JPS6199A - ヒト インターロイキン‐２の遺伝子工学的製法およびその方法を実施するための手段 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒト　インターロイキン−２（以下ＩＬ−２と
略記する）およびそれから誘導されるＩＬ−２の生物学
的および免疫学的活性を有するポ＋）　Ａｅプチドの製
法、これらペプチドをコードする化学的に合成された遺
伝子ならびにこれらポリペプチドを発現するための適当
なベクター構造および宿主細菌に関する。

ＩＬ−２は１６３個のアミノ酸からなるポリはプチドで
ある。人間のＩＬ−２のＤＮＡ配列ならびにそれらの遺
伝子工学的合成はヨーロッパ特許出願公開番号ｙ、ｐ　
Ｏ，０９１，５３９ＡＩ号に記載されている（第２６図
のアミノ酸配列■）。その合成は哺乳動物細胞から単離
されたｍＲＮＡに基づいておシ、このものがｃＤＮＡに
変換され、ベクター中に組み込まれそして大腸菌（Ｅ、
ｃｏｌｉ　）を含む宿主細胞中に挿入されて発現される
。

細菌特に大腸菌は一連の理由からポリペプチドの遺伝子
工学的製造にとって好ましい宿主である。前記特許出願
に記載されるように、ｍＲＮＡから逆転写酵素により得
られた真核生物細胞の遺伝子はしばしばプラスミド中へ
の組み込みおよび細菌中への形質転換後に不満足な程度
にしか発現されない。それゆえ本発明はＩＬ−２活性を
有するポリペプチドを大腸菌中において特に好ましく発
現する、ＩＬ−２をコードする合恋糧配列に関するもの
である。さらに本発明は合成りＮＡ配列とハイブリダイ
ズ（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ　）　Ｌそしてそこから１回ま
たは何回かの置換、削除または塩基の挿入によシ誘導さ
れるＤＮＡ配列をも包含する。コドンの交換、挿入また
は削除またはそれらの組み合せによ９１個またはそれ以
上の交換されたアミノ酸を有するはゾチド、またはよシ
長いかまたはよシ短いＩＬ−２誘導体が得られ、これら
も同様に本発明の目的とするところである。ＩＬ−２の
生物学的または免疫学的活性を有するこれらポリペプチ
ドは、そのベゾチドの安定性が増大されるか、ポリペプ
チドの親脂性がよシ良好な溶解度を有する方向に変化さ
れるか、医薬としての適用がよｐ容易とされるかまたは
生物学的活性が高められるようにそれらの性質が変化さ
れうる。

遺伝コードは周知のようにデイジエネレイト（ｄｅｇｅ
ｎｅｒａｔ、ｅ　）　Ｌ／ている、すなわち２個のアミ
ノ酸に対してのみそれぞれ１種のヌクレオチド配列がコ
ードされ、一方残る１８個の遺伝的にコードされうるア
ミノ酸には２〜６種のヌクレオチドトリジレットが割肖
てられる。しかしながらこれにより生ずる変異可能性を
異なる種の宿主細胞が常に同じに利用するわけではない
。

