DK175511B1 - DNA-sekvens, fremgangsmåde til transportekspression af proteiner ved anvendelse af DNA-sekvensen, hybridvektor og hybridplasmid indeholdende DNA-sekvensen samt værtsorganisme indeholdende hybridvektoren eller hybridplasmidet - Google Patents

Description

DK 175511 B1 i

Den foreliggende opfindelse angår en DNA-sekvens, en fremgangsmåde til transportekspression af proteiner ved anvendelse af DNA-sekvensen, en hybridvektor og et hybrid-plasmid indeholdende DNA-sekvensen samt en værtsorganisme 5 indeholdende hybridvektoren eller hybridpiasmidet.

Proteiner syntetiseres i cellen ved ribosomerne, som er lokaliseret i cytoplasmaet. Proteiner, som transporteres ud af cytoplasmaet, bærer ved aminoendedelen en relativt kort peptidkæde, der ved passage gennem cytoplasmamembranen ad-10 skilles enzymatisk, .hvorved det "modne" protein opstår. Denne korte peptidsekvens betegnes "signalpeptid" eller præ- hhv. leder-sekvens.

Den ved aminoendedelen anordnede signalsekvens er allerede karakteriseret for et stort antal sekretoriske proteiner.

15 Denne signalsekvens består generelt af en hydrofob region på ca. 10-20 aminosyrer, som beregnes "core", ved hvis aminoen-dedel en kort peptidsekvens ("pre-core") er bundet, som for det meste udviser en (eller flere) positivt ladet(de) aminosyre (r). Mellem carboxyendedelen i den hydrofobe region og 20 aminoendedelen i det "modne" transporterede protein ligger en kort peptidsekvens ("post-core"), der indeholder spaltestedet ("splice-site"), og som sørger for en gunstig rumlig anordning.

Fra US-PS nr. 4.411.994 er det kendt at koble genet 25 for et protein, der skal eksprimeres, til et bakterielt gen, der koder for et ekstracellulært eller periplasmatisk bæreprotein for således at gennemføre transporten af det ønskede protein ud fra cytoplasmaet. Til denne fremgangsmåde er det nødvendigt at isolere et værtsspecifikt, bakterielt gen for 30 en periplasmatisk, "outer membrane" - eller et ekstracellulært protein. Dette gen skæres derpå med et restriktionsenzym, genet for det protein, der skal transporteres, insereres i det dannede skærested, og værtscellen transformeres med en vektor, der indeholder det således dannede fusionsgen. Iso-35 lering af det naturlige gen og dets karakterisering til udvælgelse af egnede skæresteder er overordentlig kostbar.

I DK 175511 B1 I

i 2 I

I Ifølge den foreliggende opfindelse undgås disse store I

I omkostninger på den måde, at man gør brug af en syntetisk sig- I

I nalsekvens. I

I Opfindelsen angår således den i krav 1 definerede I

I 5 DNA-sekvens I. I

I Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til transport- I

I ekspression af eukaryotiske, prokaryotiske eller virale I

I proteiner i prokaryotiske celler, hvilken fremgangsmåde er I

I ejendommelig ved, at man kobler genet for det protein, der I

I 10 skal transporteres, til DNA-sekvens I ifølge opfindelsen, I

I indbygger dette fusionsgen i en vektor og dermed transforme- I

I rer en værtscelle, som transporterer det eksprimerede protein I

I fra cytoplasmaet. I

I Opfindelsen angår desuden en hybridvektor, som er I

I 15 ejendommelig ved, at den indeholder DNA-sekvens I ifølge I

I opfindelsen. I

I Opfindelsen angår endvidere et hybridplasmid, som er I

I ejendommeligt ved, at det i et ECO RI-skærested insereret I

I indeholder DNA-sekvens I ifølge opfindelsen. I

I 20 Opfindelsen angår endelig også en værtsorganisme, for- I

I trinsvis E. coli, som er ejendommelig ved, at den indeholder I

I en hybridvektor eller et hybridplasmid ifølge opfindelsen. I

I DNA-sekvensen ifølge opfindelsen svarer i alt væsent- I

I ligt til en naturlig signalsekvens, men udviser flere skære- 25 steder for endonukleaser, som ikke er indeholdt i det natur-

