JPH0622763A - 抗アレルギー性ペンタペプチドの多量体ペプチドをコードするｄｎａ - Google Patents
抗アレルギー性ペンタペプチドの多量体ペプチドをコードするｄｎａInfo
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- JPH0622763A JPH0622763A JP2401005A JP40100590A JPH0622763A JP H0622763 A JPH0622763 A JP H0622763A JP 2401005 A JP2401005 A JP 2401005A JP 40100590 A JP40100590 A JP 40100590A JP H0622763 A JPH0622763 A JP H0622763A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】アミノ酸配列がAsp-Ser-Asp-Gly-Lys （一文字
表記でＤＳＤＧＫ）である抗アレルギー性ペンタペプチ
ドを大量に製造するために、遺伝子組換え技術によりＤ
ＳＤＧＫ多量体ペプチドをコードするＤＮＡを提供す
る。 【構成】ＤＳＤＧＫをコードする塩基配列（Ｐ及びＱで
示す）を繰り返し単位として、この繰り返し単位の２以
上からなる一本鎖ＤＮＡと、それに相補的な一本鎖ＤＮ
Ａを混合し、冷却し、ＤＮＡポリメラーゼ存在下で４種
の塩基を反応させ、加熱し、あるいは更にそれらの反応
の一部を繰り返すことによって、同一鎖上にＤＳＤＧＫ
をコードする塩基配列を繰り返し多数有するＤＮＡ鎖を
作製する。
表記でＤＳＤＧＫ）である抗アレルギー性ペンタペプチ
ドを大量に製造するために、遺伝子組換え技術によりＤ
ＳＤＧＫ多量体ペプチドをコードするＤＮＡを提供す
る。 【構成】ＤＳＤＧＫをコードする塩基配列（Ｐ及びＱで
示す）を繰り返し単位として、この繰り返し単位の２以
上からなる一本鎖ＤＮＡと、それに相補的な一本鎖ＤＮ
Ａを混合し、冷却し、ＤＮＡポリメラーゼ存在下で４種
の塩基を反応させ、加熱し、あるいは更にそれらの反応
の一部を繰り返すことによって、同一鎖上にＤＳＤＧＫ
をコードする塩基配列を繰り返し多数有するＤＮＡ鎖を
作製する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、アスパラギン酸(Asp)
−セリン(Ser) −アスパラギン酸(Asp) −グリシン(Gl
y) −リジン(Lys) の５個のアミノ酸配列からなるペプ
チド（以下、DSDGK と略す。）の多量体ペプチドをコー
ドする塩基配列を含むＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベ
クター及び該組換えベクターにより形質転換された大腸
菌に関するものである。本発明は発酵工業、医薬品工業
などの分野に有効に利用されるものである。
−セリン(Ser) −アスパラギン酸(Asp) −グリシン(Gl
y) −リジン(Lys) の５個のアミノ酸配列からなるペプ
チド（以下、DSDGK と略す。）の多量体ペプチドをコー
ドする塩基配列を含むＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベ
クター及び該組換えベクターにより形質転換された大腸
菌に関するものである。本発明は発酵工業、医薬品工業
などの分野に有効に利用されるものである。
【０００２】
【従来の技術】DSDGK は、抗アレルギー性ペプチドの一
種であり、ケミカルメディエーターに起因して発症する
アレルギー性鼻炎、アレルギー性皮膚炎、気管支喘息及
びその他のアレルギー性疾患の予防薬及び治療薬として
の利用が期待される興味深い生理活性ペプチドである
（特開平1-316398号公報）。
種であり、ケミカルメディエーターに起因して発症する
アレルギー性鼻炎、アレルギー性皮膚炎、気管支喘息及
びその他のアレルギー性疾患の予防薬及び治療薬として
の利用が期待される興味深い生理活性ペプチドである
（特開平1-316398号公報）。
【０００３】アミノ酸数の少ないオリゴペプチドの製造
方法としては、通常、化学合成法が知られているが、近
年は遺伝子組換え技術によっても製造されるようになっ
た。その一般的な手法は、目的のペプチドをコードする
ＤＮＡを含むプラスミドを大腸菌等の宿主に導入し、宿
主に目的のペプチドを生産させる方法である。
方法としては、通常、化学合成法が知られているが、近
年は遺伝子組換え技術によっても製造されるようになっ
た。その一般的な手法は、目的のペプチドをコードする
ＤＮＡを含むプラスミドを大腸菌等の宿主に導入し、宿
主に目的のペプチドを生産させる方法である。
【０００４】しかし、DSDGK を遺伝子組換え技術により
効率的に製造するためのDSDGK の多量体をコードするＤ
ＮＡ、それを含むベクター等については全く知られてい
ない。
効率的に製造するためのDSDGK の多量体をコードするＤ
ＮＡ、それを含むベクター等については全く知られてい
ない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、DSDGK を遺
伝子組換え技術により効率的かつ多量に製造するために
用いられるDSDGK を複数個コードするＤＮＡ、それを含
むベクターおよび該ベクターで形質転換された大腸菌を
提供することにある。そして、本発明は同一鎖上にペプ
チドを繰り返し多数コードするＤＮＡ鎖を容易に調製す
る新規方法を用いることにり達成できた。
伝子組換え技術により効率的かつ多量に製造するために
用いられるDSDGK を複数個コードするＤＮＡ、それを含
むベクターおよび該ベクターで形質転換された大腸菌を
提供することにある。そして、本発明は同一鎖上にペプ
チドを繰り返し多数コードするＤＮＡ鎖を容易に調製す
る新規方法を用いることにり達成できた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】すなわち本発明は、アス
パラギン酸−セリン−アスパラギン酸−グリシン−リジ
ンのアミノ酸配列を有する抗アレルギー性ペンタペプチ
ドの多量体ペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡ
に関する。
パラギン酸−セリン−アスパラギン酸−グリシン−リジ
ンのアミノ酸配列を有する抗アレルギー性ペンタペプチ
ドの多量体ペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡ
に関する。
【０００７】この塩基配列としては、例えば下記の塩基
配列が挙げられる。 GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAG
配列が挙げられる。 GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAG
【０００８】上記抗アレルギー性ペンタペプチドの多量
体ペプチドをコードする塩基配列としては、下記の塩基
配列も挙げられる。 GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAG ACT CTG AGC AAG ACC GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAG ACT CTG AGC AAG ACC GCT