従って遺伝子の合成には莫大な多様なコドンの組み合わ
せによる可能性が存在する。

今、ＩＬ−２の全アミノ酸配列１〜１３３をコードする
ＤＮＡ配列１ Ｌｙｓ　　Ｐｈｅ　　Ｔｙｒ　　Ｍｅｔ　　Ｐｒｏ　　
Ｌｙｓ　　Ｌｙｓ　　Ａｌａ　　Ｔｈｒ　　ＧｌｕＡＡ
Ａ　　ＴＴＣ’　ＴＡＣ’　　ＡＴＧ　　ＣＣＧ　　Ａ
ＡＡ　　ＡＡＡ　　ＧＣＴ　　ＡＣＣＣ）ＡＡＴＴＴ　
　ＡＡＧ　　ＡＴＧ　　ＴＡＣＧＧＣＴＴＴ　　ＴＴＴ
　　ＣＧＡ　　ＴＧＧ　　ＣＴＴＬｅｕ　　Ｌｙｓ　　
Ｈｌｓ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｎ　　Ｃｙｓ　　Ｌｅｕ　　
Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ　　ＧｌｕＣＴＧ　　ＡＡＡ　　ＣＡ
ＣＣＴＣＣＡＧ　　ＴＧＴ　　ＣＴＡ　　ＧＡＡ　　Ｇ
ＡＡ　　ＧＡＧＧＡＣＴＴＴ　　ＧＴＧ　　ＧＡＧ　　
ＧＴＣＡＣＡ　　ＧＡＴ　　ＣＴＴ　　ＣＴＴ　　ＣＴ
ＣＬｅｕ　　Ｌｙｓ　　Ｐｒｏ　　Ｌｅｕ　　（）ｌｕ
　　Ｇｌｕ　　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ　　Ａｓｎ　　Ｌｅｕ
ＣＴＧ　　ＡＡＡ　　ＣＣＧ　　ＣＴＧ　　ＧＡＧ　Ｇ
ＡＡ　　ＧＴＴ　　ＣＴＧ　　ＡＡＣＣＴＧＧＡＣＴＴ
Ｔ　　（）ＧＣＧＡＣＣＴＣＣＴＴ　　ＣＡＡ　　ＧＡ
ＣＴＴＧ　　ＧＡＣＧＣＴ　　ＣＡＧ　　ＴＣＴ　　Ａ
ＡＡ　　ＡＡＴ　　ＴＴＣＣＡＣＣＴＧ　　ＣＧＴ　　
ＣＣＧＣ（）Ａ　　ＧＴＣＡＧＡ　　ＴＴＴ　　ＴＴＡ
　　ＡＡＧ　　ＧＴＧ　　ＧＡＣＧＣＡ　　ＧＧＣＡｒ
ｇ　　Ａｓｐ　　Ｌｅｕ　　Ｉｌｅ　　Ｓｅｒ　　Ａｓ
ｎ　　Ｉｌｅ　　Ａｓｎ　　Ｖａｌ　　ｌ１ｅＣＧＴ　
　ＧＡＣＣＴＧ　　ＡＴＣＴＣ’Ｔ　　ＡＡＣＡＴＣＡ
ＡＣＧＴＴ　　ＡＴＣＧＣＡ　　ＣＴＧ　　ＧＡＣＴＡ
Ｇ　　ＡＧＡ　　ＴＴＧ　　ＴＡＧ　　ＴＴＧ　　ＣＡ
Ａ　　ＴＡＧＧＴＴ　　ＣＴＧ　　ＧＡＧ　　ＣＴＣＡ
ＡＡ　　ＧＧＴ　　ＴＣＴ　　ＧＡＡ　　ＡＣＣＡＣＧ
ＣＡＡ　　ＧＡＣＣＴＣＧＡＧ　　ＴＴＴ　　ＣＣＡ　
　ＡＧＡ　　ＣＴＴ　　ＴＧＧ　　ＴＧＣＴＴＣＡＴＧ
　　ＴＧＣＧＡＡ　　ＴＡＣＧＣＧ　　ＧＡＣ’　　Ｇ
ＡＡ　　ＡＣＴ　　ＧＣｅＡＡＧ　　ＴＡＣＡＣＧ　　
ＣＴＴ　　ＡＴＧ　　ＣＧＣＣＴＧ　　ＣＴＴ　　ＴＧ
Ａ　　ＣＧＣＴｈｒ　　ｒｌｅ　　ｖ＝ＩＧ１ｕ　　Ｐ
ｈｅ　　Ｌｅｕ　　Ａｓｎ　　Ａｒｇ　　Ｔｒｐ　　ｌ
１ｅＡＣＧ　　ＡＴＣ（）ＴＴ　　ＧＡＡ　　ＴＴＴ　
　ＣＴＧ　　ＡＡＣＣＧＴ　　ＴＧＧ　　ＡＴＣＴＧＣ
ＴＡＧ　　ＣＡＡ　　ＣＴＴ　　ＡＡＡ　　ＧＡＣＴＴ
Ｇ　　ＧＣＡ　　ＡＣＣＴＡＧ１２３　１２４　１２５
　１２６　１２７　１２８　１２９　１３０　　ｊ３１
　１３２Ｔｈｒ　　Ｐｈｅ　　Ｃｙｓ　　Ｇｌｎ　　Ｓ
ｅｒ　　Ｉｌｅ　　Ｉｌｅ　　Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ　　Ｌ
ｅｕＡＣＣＴＴＣＴＧＣＣＡＧ　　ＴＣ（）　　ＡＴＣ
ＡＴＣＴＣＴ　　ＡＣＣ’　　ＣＴＧＴＧＧ　　ＡＡＧ
　　ＡＣＧ　　ＧＴＣＡＧＣＴＡ（）　　ＴＡ（）　Ａ
ＧＡ　　ＴＧＧ　　ＧＡＣ１３３１３４ｉ３５ Ｔｈｒ ＡＣＣＴＧＡ　　ＴＡＧ　　　　　　　　　３’ＴＧＧ
　ＡＣＴ　　ＡＴＣＡＧＣＴ　　　５’ならびにこの配
列Ｉの合成に利用されるＤＮＡ部分配列〔部分配列１１
ａ　（工Ｌ−２−１）−］Ｔｄ　（ＩＬ２−■）を有す
る配列■〕 ＤＮＡ−配列■ 配列ＩＩ　ａ　（ＩＬ　２−１） コードしない鎖　　　３’　　　　　　Ｇ　ＴＡＣＣＧ
ＣＧｅＯＣＡＡ　　ＣＴＧ　　ＧＡＡ　　ＣＡＣＣＴＧ
　　ＣＴＧ　　ＣＴＧ　ＧＡＣＣＴＧ　　ＣＡＣＴＡ　
　（）ＡＡ　　ＧＡＡ　　ＧＡＧＴＴ　　ＣＴＴ　　Ｃ
ＴＣ ｎｋ ＧＴＴ　　ＣＴＧ　　ＧＡＧ　　　ＣＴＣＡＡ　　ＧＡ
ＣＣＳａｃ　Ｉ ＴＣＧＡＧ　　ＴＴＴ　　ＣＣＡ　　ＡＧＡ　　ＣＴＴ
　　ＴＧＧ　　ＴＧＣ■１ ＡＣＣＴＧＡ　　ＴＡＧ　　Ｓａｌ夏　　　　　３′Ｔ
ＧＧ　ＡＣＴ　　ＡＴＣＡ（）ＣＴ　　　５’Ｖｊ がＩＬ−２の遺伝子工学的合成に特に好ましいことが見
出された。ＤＮＡ配列■のコー　ドする鎖の５′−末端
には例えば制限エンドヌクレアーゼＥｃ○Ｒ１に対応す
る「張シ出したＪ　ＤＮＡ配列が存在し、これに対しコ
ードする鎖の３′−末端には例えば制限酵素Ｓａｌ　Ｉ
に対応する他の一本鎖の張シ出した配列が存在する。こ
れらの二種類の異なる認識配列によシ所望の方向におけ
るプラスミド中へのＤＮＡの挿入が保証される。勿論、
意図されたベクター中の切断部位に対応する他の突き出
た配列も選択されうる。

これらの認識配列によシ適当な酵素、例えばＥ（ｏ　Ｒ
ＩおよびＳａｌ　Ｉを用いる切断によるベクターからの
ＤＮＡの再単離のみならずＤＮＡの数多くの修飾例えば
マングビーン（Ｍｕｎｇ　ｂｅａｎ　）ヌクレアーゼを
用いるような一本鎖領域の除去、クレソン（Ｋｌｅｎｏ
ｗ　）ポリメラーゼを用いるような短い方の末端の完全
なまたは部分的な充填、または適当なアダプターまたは
リンカ−の添加が許容される。それゆえ重なり合う末端
部分は本発明によるＤＮＡを発現ベクター中に挿入する
のに特に好ましい。