1ige DNA. I

Herved skal forstås, at det eksprimerede signalpeptid H

vidtgående stemmer overens med den naturlige signalsekvens

og at der altså kun på DNA-pian består den forskel, at den I

30 syntetiske DNA-sekvens ifølge opfindelsen udviser skære- I

steder, der ikke er indeholdt i den naturlige DNA-sekvens. I

Der er imidlertid overraskende ikke forbundet nogen ulempe I

hermed i ekspressionen. Den målrettede "skræddersyning" af I

det syntetiske gen bringer tværtimod så mange fordele med I

35 sig, at der almindeligvis vil blive langt mere end kompen- I

seret for en eventuel ulempe ved den "unaturlige” codon- I

3 DK 175511 B1 anvendelse. Det har endog vist sig, at erstatning af start-codonet GTG, der forekommer i den alkaliske phosphatase fra E. coli, med ATG fører til en stærkt forhøjet ekspression.

En særlig fordel ved opfindelsen består i# at værtscellen 5 skal producere mindre ballastprotein, idet det gen, der skal eksprimeres, direkte kan knyttes til 3'-enden af den syntetiske DNA-signalsekvens. Derudover fremkommer der fordele på den måde, at man ved konstruktionen af det syntetiske DNA ved enderne forsyner ovenstående DNA-sekvens med bestemte 10 restriktionsidentificeringssteder, dér tillader en kloning af denne sekvens og i tilfælde af forskellige identificeringssteder tillader en defineret indbygning i en kloningsvektor. Herved muliggøres ifølge "byggeklodsprincippet" en indbygning i vilkårlige vektorer.

15 Interne identificeringssteder for restriktionsenzymer tillader tilkoblingen af vilkårlige homologe eller heterologe gener i den rigtige læseramme. Over disse interne skæresteder kan man også på simpel måde indføre variationer i DNA signalsekvenserne, der fører til præsekvenser, som ikke forekommer 20 i naturen.

Disse interne skæresteder lægges hensigtsmæssigt i områderne før og efter den hydrofobe region, især i "post-core"--regionen, idet spaltestedet og/eller dets omgivelser kan modificeres. Det er naturligvis også muligt at modificere "core"-25 -regionen på i og for sig kendt måde.

Under hensyntagen til kendte regler (G. von Heijne, J. Mol. Biol. 173 (1984) 243-251) kan signalpeptidase-skærestedet plantes over egnede skæresteder i genafsnittet, der koder for den carboxyendestillede del af præpeptidet på en sådan måde, at 20 intet fusionsprotein eksprimeres, men direkte det ønskede, dvs. eukaryotiske peptid i nativ form. Gener af naturlig oprindelse tillader i almindelighed ikke en sådan fremgangsmåde.

Som signalsekvenser kommer i princippet alle litteraturkendte signalsekvenser på tale (M.E.E. Watson; Nucleic Acids 35 Res. 12 (1984), 5145 - 5164) variationer af samme såvel som deraf afledte "idealiserede" signalsekvenser (D. Perlman og H.O. HaIvorson; J. Mol. Biol. 167 (1983), 391 - 409).

