HU197355B

HU197355B - Process for preparing signal sequency for the transformation of proteins in expression systems

Info

Publication number: HU197355B
Application number: HU853761A
Authority: HU
Inventors: Joachim Engels; Michael Leineweber; Waldemar Wetekam; Eugen Uhlmann
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1984-10-06
Filing date: 1985-09-30
Publication date: 1989-03-28
Also published as: ATE97445T1; ES8605579A1; DE3436818A1; IE63262B1; HUT40164A; DK453285D0; GR852405B; IL76573A; EP0177827A3; NZ213717A; AU595486B2; DK453285A; DK175511B1; PT81253A; EP0177827B1; PT81253B; DE3587660D1; IE852440L; ES547600A0; PH30819A

Description

A proteineket a sejtben a citoplazmában elhelyezkedő riboszómák szintetizálják. A citoplazmáből kilépő proteinek amino-végén egy viszonylag rövid peptidlánc van, amelyet a citoplazma-membránon történő átlépéskor bizonyos enzimek leválasztanak, és igy keletkeznek az úgynevezett .érett' proteinek. A rövid, lehasadó peptidszekvenciát .szignálpeptid'-nek vagy pre-, illetve leader-székvenciának nevezzük.

Már sok esetben jellemezték a kiválasztódó proteinek amino-végén elhelyezkedő szignál-szekvenciát. Ez lényegében 10-20 aminosavat tartalmazó .core'-nek nevezett hidrofób részből áll, amelynek amino-végén legtöbbször egy (vagy több) pozitiv töltésű aminosavat tartalmazó rövid peptid-szekvencia van (.pre-core). A hidrofób rész karboxi-vége és az .érett' protein amino-vége között is van egy rövid peptid-szekvencia (.post-core'), amely hasítási helyet (.splice-site) tartalmaz és a kedvező térbeli elhelyezkedést biztosítja.

A 4 411 994 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi közlemény ír le olyan eljárást, amelynél a kiválasztandó protein génjét egy extracelluláris vagy periplazmatikus vivő-proteinnek megfelelően kódolt bakteriális génhez kapcsoljak annak érdekében, hogy a kívánt protein kijpttatását a citoplazmából lehetővé tegyék. Ehhez az eljáráshoz izolálni kell egy olyan, a gazdaszervezetnek megfelelő, bakteriális gént, amely egy periplazmatikus, .outer membráné' vagy exktracelluláris proteinnek megfelelően van kódolva. Ezt a gént ezután restrikciós enzimmel hasítják, a képződött hasítási helyre csatolják a kiválasztandó protein génjét és a gazdasejtet az így előállított, egyesített gént tartalmazó vektorral transzformálják. Az ismert eljárás hátránya, hogy a természetes gén izolálása és az alkalmas hasítási hely kiválasztása érdekében történő jellemzése rendkívül munkaigényes. Találmányunk szerint az eljárás munkaigényességét ügy csökkentjük, hogy szintetikus szignál-szekvenciát alkalmazunk.

A találmány tárgya eljárás szintetikus szignál-szekvencia előállítására, proteinek transzportjára, expressziós renszerekben, azzal jellemezve, hogy a szintetikus DNS lényegében egy természetes szignál-szekvenciának felel meg, de egy vagy több olyan, az endonukleázok számára hozzáférhető hasítási helyet tartalmaz, amelyek a természetes DNS-ben nem találhatók meg. A találmány szerinti DNS .lényegében' felel meg egy természetes szignál-szekvenciának. Ez alatt azt értjük, hogy az exprimált szignsi-peptid a természetessel a legmesszebbmenőkig vagy teljesen megegyezik, tehát az utóbbi esetben csak a DNS sikon van különbség, mégpedig annyiban, hogy a szintetikus DNS legalább egy olyan hasítási helyet tartalmaz, amely a természetes DNS-szekvenciában nem fordul elő. A találmány szerinti hasítási hely beépítése kisebb vagy nagyobb mértékű eltérést okoz a természetes szekvenciától, amit az adott körülmények között azokra a kodonokra kell visszavezetnünk, amelyeket a mindenkori gazdasejt kevésbé kedvel. Meglepő viszont, hogy ezzel az expressziónéi semmiféle hátrány nem jár. A szintetikus gén eltervezett .mértékutánisága' sokszor annyi előnynyel jár, hogy a .természettől idegen kodon alkalmazásának esetleges hátrányait általában bőségesen túlkompenzálja. Sőt azt tapasztaltuk, hogyha az E. coli lúgos foszfatáz enzimjének génjében előforduló GTG startkodont ATG-re cseréljük, akkor ez erősen megnöveli az expressziót.

