JPS61218528A - 安定化された免疫グロブリンおよびその調製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は安定化された免疫グロブリン調製物に関する。

本発明の１つの観点は人間への注射を意図する非常に精
製且つ安定化された免疫グロブリンＧ調製物に関する。

適当な環境下において、抗原の動物への注射は抗原と選
択的に反応する特異的抗血清を生成する。

この抗血清は抗原の認識に役立つ蛋白、即ち所謂「抗体
機能」を有する蛋白を含有する。そのような蛋白は通常
「抗体」として或いはより広い意味において「免疫グロ
ブリン（Ｉｇ）Ｊとして言及される。

与えられた棟内のすべての個体は「アイソタイプ（ｉｓ
ｏｔｙｐｅ）Ｊと呼ばれる種々のＩｇカテゴリジー共通
に有している。例えば人間においては１０のアイソタイ
プが同定され且つ５つの種類即ちＩ　ｇ　Ｇ　Ｎ　Ｉ　
ｇ　Ｍ　％　Ｉ　ｇＡ　−、Ｉ　ｇ　Ｄ及びＩｇｌ１３
　にグループ分けされている。これらの種類は単種類例
えば免疫グロブリンＧに対してＩｇＧ１、ＩｇＧ、、工
ｇＧ３及びＩｇＧ今に分けられる。これらの種類は時に
それぞれγＧＸｒＭ、ｒＡ、ｒＤ及びγＥとして言及さ
れ或いは表示される。主な血清免疫グロブリンは種類工
ｇＧ又はガンマグロブリンのものである。

人間への注射が意図されたガンマグロブリン（ＩｇＧ）
調製物は、元々ノ・−バードのＥ、コーン（Ｃｏｈｎ）
博士とその共同研究者が１９４０年代に開発したアルコ
ール分別法によって調製されてきた：この方法はコーン
（Ｃｏｈｎ）ら、ジエイ・アメＡ／−ケム・ツク（１，
Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　）　６８．４５９
（１９４６）に記述されている。これらの調製物は１０
〜１８重量％の蛋白溶液として調製され、殆んどは１５
重量％の蛋白溶液であった。

後者はその濃度において生成物が血液と同一の粘度を示
すから好適であった。これらの高蛋白ガンマグロブリン
生成物に対する他の利点は、２〜８℃で２〜３年間貯蔵
した時に肉眼で観察される沈殿の不存在によって判断で
きる如き固有の貯蔵安定性であった。これに対し、約１
０重量％よシ少ない蛋白を含有する調製物はしばしば最
終液体生成物中に肉眼で観察しつる沈殿を示した。

上記の比較的高蛋白のガンマグロブリン生成物は最初静
脈内（ｆｆ）投与を意図したものである。後者は循環系
の保護抗体の肴を中程度にするから臨床的に有利である
が、しかし一方で筋肉内（ＩＭ）に与えられた抗体の凡
そ半分は局部的な蛋白分解ｆ不完全な吸収のために失な
われてしまうことになる。不幸なことに、上述の生成物
はそれを受ける者に悪い過敏症反応をもたらすために■
投与に安全でないことが経験的に示された。参照例えば
ボウマン（Ｂｏｗｍａｎ）、クリ７・オプスト・　ジネ
ク（ＣＩ　ｉｎ、　０ｂｓｔ、　Ｇｙｎｅｃ、　）　２
５．３４１　（１９８２）及びシュレーダ（Ｓｃｈｒｏ
ｅｄｅｒ）ら、アメル・ジエイ・メト（Ａｍｅｒ、　Ｊ
、　Ｍｅｄ、　）、１９８４年３月３０日、３３頁。標
準的な冷アルコニル法で調製した生成物の貯蔵中の、凝
集したガンマグロブリン重合体の生成は、これらの凝集
体を患者の血液中の補体と結合させ且つ抗補体反応を生
じさせる。

即ち標準的な冷アルコール法で調製されるすべてのガン
マグロブリン生成物は筋肉内での使用だけが許容しつる
。

ガンマグロブリンの比較的大きい分子量の水性溶液中に
おける生成は製薬学的有用性に対して特に致命的である
。そのような変性はスルフヒドリル−ジスルフィド変換
反応によって影響されると思われる。