I DK 175511 B1 I

I I

I Foretrukne værtsorganismer er E. coli, Streptomyces, I

I Staphylococcus-arter, såsom S. aureus, Bacillus-arter, f.eks. I

I B. subtilis, B. amyloliquifaciens, B. cerus eller B. licheni- I

I formis, Pseudomonas, Saccharomyces, Spodoptera frugiperda og

I 5 cellerækker af overordnede organismer, f.eks. vegetabilske H

I eller animalske celler. H

I I princippet kan alle sådanne proteiner, som er membran- I

I gængse og af prokaryotisk eller eukaryotisk oprindelse, udvindes H

I ved transportekspression. Foretrukne er imidlertid farmaceutisk H

I 10 vigtige peptidprodukter, såsom hormoner, lymphokiner, inter- H

I feroner, blodkoaguleringsfaktorer og vacciner, som i naturen og- H

I så er kodede som peptider med en aminoendestillet præsekvens. H

I Dénne eukaryotiske præsekvens fraspaltes imidlertid i reglen H

I ikke fra de værtsspecifikke signalpeptidaser i de prokaryotiske I

I 15 værtsorganismer. I

I I E. coli er generne for de periplasmatiske og "outer I

I membrane"-proteiner egnede til transportekspression, hvor I

I ''førstnævnte dirigerer produktet ind i periplasma, men sidst- I

I nævnte snarere til den ydre membran. I

I 20 Som eksempel anføres DNA-signalsekvensen af det I

I periplasmatiske protein alkalisk phosphatase, som er højekspri- I

I merbart i E. coli, uden at opfindelsen er begrænset hertil. I

I I det følgende anføres præ-sekvensen inklusiv de I

I første 20 aminosyrer af den alkaliske phosphatase fra E. coli: I

I 25 I

I 5 ίο I

I Met-Lys-Gln-Ser-Thr-Ile-Ala-Leu-Ala-Leu-Leu-Pro-Leu-Leu-

I 15 20 25 I

I Phe-Thr-Pro-Val-Thr-Lys-Ala-Arg-Thr-Pro-Glu-Met-Pro-Val-

I 30 I

I 30 35 40 I Leu-Glu-Asn-Arg-Ala-Ala-Gln-Gly-Asn-Ile-Thr-Ala-Pro I 1

I 35 I

t= foretrukkent spaltested for signalpeptidase I

5 | DK 175511 B1

Det har vist sig, at indtil ca. 40, for det meste ca. 20, yderligere aminosyrer af det modne protein er tilstrækkelige til korrekt processering. I mange tilfælde er færre yderligere aminosyrer imidlertid også tilstrækkelige, 5 f.eks. ca. 10, fortrinsvis ca. 5. Da en kortere proteinkæde Λ betinger et ringere krav til protein-biosyntesesystemet i værtscellen, er det en fordel ved opfindelsen, at DNA-sekvens I, der er anført nedenfor, koder for præ-sekvensen af alkalisk phosphatase såvel som for yderligere 5 aminosyrer i 10 det modne protein.

DNA-sekvens I

Triplet nr. 123

Aminosyre nr. ' Met Lys Gin 15 Nukleotid nr. 5 10

Kodende streng 5' AA TTC ATG AAA C AA

Ikke-kodende streng 31 G TAC TTT GTT

4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 20 ser . Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu . Pro Leu 15 20 25 30 35 40

AGC ACG ATC GCA CTG GCA CTC TTA CCG TTA

TCG TGC TAG CGT GAC CGT GAG AAT GGC AAT

25 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

Leu Phe Thr Pro Val Thr Lys Ala Arg Thr 45 50 55 60 65 70

30 CTG TTT ACC CCG GTG ACA AAA GCT CGG ACC

GAC AAA TGG GGC CAC TGT TTT CGA GCC TGG

24 25 26

Pro Glu Met 2 35 2 · 80 84 CCA G AA ATG G 31 GGT CTT TAC CTT AA 51

I DK 175511 B1 I

I 6 I

I DNA-sekvens I svarer på nær nogle triplet-variationer - I

I nemlig sådanne, der indfører singulære restriktionsenzym-skære- I

I steder og erstatter startcodonet GTG med ATG - til den naturlige I

I sekvens i alkalisk phosphatase. Ved enderne af den streng, der I

I 5 skal kodes, befinder der sig "overhængende" DNA-sekvenser sva- I

I rende til restriktionsendonukleasen EcoRI, som tillader ind- I

I bygning i gængse kloningsvektorer, f.eks. de i handlen til- I

I gængelige plasmider, såsom pBR 322, pUC 8 eller pUC 12. Des- I

I uden indbygges inden i genet i DNA-sekvens i en række I

I 10 yderligere singulære skæresteder for restriktionsenzymer, I

I der på den ene side muliggør tilkobling af heterologe, gener I

på det rigtige sted og i ønsket læseramme og på den anden I

I side også tillader gennemførelse af variationer: I

I 15 I

I Restriktionsenzym Skæring efter nukleotid-nr. I

I (i den streng, der skal kodes) I

7 DK 175511 B1 -bindestedet, til en påfølgende identificeringssekvens for EcoR I er anordnet : DNA-sekvensen I og dertil umiddelbart derefter proinsulingenet (W. Wetekam et al., Gene 19 (1982)179-183).

Det eksprimeréde proinsulin-fusionspeptid indeholder ved amino-5 endedelen endnu 9 yderligere aminosyrer, der kan fraspaltes enzymatisk eller kemisk.