A találmány lényeges előnye, hogy a gazdasejtnek kevesebb ballaszt-proteint kell termelnie, mivel az exprimálandó gént közvetlenül a szintetikus DNS-szignálszekvencia 3’ végéhez csatolhatjuk. További előnye a találmánynak, hogy a szintetikus DNS-t a felépítésekor a végeken kiálló, a restrikciós enzim meghatározott felismerő helyének megfelelő DNS-szekvenciákkal láthatjuk el, amelyek lehetővé teszik a szintetikus DNS klónozását úgy, hogy több, különböző felismerő hely esetében a DNS csak egyféle, meghatározott módon épülhet be a klónozó vektorba, így lehetőség van az .épitőszekrény elv’ alapján tetszőleges vektorba történő beépítésre.

A restrikciós enzimeknek megfelelő belső felismerési helyek lehetővé teszik tetszőleges * homológ vagy heterológ gének csatolását a helyes leolvasó vázszerkezetben.

Ezeken a belső hasítási helyeken egyszerű módon vezethetünk be variációkat a szignál-szekvencia DNS-ébe, és ezek a variációk a természetben elő nem forduló preszekvenciákhoz vezetnek.

Ezeket a belső hasítási helyeket célszerűen a hidrofób rész előtt vagy után építjük be, előnyösen a .post-core'-tartományba, emellett a hasítási helyeket és/vagy azok környezetét modifikálhatjuk.

A G. von Heijne: J. Mól. Bioi. 173 (1984) 243-251. oldal irodalmi közleményben leírt, ismert szabályok figyelembe vételével a prepeptid karboxi-terminális részét kódoló génszeletben alkalmazott, és megfelelően megválasztott hasítási helyekkel a szignál-peptidák hasítási helyeket úgy tervezhetjük, hogy ne a fúziós protein, hanem közvetlenül a kívánt, általában eukariotikus, természetes formájú peptid exprimálódjék. A természetes eredetű gének általában ilyen folyamatokat nem tesznek lehetővé.

A találmány szerinti eljárásnál minden, az irodalomban [M.E.E. Watson: Nucleic Acids Rés. 12 (1984), 5145-5164. o.] leirt szignál-szekvencia, ezek variációi, valamint a belőlük levezetett, és a D. Perlmann és H.O. Halvorson: J. Mól. Bioi. 167 (1983), 391-409. o. irodalmi közleményben leirt .idealizált' szignál-szekvenciák alkalmazhatók.

Előnyős gazdaszervezetek az E. coli; Streptomyces; Staphylococcus fajták, például az S. aureus; Bacillus fajták, például a B. subtilis, B. amyloliquifaciens, B. cerus vagy B. licheniformis; Pseudomonas; Saccharomy- 5 ces; Spodoptera frugiperda és a fejlettebb szervezetek sejtvonalai, például a növényi és állati sejtek.

Elvileg minden olyan prokariotikus és eukariotikus eredetű protein, amely a memb- 10 ránon ót képes jutni, transzport-expresszióval kinyerhető. Lényegesek viszont a gyógyszerészetileg jelentős peptidtermékek, például a hormonok, limfokinek, interferonok, véralvadást elősegítő szerek és vakcinák, amelyek a természetben is aminoterminális preszekvenciáju peptidekként vannak kódolva. Ezeket az eukariotikus preszekvenciákat viszont a prokariotikus gazdaszervezetek saját szignálpeptidázai nem hasítják le.

Az E. coliban a transzport-expresszióhoz alkalmasak a periplazmatikus és .outer membráné'-proteinek génjei, amikor is az elsők a tei-méket a periplazmába, az utóbbiak viszont a külső membránra irányítják.

Példaként bemutatjuk az E. coliban jól exprimólható lúgos foszfatáz periplazmatikus protein DNS-szignál-szekvenciáját, anélkül, hogy a találmányt erre korlátoznánk.

Az E. coli lúgos foszfatázának első húsz 15 aminosavat is magában foglaló preszekvencia a következő:

10

Met-Lys-Gln-Ser-Thr-Ile-Ala-Leu-Ala-Leu-Leu-Pro-Leu-Leu15 20 25

Phe-Thr-Pro-Val-Thr-Lys-Ala-Arg-Thr-Pro-Glu-Met-Pro-Val30 35v 40

Leu-Glu-Asn-Arg-Ala-Ala-Gln-Gly-Asn-Ile-Thr-Ala-Pro ^Jelentése: a szignálpeptidáz kitüntetett hasítási helye

Azt találtuk, hogy ha a preszekvencia az érett protein első aminosavai közül max. 40-et, de legtöbbször kb. 20-at tartalmaz, akkor az a korrekt folyamathoz elegendő.