これら制限酵素の認識配列とアミノ酸配列に対するコド
ンとの間にはコードする鎖の５′−末端にアミノ酸メチ
オニンのコドンが存在する（これはＤＮＡ配列■におい
て数字０で示される）。

これの代りに細菌性のまたはそれ以外の宿主固有の蛋白
質のプレ配列（シグナル配列またはリーダー配列とも呼
ばれる）で置きかえることができ〔概説論文二パールマ
ン（Ｐｅｒｌｍａｎ　）およびハルボーンン（Ｈａｌｖ
ｏｒｓｏｎ　）氏の［ジャーナル・オフ・モレキュラー
・バイオロジー（Ｊ。

Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）　Ｊ第１６７巻第３９１頁（１９
８作）参照〕、このものは細胞質から所望のポリにプチ
ドの分泌をもたらしそしてこの排出過程において宿主細
胞中に天燃に存在するシグナルベプチタ゛′−ゼにより
分解される。次にコードする鎖の末端にスレオニンをコ
ードするヌクレオチドトリプレット１３６に続き１個ま
たは好ましくは２個の停止コド／が来る。前記ＤＮＡ配
列■はヌクレオチド配列１〜８　（ｇｃｏＲＩによる突
き出た配列およびＭｅｔ−コドン）および２個の停止コ
ドン（ヌクレオチド４０８〜４１３）ならびに５ａｌＩ
による突き出た配列と一緒に、ヌクレオチド９、〜４０
７（アミノ酸１〜１３３）を包含するＤＮＡ配列配列表
わす。２個の停止コドンは本発明の好ましい態様を表わ
す。これらは、高い蛋白質合成率においてさえも分子が
所望の末端で「切断コされそして何ら「融合蛋白質」が
形成されないことを保証する。

制限酵素Ｐｓｔ　Ｉ　、　Ｘｂａ　ＩおよびＳａｃ　ｌ
に対する３個の内部の独特の切断部位（ＤＮＡ配列夏の
コードする鎖のヌクレオチド６９〜７４．１８２〜１８
７および２９１〜２９６）により、例えばｐＵＣ１？の
ような良く研究されたクローニングベクターに挿入され
うる４種類の遺伝子断片ＩＬ　２−Ｉ〜ＩＬ２−ＩＶの
サブクローニングが可能であるこれに加え構造遺伝子内
部に、一方ではＴＬ−２の部分配列への操作性を得せし
めそして他方では変異を行わしめる制限酵素に対する一
連の他の独特の認識配列が組み込まれた。

５′３１ Ａｈａ　ＩＩ　　　　　ＧＧＣｆ）ＣＣ８Ａｖａ　１１
　　　　　ＧＧＡＣＣ６５Ｂａｎ　Ｉ　　　　　ＧＧＣ
ＧＣＣ８ Ｂａｎ　ｎ　　　　　ＧＡＧＣＴＣ２９１Ｂｂｖ　Ｉ　
　　　　（）ＣＴＧＣ５９Ｂｓｔ　　ＮＩ　　　　　　
　ＣＣＴＧＧ　　　　　　　　　　　　　２２１Ｄｄｅ
　　Ｉ　　　　　　　　ＣＴＣＡＧ　　　　　　　　　
　　　　２２６Ｆｎｕ　　４ＨＪ　　　　　　　　　　
ＧＣＴＧＣ５９Ｈａｅ　　ｎ　　　　　　　　ＧＧＣＧ
ＣＣ８Ｈｈａ　　Ｉ　　　　　　　　　ＧＣ（）Ｃ９Ｈ
ｉｎｆ　　Ｉ　　　　　　　　ＧＡＣＴＣ３５Ｈｐｈ、
Ｉ　　　　　　　ＴＣＡＣＣ３７３Ｍ１ｕ　　Ｉ　　　
　　　　　ＡＣＧＣＧＴ　　　　　　　　　　　　１１
７Ｎａｒ　　１　　　　　　　　（）ＧＣＧＣＣ８Ｐｖ
ｕ　　Ｉ　　　　　　　　ＣＧＡＴＣＧ　　　　　　　
　　　　　３４６Ｓａｕ９６１　　　　　　ＧＧＡＣＣ
６５Ｓｃｒ　　ＦＩ　　　　　　　ＣＣＴＣ）（）　　
　　　　　　　　　　２２１ＤＮＡ配列■は異なる長さ
の６８個のオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ配列配列層参照
ら、これらをはじめに化学的に合成しそして次に４〜９
個のヌクレオチドのステイツキーエンド（ｓｔｉｃｋｙ
　ｅｎｄ　）を介して酵素的に結合させることにより合
成されうる。

ＤＮＡ配列Ｉにおいては、数個のコドンが割当てられる
アミノ酸ではこれらコドンは等価でなくむしろ大腸菌の
ようなそれぞれの宿主において異なる優先性を示すこと
も顧慮された。さらにパリンドローム配列も最小限度に
減少された。

従ってＤＮＡ配列工の遺伝子構造は比較的小さな構成単
位から容易に得ることができ、４穐類の遺伝子断片の良
く知られたベクター中におけるサブク四−ニングが可能
となりそしてそれらを組み合せて総遺伝子となしうる。

制限酵素についての独特の認識配列により蛋白質分子の
延長、修正および短縮が特別に容易となる。

延長はそれぞれの制限酵素と反応させたのち適当な、化
学的に合成されたＤＮＡ分子を添加することにより達成
される。修正はＤＮＡの個々の断片を適当な制限酵素を
用いて切シ出しそしてこれらを他の化学的に得られたＤ
ＮＡ配列と置換することによシ達成される。短縮はそれ
ぞれの制限酵素を用いて解裂させたのちヌクレアーゼと
反応させることにより達成されうる。

延長されたか、修正されたかまたは短縮された分子の生
物学的活性は、例えば増殖用培地中におけるＩＬ−２の
存在に厳密に依存するＴ−細胞個体数の細胞生育の誘起
によシ、生物学的試験系において検査されうる。

