JPS6147518B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は抗腫瘍作用を有する蛋白多糖体類の製
造法に関する。詳しくは、ハラタケ属に属する新
種キノコの菌体を培養し、得られた菌糸体から抗
腫瘍作用を有する蛋白多糖体を製造する方法に関
するものである。 担子菌類より抗腫瘍性物質を製造する方法は従
来する数多く提案されており、担子菌の子実体を
原料として水系溶媒による抽出によつて抗腫瘍性
物質を製造することは、例えば特公昭51−22042
号公報にも記載されている。 本発明等はさきにハラタケ属に属する新品種キ
ノコ、カワリハラタケ（Agaricus heterosistes
Heinem.et Gooss）の子実体より抗腫瘍作用を有
する蛋白多糖体を製造する方法（特願昭53−
149828）を提案したが、今回本菌を培地に培養し
得られた菌糸体に蓄積される蛋白多糖体を採取
し、それらの薬理作用について鋭意研究した結
果、子実体から得た物質よりさらに強い抗腫瘍作
用を有する物質を工業生産上有利に、菌糸体より
製造し得ることを見出し本発明を完成した。 本発明において用いられる担子菌は、ブラジル
サンパウロ州ピエターデ市郊外で採取し、近時我
国で初めて栽培することに成功した。未だ菌分類
上未登録の新品種である。 この担子菌による子実体の栽培法については、
特願昭52−54638明細書に記載されている。次
に、本発明で使用する新品種キノコ、カワリハラ
タケの菌学的性質を示す。 (1) 子実体 子実体の形状は、つり鐘状で傘の大きさは５
〜15cmであり、独特の香り有する。傘が開き胞
子が形成されるときにむらがあり、胞子形成が
遅れ黒化するのに時間がかかる。ひだを顕微鏡
で観察すると棍棒体、側糸が微弱である。 同属の公知のキノコに比べ形態的に柄は太く
て長く、胞子の黒変が遅い。また、香気が強
く、柄の肉は美味で甘いことが特徴としてあげ
られる。 (2) 麦芽汁寒天培地及びバレイシヨ・ブドウ糖寒
天培地（PD培地）上によく生育する。PD培地
上では白色の菌糸が発育し、培地を褐色に変化
させる。 (3) 菌糸体最適生育条件 PH＝6.0〜6.5 28℃ (4) 菌糸体の生育の範囲 PH＝4.0〜8.0 10〜33℃ (5) 子実体発生の温度範囲 20〜30℃
適温は24〜28℃ (6) 子実体形成に当り菌糸網を作る。 (7) 子実体形成に当り堆肥上に畝上覆土を行なう
ことにより多量発生する。 以上菌学的性質を同属の公知のキノコ、例え
ば、はらたけ（Agricus campestris Fr.）と比
較した場合、柄が太く、胞子の黒変が遅い点が異
なり、また香気が強く、柄の肉が美味で甘い点が
他にはみられない特徴的な性質となつている。 これらの菌学的諸性質から、本担子菌はハラタ
ケ属（Agaricus）に属する新菌種であるものと
判定され、カラリハラタケ（Agaricus
heterosistes Heinem.et Gooss）と命名した。な
お、本菌は工業技術院微生物工業技術研究所に受
託番号微工研菌寄第4731号として寄託されてい
る。さらに上記担子菌の人工的あるいは自然的変
異株によつても本蛋白多糖類を製造することがで
きる。 本発明において使用する菌株の培養は、担子菌
の培養に通常用いられる固体培養法または、液体
培養法のいずれでもよいが、後者の方法が生産性
の点で好んで用いられる。培養の培地としては、
菌の発育に必要な諸栄養が含まれていればよく通
常の培地処方でよい。即ち、炭素源としては例え
ばグルコース、シユークロース、マルトース、で
んぷんなど資化し得る炭素源であれば利用でき
る。窒素源としては例えば硫安、硝安、硝酸ソー
ダ、尿素、など、天然の複合栄養源としては例え
ばジヤガイモエキス、ニンジンエキス、麦芽エキ
ス、ペプトン、Ｖ−８ジユース、麹エキス、酵母
エキス、酵母粉、タマネギエキス、コーンステイ
ープリカーなど、無機塩類としては、例えばリン
酸、塩類、マグネシウム塩類、カルシウム塩類、
鉄塩類、カリ塩類その他の無機塩類などが利用で
きる。この他に生長に必要な微量元素、ビタミン
などは適宜添加してもよい。 培養は通常好気条件下がよく、例えば振とう培
養法あるいは通気撹拌培養法が用いられる。培養
温度は20〜37℃好ましくは30℃前後で培養するの
がよい。培養PHは3.0〜9.0好ましくは4.5〜7.0が
生育に良好である。培養日数は培養条件によつて
異なるが菌糸体の生育があればよく、通常は２〜
30日間で、最大の菌糸体の生産される時期がよ
い。通気撹拌培養では、通気量0.1〜10VVM、撹
拌速度30〜800r.p.m.の範囲で行なうのがよい。 培養終了後、培養液を遠心分離あるいは過す