Sok esetben viszont kevesebb kiegészítő 35 aminosav is elegendő, például kb. 10 vagy előnyösebben kb. 5. Mivel a rövidebb proteinlánc kevésbé veszi igénybe a gazdasejt protein-bioszintetizáló szerkezetét, ezért a találmány egyik előnyös kivitelezési formája az I DNS-szekvencia (képlete a mellékletben), amely a lúgos foszfatáz preszekvencióját és az érett protein további 5 aminosavát kódolja. Az I DNS-szekvencia megfelel a lúgos foszfatáz természetes szekvenciája néhány ⁴ 5 triplett-variációjának - mégpedig olyan variációknak, amelyek szinguláris restrikciós enzim hasítási helyeket vezetnek be és a GTG startkodont ATG-vel helyettesítik. A kódoló szól végén az EcoR I restrikciós endo- £0 nukleóznak megfelelő, .kiálló' DNS-szekvencia van, amely lehetővé teszi a szokásos klónozó vektorokba, például a kereskedelemben kapható pBR 322, pUC 8 vagy pUC 12 plazmidokba történő beépítést. Az I. DNS-szek- 55 vencia génjének belsejében további szinguláris restrikciós enzim hasítási helyek vannak, amelyek lehetővé teszik egyrészt heterológ gének csatolását a megfelelő helyekre és a kívánt leolvasó vázszerkezet szerint, más- 60 részt a variációk megvalósítását, ezek a hasítási helyek a kővetkezők:

Restrikciós	A kódoló szól nukleotid
enzim	sorszáma, amely után a hasítási hely következik
Sau 3 A	19
Pvu I	22
Hpa II	54)
	(A természetes génben
Nci I	54) is előfordul)
Alu I	66
Hph I	68
Ava II	70

Magától értetődően lehetséges az is, hogy a .kiálló szekvenciát úgy konstruáljuk, hogy különböző restrikciós enzimeknek is megfeleljen, és ezzel az alkalmas vektorokba meghatározott orientációval történő beépítés lehetővé váljon. A szakembernek ebben az esetben mérlegelnie kell, mi a munkaigényesebb, a gén megszerkesztése és meghatározott módon történő beépítése, vagy a járulékos szétválasztás, amelyet a .kiálló' végek azonossága esetén a kétféle orientációs irányban történő beépülés eredményez.

Az I DNS-szekvencia egyenként 26-31 bázist tartalmazó hat oligonukleotidből felépíthető. Az egyes oligonukleotideket kémiailag szintetizáljuk és a hat nukleotid .sticky end'-jeit enzimatikusan csatoljuk. A szintetikus gén beépítése a klónozó vektorokba, például az előbbiekben említett, kereskedelemben kapható plazmidokba, már ismert módon történik.

Egy eukariotikus gén E. coliban, a találmány szerinti preszekvencia segítségével történő expressziójára példaként a következőkben a majom-proinzulin szintézisét Írjuk le: Olyan DNS-szekvenciát szerkesztünk, amelynél a bakteriális promotorból, lac-operátorból és riboszómatikus kötési helyből álló kémiai-szintetikus szabályozási tartomány (P 3 430 683.8 sz. NSZK-beli szabadalmi bejelentés) mögött a riboszóma-kötési hely 6-14 nukleotidját eltávolítjuk, az EcoR I csatlakozó felismerési helyére az I DNS-szekvenciát és erre illesztve a proinzulin gént [W. Wetekam és társai: Gene 19 (1982) 179-183. p.] helyezzük el. Az exprimált proinzulin fúziós peptid az amino-végen még 9 kiegészítő aminosavat tartalmaz, amelyek enzimatikusan vagy kémiailag lehasithatók.

A szintetikus gén pUC 8-ba történő beépítése, valamint az eukariotikus gént az I DNS-szekvenciához csatolva tartalmazó expressziós plazmidok konstrukciója már ismert módon történik. Itt Maniatis tankönyvére utalhatunk (Maniatis és társai: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1982). A kapott hibridplazmidok transzformációja alkalmas gazdaszervezetekbe, előnyösen E. coliba, hasonlóképpen ismert és az előzőekben említett tankönyv részletesen tárgyalja. Az exprimált proteinek kinyerése és tisztítása is ismert és leirt módon történik.

A következő példákban a találmány néhány megvalósítási módját ismertetjük. A szakember számára önként adódik a példákból kiindulva nagyszámú egyéb lehetséges változat és kombináció. A százalékos adatok tömegszázalékban értendők, ha más nincs megadva.