Indbygningen af det syntetiske gen i pUC 8 såvel som konstruktionen af ekspressionsplasmider, der indeholder de eukaryotiske gener koblet til DNA-sekvens I, sker på i og 10 for sig kendt måde. Desuden kan der henvises til Maniatis1 lærebog (Molecular Cloning, Maniatis et al., Cold Spring Harbor, 1982). Transformationen af de således opnåede hybrid-plasmider -.i egnede værtsorganismer, fortrinsvis E. coli, er ligeledes kendt og er beskrevet indgående i ovennævnte 15 lærebog. Udvindingen af de eksprimerede proteiner og rensning heraf er ligeledes beskrevet.

I de følgende eksempler belyses i detaljer endnu nogle foranstaltninger ved den foreliggende opfindelse, hvoraf de forskellige mulige variationer (og kombinationer) vil være ind-20 lysende for en fagmand. Procentangivelser er beregnet på vægten, medmindre andet er angivet.

Eksempler 25 l. Kemisk syntese af et enkeltstrenget oligonukleotid

Med genbyggesten la, der omfatter nukleotider 1-29 i den streng, der skal kodes, som eksempel, belyses syntesen af gen- byggestenene. Ifølge kendte metoder IM.J. Gait et al., Nucleic 30 Acids Res. 8 (1980), 1081-1096) bindes det ved 3’-enden stående nukleosid, i det foreliggende tilfælde altså guanosin (nukleo- tid nr. 29) covalent til kiselgel ("FRACTOSIL", firma Merck) over 3'-hydroxyfunktionen. Hertil omsættes først kiselgelen under fraspaltning af ethanol med 3-(triethoxysilyl)-propylamin, 2' 35 idet der opstår en Si-O-Si-binding. Guanosin omsættes som N - -isobutyryl-3’-O-succinoyl-5'-dimethoxytriethylether i nærværelse af paranitrophenol og N,N‘-dicyclohexylcarbodiimid med det

I DK 175511 B1 I

I I

I modificerede bæremateriale, idet den frie carboxygruppe i' sue- I

I cinoylgruppen acylerer aminogruppen i propylamingruppen. I

I I de følgende syntesetrin anvendes basekomponenten I

I som 5’-O-dimethoxytrityl-nukleosid-3'-phosphorsyrling-mono- I

I 5 methylester-dialkylamid eller -chlorid, idet adeninet foreligger I

6 4 I

som N -benzoyl-forbindelse, cytosinet som N -benzoyl-forbindelse,

I 2 - H

guaninet som N -isobutyryl-forbindelse og thyminet, der ikke

I indeholder nogen aminogruppe,,uden beskyttelsesgruppe. I

I 50 mg af det polymere bæremateriale, der bundet indeholder I

I 10 2 ^amol guanosin, behandles i rækkefølge med følgende reagen- I

I ser: I

I a) N i tr orne than I

I b) mættet zinkbromidopløsning i nitromethan med 1% vand I

I 15 c) methanol H

I d) tetrahydrofuran I

I e) acetonitril

I f) 40 ^imol af det tilsvarende nukleosidphosphit og 200 ^ol I

I tetrazol i 0,5 ml vandfrit acetonitril (5 minutter) I

I 20 g) 20% -eddikesyreanhydrid i tetrahydrofuran mea 40% lutidin og 10% I

I dimethylaminopyridin (2 minutter) I

I h) tetrahydrofuran I

I i) tetrahydrofuran med 20% vand og 40% lutidin I

I j) 3% iod i kollidin/vand/tetrahydrofuran i volumenforholdet

I 25 5:4:1 I

I k) tetrahydrofuran og I

I 1) methanol. I

9 DK 175511 B1

Efter afsluttet syntese af oligonukleotidet fraspaltes methylenphosphatbeskyttelsesgrupperne i den oligomere ved hjælp af p-thiocresol og triethylylamin. Ved en tre timers behandling med ammoniak skilles oligonukleotidet derpå fra 5 den faste bærer. En 2- til 3-dages behandling af de oligomere med koncentreret ammoniak fraspalter kvantitativt aminobe-skyttelsesgrupperne fra baserne. Det således opnåede råprodukt renses ved højtryksvæskechromatografi (HPLC) eller ved poly-acrylamid-gelelektroforese.