ることにより菌糸体が培養液から分離採取され
る。 菌糸体から蛋白多糖体を分離する方法として
は、菌糸体を水性溶媒により処理し抽出すること
により行われる。水性溶媒としては、水を主体と
した溶媒であつて水単独あるいは水と有機溶媒、
酸又は塩基を１種または２種以上を含有する溶媒
をいう。また培養液そのものも菌糸体から有効成
分の抽出のために使用することができるので、本
発明においては培養液も水性溶媒の範疇に属する
ものである。抽出に際しては通常菌糸体湿重量の
２〜10倍の水性溶媒が用いられ、処理は50〜100
℃の温度で約１〜10時間行なわれる。この抽出処
理は繰り返し実施することができる。このように
して得られた抽出液は、その中に有効成分たる蛋
白多糖体を含有しそのままでも抗腫瘍性を示すが
さらに種々の方法により抽出液から有効成分を粉
末状として回収することができる。例えばアルコ
ール、アセトンなどの水可溶性有機溶媒あるいは
各種の塩類、例えば硫安、塩化カルシウムなどを
加えることにより目的物を沈澱させ、過または
遠心分離した後アセトン、エーテルで洗滌乾燥す
ると粉末状として目的物を得ることができる。 抽出液から沈澱物を生じさせる前に、必要に応
じて透析、限外過、ゲル過などにより低分子
物質を除去したり、活性炭、イオン交換処理など
により脱色、脱イオンを行なうこともできる。ま
た、得られた沈澱物も必要に応じて水などに再溶
解し上記処理を行なつてもよい。次いでアルコー
ルなどの水性溶媒にて再沈澱させる操作を繰り返
し実施することもできる。 このようにして得られた物質は、淡灰白色不定
形の粉末であり、その１％水溶液はPH6.0を示
す。この物質について呈色反応を行つたところ、
アンスロン−硫酸反応、フエノール硫酸反応、ビ
アル反応、ビユーレツト反応、キサントプロテイ
ン反応及びフオーリンチオカルト反応はいずれも
陽性であり、本発明物質はこれらの諸反応から蛋
白多糖体であると考えられる。 本発明物質のその他の物理化学的性質の一例は
下記の通りである。 (1) 平均分子量 10⁵〜10⁷ セフアロース4Bを用いたゲル過法によつ
て測定した分子量の標準物質としてデキストラ
ンを用いた。 (2) 比旋光度（透析試料について） 〔α〕^２０ _Ｄ＝＋57゜（2.0重量／容量％水溶液） (3) 元素分析 Ｎ：3.8％、Ｃ：38.6％、Ｈ：6.1％、Ｏ：
51.5％ 精製の程度によつてＮ含量が変動する。 (4) 構成糖 本物質の１％水溶液に1Nとなるように硫酸
を加え４時間、封管中100℃にて加水分解を行
ない、炭酸バリウムにて中和後その上澄液につ
いてシリカゲルの一次元薄層クロマトグラフイ
ーを行なつた。展開溶媒はｎ−プロピルアルコ
ール：酢酸エチル：水（７：１：２）、検出は
ジフエニルアミン−アニリンによる発色によつ
て行なつた。その結果、４種のスポツトＲ_f＝
0.31（ガラクトース）、0.40（グルコース、0.45
（マンノース）、0.51（リボース）を検出した。 さらに、先に得られた上澄液を乾固しトリメ
チルシリル化した後、ガスクロマトグライーに
て分析した結果、主としてグルコース、マンノ
ースからなり、リボース、ガラクトースが含ま
れることを確認した。 (5) アミノ酸 本物質を再蒸留塩酸に溶解し、ドライアイス
浴上で凍結減圧密封した後110℃、22時間加水
分解する。これを乾固し、PH＝2.2の緩衝液に
溶かしこれをアミノ酸アナライザーにより分析
した。その結果、アスパラギン酸、スレオニ
ン、セリン、グルタミン酸、プロリン、グリシ
ン、アラニン、シスチン、バリン、シスタチオ
ニン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、
チロシン、フエニルアラニン、γ−アミノ酪
酸、ヒスチジン、オルニチン、リジン及びアル
ギニンを検出した。 (6) 溶解性 水、IN苛性ソーダ、INアンモニア水及び蟻
酸に可溶であるが、1N塩酸、1N硫酸及び５％
トリクロル酢酸では白濁を生じる。アルコー
ル、アセトン、酢酸エチル、エーテル、ベンゼ
ン、酢酸、ジメチルスルホキシド、ジメチルホ
ルムアミド、アセトニトリル及びジオキサンに
は不溶である。 (7) 紫外線吸収スペクトル（第１図参照） 本物質の0.05％水溶液について測定した結果
200nｍ及び250nｍ近傍に吸収を有する。 (8) 赤外線吸収スペクトル（第２図参照） 3400（Ｓ）、2930（Ｍ）、1640（Ｓ）、1540
（Ｗ）、1400（Ｗ）、1240（Ｗ）、1050（Ｓ）、570
（Ｍ）の特徴的吸収（波数cm^-1）を示す。（KBr