Példák

1. Egyszálú oligonukleotid kémiai szintézise

A kódoló szál 1-29 sorszámú nukleotidjait tartalmazó, la jelű génrészlet példájával mutatjuk be a génrészletek szintézisét. Az M.J. Gait és társai: Nucleic Acids Rés. 8 (1980) 1081-1096. o. irodalmi közleményben leirt ismert módszerekkel a 3’-végen álló nukleozid, jelen esetben a guanozin (19. sorszámú nukleotid) és a Merck cég által gyártott FRACTOSIL márkanevű kovasav gél között a 3’-hidroxil csoport segítségével kovalens kötést hozunk létre. Ehhez a kovasavgélt átalakítjuk 3-(trietoxiszilil)-propil-aminnal, amikor is etanol-képződés mellett Si-O-Si kötések jönnek létre. A guanozint N²’-izobutiril-3’-0-szukcinoil-5’-dimetoxi-tritil-éterként para-nitro-fenol és N,N’-diciklohexil-karbo-diimid jelenlétében a modifikált hordozóval reagáltatjuk, ekkor a szukcinoil-csoport szabad karboxil-csoportja a propil-amin-csoport amino-csoportjával reagál.

A szintézis következő lépéseinél a bázikus komponenseket 5’-0-dimetoxi-tritil-nukleozid-3’-foszforossav-monometilészter-dialkil-amid vagy -klorid, és emellett az adenint N⁶-benzoil-vegyület, a citozint N⁴-benzoil vegyület, a guanint N^izobutiril-vegyület formájában és az amino-csoportot nem tartalmazó timint védő csoport nélkül alkalmazzuk.

A polimer hordozó 50 mg-ját, amely 2 Mmol megkötött guanozint tartalmaz, egymás utén a kővetkező reagensekkel kezeljük:

a) nitro-metán,

b) telített 1 tömegX vizet tartalmazó nitro-meténos cink-bromid oldat,

c) metanol,

d) tetrahidrofurán,

e) acetonitril,

f) 40 umol megfelelő nukleozid-foszfit és

200 Mmol tetrazol 0,5 ml vízmentes acetonitrilben (5 percig),

g) 20 tömeg% ecetsavanhidrid tetrahidrofuránban 40 tömeg% lutidinnel és 10 tómegX dimetil-amino-piridinnel (2 percig),

h) tetrahidrofurán,

i) 20 tőmeg% vizet és 40 tömegX lutidint tartalmazó tetrahidrofurán,

j) 3 tömegX jód 5:4:1 térfogatarényú kollidin/vlz/tetrabidrofurán elegyben,

k) tetrahidrofurán,

l) metanol.

A .foszfit vegyület a fenti felsorolásban dezoxiribóz-3’-monofoszforossav-monometil-észter, és a foszforatom harmadik vegyértékét klóratom vagy tercier amino-csoport, például morfolinocsoport köti le.

Az egyes szintézis-lépések kitermelését a mindenkori detritiláló reakció (b) után a dimetoxi-tritil kation 496 nm hullámhosszon mért abszorpciójával tudjuk spektrofotometriásán meghatározni.

Az oligonukleotid szintézisének befejezése után az oligomer metil-foszfát védőcsoportjait p-tiokrezollal és trietanol-aminnal lehasítjuk. Ezt kővetően 3 órás ammóniás kezeléssel az oligonukleotidet eltávolítjuk a szilárd hordozóról. Az oligomer koncentrált ammóniával történő 2-3 napos kezelése során a bázisok amino-védő csoportjai kvantitatíve lehasadnak. Az így előállított nyers terméket nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárás-48 sál (HPLC) vagy poli(akril-amid)-os gélelektroforézissel tisztítjuk.

Teljesen azonos módon szintetizáljuk az Ib-If jelű génrészleteket is, amelyek nukleotid sorrendjét a II DNS-szekvencia képlete 5 (a mellékletben található) megadja.

2. Az egyszálú oligonukleotidek enzimatikus összekapcsolása I DNS-szekvenciá- 10 vá

Az la és If jelű, véghelyzetű oligonukleotidekét nem foszforiláljuk. Ezzel a kiálló végeken bekövetkező oligomerizációt kerüljük 15 el. Az lb, Ic, Id és le oligonukleotideket a következők szerint foszforizáljuk. Az egyes oligomerekböl 1 nmol-t 5 nmoí adenozin-trifoszfáttal és négy egység T4-polinukleotid-kinázzal 20 μΐ 50 mmol trisz-HCl-puffert 20 (pH=7,6), 10 mmol magnézium-kloridot és mmol ditio-treitolt (DTT) tartalmazó oldatban 30 percig 37 °C hőmérsékleten kezeljük.