体ペプチドをコードする塩基配列としては、下記の塩基
配列も挙げられる。 GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAG ACT CTG AGC AAG ACC GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAG ACT CTG AGC AAG ACC GCT
【０００９】さらに本発明は、上記ＤＮＡをベクターに
組み込んだ組換えベクターに関するものでもある。
組み込んだ組換えベクターに関するものでもある。
【００１０】上記組換えベクターには、大腸菌において
安定に複製され、宿主である大腸菌にアンピシリン耐性
を与える組換えプラスミドが含まれる。
安定に複製され、宿主である大腸菌にアンピシリン耐性
を与える組換えプラスミドが含まれる。
【００１１】さらに上記組換えベクターには、プラスミ
ド pUC119の制限酵素HincII切断部位に下記の塩基配列
が挿入された構造を有する組換えプラスミドp1-9が含ま
れる。なお、p1-9はpUC119に対し抗アレルギー性ペンタ
ペプチドの多量体ペプチドをコードする塩基配列が、pU
C119上のlac プロモーターの方向とは逆方向に挿入され
た構造となっている。下記の塩基配列は抗アレルギー性
ペンタペプチドの多量体ペプチドをコードするＤＮＡ鎖
側の塩基配列を５’末端側から記載した塩基配列であ
る。 GACTCTGACG GCAAAGATTC CGATGGTAAA GATTCCGATG GTAAAGACTC TGACGGCAAA GATTCCGATG GTAAAGATTC CGATGGTAAA GACTCTGACG GCAAAGATTC CGATGGTAAA GATTCCGATG GTAAAGACTC TGACGGCAAA GATTCCGATG GTAAAGATTC CGATGGTAAA GACTCTGACG GCAAAGATTC CGATGGTAAA GATTCCGATG GTAAGACTCT GAGCAA
ド pUC119の制限酵素HincII切断部位に下記の塩基配列
が挿入された構造を有する組換えプラスミドp1-9が含ま
れる。なお、p1-9はpUC119に対し抗アレルギー性ペンタ
ペプチドの多量体ペプチドをコードする塩基配列が、pU
C119上のlac プロモーターの方向とは逆方向に挿入され
た構造となっている。下記の塩基配列は抗アレルギー性
ペンタペプチドの多量体ペプチドをコードするＤＮＡ鎖
側の塩基配列を５’末端側から記載した塩基配列であ
る。 GACTCTGACG GCAAAGATTC CGATGGTAAA GATTCCGATG GTAAAGACTC TGACGGCAAA GATTCCGATG GTAAAGATTC CGATGGTAAA GACTCTGACG GCAAAGATTC CGATGGTAAA GATTCCGATG GTAAAGACTC TGACGGCAAA GATTCCGATG GTAAAGATTC CGATGGTAAA GACTCTGACG GCAAAGATTC CGATGGTAAA GATTCCGATG GTAAGACTCT GAGCAA
【００１２】さらに上記組換えベクターには、プラスミ
ドpUC118の制限酵素HincII，HindIII 切断部位間の１６
塩基の塩基配列と下記の塩基配列を置換した構造を有す
る組換えプラスミドp28X-1が含まれる。 GACTCTGACG GCAAAGATTC CGATGGTAAA GATTCCGATG GTAAAGACTC TGACGGCAAA GATTCCGATG GTAAAGATTC CGATGGTAAA GACTCTGACG GCAAAGATTC CGATGGTAAA GATTCCGATG GTAAAGACTC TGACGGCAAA GATTCCGATG GTAAAGATTC CGATGGTAAA GACTCTGACG GCAAAGATTC CGATGGTAAA GATTCCGATG GTAAGACTCT GAGCAAGACC GACTCTGACG GCAAAGATTC CGATGGTAAA GATTCCGATG GTAAAGACTC TGACGGCAAA GATTCCGATG GTAAAGATTC CGATGGTAAA GACTCTGACG GCAAAGATTC CGATGGTAAA GATTCCGATG GTAAAGACTC TGACGGCAAA GATTCCGATG GTAAAGATTC CGATGGTAAA GACTCTGACG GCAAAGATTC CGATGGTAAA GATTCCGATG GTAAGACTCT GAGCAAGACC GCTTAATTAA TTAAGCGCTT AATTAATTAA GCGCTTAATT AATTAAGCGG CATGCAAGCT CCTCGAGG
ドpUC118の制限酵素HincII，HindIII 切断部位間の１６
塩基の塩基配列と下記の塩基配列を置換した構造を有す
る組換えプラスミドp28X-1が含まれる。 GACTCTGACG GCAAAGATTC CGATGGTAAA GATTCCGATG GTAAAGACTC TGACGGCAAA GATTCCGATG GTAAAGATTC CGATGGTAAA GACTCTGACG GCAAAGATTC CGATGGTAAA GATTCCGATG GTAAAGACTC TGACGGCAAA GATTCCGATG GTAAAGATTC CGATGGTAAA GACTCTGACG GCAAAGATTC CGATGGTAAA GATTCCGATG GTAAGACTCT GAGCAAGACC GACTCTGACG GCAAAGATTC CGATGGTAAA GATTCCGATG GTAAAGACTC TGACGGCAAA GATTCCGATG GTAAAGATTC CGATGGTAAA GACTCTGACG GCAAAGATTC CGATGGTAAA GATTCCGATG GTAAAGACTC TGACGGCAAA GATTCCGATG GTAAAGATTC CGATGGTAAA GACTCTGACG GCAAAGATTC CGATGGTAAA GATTCCGATG GTAAGACTCT GAGCAAGACC GCTTAATTAA TTAAGCGCTT AATTAATTAA GCGCTTAATT AATTAAGCGG CATGCAAGCT CCTCGAGG
【００１３】さらに本発明は、上記組換えベクターによ
り形質転換された大腸菌に関するものでもある。
り形質転換された大腸菌に関するものでもある。
【００１４】本発明の抗アレルギー性ペンタペプチドの
多量体ペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡは、
次の(a)〜(f)の手順による方法を用いて調製した。 (a) ペプチドをコードする塩基配列を繰り返し単位とし
て、この繰り返し単位の２以上から成る一本鎖ＤＮＡと
それに相補的な一本鎖ＤＮＡを混合し、(b）保温、冷却
して、両ＤＮＡ鎖が少なくとも１繰り返し単位以上ずれ
て相補する二本鎖ＤＮＡを生成させ、(c) デオキシアデ
ノシン５’−三リン酸(dATP)、デオキシシチジン５’−
三リン酸(dCTP)、デオキシグアノシン５’−三リン酸(d
GTP)及びデオキシチミジン５’−三リン酸(dTTP)（以
下、４種の塩基と略す。）をＤＮＡポリメラーゼの存在
下で反応させて一本鎖ＤＮＡ領域の相補鎖を合成して二
本鎖ＤＮＡとし、(d) 加熱して、一本鎖ＤＮＡと、それ
に相補的な一本鎖ＤＮＡに解離させ、(e) 上記(b) から