合成遺伝子または遺伝子断片のクローニングベクター例
えばｐＵｏ　１２のような商業上入手しうるシラスミド
またはｐｔａｃ　１１、ｐｔｒｐ　Ｈ１およびｐＫｘ　
１７７．３のような他の一般的に入手しうるプラスミド
中への挿入はそれ自体知られた方法で遂行される。さら
に、化学的に合成された遺伝子は、その蛋白質の発現を
可能にする適当な化学的に合成された調節領域を予め備
えることもできる。それにはマニアテイス（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ　）氏の教本〔マニアテイス氏他の「モレキュラ
ー°クローニング（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ）　Ｊ、コールド・スプリング・ハーバ−（Ｃｏ１ｄ
　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　）、１９８２年〕が参照
されうる。かくして得られたハイブリッドプラスミドの
適当な宿主細菌好ましくは大腸菌中への形質転換も同様
にそれ自体知られそして前記した教本中に詳細に記載さ
れている。

本発明によシ得られた遺伝子断片ｆｆＬ　２−Ｉ〜ＩＬ
２−■、それらを用すて得られ六ノ・イブリッドプラス
ミドおよび形質転換された宿主細菌も同じく新規であシ
そして本発明はそれらに関するものである。同じことは
ＤＮＡ配列■から変化された新規ＤＮＡ配列にもあては
まる。本発明の他の態様は特許請求の範囲に記載されて
いる。

本発明のいくつかの態様を以下の実施例において詳細に
説明する。これらから多数の可能な変形および組み合せ
が当業者には明らかであろう。百分率の記載は別に断わ
シなければ重量によるものとする。

実施例 （１）１本鎖オリゴヌクレオチドの化学合成コードする
鎖のヌクレオチド１〜１７を包含する遺伝子構成単位Ｉ
ａの例を用いて遺伝子構成単位の合成について説明する
。知られた方法〔エム・ジェー・ゲイト（Ｍ、　Ｊ、Ｇ
ａ１ｔ　）氏他の「ヌクレイツク・アシッズ・レス（Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、）　Ｊ第８巻第１０
８１〜１０９６頁（１９８０年）参照〕によシ３′−末
端に存在するヌクレオシにすなわちこの場合シチジン（
ヌクレオチド番号丁７）をシリカゲル〔フラントシル（
躊ａｏｓｎ、ρメルク（Ｍｅｒｃｋ　）社製品〕に３７
−水酸基を介して共有結合させる。これにははじめにシ
リカゲルを３−（）リエトキシシリル）−プロピルアミ
ンと反応させてエタノールの脱離により、Ｓｌ−０−Ｓ
ｉ結合が生成する。シチジンはＮ４−ベンゾイル−３’
　−０−スクシンイル−５′−シメトキシトリチルエー
テルトシて／ξジニトロフェノールおよヒＮ、Ｎ′−ジ
シクロへキシルカルボジイミドの存在下に修飾された担
体と反応させると、スクシノイル基の遊離のカルボキシ
基がアミノゾルピル基のアミノ基をアシル化する。

以下の合成段階においては塩基成分は５′−Ｏ−ジメト
キシトリチルーヌクレオシド−３７−亜燐酸モノメチル
エステル−ジアルキルアミドまたは一クロリドとして用
いられ、その際アデニンはＮ６−ベンゾイル化合物とし
て、シトシンはＮ４−ベンゾイル化合物として、グアニ
ンはＮ２−インブチリル化合物としてそして何らアミノ
基を含有しないチミンは保護基なしで存在する。

シトシン２μモルを共有結合させた重合体状担体５０Ｉ
Ｉｇを下記の試薬で逐次的に処理する。

ａ）ニトロメタン、 ｂ）水１％を含有するニトロメタン中の飽和臭化亜鉛溶
液、 Ｃ）メタノール、 ｄ）テトラヒドロフラン、 ｅ）アセトニトリル、 ｆ）無水アセトニトリル０．５ａ中の適当なヌクレオシ
ド亜燐酸エステル４０μモルおよびテトラゾール２００
μモル（５分間）、 ｇ）ルチジン４０％およびジメチルアミノピリジン１０
％を含有するテトラヒドロフラン中の２０％無水酢酸（
２分間）、 ｈ）テトラヒドロフラン、 ｊ）水２０％およびルチジン４０％を含有するテトラヒ
ドロフラン、 Ｊ）コリジン／水／テトラヒドロンラン（容量比５：４
：１　）混合物中の６チ沃素、ｋ）テトラヒドロフラン
、および ｌ）メタノール。

「亜燐酸エステル」なる用語はここではデオキシリボー
ス−３′−モノ亜燐酸−モノメチルエステルであること
が理解されるべきで、その際燐原子の第三番目の原子価
は塩素によシまたは三級アミン基例えばモルホリフ基に
よシ飽和されている。それぞれの合成段階の収率は脱ト
リチル化反応ｂ）後にジメトキシトリチル陽イオンの吸
収を波長４９６ｎｍで計測することにより分光測光的に
測定されうる。

オリゴヌクレオチドの合成完了後オリコマ−のメチルホ
スヘート保護基をｐ−チオクレゾールおよびトリエチル
アミンを用いて除去する。

次にアンモニアで３時間処理することによシオリゴヌク
レオチドを固相担体から分離する。

このオリゴマーを濃アンモニアで２〜３日間処理すると
塩基のアミン保護基が定量的に除去される。かくして得
られた粗生成物を高圧液体クロマトグラフィー（以下Ｈ
ＰＬＣと略記する）′！！、たけポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動にょシ精製する。