Az enzimet ezután 95 °C hőmérsékleten 5 percig tartó hőkezeléssel dezaktiváljuk. 25

A kővetkező lépésben az la, lb, Ic, Id, le és If jelű oligonukleotideket egyesítjük és kettős szállá hibridizáljuk úgy, hogy 20 mmol-os KCl-oldatban felmelegítjük és lassan (kb. 2 órán keresztül) 16 °C hőmérsék- 30 letre lehűtjük. Az I DNS-szekvencia szerinti DNS-fragmenssé történő ligálás 100 egység T4-DNS-ligázzal, 40 μΐ 50 mmol trisz-HCl-puffert, 20 mmol magnézium-kloridot és 10 mmol DTT-t tartalmazó oldatban, 15 °C hőmérsékle- 35 ten, 18 órás reakció során következik be.

A génfragmenset gélelektroforézissel tisztítjuk 10%-os poli(akril-amid)-gélen (20x x40 cm, 1 mm vastag, karbamid adalék nélkül). A marker anyag Zxl74 DNS (a BRL cég 40 gyártmánya) Hinf I-el hasítva, vagy pBR 322 Hae ΠΙ-al hasítva.

3. A génfragmens beépítése pUC 8-ba 45

A kereskedelemben kapható pUC 8 plazmidot az előállító adatai szerint, ismert módon az EcoR I restrikciós endonukleázzal felnyitjuk. Az emésztési terméket 5%-os poli(ak- 50 ril-amid)-gélen, ismert módon, elektroforézissel szétválasztjuk és a DNS-t etídium-bromiddal megszinezve vagy radioaktív jelzéssel (.Nick-transzláció” Maniatis szerint, a már hivatkozott tankönyv alapján) láthatóvá tesz- 55 szűk. A plazmideávot az akril-amid gélből kivágjuk és elektroforetikusan a poli(akril-amid)-ról leválasztjuk.

4. Az I DtJS-szekvenécia beépítése egy expressziös plazmidba

A pWI 6 expressziös plazmidot a majom-proinzulin számára szóló információs tarta- 65 6 lommal a kővetkezők szerint szerkesztjük meg:

pg pBR 322 plazmidot az Eco RI/Pvu Π restrikciós endonukleázokkal megemésztetük és ezt követően .fill-in'-reakcióban Klenow-polimerázzal az Eco Rí hasitási helyet betölt jük. Az 5%-os poli(akril-amid)-gélen történő gélelektroforézises szétválasztás után a 2293 Bp hosszúságú plazmidfragmenset elektroelúcióval kinyerjük (1. ábra). A Wetekam és társai: Gene 19 (1982) 179-Γ83. oldal irodalmi közleményben leírt majom-preproinzulin-DNS-t tartalmazó pBR 322 plazmidból Hind III és Mst I restrikciós endonukleázokkal megemésztetve izoláljuk a majompreproinzulin-DNS-t (1250 Bp hosszúságú fragmensként) és a pUC 9 plazmidba a következők szerint reklónozzuk: A pUC plazmidot Bam Hl enzimmel hasítjuk, a hasítás helyett szabványos .fill-in' reakcióban Klenow- polimerázzal (.large fragmenf) betölt jük, Hind III restrikciós enzimmel utánhasitjuk és a DNS-t az egyéb DNS-fragmenésektől 5%-os polÍ-(akril-amid)-gélen gélelektroforetikusan elválasztjuk. A nyitott plazmidba az izolált, kb. 1250 Bp hosszúságú inzulin-DNS-fragmenst beépítjük.

Az .untranslated region' és a preszekvencia leválasztásához a fentiek szerint modifikált pUC 9 plazmidot Hae ΠΙ-mal megemésztetjük és a 143 Bp hosszúságú fragmenset. a preszekvencia utolsó két nukleotidjének lehasitasa érdekében Bal 31 enzimmel megemésztetjük. igy az amino-végen első ködönként a TTT áll, amely a B-lánc első aminosavjaként a fenil-alanint kódolja.

Ehhez a fragmenshez .blunt end' típusú ligálö reakcióval Eco Ri-re specifikus adaptert ligálunk:

a) 5’ AAT TAT GAA TTC GCA ATG

Eco Rí TA CCT AAG CGT TAC

b) 5’ AAT TAT GAA TTC GCA AGA

Eco Ri TA CTT AAG CGT TCT

Annak érdekében, hogy az adapterok polimerizációját elkerüljük, ezeket a ligálö reakcióban foszforilálatlanul alkalmazzuk (amelyet a mellékelt ábrákban Eco Ri‘ szimbólummal jelöltünk, ugyanúgy mint a betöltéssel inaktívak felismerési helyeket). Az a) jelű adapter végén metionint, a b) jelű adapter végén arginint kódoló kodon van.