(d) の操作を少なくとも１回以上行い、(f) 上記(b) 及
び(c) の操作を行う。
多量体ペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡは、
次の(a)〜(f)の手順による方法を用いて調製した。 (a) ペプチドをコードする塩基配列を繰り返し単位とし
て、この繰り返し単位の２以上から成る一本鎖ＤＮＡと
それに相補的な一本鎖ＤＮＡを混合し、(b）保温、冷却
して、両ＤＮＡ鎖が少なくとも１繰り返し単位以上ずれ
て相補する二本鎖ＤＮＡを生成させ、(c) デオキシアデ
ノシン５’−三リン酸(dATP)、デオキシシチジン５’−
三リン酸(dCTP)、デオキシグアノシン５’−三リン酸(d
GTP)及びデオキシチミジン５’−三リン酸(dTTP)（以
下、４種の塩基と略す。）をＤＮＡポリメラーゼの存在
下で反応させて一本鎖ＤＮＡ領域の相補鎖を合成して二
本鎖ＤＮＡとし、(d) 加熱して、一本鎖ＤＮＡと、それ
に相補的な一本鎖ＤＮＡに解離させ、(e) 上記(b) から
(d) の操作を少なくとも１回以上行い、(f) 上記(b) 及
び(c) の操作を行う。
【００１５】これを、図１を使って説明すると次のよう
になる。図１中、(1) 及び(2) は、「ペプチドをコード
する塩基配列を繰り返し単位として、この繰り返し単位
の２以上から成る一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖
ＤＮＡ」を示す。P 、Q はいずれもペプチドをコードす
る塩基配列、P'、Q'はそれぞれP 、Q の相補的な配列で
ある。
になる。図１中、(1) 及び(2) は、「ペプチドをコード
する塩基配列を繰り返し単位として、この繰り返し単位
の２以上から成る一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖
ＤＮＡ」を示す。P 、Q はいずれもペプチドをコードす
る塩基配列、P'、Q'はそれぞれP 、Q の相補的な配列で
ある。
【００１６】(1) 及び(2) の２本の一本鎖ＤＮＡを保温
・冷却する、つまり、70〜 100℃まで加熱した後、ゆる
やかに冷却すると、一本鎖ＤＮＡ中の相補鎖形成に関わ
る領域の組合せの違いにより、複数種類の二本鎖ＤＮＡ
が生成する。すなわち、末端が平滑となるようにそれぞ
れの一本鎖ＤＮＡが相補した二本鎖ＤＮＡのほかに、一
本鎖ＤＮＡがずれて相補し、末端が平滑とはならない二
本鎖ＤＮＡが生成する。その一例が(3) の二本鎖ＤＮＡ
である。ここでは、ずれて相補し末端が平滑ではない二
本鎖ＤＮＡを利用する。
・冷却する、つまり、70〜 100℃まで加熱した後、ゆる
やかに冷却すると、一本鎖ＤＮＡ中の相補鎖形成に関わ
る領域の組合せの違いにより、複数種類の二本鎖ＤＮＡ
が生成する。すなわち、末端が平滑となるようにそれぞ
れの一本鎖ＤＮＡが相補した二本鎖ＤＮＡのほかに、一
本鎖ＤＮＡがずれて相補し、末端が平滑とはならない二
本鎖ＤＮＡが生成する。その一例が(3) の二本鎖ＤＮＡ
である。ここでは、ずれて相補し末端が平滑ではない二
本鎖ＤＮＡを利用する。
【００１７】この(3) の二本鎖ＤＮＡに４種の塩基をク
レノーフラグメントやTaq ポリメラーゼ等のＤＮＡポリ
メラーゼの存在下で反応させると、二本鎖ＤＮＡの末端
部分の一本鎖ＤＮＡ領域の相補鎖が合成されて(4) の二
本鎖ＤＮＡが形成される。(4) の二本鎖ＤＮＡは、(1)
及び(2) の２本の一本鎖ＤＮＡが末端が平滑となるよう
相補した二本鎖ＤＮＡに比べ、(L) で示される分の長さ
だけＤＮＡ鎖が伸長している。伸長したＤＮＡ鎖の中に
はペプチドをコードする塩基配列である P及び Qが存在
しているので、ＤＮＡ鎖の伸長に伴い、ＤＮＡ鎖中に含
まれるペプチドをコードする塩基配列の数も増加するの
である。
レノーフラグメントやTaq ポリメラーゼ等のＤＮＡポリ
メラーゼの存在下で反応させると、二本鎖ＤＮＡの末端
部分の一本鎖ＤＮＡ領域の相補鎖が合成されて(4) の二
本鎖ＤＮＡが形成される。(4) の二本鎖ＤＮＡは、(1)
及び(2) の２本の一本鎖ＤＮＡが末端が平滑となるよう
相補した二本鎖ＤＮＡに比べ、(L) で示される分の長さ
だけＤＮＡ鎖が伸長している。伸長したＤＮＡ鎖の中に
はペプチドをコードする塩基配列である P及び Qが存在
しているので、ＤＮＡ鎖の伸長に伴い、ＤＮＡ鎖中に含
まれるペプチドをコードする塩基配列の数も増加するの
である。
【００１８】この(4) の二本鎖ＤＮＡを加熱すると、こ
の二本鎖ＤＮＡは(5) 及び(6) の２本の一本鎖ＤＮＡに
解離する。
の二本鎖ＤＮＡは(5) 及び(6) の２本の一本鎖ＤＮＡに
解離する。
【００１９】(5) 及び(6) の２本の一本鎖ＤＮＡを保温
・冷却すると、もとの(4) の二本鎖ＤＮＡのほかに、
(5) 及び(6) の２本の一本鎖ＤＮＡがずれて相補し、末
端が平滑ではない二本鎖ＤＮＡが生成する。その一例が
(7) の二本鎖ＤＮＡである。この(7) の二本鎖ＤＮＡに
４種の塩基をＤＮＡポリメラーゼの存在下で反応させる
と、二本鎖ＤＮＡの末端部分の一本鎖ＤＮＡ領域の相補
鎖が合成されて(8) の二本鎖ＤＮＡが生成する。(8) の
二本鎖ＤＮＡは(4) の二本鎖ＤＮＡに比べ、(M)で示さ
れる分の長さだけＤＮＡ鎖が伸長している。
・冷却すると、もとの(4) の二本鎖ＤＮＡのほかに、
(5) 及び(6) の２本の一本鎖ＤＮＡがずれて相補し、末
端が平滑ではない二本鎖ＤＮＡが生成する。その一例が
(7) の二本鎖ＤＮＡである。この(7) の二本鎖ＤＮＡに
４種の塩基をＤＮＡポリメラーゼの存在下で反応させる
と、二本鎖ＤＮＡの末端部分の一本鎖ＤＮＡ領域の相補
鎖が合成されて(8) の二本鎖ＤＮＡが生成する。(8) の
二本鎖ＤＮＡは(4) の二本鎖ＤＮＡに比べ、(M)で示さ
れる分の長さだけＤＮＡ鎖が伸長している。
【００２０】この(8) の二本鎖ＤＮＡを加熱すると、こ
のＤＮＡ鎖は(9) 及び(10)の２本の一本鎖ＤＮＡに解離
する。
のＤＮＡ鎖は(9) 及び(10)の２本の一本鎖ＤＮＡに解離
する。
【００２１】上記(5) 及び(6) の２本の一本鎖ＤＮＡ
に、保温・冷却、ＤＮＡポリメラーゼの存在下での４種
の塩基の反応及び加熱の処理サイクルを少なくとも１回
以上行い、次いで保温・冷却し、ＤＮＡポリメラーゼの
存在下で４種の塩基を反応させると、末端がさらに伸長
した二本鎖ＤＮＡが得られる。その一例が(11)の二本鎖
ＤＮＡである。伸長した部分のＤＮＡ鎖の中にはペプチ
ドをコードする塩基配列である P及び Qが存在している
ので、ＤＮＡ鎖の伸長に伴い、ＤＮＡ鎖中に含まれるペ
プチドをコードする塩基配列の数も増加する。
に、保温・冷却、ＤＮＡポリメラーゼの存在下での４種
の塩基の反応及び加熱の処理サイクルを少なくとも１回
以上行い、次いで保温・冷却し、ＤＮＡポリメラーゼの
存在下で４種の塩基を反応させると、末端がさらに伸長
した二本鎖ＤＮＡが得られる。その一例が(11)の二本鎖
ＤＮＡである。伸長した部分のＤＮＡ鎖の中にはペプチ
ドをコードする塩基配列である P及び Qが存在している
ので、ＤＮＡ鎖の伸長に伴い、ＤＮＡ鎖中に含まれるペ
プチドをコードする塩基配列の数も増加する。
【００２２】なお、通常の遺伝子操作技術を用いること
により、上記の方法で調製したＤＮＡを直列に多数連結
することもできる。本発明において、「アスパラギン酸