法による。） (9) 粘度（透析試料について） 2.0（重量／容量）％水溶液についてBL型粘
度計（東京計器製）を用い20℃で測定した結
果、2.4CPSであつた。 (10) 味およびにおい 本物質及びその水溶液は無味無臭である。 (11) 分解点 一定の分解点、融点を示さない。強熱により
炭化する。 各種文献によると、例えば、Lentinus edodes
（Berg）Sing.由来の抗腫瘍多糖レンチナンはβ
（１→３）を主鎖とし、β（１→６）、β（１→
３）の分岐を有するグルカンであり、また、
Schizophyllum commue由来の抗腫瘍多糖SPG
（Schizophyllan）もβ（１→３）結合を基本とす
るグルカンである。これらに対し、本蛋白多糖体
は、マンナンを多量に含んでおり、今まで発表さ
れている抗腫瘍多糖と明らかに異なり新規のもの
である。 上記のような物理化学的特性を有する本発明の
蛋白多糖体は、顕著な抗腫瘍作用を有すると共に
（後記参考例参照）、免疫増強作用、インターフエ
ロン誘機作用、血管機能改善作用（例えば抗高脂
血症作用）、肝機能改善作用も認められ極めて有
用な物質である。 以下に実施を挙げて本発明を具体的に説明す
る。 実施例 １ グルコース４ｇ、酵母エキス４ｇ、麦芽エキス
10ｇ、及び水１からなるPH5.5の培地を120℃、
20分間滅菌し、寒天培地に培養したカワリハラタ
ケ菌糸体を接種し、30℃で30日間、時々撹拌しな
がら静置培養した。 グルコース20ｇ、エビオス粉５ｇ、消泡剤レオ
コン1705W（ライオン油脂社製商品名）20ppm及
び水１からなるPH5.0の本培養培地2.0を５
坂口フラスコに入れ120℃、20分間滅菌した。こ
れに上記前培養した培地200mlを接種し、培養温
度30℃で往復振とう機にて培養した。30日間培養
後培養を停止し、遠心分離により菌糸体を培養物
より分離した。培養液当り菌糸体35ｇ（湿重
量）を得た。菌糸体に対して７倍量の水を加え95
℃で２時間加熱抽出した。遠心分離機で残査を除
去して得た上澄液を1/2に濃縮し、エタノールを
等量加えて４℃１昼夜放置、沈澱を生じさせた。
この沈澱を遠心分離で集めアセトン次いでエーテ
ルで洗滌し乾燥後菌体湿重量１ｇ当り淡褐色粉末
2.1mgを得た。 実施例 ２ グルコース20ｇ、酵母エキス５ｇ及び純水１
からなるPH5.0に調整した培地を三角フラスコに
入れ120℃20分間滅菌した。これに寒天培地（ス
ラント）に培養したカワリハラタケ菌糸体を接種
し30℃で３週間静置培養した。 グルコース50ｇ、エビオス粉10ｇ、消泡剤レオ
コン20ppmを１の純水に溶解しPHを5.0に調整
して本培養培地とした。この培地7.0を10容
のジヤーフアーメンターに入れ、120℃、20分間
滅菌した。これに上記の前培養した培地500mlを
接種し、培養温度30℃、通気量0.5VVM、撹拌速
度200〜300rpmの条件にて培養した。10日間の培
養後培養を停止し過して菌糸体を分離後さらに
遠心分離機にて10000rpm、15分の条件で遠心分
離し湿重量として1.1Kgの菌糸体を得た。 上記菌糸体に水３を加え95℃、２時間加熱抽
出した。冷却後遠心分離機で10000rpm、30分処
理し、残査を除去した上澄液をロータリーエバポ
レーターで濃縮し１とした。これにエタノール
１を加え、１昼夜４℃に放置して沈澱を生じさ
せた。 次いで固液分離し、得られた沈澱物をアセト
ン、エーテルで洗滌した後乾燥して4.5ｇの淡灰
白色の粉末を得た。さらにこれを純水に溶解し透
析チユーブ（ユニオンカーバイド社製ビスキング
チユーブ）にて純水に対して透析し、生じた沈澱
物を遠心分離にて除去後、上澄液を凍結乾燥し
2.0ｇの白色粉末を得た。 参考例 １ ザルコーマ180腫瘍に対する効果 腫瘍接種24時間後から実施例２で得られた淡白
色の蛋白多糖体（未透析物）を生理食塩水に溶解
させて１群11匹のマウス（Swiss albino mice）
の腹腔内に毎日１回10日間、所定量を投与した。
接種後14日、21日、28日及び35日に夫々肉腫の大
きさを測定し、その結果から抑制率を算出した。 それらの結果を第１表に示す。 【表】

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明方法により得られる蛋白多糖
体の紫外線吸収スペクトルであり、第２図はその
赤外線吸収スペクトルである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ハラタケ属に属するカワリハラタケを培養し
   て得られた菌糸体を水性溶媒にて抽出し、該抽出
   液から蛋白多糖体を採取することを特徴とする蛋
   白多糖体の製造法。