Az a) változattal olyan génterméket kapunk, amelynél a bakteriális rész leválasztása bróm-ciános hasítással lehetséges, a b) változat viszonL tripszines hasítást tesz lehetővé.

A ligáit terméket Mbo Π-vel emésztetjük nn?g. A gélelektroforézises szétválasztás után egy 79 Bp DNA-fragmenst kapunk, amely a B-lánc 1-21 sorszámú aminosavainak információját tartalmazza.

A proinzulin molekula maradék információjának génjét (beleértve a klónozásból eredő G-C-szekvenciét és a pBR 322-ből eredő 21 Bp hosszúságú részt a stop-kodonhoz

-510 'csatlakozóan) a teljes majom-preproinzulin információt tartalmazó pUC 9 plazmidból nyerjük MbO II/Sma I-el történő emésztéssel és a 240 BP hosszúságú DNS-fragmens izolálásával. A két proinzulin-fragmens Ugatásával 5 kapjuk a 320 Bp hosszúságú, helyes ligálási terméket (a 18 Bp hosszúságú adapterral együtt). Az így szerkesztett proinzulin-DNS-fragmenset az Eco RI-negatív hasítási helyen most már egy szabályozási tartománnyal 10 is ligálhatjuk.

A reakció teljes menetét a 2. ábrán tüntettük fel, ahol A, B és C jelentése: a proinzulin molekula egyes peptidtáncai, Ad jelentése: az a) vagy b) jelű (defoszforilált) 15 adapter és Prae jelentése: a majom preproinzulin preszekvenciáját kódoló DNS.

Egy kémiai-szintetikus szabályozási tartományt - amely tartalmaz egy Bam Hl felismerési helyet, egy lac-operátort (0), egy 20 bakteriális promotort (P), egy ATG start-kodonnal rendelkező, 6-14 nukleotiddel megrövidített riboszómális kötési helyet (RB) és ehhez csatlakozó Eco RI felismerési helyet (3. ábra szerint) - ligálunk az előzőekben leír- 25 tak szerint előállított proinzulin-fragmenshez a közös Eco RI átfedési tartománynál.

Előnyős a kővetkező szintetikus szabályozási tartományt alkalmazzuk (a 2. táblázatból a lia jelű DNS-szekvencia, a P 34 30 683.8 sz. NSZK-beli szabadalmi bejelentésnek megfelelően):

5’ GATCCTAAATAAATTCTTGACATTTTTTAAA 3’

3’ GATTTATTTAAGAACTGTAAAAAATTT 5’ (Bam Hl) P

5’ TAATTTGGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCG 3’

3’ ATTAAACCATATTACACACCTTAACACTCGC 5’

5’ GAATAACAATTTCACAGAGGATCTAG 3’

3’ CTTATTGTTAAAGTGTCTCCTAGATCTTAA 5’ ' RB (Eco RI)

Ugyanígy alkalmazhatjuk a Táblázatban feltüntetett többi szintetikus szabályozási tartományt is. De az is lehetséges, hogy a szakirodalomban leírt természetes vagy levezetett (Perlman és társai előzőekben hivatkozott irodalmi közleménye) szignálszekvenciákat alkalmazzuk.

Táblázat

Szintetikus szabályozási tartomány (kódoló szál):

5’ GGATCCTAAATAAATTCTTGACATT1TTAA2TAATTTGGTATAATGT3T

4GAATTG5GAGCG6T7ACAATT8C9C10G11G12T13TA14TT15 (ATG) 3’

1=T vagy G

2=A vagy C

3=G vagy C

4=G vagy A

5=T vagy C

6=C, GA vagy GAA

Ila-h jelű DNS-szekvencia:

7=A vagy C

8=T vagy közvetlen kötés

9=A vagy TAGA

10=A, TTTAAA, AAGCTT vagy

AAGCTA 11=AG vagy GA

12=A vagy G

13=C vagy T

14=GAA vagy AGC

15=C vagy közvetlen kötés

	1	2	5	6	7	8
Ha	T	A	T	GAA	A	T
b	T	A	T	GAA	A	T
c	G	C	T	GAA	A	T
d	G	C	T	GAA	A	-
e	G	C	c	GAA	A	-
f	G	C	T	C	C	-
g	G	C	T	GA	C	-
h	G	C	T	GA	C	—
A	Sma	I/Bam	Hl enzimekkel	történő	két-
szeres	emésztés után a	Bam Hl	hasítási	he-