10 På tilsvarende måde syntetiseres også de øvrige genbygge sten Ib-If, hvié nukleotidrække fremgår af DNA-sekvensen II, 15 DNA-sekvens II: 4- la —......►

''5’ AA TTC ATG AAA CAA AG C ACG ATC GCA CTG 20 3' G TAC TTT GTT TCG TGC TAG CGT GAC

Eco RI 4---- Ib - |«- Ic-

IgCA CTC TTA CCG TTA CTG TTT ACC CCG

25 CGT GAG AAT GGC AAT GAC AAA TGG GGC

-> 4-:---- Id —-

4-- le----► Eco RI

GTG ACA AAA GCT CGG ACC CCA OAA ATG G ' 3Q CAC TGT TTT CG A GCC TGG GGT CTT TAC CTT AA j -► 4- If -► 35

I DK 175511 B1 I

I 10 I

I 2. Enzymatisk sammenknytning af de enkeltstrengede I

I oligonukleotider til DNA-sekvens I. I

I De endestillede oligonukleotider la og If phosphoryle- I

I 5 res ikke. Derved undgås en oligomerisation over de overhæn- I

I gende ender. Til phosphorylering af oligonukleotiderne ,Ib, Ic, I

I Id og le behandles 1 nmol af disse forbindelser med 5 nmol I

I adenosintriphosphat og fire enheder T4-polynukleotid-kinase i I

I 20 yuliter 50 mM tris-HCl-puffer (pH-værdi 7,6), 10 mM mag- I

I 10 nesiumchlorid og 10 mM dithiothreitol (DTT) i 30 minutter ved I

I 37°C. Enzymet desaktiveres ved fem minutters opvarmning til I

I 95°C. Derpå forenes oligonukleotiderne la til If og hybrideres I

I til dobbeltstrengen, idet man opvarmer dem i en 20 mM KCl- I

I -opløsning og derpå langsomt (i løbet af 2 timer) afkøler I

I 15 til 16°C. Ligationen til DNA-fragmentet ifølge DNA-sekvens I I

I sker ved omsætning i 40 yuliter 50 mM tris-HCl-puffer (20 mM I

I magnesiumchlorid og 10 mM DTT) ved hjælp af 100 enheder T4- I

I -DNA-ligase ved 15°C i løbet af 18 timer. I

I Rensningen af genfragmentet sker ved gelelektroforese I

I 20 på en 10%'s polyacrylamidgel (uden urinstoftilsætning, I

I 20 x 40 cm, 1 mm tykkelse), idet ØX 174 DNA (Fa. BRL), skåret I

I med Hinf I, eller pBR 322), skåret med Hae III, tjener som I

I mærkersubstans. I

I 25 I

I 30 I

35 I

11 DK 175511 B1 3. Indbygning af genfragmentet i pUC 8.

Det i handlen tilgængelige plasmid pUC 8 åbnes på kendt måde med restriktionsendonuklease EcoR I ifølge fabrikantens 5 angivelser. Fordøjelsesblandingen opdeles på en 5%'s polyacryl-amidgel ved elektroforese på kendt måde, og DNA gøres synlig ved farvning med ethidiumbromid eller ved radioaktiv mærkning {"Nick-Translation" ifølge Maniatis, i omtalte bog). Plasmid-båndet skæres derpå fra acrylamidgelen og skilles elektrofore-10 tisk fra polyacrylamidet.

4. Indbygning af DNA-sekvensen I i et ekspressionsplasmid.

Ekspressionsplasmidet pWI 6 med information for abe--proinsulin konstrueres som følger: 10 ^ig plasmid pBR 322 fordøjes med restriktionsendonu-kleaserne Eco Rl/Pvu II og fyldes derpå ved hjælp af en "fill--in"-omsætning med Klenow-polymerase på Eco RI-skærestedet.

Efter gelelektroforetisk opdeling i en 5%'s polyacrylamid-20 gel kan plasmidfragmentet udvindes ved elektroeluering af 2293 Bp længde (fig. 1).

Fra plasmidet pBR 322 med integreret abe-præproinsulin-DNA (Wetekam et al., Gene 19 (1982)^ 179-183) isoleres dette ved fordøjelse med restriktionsendonukleaser Hind III og Mst I (som 25 fragment på ca. 1250 Bp) og reklones i plasmidet pUC9 som følger: Plasmidet pUC 9 spaltes med enzymet Bam HI, spaltestedet fyldes op med Klenow-polymerase ("large fragment") i en Standard-"fill--in"-omsætning, efterskæres med restriktionsenzymet Hind III, og DNA skilles gelelektroforetisk i en 5%'s polyacrylamidgel fra 30 de øvrige DNA-fragmenter. I det åbnede plasmid integreres det isolerede insulin-DNA-fragment med en længde på ca. 1250 Bp.