ガンマグロブリンの補体に結合する能力は、変性の結果
として、特に高分子量槽への凝集によって非常に増大す
る。これらの凝集体の補体結合機構は抗原−抗体複合体
のそれと同一であるように見える。Ｄ、　Ｍ、マークス
（Ｍａｒｃｕｓ）、ジエイ・イミュノ／Ｉ／　（Ｊ、　
Ｉｍｍｕ　ｎ　ｏ　ｌ　）、８４．２７３〜２８４（１
９６０）。ＩｇＧの場合、補体の結合点は互いに近い２
分子を必要とすることは公知である。それ故に、分子の
臨界充填がいずれか必要な空間的変化よりもむしろ必要
とされるかも知れない。しかしながら、変性された抗体
溶液中の凝集体の寸法の分布及びその抗補体活性との関
連は検討されていない。

初期の研究、即ちゲルバー（Ｇｅｒｂｅｒ）、ジエイ・
イミュノル、９２．８８５〜８８８　（１９６４）及ヒ
ケルバー、アースリチス・リューム（Ａｒ　ｔ　ｈ　−
ｒｉｔｉｓ　Ｒｅｕｍ、）、１７．８５〜９１（１９７
１）において、リューマチ性関節炎に悩む患者の場合、
生体内機構はガンマグロブリンの凝集物の生成を増大さ
せる金属銅によって誘導されると推定されている。この
研究者は、１つのアミノ酸グーヒスチジンの量を増加さ
せると患者にとって有利であることを発見した。なおこ
れらの研究は生理学的ｐＨ値、即ち約７．４のｐＨで行
なわれている。またヒスチジン保護の、凝集物の不存在
領域における比較的低蛋白の人間のガンマグロブリン生
成物及び抗補体活性に及ぼす効果は、ゲルバーの研究で
試験されておらず且つ報告されたデータから予見するこ
とができない。

ガンマグロブリンでの治療が許容される方法になるにつ
れて、市販の生成物が多量に必要となり、製造業者はガ
ンマグロブリンを含む生成物の由来する出発血液の供与
者に対して超免疫プログラム（ｈｙｐｅｒｉｍｍｕｎｉ
ｚａｔｉｏｎ　ｐｒｏｇｒａｍｓ）を採用する必要が生
じた。得られる血漿又は血清は所望の高出発抗体力価を
有し、斯くしてよシ多くの生成物を一定の出発容量の血
液から誘導させることができる。所望の最終の抗体の力
価は従来の１０〜１８重量％値よりも低蛋白濃度で達成
することができるけれど、そのようなガンマグロブリン
含有生成物は貯蔵中の安定性が低い。

従って所望の１０〜１８重量％の濃度を維持するために
蛋白を生成物に添加するか、或いは１０重量％より低蛋
白濃度の高度に精製されたガンマグロブリン生成物の溶
液を安定化させる方法を開発するかしなければならない
。前者の解決策に対しては、低力価の血漿源に由来する
精製されたアルブミン又はガンマグロブリンのいずれカ
１を添加することが普通である。しかしながらこの方策
は経済的に魅力がない。また更彦る精製された蛋白から
のウィルス感染が起こりつるから、それは患者を更なる
健康の危険にさらすこととなる。後者の解決策の例は、
ルンドプラッド（Ｌｕｎｄｂｌａｄ）らの米国特許第４
．１８６．１９６号に見出すことができる。この方法で
は５重ｔＸのガンマプロブリン生成物を安定化させるた
めに、比較的高濃度のマルトースを最終緩衝液に添加す
る。この５重量％のガンマグロブリン生成物は、凝集物
も排除すると言われ且つ対象が静脈内に投与しつる生成
物である改変冷アルコール法に由来する。