それらのヌクレオチド配列がＤＮＡ配列Ｈに由来する残
シの遺伝子構成単位１ｂ〜ＩＶｊも全く同様に合成され
る。

（２）１本Ｍオリゴヌクレオチドの遺伝子断片ＩＬ・２
−Ｉ〜ＩＬ２−ＩＶへの酵素的連結オリゴヌクレオチド
を５′−末端でホスホリル化するにはオリゴヌクレオチ
ドＩａおよびＩｂの１ｎモルずつを５０ミリモルトリス
ーＨＣ７緩衝液（ｐＨ７，６）　２　［１ｘｉ　、塩化
マグネシウム１０ｍＭおよびジチオトレイトール（以下
ＤＴＴと略記する）、１１０Ｉｎ中で５ｎモルのアデノ
シン三燐酸（ＡＴＰ　）および４単位のＴ４−ポリヌク
レオチドキナーゼと３７℃で６０分間処理した〔シー。

シー・リチャードンｙ　（Ｃ９Ｃ，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏ
ｎ　）氏の「プログレス・イン・ヌクレイツク・アシッ
ズーリサーチ（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｎｕｃｌ、　
Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）　Ｊ第２巻第８２５頁（１９７
２年）参照〕。この酵素を９５℃に５分間加熱すること
により不活性化した。続いてオリゴヌクレオチド対ａお
よびＩｂを水溶液中９５℃に２分間加熱しそして次に除
徐に５℃まで冷却することにより相互にハイブリダイズ
させる。

同様にしてオリゴヌクレオチドＩｃとＩｄならびにＩｅ
とＩｆをホスホリル化しそして対でハイブリダイズさせ
る。、Ｊ〜断片ＩＬ２−１１にはオリゴヌクレオチドＩ
ｌａとＩｌｂ　−１［ｉとＩｌｊを、小断片ＩＬ２−ｍ
にはオリゴマー１１１ａとｍｂ　−ｉｎｋと■１を、そ
して小断片ＩＬ２−ＩＶにはオリゴマーｆＶａとＩＶｂ
〜■１とＦ／ｊをホスホリル化しそして対で）−イブリ
ダイズさせる。

かくして得られた遺伝子断片ＩＬ２−Ｉのための３種類
のオリゴヌクレオチド対、遺伝子断片ＩＬ２−１１およ
びＩＬ　’２−　ＩＶのための５種類のオリゴヌクレオ
チド対ならびに遺伝子断片ＩＬ２−ＩＩＩのだめの６種
類のオリゴヌクレオチド対をそれぞれ以下のようにして
連結させる。

２本鎖ヌクレオチドを合しそしてそれぞれ５０ｍモルト
リス−ＨＣｌ緩衝液４０μｂ シウム２０ミリモルおよびＤＴＴ　１０ミリそル中１０
０単位のＴ４−　ＤＮＡリガーゼを用い１５℃で１６時
間かかつて連結させる。

遺伝子断片ＩＬ２−Ｔ〜ＩＬ２−ＩＶは１０チポリアク
リルアミドゲル（尿素添加せず、２０Ｘ４０Ｌ１厚さ１
　ｔｍ　）上のゲル電気泳動によシ精製され、その際マ
ーカー物質としてはＨｉｎｆ　Ｉで切断されたφＸ　’
１７４　ＤＮＡ　（ＢＲＬ社製品）またはＨａｅ　ｍで
切断されたｐＢＲ３２２が用いられる。

（３）遺伝子断片ＩＬ２−１〜ＩＬ２−■を含有するハ
イブリッドプラスミドの調製 ａ）遺伝子断片ＩＬ２−ＩのｐＵＣ１２中ヘノ挿入シラ
スミドｐＵＣ１２はプラスミドｐＵＣ８に対応する〔ビ
エイラ（Ｖｉｅｉｒａ　）氏他の「ジーン（Ｇｅｎｅ）
Ｊ第１９巻第２５９〜２６８頁（１９８２年）、および
メシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ　）氏他の同上第２６９〜２
７６頁参照〕、しかしながら酵素Ｘｂａ　ＩおよびＳａ
ｃ　Ｉに対する付加的な制限部位を有する幾分大きなポ
リリンカーを含有する〔ノランダー（Ｎｏｒｒａｎａｅ
ｒ　）氏他、「ジーン」第２６巻第１０１〜１０６頁（
１９８３年）参照〕。このプラスミドを酵素ＥｃｏＲＩ
およびＰｓｔｌによシ処理する。それによシ約４０塩基
対の大きさのポリヌクレオチドがプラスミドから切シと
られる。開環されたプラスミドからのこの断片の分離は
セファデックス（５ＥＰＨＡＤＥＸ　）■Ｇ５０でのク
ロマトグラフィーによるかまたは１．５％アガロース中
での電気泳動により知られた方法（マニアテイス（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ　）氏の方法）で行われる。断片の分離は
回避することもできる、何故ならＩＬ２−Ｉが挿入され
たプラスミドは培養によシ容易に識別されうるからであ
る（以下に詳述するように）。

開環されたプラスミド中に断片ＩＬ２−Ｉを以下のよう
にして酵素によシ挿入すると、シラスミドｐ１４５／３
（第１図参照）が形成される。

ＤＮＡ断片の結合は５０ミリモルトリス（ｐＨ７，６）
、５ミリモルＡＴＰ、５ミリモルジチオトレイトール、
５ミリモルＭｇＣｌ２および約１００単位のＴ４−　Ｄ
ＮＡ　リガーゼからなる混合物中１２℃で１６時間行な
われる。続いヤこのプラスミドを７０ミリモルのＣａＣ
ｊ！　２でコンピテントとなした大腸菌Ｋ　１２　（Ｊ
Ｍ　１０３　）株中に形質転換する。

プラスミドｐ１４５／３を含有する細菌は５０μｙｄの
アンピシリン、１ミリモルのインプロピル−チオガラク
トシド（以下ＩＰＴＧと略記する）おｘび２ｓｓ−−ｉ
ロモー４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクト
シド（Ｘ−Ｇａｌ　）を含有する寒天プレート上に「白
色」コロニーとして検出されうる。場合によってはまだ
未変化のまたは完全には切断されてないプラスミドｐＵ
Ｃ１２に起因する「青色」の細菌コロニーも存在する。