−セリン−アスパラギン酸−グリシン−リジンのアミノ
酸配列を有する抗アレルギー性ペンタペプチドの多量体
ペプチド」とは、ペンタペプチドDSDGK が複数個連続し
て連結したアミノ酸配列を含むペプチドをいう。
により、上記の方法で調製したＤＮＡを直列に多数連結
することもできる。本発明において、「アスパラギン酸
−セリン−アスパラギン酸−グリシン−リジンのアミノ
酸配列を有する抗アレルギー性ペンタペプチドの多量体
ペプチド」とは、ペンタペプチドDSDGK が複数個連続し
て連結したアミノ酸配列を含むペプチドをいう。
【００２３】また、「アスパラギン酸−セリン−アスパ
ラギン酸−グリシン−リジンのアミノ酸配列を有する抗
アレルギー性ペンタペプチドの多量体ペプチドをコード
する塩基配列」とは、DSDGK をコードする塩基配列が、
同一鎖上に直列に複数個存在する塩基配列をいう。この
塩基配列中のDSDGK をコードする塩基配列は必ずしも全
て同一でなくてもよい。
ラギン酸−グリシン−リジンのアミノ酸配列を有する抗
アレルギー性ペンタペプチドの多量体ペプチドをコード
する塩基配列」とは、DSDGK をコードする塩基配列が、
同一鎖上に直列に複数個存在する塩基配列をいう。この
塩基配列中のDSDGK をコードする塩基配列は必ずしも全
て同一でなくてもよい。
【００２４】DSDGK をコードする塩基配列の繰り返し回
数は、微生物によるタンパク質の生産性を低下させない
範囲内であれば多いほど望ましい。
数は、微生物によるタンパク質の生産性を低下させない
範囲内であれば多いほど望ましい。
【００２５】組換えベクターの作製に使用する親ベクタ
ーは、宿主において安定に複製されるプラスミドベクタ
ーやファージベクターを使用することができる。好まし
くは宿主として大腸菌を使用できるプラスミドベクター
がよく、さらに好ましくはアンピシリン耐性等の選択マ
ーカーを備えているものがよい。そして、それらの例と
しては、pBR322及びこのプラスミドを改良したプラスミ
ド等が挙げられる。
ーは、宿主において安定に複製されるプラスミドベクタ
ーやファージベクターを使用することができる。好まし
くは宿主として大腸菌を使用できるプラスミドベクター
がよく、さらに好ましくはアンピシリン耐性等の選択マ
ーカーを備えているものがよい。そして、それらの例と
しては、pBR322及びこのプラスミドを改良したプラスミ
ド等が挙げられる。
【００２６】
【実施例】以下、実施例により本発明を詳細に説明す
る。
る。
【００２７】実施例１
【００２８】抗アレルギー性ペンタペプチドをコードす
る塩基配列の繰り返しが１５であるＤＮＡ鎖を含む組換
えベクターの作製
る塩基配列の繰り返しが１５であるＤＮＡ鎖を含む組換
えベクターの作製
【００２９】(1) 繰り返し単位としてのペプチドをコー
ドする塩基配列（抗アレルギー性ペンタペプチドを直列
に３個コードする塩基配列）からなる一本鎖ＤＮＡの作
製
ドする塩基配列（抗アレルギー性ペンタペプチドを直列
に３個コードする塩基配列）からなる一本鎖ＤＮＡの作
製
【００３０】以下の１及び２に示す45塩基からなる２本
のオリゴヌクレオチドをホスホアミダイド法に従って化
学合成機（ミリジェン社製、7500型）で合成した。
のオリゴヌクレオチドをホスホアミダイド法に従って化
学合成機（ミリジェン社製、7500型）で合成した。
【００３１】 １．5'-GACTCTGACGGCAAAGATTCCGATGGTAAA GATTCCGATGGTAAA-3' ２．5'-TTTGCCGTCAGAGTCTTTACCATCGGAATC TTTACCATCGGAATC-3'
【００３２】これを減圧乾固後、エチレンジアミン４酢
酸２ナトリウム 1mMを含むpH 8.0の10mMトリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン（以下、トリスと略す。）−
塩酸緩衝液（以下、ＴＥ溶液という。）に溶解した。こ
の溶液の 260nmの吸光度を測定し、吸光度 1.0が20μg/
mlと仮定してオリゴヌクレオチドの濃度を測定した。エ
チレンジアミン４酢酸２ナトリウム 2mMとホウ酸0.089M
を含むpH 8.0の0.089Mトリス−ホウ酸溶液（以下、ＴＢ
Ｅ溶液という。）を緩衝液とし、7M尿素を含む16％ポリ
アクリルアミドゲル（アクリルアミドと N,N'-メチレン
ビスアクリルアミドの重量比を19:1とする。）を使用し
て、70〜 100μｇのオリゴヌクレオチドを電気泳動し
た。目的の大きさのオリゴヌクレオチドが存在するゲル
を切り出した後、スミスの拡散溶出法［Smith,H.O.; Me
thods in Enzymology, vol.65,p.371 (1980)］によりそ
れぞれのオリゴヌクレオチドを精製し、30μl のＴＥ溶
液に溶解し、一本鎖ＤＮＡ溶液とした。
酸２ナトリウム 1mMを含むpH 8.0の10mMトリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン（以下、トリスと略す。）−
塩酸緩衝液（以下、ＴＥ溶液という。）に溶解した。こ
の溶液の 260nmの吸光度を測定し、吸光度 1.0が20μg/
mlと仮定してオリゴヌクレオチドの濃度を測定した。エ
チレンジアミン４酢酸２ナトリウム 2mMとホウ酸0.089M
を含むpH 8.0の0.089Mトリス−ホウ酸溶液（以下、ＴＢ
Ｅ溶液という。）を緩衝液とし、7M尿素を含む16％ポリ
アクリルアミドゲル（アクリルアミドと N,N'-メチレン
ビスアクリルアミドの重量比を19:1とする。）を使用し
て、70〜 100μｇのオリゴヌクレオチドを電気泳動し
た。目的の大きさのオリゴヌクレオチドが存在するゲル
を切り出した後、スミスの拡散溶出法［Smith,H.O.; Me
thods in Enzymology, vol.65,p.371 (1980)］によりそ
れぞれのオリゴヌクレオチドを精製し、30μl のＴＥ溶
液に溶解し、一本鎖ＤＮＡ溶液とした。
【００３３】(2) 繰り返し単位の２以上からなる一本鎖
ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮＡの作製及びこれら
の混合
ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮＡの作製及びこれら
の混合
【００３４】精製した２本の一本鎖ＤＮＡを等量混合
し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにより各一本鎖ＤＮ
Ａの５’末端をリン酸化した。70℃で10分間加熱して酵
素を失活させた後、室温まで自然冷却した。これをライ
ゲーションして、一本鎖ＤＮＡどうしをホスホジエステ
ル結合で連結した。これをエタノール沈澱して二本鎖Ｄ
ＮＡを回収した。回収した二本鎖ＤＮＡは、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動することにより、繰り返し単位の
２以上の鎖長を有する二本鎖ＤＮＡであることを確認し
た。リン酸化、ライゲーション、エタノール沈澱及びポ
リアクリルアミドゲル電気泳動の操作は、モレキュラー
クローニング：ア ラボラトリー マニュアル（Mole
cular Cloning :A Laboratory Manual）［T.Maniatis,
E.F.Fritsch,J.Sambrook,eds., Cold Spring Harbor La