蛋白溶液の安定化における他の従来法の試みはフＸ−ウ
ニ／Ｉ／　（Ｆｏｗｅ　ｌ　１　）の米国特許第２，８
２６゜５３３号に例示されている。これは溶液中のフィ
ブリノーゲンの溶解性を増大させるためにデキストロー
ズの使用を開示している。トーツス（ｔｈｏ−ｍａｓ）
の米国特許！４，０８９，９４９号は、抗親血性因子（
ＡＨＦ）−フィプリノゲン組成物の溶解性を高めるため
に種々の炭水化物（例えばデキストロース、マンノース
、カラクトース、フルクトース、ラクトース、スクロー
ス及ヒマルトース）ヲ用いることを開示している。メー
′ス（Ｍａｃｅ）らの米国特許第＆０５７，７８１号は
血漿の転化糖による安定化を開示している〇 他の研究者は、・ガンマグロブリン生成物を全く異なる
方法で製造することの可能性を開発した。

この場合にも目的はＩＭ又はＩＶ投与に適当な生成物を
製造することであった。現在好ましい解決策はイオン交
換クロマトグラフィーを用いることである。参照例えば
コンディ（Ｃｏｎｄｉｅ）の米国特許第４，１３６，０
９４号及びホソペ（Ｈｏｐｐｅ　）ら、ホクス・サンプ
（ｖｏｘ　Ｓａｎｇ、　）、２５．３０８（１９７３）
；フリーゼン（Ｆｒｉｅｓｅｎ）ら、ジエイ・アプライ
ド・バイオケム（Ｊ、　Ａｐｐｌ　ｆｅｄＢｉｏｃｈｅ
ｍ）、３．１６４（１９８１）：及びウオルシ：ｙ−（
Ｗａ　１　ｓ　ｈ　）及びオリオルダｙ（０’Ｒｉｏ−
ｒｄａｎ）、イリツシュ・メト・ジエイ（ＩｒｉｓｈＭ
ｅｄ、　Ｊ、　）　７５．２３２（１９８２）。

コンディはＩＶ投与しつる且つ安定な５重量％蛋白溶液
が標準的なグリシン−食塩水緩衝液以外の特別な添加剤
なしに可能であるということを主張している。しかしな
がら、この特別な方法における鍵となる工程が血漿源の
コロイド状シリカでの予備処理であることを記述しなけ
ればならない。

−力木発明の方法は、シリカ蒸気をとり扱うという潜在
的な健康の危険性に作業員をさらす必要がなく、そして
安定化された蛋白溶液を製造する。

他の３つの上記群の参考文献は、もつ１イらイオン交換
クロマトグラフィー法に依存して、工ｖ投与に安全であ
ると言われる最終生成物を得ている。

しかしながら、すべての３つは非常に低い蛋白濃度（１
〜４重量％）を含む最終生成物を凍結乾燥して、適当な
貯蔵安定性の必要条件に適合させる。

−力木発明は凍結乾燥の不便さと費用、そして使用前の
再構成を回避する低蛋白ガンマグロブリン溶液を十分に
安定化させるだめの比較的低費用の方法を与える。

液体ガンマグロブリン生成物の安定性を評価するために
、比較的簡単な試験法が歴史的に使用されてきた。この
試験は、米国生物局の推奨するもので、最終生成物の５
７℃の温度への加熱及びこの温度における４時間の保持
とその間における肉眼での沈殿の検査を含む。参照コー
ド・オブ・フエテラル・レギュレーションス（Ｃｏｄｅ
　ｏｆＦｅｄｅｒａｌ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）　２
１．７ソド拳アンド・ドラゲス（Ｆｏｏｄ　　ａｎｄ　
Ｄｒｕａｓ）、６４０．１０１３（１９７８年４月改！
Ｔ）。フエルナンデス（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ）及びルン
ドブラツド、ボクス・サンプ、３９．１０１〜１１２（
１９８０）は、有用な添加剤の日常的評価に適当なこの
方法の改変を報告している。この改変法は試験生成物の
約２財を５７℃に４時間加熱し、次いで実験室の分光機
を用いて５８０　ｎｍの透過度を読むことによって測定
される如き不透明性の程度の変化の百分率を測定するこ
とを含んでなる。