白色の細菌クローン約５個を培養しそして含有されるプ
ラスミドを知られた方法（マニアナイス氏の方法）で単
離する。

挿入されたＤＮＡの大きさは制限酵素ＰｓｔＩおよびＥ
ｃｏＲＩによる処理に続いて１０％ポリアクリルアミド
ゲル上での電気泳動によシ確認される。こｎに続き挿入
の配列整理力神キサム（ｂ）およびギルバート（Ｇ１１
ｂｅｒｔ　）氏の方法〔「メソツズ・エンザイモロジー
（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　）Ｊ第６５巻第
４９９頁（１９８０年）参照〕またはサンガー（Ｓａｎ
ｇｅｒ　）およびクールソン（Ｃｏｕｌｓｏｎ）氏の方
法〔「ジャーナル・オフ・モレキュラーバイオロジー（
、’、　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）　Ｊ第９４巻第４４１頁
（１９７５年）参照〕に従い遂行される。

ｂ）遺伝子断片ＩＬ２−ＩＩのｐＵＣ１２中への挿入ａ
）項と同様にしてプラスミドｐＵＣ１２を制限酵素Ｐｓ
ｔ　工およびＸｂａ　Ｉと反応させそして生成したオリ
ゴヌクレオチドを場合により分離したのち断片ＩＬ２−
１１を酵素的に挿入する。シラスミドｐ　１４７／１（
第２図参照）が生成する。

Ｃ）遺伝子断片ＩＬ２−１のｐＵＣ１２中への挿入ａ）
項と同様にしてプラスミドｐＵＣ１２を制限酵素Ｘｂａ
　ＩおよびＳａｃ　Ｉと反応させそして断片ＩＬ２−Ｉ
ＩＩを酵素により挿入する。プラスミドｐ１３８／２５
　（第６図参照）が生成する。

ｄ）遺伝子断片ＩＬ２−ＩＶのｐＵｏ　１２中への挿入
ａ）項と同様にしてプラスミドｐＵＣ１２を制限酵素Ｓ
ａｃ　ＴおよびＳａｌ　Ｉを用いて切断しそして断片Ｉ
Ｌ２−Ｒ／を酵素により挿入する。プラスミドｐ　１４
３／１　（第４図参照）が生成する。

（４）遺伝子断片の連結 プラスミドｐ１４５／３、ｐ１４７／１、ｐ　１３８／
２５およびｐ１４３／１を増殖させそして配列を確認し
たのち小断片ＩＬ２−Ｉ〜ＩＬ２−１ｔ／を新たに適当
な制限酵素を用いて切シ出しそしてポリアクリルアミド
上の電気泳動により分離する。このゲルをエチジウムブ
ロマイドの水溶液中に浸漬したのちバンドをＷ光線によ
り確認し、切シ出しそしてＤＮＡを知られた方法で抽出
する（マニアナイス氏の方法）。

小断片ＩＬ　２−Ｉ　〜工Ｌ　２−１１／を（３）　ａ
）項記載のようにして酵素的に連結させそして制限酵素
Ｒｃ。

ＲＩおよびＳａｌ　Ｉと反応させることによシ開環され
たプラスミドｐＵＣ１２中に挿入する。ハイブリッドプ
ラスミドｐ　１５９／（Ｓ　（第５図参照）が得られ、
このものの配列はもう一度分析に′よシ確認する。

・　　（５）　　ＤＮＡ配列Ｉを発現させるためのハイ
ブリッドプラスミドの構成 ａ）　　ｐＫＫ１７７、！ｌ中への挿入発現プラスミド
ｐＫＫ　１７７．５　（Ｅｃｏ　ＲＴ認識部位中にＳａ
ｌ　Ｔ切断部位を含有する配列が合成的に挿入されたプ
ラスミドｐｔａｃ　１１　（アンマン（Ａｍｍａｎ　）
氏他、「ジーン」第２５巻第１６７頁（１９８３年）参
照）〕を制限酵素ＥＣｏ　ＲＩおよびＳａｌ　Ｉを用い
て開環させる。プラスミドｐ１５９／６（第５図参照）
からＤＮＡ配列工を制限酵素ＥｃｏＲ１および８ａｌＩ
を用いて切り出しそしてポリアクリルアミドまたは２％
低融解（低融点）アガロース上に加え、プラスミドＤＮ
Ａを分離しそして挿入物を回収する（マニアテイス氏の
方法）。開環されたプラスミドｐＫＫ’　１７７．３を
ＤＮＡ配列■と連結させることＫより、発現領域または
調節領域が挿入の上流に位置するハイブリッドプラスミ
ドが生成される。Ｉ　ＰＴＧのような適当な誘導物質を
添加した後にｍＲＮＡが形成されそしてこれがＤＮＡ配
列工に対応するポリペプチドの発現を生ずる。

ｂ）ｐｔｒｐＨＩ中への挿入 発現プラスミドｐｔ、ｒｐＨ１（アンマン氏他の「ジー
ン」第２５巻第１６７〜１７８頁（１９８３年）参照）
はＨｉｎｄ　１１制限部位が後に続＜　Ｔｒｐオペロン
（プロモーターおよびオはレータ−）の制御エレメント
を含有する（４＠６図参照）。

ｐ１５９／ＳからＤＮＡ配列工を単離したのち突き出た
末端を製造者（ＰＬバイオケミカカル社）の記載に従い
マングビーン（Ｍｕｎｇ　ｂｅａｎ　）ヌクレアーゼを
用いて除く。ｐｔｒブＨ１をＨｉｎｄ　ＩＩＩを用いて
開環させそして突き出た末端も同様にマングビーンヌク
レアーゼを用いて除去する。次ＫＤＮＡ配列１をプラン
トエンド（ｂｌｕｎｔθｎｄ　）状で開環されたプラス
ミド中にＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて挿入する（第６
図参照）。