10	11	12	13	14	15	3=G
A	AG	A	C	GAA	C	4=G
TTTAAA	AG	A	C	GAA	C	9=A
TTTAAA	AG	A	C	GAA	C
AAGCTT	AG	A	C	GAA	C
AAGCTT	AG	A	C	GAA	C
AAGCTT	AG	A	C	GAA	c
AAGCTT	AG	A	C	GAA	c
AAGCTA	GA	G	T	AGC	—
A	HB 101	E.	coli törzsben történő	sze-
lekció	után a	plazmid-DNS	egyedi	kiónjait a

lyet Klenow-fragmenssel .fill-in reakcióban betöltjük és a ligálás termékét (kb. 420 Bp hosszú) gélelektroforézissel izoláljuk.

Az így előállított fragmenset .blunt-end lig átás sál az 1. ábra szerinti pBR 322 részplazmidhoz ligáljuk (4. ábra), igy kapjuk a pWI 6 hibridplazmidot.

szabályozási tartományt tartalmazó 420 Bp 60 hosszúságú fragmens és a Bal 31-el lerövidített proinzulingén integrációjára vizsgáljuk.

A Bal 31-el történt helyes proinzulingén-rővidités (2. ábra) kimutatására a plazmidokat az integrált proinzulin fragmenssel az Eco RI 65 hasítási helytől kiindulva szekventáljuk. 60 7

-612 szekventált klón közül 3 tartalmazta a két nukleotid kívánt rövidített változatát (4. ábra).

Pg PWI 6 plazmidot Eco Rí restrikciós enzimmel hasltunk és ezt követően 30 ng I DNS-szekvencia jelenlétében 16 °C hőmérsékleten 6 órán keresztül ligáljuk. A HB 101 E. coli törzsben történő transzformáció után az egyedi kiónok közül a plazmidokat izoláljuk és restrikciós enzim-analízissel az I. DNS-szekvencia beépülését vizsgáljuk. Az összes kiónok 7%-a az I. DNS-szekvenciát integrált pWI 6 plazmid.

Az integrációs reakció irányítottságát a restrikciós enzim-analízis szabványos módszereivel a Hind ΠΙ/Pvu I-el történt kétszeres emésztés alapján egyértelműen meghatározhatjuk.

A proinzulinhez viszonyítva helyes leolvasási irányítottsággal beépült I DNS-szekvenciát tartalmazó pWI 6 plazmidot pWIP 1 jelöléssel az 5. ábrán tüntettük fel.

Ezt a plazmidot különböző E. coli törzsekbe transzformálva az egyes törzsek szintézis-kapacitását meghatározhatjuk.

A preszekvencia-proinzulin fúzió E. coliban történő expresszióját a következők szerint határozzuk meg:

ml IPTG-vel (izopropil-j3-D-tiogalakto-piranozid) indukált baktérium kultúrát OD6űo=1,0 optikai sűrűségnél és 1 órás indukciós idő után 5.10⁴ mól koncentrációnál PMSF-el (fenil-metil-szulfonil-fluorid) leállítunk, jégben lehűtjük és lecentrifugáljuk. A kicsapódott sejteket 1 ml puffer-oldattal (10 mmól tris-HCl, pH=7,6; 40 mmól NaCl) mossuk, centrifugáljuk és 200 pl puffer-oldatban (20 tömegX szacharóz, 20 mmól tris-HCl, pH=8,0; 2 mmól Edta) reszuszpendáljuk, 10 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk, lecentrifugáljuk és rögtön 500 pl kétszer desztillált vízben reszuszpendáljuk. Jégen 10 percig inkubáljuk, majd a .sokk-lizálf baktériumokat lecentrifugáljuk, a felette lévő részt befagyasztjuk. Ennek a .maradéknak* a proinzulin tartalmát standard-inzulin-RIA-ban (Amersham) meghatározzuk.

A kicsapódott baktériumokat még egyszer 200 pl lizozim-pufferban (20 tömegX szacharóz, 2 mg/ml lizozim, 20 nmól tris-HCl, pH=8,0, 2 mM EDTA) reszuszpendáljuk, 30 percig jégen inkubáljuk, 3-szor 10 percig ultrahanggal kezeljük és centrifugáljuk. A sejtek feletti rósz, azaz a plazma-frakció proinzulin tartalmát radioimmunoassay készülékben meghatározzuk.