従来精製された液体ガンマグロブリン生成物に対して好
適な緩衝剤は、グリシン−食塩水、ｐＨ６，４〜７．２
である；シあしながらこの緩衝剤は蛋白濃度が５ｆｉ号
％又はそれ以下の場合不適当であることが今回発見され
た。

グリシン−食塩水だけを安定剤として用いる比較的低蛋
白のガンマグロブリン生成物を用いて遭遇する他の問題
はｐ）Ｉの調節である。歴史的には、高蛋白濃度（即ち
約１５重量％）は、グリシン又は食塩水のいずれでもな
くて、それ自体が生成物に対する主たる緩衝剤として役
立った。しかし比較的低い蛋白濃度は適当な緩衝作用を
示さない。

−力木発明は５重１％又はそれ以下の蛋白濃度の精製さ
れたガンマグロブリン溶液に対して歴史的なグリシン−
食塩水緩衝剤よシも優れたｐＨの安定化を与える。

更に本発明は、ガンマグロブリンでの治療の目的で患者
に注射した時に安全である比較的低価格の生成物を与え
る。本生成物は従来使用されてい九安定化生成物よりも
非常に低濃度で効果的であり、ガンマグロブリンを処理
するために二酸化珪素のような危険な化学品の使用を必
要とせず、そしてガンマグロブリン自体の化学的改変を
必要としない。

ヒスチジンを安定化青で含み且つ僅かに酸性範囲のｐＨ
値を有する免疫グロブリン調製物が本発明の意図するも
のである。そのような調製物は抗補体活性を実質的に含
まず、また存在する免疫グロブリンの凝集を禁示するの
に十分な濃度でヒスチジンを含有する。

本調製物のｐＨ値は少くとも約６．０であって高々７．
０であり、好ましくは約６．２〜約６．６、最も好まし
くは約６．４である。

本調製物の伝導度は５℃において約２〜約４ミリジーメ
ンス、好ましくは約２５〜約３．５シーメンス、最も好
ましくは約２−７ジーメンスである。

上記方法においていずれの免疫グロブリンも貯蔵のため
に安定化させうるけれど、本発明は人間のガンマグロブ
リン又はＩ　ｇＧ、即ち人間の血漿中の主たる血清免疫
グロブリンの安定化に特に良く適している。

この目的に対し、抗補体活性を実質的に示さない特に好
適な安定化された無策のガンマグロブリン組成物は、生
理学的に有効な濃度のガンマグロブリン、ガンマグロブ
リンの凝集を挙止するのに十分な濃スのヒススジン及び
約０．０！’Ｓ〜約０．５　Ｍの濃度のグリシンを含む
水溶液からなる。

上記組成物において、ガンマグロブリンの濃度は約５ｆ
ｊｌｌ１％又はそれ以下、更に好ましくは約’　　　　
　　　０．０５〜約５重量％、最も好ましくは約１〜約
２重量％である。

安定化された免疫グロブリンは患者に静脈内又は筋肉内
に投与することができ、且つ患者の循環系抗体量を評価
するのに有用である。

緩衝能力及びｐＨは、多くの球形の蛋白例えば免疫グロ
ブリンの溶解性がその存在する系のｐＨによって影響さ
れるから本発明の重要な特徴である。普通には蛋白が最
小に溶解するｐＨが等電点、即ち蛋白分子が設定された
電場を有さないｐＨである。この等α点ｐＨでは、隣る
蛋白分子間に静電的反撥がなく、それらは凝集しかつ沈
殿しがちである。本発明を実施する場合、存在する免疫
グロブリン例えばガンマグロブリンは、溶液のｐＨを存
在する免疫グロブリン分子の等電点ｐＨ値以外の値に維
持することばより凝集に対して安定化せしめられる。

この目的に対して、アミノ酸ヒスチジンは安定化剤とし
て利用される。好ましく吋ヒスチジンはグリシンと一緒
に使用される。本水性溶液を安定化させるために使用さ
れるヒスチジン及びグリシンは、例えばメルク・インデ
ックス（ＭｅｒｋＩｎｄｅｘ、第１０版、メルク社（Ｍ
ｅｒｋ　＆＋　Ｃｏ。