boratory (1982) 以下、マニアティスらの方法とい
う。］に従った。
し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにより各一本鎖ＤＮ
Ａの５’末端をリン酸化した。70℃で10分間加熱して酵
素を失活させた後、室温まで自然冷却した。これをライ
ゲーションして、一本鎖ＤＮＡどうしをホスホジエステ
ル結合で連結した。これをエタノール沈澱して二本鎖Ｄ
ＮＡを回収した。回収した二本鎖ＤＮＡは、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動することにより、繰り返し単位の
２以上の鎖長を有する二本鎖ＤＮＡであることを確認し
た。リン酸化、ライゲーション、エタノール沈澱及びポ
リアクリルアミドゲル電気泳動の操作は、モレキュラー
クローニング：ア ラボラトリー マニュアル（Mole
cular Cloning :A Laboratory Manual）［T.Maniatis,
E.F.Fritsch,J.Sambrook,eds., Cold Spring Harbor La
boratory (1982) 以下、マニアティスらの方法とい
う。］に従った。
【００３５】(3) 保温、冷却による、両ＤＮＡ鎖が少な
くとも１繰り返し単位以上ずれて相補する二本鎖ＤＮＡ
の生成
くとも１繰り返し単位以上ずれて相補する二本鎖ＤＮＡ
の生成
【００３６】90℃、75℃、50℃及び37℃の４個のインキ
ュベーターを用意した。上記(1) で得た一本鎖ＤＮＡ溶
液各７μｌから出発して、上記(2) の操作を経た二本鎖
ＤＮＡをＴＥ溶液45μｌに溶解後、90℃で２分間加熱し
て２本の一本鎖ＤＮＡに解離した。次いで75℃で５分
間、50℃で５分間、37℃で５分間と順次冷却して、少な
くとも１繰り返し単位以上ずれて相補する二本鎖ＤＮＡ
を取得した。
ュベーターを用意した。上記(1) で得た一本鎖ＤＮＡ溶
液各７μｌから出発して、上記(2) の操作を経た二本鎖
ＤＮＡをＴＥ溶液45μｌに溶解後、90℃で２分間加熱し
て２本の一本鎖ＤＮＡに解離した。次いで75℃で５分
間、50℃で５分間、37℃で５分間と順次冷却して、少な
くとも１繰り返し単位以上ずれて相補する二本鎖ＤＮＡ
を取得した。
【００３７】(4) ４種の塩基をＤＮＡポリメラーゼの存
在下で反応させることによる一本鎖ＤＮＡ領域の相補鎖
の合成
在下で反応させることによる一本鎖ＤＮＡ領域の相補鎖
の合成
【００３８】得られた二本鎖ＤＮＡに10倍濃度のシンセ
シス・バッファー（synthesis buffer）［dATP 5mM、dC
TP 5mM、dGTP 5mM、dTTP 5mM、ATP 10mM、塩化マグネシ
ウム50mM及びジチオトレイトール20mMを含むpH 7.4の10
0 mMトリス−塩酸緩衝液］を1/10容とクレノーフラグメ
ント（宝酒造社製）２ユニットを加え、37℃、20分間イ
ンキュベートして、上記(3) で得た二本鎖ＤＮＡ中に存
在する一本鎖ＤＮＡ領域の相補鎖を合成して二本鎖ＤＮ
Ａとした。
シス・バッファー（synthesis buffer）［dATP 5mM、dC
TP 5mM、dGTP 5mM、dTTP 5mM、ATP 10mM、塩化マグネシ
ウム50mM及びジチオトレイトール20mMを含むpH 7.4の10
0 mMトリス−塩酸緩衝液］を1/10容とクレノーフラグメ
ント（宝酒造社製）２ユニットを加え、37℃、20分間イ
ンキュベートして、上記(3) で得た二本鎖ＤＮＡ中に存
在する一本鎖ＤＮＡ領域の相補鎖を合成して二本鎖ＤＮ
Ａとした。
【００３９】(5) 加熱による一本鎖ＤＮＡとそれに相補
的な一本鎖ＤＮＡへの解離
的な一本鎖ＤＮＡへの解離
【００４０】上記(4) の反応液を90℃、２分間加熱し、
(4) で得られた二本鎖ＤＮＡを、一本鎖ＤＮＡとそれに
相補的な一本鎖ＤＮＡに解離した。
(4) で得られた二本鎖ＤＮＡを、一本鎖ＤＮＡとそれに
相補的な一本鎖ＤＮＡに解離した。
【００４１】(6) DSDGK をコードする塩基配列を繰り返
し多数有するＤＮＡ鎖の作製
し多数有するＤＮＡ鎖の作製
【００４２】上記(3)〜(5)からなるサイクルを15回を繰
り返した。クレノーフラグメントは各サイクルで加え、
10倍濃度のシンセシス・バッファー1/10容を５サイクル
毎に加えた。その後、上記(3)〜(4)の操作を行った。
り返した。クレノーフラグメントは各サイクルで加え、
10倍濃度のシンセシス・バッファー1/10容を５サイクル
毎に加えた。その後、上記(3)〜(4)の操作を行った。
【００４３】(7) 得られたＤＮＡ鎖のプラスミドベクタ
ーへの組み込み
ーへの組み込み
【００４４】上記(6) の反応液を70℃、10分間加熱して
酵素を失活させた。これを、制限酵素HincIIで切断後ア
ルカリ性フォスファターゼで処理したプラスミドベクタ
ーpUC119（宝酒造社製）とライゲーションして、ライゲ
ーション反応物を得た。
酵素を失活させた。これを、制限酵素HincIIで切断後ア
ルカリ性フォスファターゼで処理したプラスミドベクタ
ーpUC119（宝酒造社製）とライゲーションして、ライゲ
ーション反応物を得た。
【００４５】(8) 形質転換体の取得と組換えベクターの
解析
解析
【００４６】大腸菌の形質転換法（マニアティスらの方
法）に従い、上記(7) で得たライゲーション反応物を大
腸菌MV1184株（宝酒造社製プラスミドpUC118の宿主菌）
に取り込ませ、形質転換体を得た。得られた形質転換体
のうち１株を培養して組換えプラスミドを大量取得し
た。組換えプラスミドの大量取得は、マニアティスらの
方法に従った。
法）に従い、上記(7) で得たライゲーション反応物を大
腸菌MV1184株（宝酒造社製プラスミドpUC118の宿主菌）
に取り込ませ、形質転換体を得た。得られた形質転換体
のうち１株を培養して組換えプラスミドを大量取得し
た。組換えプラスミドの大量取得は、マニアティスらの
方法に従った。
【００４７】得られた組換えプラスミドをp1-9と命名
し、制限酵素EcoRI とHindIII で消化し、ＴＢＥ溶液を
緩衝液とし、８％ポリアクリルアミドゲル（アクリルア
ミドとN,N'-メチレンビスアクリルアミドの重量比は29:
1とした。）で電気泳動したところ、図２に示す通り約
300塩基対のバンドが検出できた。なお、図２において
Ｓは試料の注入位置を示し、各点線及び数字は並行して
泳動したそれぞれの分子量マーカーの位置と大きさ（単
位は塩基対）を示す。また、矢印は電気泳動の方向を示
す。
し、制限酵素EcoRI とHindIII で消化し、ＴＢＥ溶液を
緩衝液とし、８％ポリアクリルアミドゲル（アクリルア
ミドとN,N'-メチレンビスアクリルアミドの重量比は29:
1とした。）で電気泳動したところ、図２に示す通り約
300塩基対のバンドが検出できた。なお、図２において
Ｓは試料の注入位置を示し、各点線及び数字は並行して
泳動したそれぞれの分子量マーカーの位置と大きさ（単
位は塩基対）を示す。また、矢印は電気泳動の方向を示
す。
【００４８】また、約 300塩基対のバンドのＤＮＡの塩
基配列をサンガーらのダイデオキシ法［Sanger, F., Ni
cklen, S. & Coulson, A. R.: Proc. Natl. Acad. Sci.
USA74, p.5463-5467(1977)］で解析したところ、アス
パラギン酸−セリン−アスパラギン酸−グリシン−リジ