A pWIP 1 plazmidot tartalmazó egyedi baktériumklónok szintézis-kapacitását és a proinzulin-preezekvencia termék transzport képességét megvizsgáltuk. Az elvárásoknak megfelelelóen az összes baktérium-klönnál a termelt proinzulin kb. 90%-a a periplazmati30 kus térbe transzportálódott.

A proinzulin RIA-aktivitás kb. 10 tömeg%-a még a plazma-frakcióban volt található.

-714

Melléklet

I DNS-szekvencia

Triplett sorszám:	1	2	3
Aminosav sorszám:				Met	Lys	Gin
Nukleotid sorszám:			5		10
Kódoló szál:	5’	AA	TTC	ATG	AAA	CAA
Nem kódoló szál:	3’		G	TAC	TTT	GTT

4	5	6	7	8	9	10	11	12	13
Ser	Thr	Ile	Alá	Leu	Alá	Leu	Leu	Pro	Leu
15	20		25		30	35		40
AGC	ACG	ATC	GCA	CTG	GCA	CTC	TTA	CCG	TTA
TCG	TGC	TAG	CGT	GAC	CGT	GAG	AAT	GGC	AAT
14	15	16	17	18	19	20	21	22	23
Leu	Phe	Thr	Pro	Val	Thr	Lys	Alá	Arg	Thr
45	50		55		60	65		70
CTG	TTT	ACC	CCG	GTG	ACA	AAA	GCT	CGG	ACC
GAC	AAA	TGG	GGC	CAC	TGT	TTT	CGA	GCC	TGG
24	25	26
Pro	Glu	Met
75	80		84
CCA	GAA	ATG	G		3’
GGT	CTT	TAC	CTT	AA	5’

II DNS-szekvencia

	4-				la					-►
5’	AA	TTC	ATG	AAA	CAA	AGC	ACG	ATC	GCA	CTG
3’	Eco RI	G	TAC	TTT	GTT	TCG	TGC - Ib —	TAG	CGT	GAC

Igca	CTC	TTA	CCG	-Ic- TTA	CTG	TTT
CGT	-ö^i	AAT	GGC	AAT	GAC	AAA


\|gtg	ACA	AAA	GCT	CGG	ACC	CCA
CAC	TGT I -p, 1	TTT 4-	CGA	GCC	TGG - If -	GGT

ACC CCG

TGG GGC

->Eco RI

GAA ATG G

CTT TAC CTT AA

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás szintetikus szignál-szekvencia előállítására proteinek transzportjára expressziós rendszerekben, amely szignál-szekvencia az E. coli lúgos foszfatáz enzimje természetes szignál-szekvenciájának aminosav-sor rend jét kódolja, azzal a kivétellel, hogy a DNS egy vagy több olyan, az endonukleázok számára hozzáférhető hasítási helyet tartalmaz, amely vagy amelyek a természetes DNS-ben nem találhatók meg, továbbá kodonokat tartalmaz a kifejezendő protein szerkezeti génjének aminosav-terminális kodonjaiból, azzal jellemezve, hogy a tárgyi kör szerinti szerkezetnek megfelelő dezoxiribonukleinsavakat kémiai úton összekapcsoljuk, vagy a szerkezet egy-egy részének megfelelő dezoxiribonukleinsavakat kémiai úton összekapcsoljuk, és az így kapott DNS-szekvencia részeket enzimatikus úton összekapcsoljuk.
2. Az l. igénypont szerinti eljárás olyan szignál-szekvencia előállításéra, amely a belső hasítási helyeket a szignál-szekvencia hidrofób tartománya előtt és/vagy után tar5 Lalmazza, azzal jellemezve, hogy a megfelelő dezoxiribonukleinsavakat összekapcsoljuk.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás olyan szignál-szekvencia előállítására, amely a 3’-végen a szerkezeti gén amino10 -terminális kodeinjaiból legfeljebb 40-et tartalmaz, azzal jellemezve, hogy a megfelelő dezoxiribonukleinsavakat összekapcsoljuk.
4. Eljárás eukariotikus, prokariotikus vagy virális proteinek kifejezésére, és a ki15 fejezett termék citoplazmából való transzportjára prokariotikus és eukariotikus sejtekben, azzal jellemezve, hogy a transzportálandó protein génjét az 1-3. igénypontok szerinti eljárással előállított szintetikus DNS20 -szekvenciához csatoljuk, a kapott fúziós gént egy vektorba építjük be, a vektorral egy gazdasejtet transzformálunk, a transzformáit gazdasejtet. tenyésztjük, és ily módon az exprimált. proteint a citoplazmából transz25 portóijuk.