Til adskillelse af "the untranslated region" og præ-sekvensen fordøjes det således modificerede pUC 9-plasmid med Hae III, og det 143 Bp lange fragment fordøjes til fraspaltning 35 af de to sidstnævnte nukleotlder fra præ-sekvensen under begrænsende enzymbetingelser med Bal 31. Man opnår således ved amino-endedelen som første codon TTT, som for phenylalanin ' står som første aminosyre i B-kæden.

I DK 175511 B1 I

I 12 I

I Til dette fragment ligeres nu en for Eco RI specifik I

adaptor i en "blunt-end" ligationsreaktion: I

I a) 5' AAT TAT GAA TTC GCA AYG I

I 5 Eco RI TA CTT AAG CGT TAC I

I b) 5’ AAT TAT GAA TTC GCA AGA I

I ECO RI TA CTT AAG CGT TCT I

I 10 For at undgå en polymerisering af adaptorerne anvendes I

I disse uphosphoryleret i ligationsreaktionen (hvilket i figurerne I

I er antydet med Eco Ri”/ ligeledes, f.eks. ved opfyldning, in- I

I aktiverede identifikationssekvenser). Adaptor a) udviser ved I

I enden et codon for methionin, adaptor b) codonet for arginin. I

I 15 u H

Ifølge variant a) opnås således et genprodukt, hvori

I en fraskillelse af den bakterielle andel er mulig ved bromcyan- I

I spaltning, medens variant b) tillader en trypsinspaltning. I

I Ligationsproduktet fordøjes med Mbo II. Efter gelelek- I

I troforetisk opdeling opnår man et DNA-fragment af en længde på I

I 20 I

I 79 Bp med information for aminosyrerne nr. 1-21 i B-kæden.

I Genet for den resterende information af pro-insulinmole- I

I kylet (herunder en G-C-sekvens fra kloningen og 21 Bp fra I

I pBR 322 i tilknytning til stop-codonet) opnår man ud fra pUC I

I 9-plasmidet med den komplette præ-pro-abeinsulin-information I

I 25 I

I ved fordøjelse med Mbo II/SmaI og isolering af et DNA-frag-

I ment' med en længde på ca. 24 0 Bp. Ved ligering af begge pro- I

I insulin-fragmenter opnår man det korrekte ligationsprodukt I

I med en længde på ca. 320 Bp (inklusiv adaptoren på 18 Bp). I

I Det således konstruerede proinsulin-DNA-fragment kan nu sammen- H

I 30 H

I ligeres med en regulationsregion over det Eco Rl-negative

I skærested. I

I Den samlede reaktionsrække vises i fig. 2, hvori A, B I

I og C betyder DNA for de pågælgende peptidkæder i proinsulin- I

I molekylet, Ad betyder den (dephosphorylerede) adaptor (a eller I

I 35 I

I b), og præ betyder DNA for præ-sekvensen i. abe-præ-proinsuli- I net.

13 DK 175511 B1

En kemisk-syntetisk regulationsregion bestående af en identificeringssekvens for Bam HI, lac-operatoren (0), en bakteriel promotor (P) og et ribosomalt bindested (RB) med et ATG-start-codoh, i en afstand på 6-14 nukleotider fra RB, og 5 en påfølgende identificeringssekvens for Eco RI (fig.

3) ligeres over den samlede Eco Rl-overlapningsregion med det ifølge det foregående eksempel opnåede pro-insulinfragment.

Man vælger fordelagtigt den følgende syntetiske regulations^· region (DNA-sekvens Ila fra tabel II, svarende til DE-PA 10 nr. P 34 30 683.8): 5.' GATCCTAAATAAATTCTTGACATTTTTTAAA 3’ 3' GATTTATTTAAGAACTGTAAAAAATTT 5' 15

(Bam HI) P

5' TAATTTGGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCG 3' 3’ ATTAAACCATATTACACACCTTAACACTCGC 5' 20 0 5' GAATAACAATTTCACAGAGGATCTAG 3' 3' CTTATTGTTAAAGTGTCTCCTAGATCTTAA 5' 25 RB (Eco RI)

Ligeledes kan de andre i tabel II nævnte syntetiske re-gulationsregioner anvendes. Det er imidlertid også muligt at 30 vælge en fra litteraturen kendt naturlig eller afledt (Perlman et al., omtalt i denne bog) signalsekvens.