ンのアミノ酸配列をコードする塩基配列を３個有する塩
基配列が、５回繰り返して存在しているのが確認でき
た。ただし、最後の１塩基は欠失していた。配列番号１
の配列は、組換えプラスミドp1-9の塩基配列のうち、pU
C119に挿入された塩基配列である。配列番号１の配列中
の番号はpUC119にある制限酵素HincIIによる切断部位か
ら数えた番号であり、制限酵素EcoRI の認識切断部位に
近いほうを１番としている。p1-9はpUC119に対し、抗ア
レルギー性ペンタペプチドを繰り返しコードする塩基配
列が、pUC119上のlac プロモーターの方向とは逆方向に
挿入された構造となっている。配列番号１の配列は、抗
アレルギー性ペンタペプチドの多量体ペプチドをコード
するＤＮＡ鎖側の塩基配列を５’末端側から記載した塩
基配列である。配列番号１の配列のうち、第 226番目か
ら第 236番目までの配列は、抗アレルギー性ペンタペプ
チドを繰り返しコードするＤＮＡを作製する際に、塩基
の欠失が起こったためこのペンタペプチドをコードしな
くなった塩基配列である。なお、p1-9を含有する大腸菌
は微工研に微工研菌寄第11802 号（FERM P-11802）とし
て寄託されている。
基配列をサンガーらのダイデオキシ法［Sanger, F., Ni
cklen, S. & Coulson, A. R.: Proc. Natl. Acad. Sci.
USA74, p.5463-5467(1977)］で解析したところ、アス
パラギン酸−セリン−アスパラギン酸−グリシン−リジ
ンのアミノ酸配列をコードする塩基配列を３個有する塩
基配列が、５回繰り返して存在しているのが確認でき
た。ただし、最後の１塩基は欠失していた。配列番号１
の配列は、組換えプラスミドp1-9の塩基配列のうち、pU
C119に挿入された塩基配列である。配列番号１の配列中
の番号はpUC119にある制限酵素HincIIによる切断部位か
ら数えた番号であり、制限酵素EcoRI の認識切断部位に
近いほうを１番としている。p1-9はpUC119に対し、抗ア
レルギー性ペンタペプチドを繰り返しコードする塩基配
列が、pUC119上のlac プロモーターの方向とは逆方向に
挿入された構造となっている。配列番号１の配列は、抗
アレルギー性ペンタペプチドの多量体ペプチドをコード
するＤＮＡ鎖側の塩基配列を５’末端側から記載した塩
基配列である。配列番号１の配列のうち、第 226番目か
ら第 236番目までの配列は、抗アレルギー性ペンタペプ
チドを繰り返しコードするＤＮＡを作製する際に、塩基
の欠失が起こったためこのペンタペプチドをコードしな
くなった塩基配列である。なお、p1-9を含有する大腸菌
は微工研に微工研菌寄第11802 号（FERM P-11802）とし
て寄託されている。
【００４９】実施例２
【００５０】抗アレルギー性ペンタペプチドをコードす
る塩基配列の繰り返しが３０であるＤＮＡ鎖を含む組換
えベクターの作製
る塩基配列の繰り返しが３０であるＤＮＡ鎖を含む組換
えベクターの作製
【００５１】組換えベクターは下記の(1)〜(7)の手順で
作製した。なお、図３にこの組換えベクターの構築図を
示す。図中、白抜きの矢印はラクトースオペロンのプロ
モーター及びオペレーター領域を示し、黒塗りの矢印は
DSDGK の多量体ペプチドをコードする塩基配列のある領
域を示し、Ap（右肩r 付き）はアンピシリン耐性遺伝子
領域を示し、t はユニバーサルトランスレーションター
ミネーターの塩基配列のある領域を示し、dGCTTAATTAAT
TAAGC はその塩基配列を示し、dCCTCGAGG は制限酵素Xh
oIのリンカーの塩基配列を示す。また、kbはキロ塩基対
の略である。
作製した。なお、図３にこの組換えベクターの構築図を
示す。図中、白抜きの矢印はラクトースオペロンのプロ
モーター及びオペレーター領域を示し、黒塗りの矢印は
DSDGK の多量体ペプチドをコードする塩基配列のある領
域を示し、Ap（右肩r 付き）はアンピシリン耐性遺伝子
領域を示し、t はユニバーサルトランスレーションター
ミネーターの塩基配列のある領域を示し、dGCTTAATTAAT
TAAGC はその塩基配列を示し、dCCTCGAGG は制限酵素Xh
oIのリンカーの塩基配列を示す。また、kbはキロ塩基対
の略である。
【００５２】(1) 実施例１で得られたプラスミドp1-9を
制限酵素EcoRI 及びHindIII で消化し、消化物を８％ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動して0.29キロ塩基対（以
下、kbと略す。）のＤＮＡ断片を分離した。
制限酵素EcoRI 及びHindIII で消化し、消化物を８％ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動して0.29キロ塩基対（以
下、kbと略す。）のＤＮＡ断片を分離した。
【００５３】(2) プラスミドpUC118（宝酒造社製）を制
限酵素EcoRI 及びHindIII で消化して上記(1) の0.29kb
のＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡリガーゼを使用してライ
ゲーション反応物を得た。実施例１の(8) と同様にして
このライゲーション反応物を大腸菌MV1184株に取り込ま
せて形質転換体を取得し、さらにこの形質転換体のうち
１株を大量培養して組換えプラスミドを得た。
限酵素EcoRI 及びHindIII で消化して上記(1) の0.29kb
のＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡリガーゼを使用してライ
ゲーション反応物を得た。実施例１の(8) と同様にして
このライゲーション反応物を大腸菌MV1184株に取り込ま
せて形質転換体を取得し、さらにこの形質転換体のうち
１株を大量培養して組換えプラスミドを得た。
【００５４】(3) 得られた組換えプラスミドをp1-9RVと
命名し、これを制限酵素PstIで消化し、生成した線状プ
ラスミドＤＮＡの末端をクレノーフラグメントで平滑化
した。終止コドンを含むリンカー（ファルマシア社製ユ
ニバーサルトランスレーションターミネータ、dGCTTAAT
TAATTAAGC ）の5'末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ
でリン酸化し、この線状プラスミドＤＮＡと混合し、Ｄ
ＮＡリガーゼを使用してライゲーション反応物を得た。
実施例１の(8) と同様にしてこのライゲーション反応物
を大腸菌MV1184株に取り込ませて形質転換体を取得し、
さらにこの形質転換体のうち１株を大量培養して組換え
プラスミドを得た。
命名し、これを制限酵素PstIで消化し、生成した線状プ
ラスミドＤＮＡの末端をクレノーフラグメントで平滑化
した。終止コドンを含むリンカー（ファルマシア社製ユ
ニバーサルトランスレーションターミネータ、dGCTTAAT
TAATTAAGC ）の5'末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ
でリン酸化し、この線状プラスミドＤＮＡと混合し、Ｄ
ＮＡリガーゼを使用してライゲーション反応物を得た。
実施例１の(8) と同様にしてこのライゲーション反応物
を大腸菌MV1184株に取り込ませて形質転換体を取得し、
さらにこの形質転換体のうち１株を大量培養して組換え