０位にあるメチオニンについてのヌクレオチドトリプレ
ッ）　ＡＴ（）にょシ蛋白質合成の開始点が確立される
。発現はトリプトファンの非存在および／またはインド
リル酢酸の存在にょシ誘導される。

（６）修飾物の調製 ａ）蛋白質のＣ−末端での短縮 ＩＬ−２の生物学的活性を有する短縮された蛋白質分子
を調製するにはプラスミドｐ　１５９／６　全制限酵素
Ｓａｌ　Ｉと反応させ続いてそれ自体知らレタ方法でエ
キソヌクレアー−ｄ■およヒｓ１−ヌクレアーゼによシ
処理する。Ｅｃｏ　Ｒ１と反応させたのちにＩＬ−２の
部分配列が得られ、このものは一方の末端にＥｃｏＲＩ
に対する重なシ合う配列を担持しそしてもう一方の末端
はプラントエンドである。一方の末端がプラントエンド
であシそしてここでは第１番目のコドンとして停止コド
ンを有し、これに対しもう一方の末端にはＳａｌ　Ｉ配
列の張シ出しを担持する化学的に合成されたＤＮＡを添
加したのちに、この短縮されたＤＮＡ配列が同じ発現ベ
クター中に挿入されうる。

ｂ）蛋白質のＮ−末端での短縮 脱−［Ａｌａ１］　−１Ｌ−２を発現させるＤＮＡ配列
を含有するハイブリッドシラスミドを構成させるには、
プラスミドｐ１５９／６からそれ自体知られた方法で制
限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄ　ｍを用いてシラスミ
ドのポリリンカ一部分を含めＤＮＡ配切断する。単離さ
れたＡｈａ　ｎ　−Ｈｉｎｄ　ｍ断片を実施例（５１ｂ
）項記載のようにしてプラントエンドとなしそして次に
Ｓａｌ　Ｉを用いて切断する。下記アダプター ５’　　ＡＡ　ＴＴＣＡＴＧ　　３’ ３’　　　　　ＧＴＡＣ５’ を用い、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌ　■で開環されたプラ
スミドｐｘｘ１７Ｚ３と連結させると脱−（Ａｌａｌ〕
−ＩＬ−２産生のための遺伝子を含有する新規なハイブ
リッドプラスミドが得られる。

（カ　ハイブリッドシラスミドの形質転換コンピテント
な大腸菌細胞を配列Ｉまたはその誘導体を含有するハイ
ブリッドプラスミド０．１〜１μＳを用いて形質転換し
そしてアンピシリンを含有する寒天プレート上で培養す
る。続いて正しく統合されたＩＬ−２遺伝子配列または
その誘導体を相当するプラスミド中に含有するクローン
をＤＮＡ迅速処理により固定する（マニアテイス氏の方
法、前記参’Ｊｌ［）。

＋８）　　ＩＬ　−２活性を有するポリペプチドの発現
ＤＮＡ配列■またはその誘導体を含有するハイブリッド
プラスミドを大腸菌中に形質転換すると、ＩＬ−２アミ
ノ酸配列または変化された配列の外にアミノ末端でさら
に付加的なメチオニル基を担持するポリペプチドが発現
される。

（９）後処理および精製 所望の光学濃度となるまで培養した細菌菌株を適当な誘
導物質、例えばＩＰＴＧ、と充分な時間例えば２〜４時
間培養する。続いて細胞を０．１チクレゾールおよび０
．１ミリモルのベンジルスルホニルフルオライドを用い
て殺す。誘導後に分子量約１５０００ダルトンの蛋白質
バンドがドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド
ゲル（以下ＳＤＳ　−ＰＡＡゲルと略記する）上に確認
される。遠心分離または濾過後に細胞塊を緩衝溶液（５
０ミリモルトリスおよび５０ミリモルＥＤＴＡ　、　’
　ｐＨ７，５）中にとシそして例えばフレンチプレス（
Ｆｒｅｎｃｈ　Ｐｒｅｓｓ　）またはダイン（ＤＹＮＯ
）■ミル（ウィリー・パホーファ＝（Ｗｉｌｌｙ　Ｂａ
ｃｈｏｆｅ：９社製品、バーゼル）を用いて機械的に崩
壊させ、次に不溶の成分を遠心分離除去する。

ＩＬ−２蛋白質の一部分が細胞崩壊後に残留物中に留ま
りそして８Ｍ尿素、６Ｍグアニジニウム−ＨＣＡ’　、
およびイオン系または非イオン系界面活性剤および類似
の溶媒を含有する緩衝溶液を用いて可溶化されうる。こ
の溶液からＩＬ−２活性を包含する蛋白質が慣用の方法
により精製される。イオン交換カラム、吸着カラムまた
はゲル濾過カラムでのり四マドグラフィー、または抗体
カラムでの７フイニテイクロマトグラフイーが適当であ
る。ドデシル硫酸ナトリウム−アクリルアミドゲルによ
る分析またはＨＰＬＣ分析により生成物の濃度および純
度が検査される。

ＩＬ　−２蛋白質の生物学的特性化には培地中における
ＩＬ−２の存在に厳密に依存するＴ−細胞が用いられる
。かかる細胞系列の細胞分裂速度は培地のＩＬ−２濃度
に゛ある限界内で比例し、それゆえこれは培地からの５
Ｈ−チミジンのと９込みから測定されうる。