35

I DK 175511 B1 I

I 14. I

σ> c T3 c

Xi

I

4-1 u x O Φ

e < m I

O ·Η ϋ Η Μ Ό I C5C3< .1

I Hl ,5} φ ® 11 " Ί I

I Φ I—t ιΗ Η CO^T CT\ I

Φ Φ < Φ ^ lue

I e e u u u I

I II II II II II I

I riNnvui ^

rH >H .H -H rH rHOOOOOOOl I

I <C <C C <C < < *£ O

j3-<c<c«£«c<*:<c«s:u H

? HCOOOOOD<

I η -η I

ti

G H

— HH

H O £X U -ρη

I S < <D < hOOOOOOOH

O ^ < H .* e m φ e e

e Η Η O ~ H

^ Ή < <ί u ΛΙ H

I ^ I

fc-t ^ <ζ ^o^uuu^<

t n O < 0 0 <D IH

I C Η Η Η Η Η Η M H

I (D £h Π r—{ 0

I H ri <u <u <i> ^ ^huouoouuc I

I w i £ <*<<υ ^<e<<<<eu

I Η H

o) ni o II II II II

I TI e t—i e; <;

I S H U ^ B Eh ^ < I

I rrt So <<CEHEhHHH

I x 5 S hhooooo

I OHHOOOOU

I - Η σι I hu <<<·<< c e co

O U H

I σι u e ooe^eh^ I I I I t φ h e I Sue t-e<e<eooo

I -η e S 5 i I

I S 2 8 ϋ h vsuSSSSoSS ·

I rH HU HH

I σ> 2u U U U e U Η Π ΐηΒΒ£ι^ϋ^£Η&Η I

I φ e in rH 0)

I ι-t HU M Jh Jh >h Sh di cn «Kf d'rviru^nr^ I

I UH φφφφφ cojeeuuuuuu I U Η I—I rH i—1 rH rH e Φ

I H tø He iHrHrHiHrHU t> . cj Ej »i« »·» r·* r* r»i ru H

η ή ee φ φ φ φ φ x •Hb-'E-'ttoouoo •P u O * Φ <HΦU'^,HeuUHUcn

-Q a il il il ii li li é «·“ o tj φ ς-. tor I

ea >1 - z ri

Hu in h cm n f in io Q

15 DK 175511 B1

Efter en dobbeltfo'rdøjelse med Sma Ι/Bam HI og en "fill--in"-reaktion af Bam HI skærestedet med Klenow-fragmentet isoleres ligeringsproduktet (ca. 420 Bp) gelelektroforetisk.

Det således opnåede fragment kan derpå indligeres over 5 en ”blunt-end"-ligering i pBR 322-delplasmidet ifølge fig. 1 (fig. 4). Man opnår hybridplasmidet pWI 6.

Efter transformation i E. coli-stammen HB 101 og selektion på amicillin-plader undersøges plasmid-DNA af individuelle kloner for integration af et 420 Bp-fragment med regula-10 tionsregionen og det Bal 31-forkortede pro^insulingen. Til påvisning af den korrekte forkortelse af proinsulingenet med Bal 31 (fig. 2) sekvenseres plasmiderne med det integrerede pro-insulinfragment ud af Eco Ri-skærestedet. Af 60 sekvenserede kloner har tre den ønskede forkortelse på to nukleotider 15 (fig. 4).

1 ^ug af plasmidet pWI 6 skæres med restriktionsenzymet Eco RI og sammenligeres derpå i nærværelse af 30 ng DNA-sekvens I ved 16°C i 6 timer. Efter transformation i E. coli HB 101 isoleres plasmider ud fra individuelle kloner og undersøges 20 ♦ ved hjælp af en restriktionsenzymanalyse for integration af DNA-sekvens T. 7% af alle kloner indeholder plasmidet pWI 6 integreret med DNA-sekvens I.

Retningen af denne integrationsreaktion kan konstateres entydigt med standardmetoder for restriktionsenzymanalyse over 25 en dobbeltfordøjelse med Hind III/Pvu I. Plasmidet pWI 6 integreret med en DNA-sekvens I i korrekt læseretning til proinsulinet er angivet som pWIP 1 i fig. 5.

Dette plasmid kan derpå transformeres ind i forskellige E. coli-stammer for at afprøve syntesekapaciteten af de en- ΟΛ kelte stammer.