プラスミドを得た。
【００５５】(4) 得られた組換えプラスミドをp14T5 と
命名した。この組換えプラスミドには上記リンカーが３
個含まれていた。これを制限酵素HindIII で消化し、生
成した線状プラスミドＤＮＡの末端をクレノーフラグメ
ントで平滑化した。そして、XhoIリンカー（宝酒造社
製、dCCTCGAGG ）の5'末端をＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼでリン酸化し、この線状プラスミドＤＮＡと混合
し、ＤＮＡリガーゼを使用してライゲーション反応物を
得た。実施例１の(8) と同様にしてこのライゲーション
反応物を大腸菌MV1184株に取り込ませて形質転換体を取
得し、さらにこの形質転換体のうち１株を大量培養して
組換えプラスミドを得た。得られた組換えプラスミドは
p14TX と命名した。
命名した。この組換えプラスミドには上記リンカーが３
個含まれていた。これを制限酵素HindIII で消化し、生
成した線状プラスミドＤＮＡの末端をクレノーフラグメ
ントで平滑化した。そして、XhoIリンカー（宝酒造社
製、dCCTCGAGG ）の5'末端をＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼでリン酸化し、この線状プラスミドＤＮＡと混合
し、ＤＮＡリガーゼを使用してライゲーション反応物を
得た。実施例１の(8) と同様にしてこのライゲーション
反応物を大腸菌MV1184株に取り込ませて形質転換体を取
得し、さらにこの形質転換体のうち１株を大量培養して
組換えプラスミドを得た。得られた組換えプラスミドは
p14TX と命名した。
【００５６】(5) 実施例１で得られた組換えプラスミド
p1-9を制限酵素PstIで消化後、生成した線状プラスミド
ＤＮＡの末端をクレノ−フラグメントで平滑化した。こ
の線状プラスミドＤＮＡを制限酵素EcoRI で消化し、消
化物を1.2 ％アガロースゲル電気泳動して0.29kbのＤＮ
Ａ断片を分離した。
p1-9を制限酵素PstIで消化後、生成した線状プラスミド
ＤＮＡの末端をクレノ−フラグメントで平滑化した。こ
の線状プラスミドＤＮＡを制限酵素EcoRI で消化し、消
化物を1.2 ％アガロースゲル電気泳動して0.29kbのＤＮ
Ａ断片を分離した。
【００５７】(6) 実施例２で得た組換えプラスミドp14T
Xを制限酵素EcoRI 及びHincIIで消化し、上記0.29kbの
ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡリガーゼを使用してライゲ
ーション反応物とした。
Xを制限酵素EcoRI 及びHincIIで消化し、上記0.29kbの
ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡリガーゼを使用してライゲ
ーション反応物とした。
【００５８】(7) 実施例１の(8) と同様にしてこのライ
ゲーション反応物を大腸菌MV1184株に取り込ませて形質
転換体を取得し、さらにこの形質転換体のうち１株を大
量培養して組換えプラスミドを得た。得られた組換えプ
ラスミドはp28X-1と命名した。配列番号２の配列は、p2
8X-1の全塩基配列のうち、プラスミドpUC118の制限酵素
HincII及びHindIII 切断部位間の16塩基の塩基配列と置
換された塩基配列である。配列番号２の配列中の番号は
pUC118にある制限酵素HincIIによる切断部位から数えた
番号であり、制限酵素EcoRI の認識切断部位に近いほう
を１番としている。
ゲーション反応物を大腸菌MV1184株に取り込ませて形質
転換体を取得し、さらにこの形質転換体のうち１株を大
量培養して組換えプラスミドを得た。得られた組換えプ
ラスミドはp28X-1と命名した。配列番号２の配列は、p2
8X-1の全塩基配列のうち、プラスミドpUC118の制限酵素
HincII及びHindIII 切断部位間の16塩基の塩基配列と置
換された塩基配列である。配列番号２の配列中の番号は
pUC118にある制限酵素HincIIによる切断部位から数えた
番号であり、制限酵素EcoRI の認識切断部位に近いほう
を１番としている。
【００５９】
【発明の効果】本発明により、DSDGK の多量体ペプチド
をコードするＤＮＡ鎖及びこれを含む有効な組換えベク
ターを提供できた。これを利用することにより、DSDGK
を安価に製造できる。
をコードするＤＮＡ鎖及びこれを含む有効な組換えベク
ターを提供できた。これを利用することにより、DSDGK
を安価に製造できる。
【００６０】
配列番号：1 配列の長さ：236 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GACTCTGACG GCAAAGATTC CGATGGTAAA GATTCCGATG GTAAAGACTC TGACGGCAAA 60 GATTCCGATG GTAAAGATTC CGATGGTAAA GACTCTGACG GCAAAGATTC CGATGGTAAA 120 GATTCCGATG GTAAAGACTC TGACGGCAAA GATTCCGATG GTAAAGATTC CGATGGTAAA 180 GACTCTGACG GCAAAGATTC CGATGGTAAA GATTCCGATG GTAAGACTCT GAGCAA 236
【００６１】配列番号：2 配列の長さ：548 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 配列の種類：他の核酸 組換えＤＮＡ 配列 GACTCTGACG GCAAAGATTC CGATGGTAAA GATTCCGATG GTAAAGACTC TGACGGCAAA 60 GATTCCGATG GTAAAGATTC CGATGGTAAA GACTCTGACG GCAAAGATTC CGATGGTAAA 120 GATTCCGATG GTAAAGACTC TGACGGCAAA GATTCCGATG GTAAAGATTC CGATGGTAAA 180 GACTCTGACG GCAAAGATTC CGATGGTAAA GATTCCGATG GTAAGACTCT GAGCAAGACC 240 GACTCTGACG GCAAAGATTC CGATGGTAAA GATTCCGATG GTAAAGACTC TGACGGCAAA 300 GATTCCGATG GTAAAGATTC CGATGGTAAA GACTCTGACG GCAAAGATTC CGATGGTAAA 360 GATTCCGATG GTAAAGACTC TGACGGCAAA GATTCCGATG GTAAAGATTC CGATGGTAAA 420 GACTCTGACG GCAAAGATTC CGATGGTAAA GATTCCGATG GTAAGACTCT GAGCAAGACC 480 GCTTAATTAA TTAAGCGCTT AATTAATTAA GCGCTTAATT AATTAAGCGG CATGCAAGCT 540 CCTCGAGG 548
【図１】同一鎖上にペプチドの多量体をコードする塩基
配列を含むＤＮＡ鎖の製造法を簡単に示したスキームで
ある。
配列を含むＤＮＡ鎖の製造法を簡単に示したスキームで
ある。
【図２】組換えプラスミドp1-9を制限酵素EcoRI 及びHi