【図面の簡単な説明】

第１図はＩＬ−２−Ｉが挿入されたプラスミドおよびそ
の調製法を示す図である。 第２図、第３図、第４図および第５図はそれぞれＩＬ　
２−１１．　ＩＬ　２−ｍ、（、ｒｒ＝　２−ｗおよび
ＩＬ−２が挿入されたシラスミドを示す。 第６図はプラスミドｐｔｒｐＨＩ中へのＩＬ　２　ＤＮ
Ａの挿入を示す図であるＯ 外２名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ヒトインターロイキン−２の部分配列または誘導体
   を有することを特徴とするヒトインターロイキン−２の
   生物学的活性を有する蛋白質。 ２）ヒトインターロイキン−２のアミノ酸配列に加えさ
   らに１個またはそれ以上のアミノ酸を有することを特徴
   とする前記第１項記載の蛋白質。 ３）ヒトインターロイキン−２のアミノ酸配列からなる
   が、しかしながらＮ−末端で１個またはそれ以上のアミ
   ノ酸が欠落していることを特徴とする前記第１項記載の
   蛋白質。 ４）ヒトインターロイキン−２のアミノ酸配列からなる
   が、しかしながらＣ−末端で１個またはそれ以上のアミ
   ノ酸が欠落していることを特徴とする前記第１項記載の
   蛋白質。 ５）ヒトインターロイキン−２のアミノ酸配列からなる
   が、しかしながらＮ−末端でさらに１個またはそれ以上
   のアミノ酸が付加的に存在することを特徴とする前記第
   １項記載の蛋白質。 ６）ヒトインターロイキン−２のアミノ酸配列からなる
   が、しかしながらＣ−末端でさらに１個またはそれ以上
   のアミノ酸が付加的に存在することを特徴とする前記第
   １項記載の蛋白質。 ７）Ｃ−末端でさらに１個またはそれ以上のアミノ酸が
   付加的に存在することを特徴とする前記第５項記載の蛋
   白質。 ８）Ｎ−末端でさらに１個またはそれ以上のアミノ酸が
   付加的に存在することを特徴とする前記第４項記載の蛋
   白質。 ９）１個またはそれ以上のアミノ酸がＣ−末端でも欠落
   していることを特徴とする前記第６項記載の蛋白質。 １０）Ｃ−末端でも１個またはそれ以上のアミノ酸が付
   加的に存在することを特徴とする前記第５項記載の蛋白
   質。 １１）ヒトインターロイキン−２の配列の１個またはそ
   れ以上のアミノ酸が交換されていることを特徴とする前
   記第６〜１０項記載の蛋白質。 １２）ＤＮＡ配列 I 、すなわちアミノ酸１〜１３３に
   相当するヌクレオチド９〜４０７を完全にまたは部分的
   に包含する合成遺伝子が使用されることを特徴とするヒ
   トインターロイキン−２の遺伝子工学的製法。 ＤＮＡ−配列 I 【ＤＮＡ配列があります】 １３）ＤＮＡ配列 I 、すなわちアミノ酸１〜１３３に
   相当するヌクレオチド９〜４０７、を完全にまたは部分
   的に包含する合成遺伝子が使用されることを特徴とする
   前記第３、４および９項記載のヒトインターロイキン−
   ２の生物学的活性を有する蛋白質の遺伝子工学的製法。 １４）ＤＮＡ配列 I 、すなわちアミノ酸１〜１３３に
   相当するヌクレオチド９〜４０７、またはこの配列の一
   部分に付加的な１個またはそれ以上のアミノ酸に相当す
   る１個またはそれ以上のヌクレオチドトリプレットを付
   加的に包含する合成遺伝子が使用されることを特徴とす
   る前記第２、５、６、７、８および１０項記載のヒトイ
   ンターロイキン−２の生物学的活性を有する蛋白質の遺
   伝子工学的製法。 １５）その遺伝子が、１個または２個の停止コドンを伴
   つたＤＮＡ配列 I 、すなわちアミノ酸０〜１３３に相
   当するヌクレオチド６〜４０７、を包含することを特徴
   とする前記第１２項記載の方法。 １６）その遺伝子が第一番目のアミノ酸をコードするヌ
   クレオチドトリプレットの前にＡＴＧコドンを有しそし
   て最後のアミノ酸をコードするヌクレオチドトリプレッ
   トの後に２個の停止コドンを有することを特徴とする前
   記第１６および１４項記載の方法。 １７）宿主細菌として大腸菌が使用されることを特徴と
   する前記第１２〜１６項記載の方法。 １８）ヌクレオチド９〜４０７（アミノ酸１〜１３３）
   を含有するＤＮＡ配列 I 。 １９）１個または２個の停止コドンを伴うヌクレオチド
   ６〜４０７（アミノ酸０〜１３３）を含有するＤＮＡ配
   列 I 。 ２０）ＤＮＡ配列IIａ（ヒトインターロイキン２− I
   ）、IIｂ（ヒトインターロイキン２−II）、IIｃ（ヒト
   インターロイキン２−III）およびIIｄ（ヒトインター
   ロイキン２−IV）。 ２１）ＤＮＡオリゴヌクレオチド I ａ〜IVｊ。 ＤＮＡ−配列II 【ＤＮＡ配列があります】 ２２）Ｅｃｏ−Ｒ I 切断点およびｐｓｔ I 切断点の間
   のＤＮＡ配列IIａ（ヒトインターロイキン２− I ）を
   含有するハイブリッドプラスミド。 ２６）Ｐｓｔ I 切断点およびＸｂａ I 切断点の間のＤ
   ＮＡ配列IIｂ（ヒトインターロイキン２−II）を含有す
   るハイブリッドプラスミド。 ２４）Ｘｂａ I 切断点およびＳａｃ I 切断点の間のＤ
   ＮＡ配列IIｃ（ヒトインターロイキン２−III）を含有
   するハイブリッドプラスミド。 ２５）Ｓａｃ I 切断点およびＳａｌ I 切断点の間のＤ
   ＮＡ配列IIｄ（ヒトインターロイキン２−IV）を含有す
   るハイブリッドプラスミド。 ２６）ＥｃｏＲ I 切断点およびＳａｌ I 切断点の間の
   ＤＮＡ配列 I を含有するハイブリッドプラスミド。 ２７）ＤＮＡ配列 I （ヌクレオチド６−４１３）を含
   有するハイブリッドプラスミド。 ２８）前記第２２〜２７項記載のハイブリッドプラスミ
   ドを含有する宿主細菌。 ２９）前記第１２〜２７項記載のハイブリッドプラスミ
   ドを含有する大腸菌。