Ekspressionen af præ-sekvens-proinsulin-fusionen i E. coli bestemmes på følgende måde: 1 ml af en med IPTG (isopropyl-&-thiogalactopyranosid) induceret bakteriekultur ved en optisk tykkelse ODfion på 1,0 og 35 o o u u en induktionsvarighed på én time stoppes med PMSF (phenylmethyl-sulfonylfluorid) i en slutkoncentration på 5-10 ^M, afkøles i is og fracentrifigeres. Cellebundfaldet vaskes dérpå i 1 ml

I DK 175511 B1 I

I 16 I

I puffer (10 mM tris-HCl> pH-værdi 7,6; 40 mM NaCl), centri- I

I fugeres fra og resuspenderes i 200 yaliter puffer (20% saccha- I

I rose; 20 mM tris-HCl, pH-værdi 8,0, 2 mM EDTA), inkuberes i I

I 10 minutter véd stuetemperatur, fracentrifugeres og resuspende- I

I 5 res straks i 500 yiliter dobbeltdestilleret H^O. Efter 10 mi- I

I nutters inkubationstid i is fracentrifugeres de "chok-lyserede" I

I bakterier, og den ovenstående væske fryses. Denne ovenstående I

I væske undersøges for proinsulinindholdet i en Standard-Insu- I

I lin-RIA (Amersham). I

I 10 Bakteriebundfaldet resuspenderes endnu en gang i 200 yuli- I

I ter lysozympuffer (20% saccharose, 2 mg/ml lysozym, 20 mM I

I tris-HCl, pH-værdi 8,0, 2 mM EDTA), inkuberes i is i 30 minut- I

I ter, behandles 3 gange 10 sekunder med ultralyd og fracentrifu- I

I geres derpå. Den således resulterende ovenstående væske under- I

I 15 søges som plasmafraktion for indhold af proinsulin i en radio- I

I immunoanalyse. I

I Individuelle bakteriekloner, som indeholder plasmid I

I pWIP 1, undersøges for deres syntesekapacitet og deres trans- I

I portevne for proinsulin-præsekvens-produktet. Det kan påvises, I

I 20 at samtlige bakteriekloner på forventet måde transporterer det

I producerede proinsulin for ca. 90%'s vedkommende ind i det pe- I

I riplasmatiske rum. Ca. 10% af proinsulin-RIA-aktiviteten kan I

I genfindes i plasmafraktionen. I

I 25 I

I 30 I

I 35 I

Claims (6)

1. 5 Triplet nr. 123 Aminosyre nr. Met Lys Gin Nukleotid nr. 5 10 Kodende streng 5' AA TTC ATG AAA CAA Ikke-kodende streng 3' G TAC TTT GTT 10 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Ser Thr Ile A.la Leu Ala Leu Leu Pro Leu 15 20 25 30 35 40

   15 AGC ACG ATC GCA CTG GCA CTC TTA CCG TTA TCG TGC TAG C GT GAC C GT GAG AAT GGC AAT -•14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Leu Phe Thr Pro Val Thr Lys A.la Arg Thr 20 45 50 55 60 65 70 CTG TTT ACC CCG GTG ACA AAA GCT CGG ACC GAC AAA TGG GGC CAC TGT TTT CGA GCC TGG 25 24 25 26 Pro Glu Met 1 · 80 84 CCA GAA ATG G 3'
2. 2. Fremgangsmåde til transportekspression af eukaryo-tiske, prokaryotiske eller virale proteiner i prokaryotiske celler, kendetegnet ved, at man kobler genet for det protein, der skal transporteres, til DNA-sekvens I ifølge 35 krav 1, indbygger dette fusionsgen i en vektor og dermed transformerer en værtscelle, som transporterer det eksprime- I DK 175511 B1 I I 18 1 I rede protein fra cytoplasmaet. I
3. 3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendeteg- I I net ved, at DNA-sekvens I koder et værtsspecifikt signal- I I protein. I I 5
4. 4. Hybridvektor, kendetegnet ved, at den I I indeholder DNA-sekvens I ifølge krav 1.

   3. GGT CTT TAC CTT AA 5'
5. 5. Hybridplasmid, kendetegnet ved, at det I I i et Eco RI-skærested insereret indeholder DNA-sekvens I I I ifølge krav l. I I 10
6. 6. Værtsorganisme, fortrinsvis E. coli, kende- I I tegnet ved, at den indeholder en hybridvektor ifølge I I krav 4 eller et hybridplasmid ifølge krav 5. I