ndIII で分解したときの分解物をポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動で分離した電気泳動図である。
ndIII で分解したときの分解物をポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動で分離した電気泳動図である。
【図３】プラスミドp1-9を最初のプラスミドとして用い
て、プラスミドp28X-1を作製する手順を示した構築図で
ある。
て、プラスミドp28X-1を作製する手順を示した構築図で
ある。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成３年５月９日
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正内容】
【図３】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ０７Ｋ 7/10 7537−4Ｈ 13/00 8619−4Ｈ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ０７Ｋ 99:00
Claims (8)
- 【請求項１】アスパラギン酸−セリン−アスパラギン酸
−グリシン−リジンのアミノ酸配列を有する抗アレルギ
ー性ペンタペプチドの多量体ペプチドをコードする塩基
配列を含むＤＮＡ。 - 【請求項２】抗アレルギー性ペンタペプチドの多量体ペ
プチドをコードする塩基配列が下記の塩基配列である請
求項１記載のＤＮＡ。 GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAG - 【請求項３】抗アレルギー性ペンタペプチドの多量体ペ
プチドをコードする塩基配列が下記の塩基配列である請
求項１記載のＤＮＡ。 GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAG ACT CTG AGC AAG ACC GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAC TCT GAC GGC AAA GAT TCC GAT GGT AAA GAT TCC GAT GGT AAG ACT CTG AGC AAG ACC GCT - 【請求項４】請求項１記載のＤＮＡを含む組換えベクタ
ー。 - 【請求項５】組換えベクターが、大腸菌において安定に
複製され、宿主である大腸菌にアンピシリン耐性を与え
る組換えプラスミドである請求項４記載の組換えベクタ
ー。 - 【請求項６】組換えベクターが、プラスミドpUC119の制
限酵素HincII切断部位に下記の塩基配列が挿入された構
造を有する組換えプラスミドp1-9である請求項４記載の
組換えベクター。 GACTCTGACG GCAAAGATTC CGATGGTAAA GATTCCGATG GTAAAGACTC TGACGGCAAA GATTCCGATG GTAAAGATTC CGATGGTAAA GACTCTGACG GCAAAGATTC CGATGGTAAA GATTCCGATG GTAAAGACTC TGACGGCAAA GATTCCGATG GTAAAGATTC CGATGGTAAA GACTCTGACG GCAAAGATTC CGATGGTAAA GATTCCGATG GTAAGACTCT GAGCAA - 【請求項７】組換えベクターが、プラスミドpUC118の制
限酵素HincII，HindIII 切断部位間の１６塩基配列と下
記の塩基配列を置換した構造を有する組換えプラスミド
p28X-1である請求項４記載の組換えベクター。 GACTCTGACG GCAAAGATTC CGATGGTAAA GATTCCGATG GTAAAGACTC TGACGGCAAA GATTCCGATG GTAAAGATTC CGATGGTAAA GACTCTGACG GCAAAGATTC CGATGGTAAA GATTCCGATG GTAAAGACTC TGACGGCAAA GATTCCGATG GTAAAGATTC CGATGGTAAA GACTCTGACG GCAAAGATTC CGATGGTAAA GATTCCGATG GTAAGACTCT GAGCAAGACC GACTCTGACG GCAAAGATTC CGATGGTAAA GATTCCGATG GTAAAGACTC TGACGGCAAA GATTCCGATG GTAAAGATTC CGATGGTAAA GACTCTGACG GCAAAGATTC CGATGGTAAA GATTCCGATG GTAAAGACTC TGACGGCAAA GATTCCGATG GTAAAGATTC CGATGGTAAA GACTCTGACG GCAAAGATTC CGATGGTAAA GATTCCGATG GTAAGACTCT GAGCAAGACC GCTTAATTAA TTAAGCGCTT AATTAATTAA GCGCTTAATT AATTAAGCGG CATGCAAGCT CCTCGAGG - 【請求項８】請求項４乃至７のいずれかの項記載の組換
えベクターにより形質転換された大腸菌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2401005A JPH0622763A (ja) | 1990-12-10 | 1990-12-10 | 抗アレルギー性ペンタペプチドの多量体ペプチドをコードするｄｎａ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2401005A JPH0622763A (ja) | 1990-12-10 | 1990-12-10 | 抗アレルギー性ペンタペプチドの多量体ペプチドをコードするｄｎａ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0622763A true JPH0622763A (ja) | 1994-02-01 |
Family
ID=18510869
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2401005A Pending JPH0622763A (ja) | 1990-12-10 | 1990-12-10 | 抗アレルギー性ペンタペプチドの多量体ペプチドをコードするｄｎａ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0622763A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10118239B2 (en) | 2011-12-09 | 2018-11-06 | Sodick Co., Ltd. | Wire electric discharge machining device and method |
-
1990
- 1990-12-10 JP JP2401005A patent/JPH0622763A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10118239B2 (en) | 2011-12-09 | 2018-11-06 | Sodick Co., Ltd. | Wire electric discharge machining device and method |
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