、２０５ＩＵ／ｍｇであることが観察された。これは、現在米国で利用可能なＥｎｏｘａｐａｒｉｎ（１３５ＩＵ／ｍｇ）、Ａｒｄｅｐａｒｉｎ（９３ＩＵ／ｍｇ）のようなＬＭＷＨより高い。この結果をまた、図１３に示す。

前述の示された明細書は、当業者が本発明を実施することを可能にするに十分であると考えられる。本発明は、提供された実施例により範囲が限定されるのではない。なぜなら、実施例は、単に本発明の１局面の例示として意図されるに過ぎず、他の機能的に等価な実施形態が本発明の範囲内にあるからである。本明細書中で示され、記載されたものに加えて、本発明の種々の改変が、前述の詳細な説明から当業者に明らかになり、これらの改変は、添付の特許請求の範囲内に入る。

Claims

本願明細書に記載された発明。