Ｉｎｃ、　、Ｒａｈｗａｙ、Ｎ、Ｊ、　）（１９８３）
のそれぞれ４６２１及び４３５９頁に詳細に記述される
。Ｌ−ヒスチジンは木目的に対するヒスチジンの特に好
適な立体異性体であるが、Ｄ−ヒスチジン又はヒスチジ
ン立体異性体のラセミ体混合物も適当である。更にヒス
チジン及びグリシンの製薬学的に許容しうる塩も同様に
使用できる。Ｌ−ヒスチジン塩酸塩モノハイドレート及
びグリシン塩酸塩は本目的に対して特に好適な塩である
０ 本明細書に用いる如き「製薬学的に許容しうる塩」とは
、技術的に十分公知の方法によって製造されるナトリウ
ム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム及
びアンモニウム塩などを含む製薬工業で使用される無毒
性のアルカリ金属、アルカリ土類全率及びアンモニウム
塩に関するものである。この術語は、本発明の化合物を
適当な有機又は無機酸と反応させることによって一般に
得られる無毒性の酸付加塩も含む。代表的は塩は塩酸塩
、臭化水素酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、酢酸塩、シュウ
酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、ホウ酸
塩、安息香酸塩、乳酸塩、燐酸塩、トシレート、クエン
酸塩、マレイン酸塩、７マル酸塩、コハク酸塩、酒石酸
塩などを含む。

木調−製物中のヒスチジン及びグリシンの濃度は塩の濃
度のような因子に依存して変化しつる。ヒスチジンの濃
１・ｔは好ましくは約０．０２５〜約０．２Ｍの範囲で
あり、またグリシンの存在する場合、それは約０．０５
〜約０．５Ｍの範囲であってよい。

特に好適な組成物にかいて、ヒスチジンとグリシンの＃
度はそれぞれ約０．０５〜約０．１　ＭであるＯ本発明
の利点の１つは、水素イオン濃度（ｐＨ）の望ましくな
い変化に対して水性弓液を適当に緩衝させる能力である
。本調製物に対するｐＨ値の全範囲は少くとも約６．０
ないし高々７．０である。

好適な具体例１／ｃおいて、本発明を具現化する水性調
製物のｐＨ値は約６，２〜約６．６、更に好ましくは６
．４である。

本発明の調型物における緩衝能力は、殆んどの部分がヒ
スチジンによって付与されると思われる。

これは所望のｐＨ範囲において有意義な緩衝能力を有す
る唯一のアミノ酸である。

水性免疫グロブリン溶液の伝導度は最適な安定化に対し
ても重要である。この目的に対して、本溶液は５℃にお
いて約２〜約４ミリジーメンス±１０％の伝導度を示す
。好ましくは溶液の伝導度は５℃において約λ５〜約３
．５ミリジーメンス、最も好ましくは約２−７ミリジー
メンスである。

Ｌ−ヒスチジン塩酸塩モノハイドレートを安定化剤とし
て用い且つ水性水酸化ナトリウム溶液を用いて最終のｐ
Ｈ調節を行なう場合、約６．４へのｐＨ調節は最終溶液
中の塩化ナトリウム濃度を０．０５Ｍにし、また５℃に
おいてｚ７±０．２７　ミリジーメンスの所望の伝導度
をもたらす。

免疫グロブリン例えばガンマグロブリンは、本発明を具
現化する調製物中に薬理学的有効量で存在する。その特
別な量は、意図する投薬法及び治療の用途に依存して変
化しうる：しかしながら一般に本調製物中の免疫グロブ
リンの濃度は約０．０５〜約５重量％、好ましくは約１
〜約２重量％である０ ガンマグロブリンの場合、元々の蛋白は純度が好ましく
は少くとも約９５％、更に好ましくは９９．５％であり
、いずれの化学的又は酵素的改変を受けていない。

本発明に従って安定化されたガンマグロブリンは、治療
の目的に対し所望の期間にわたって約２０〜約２００１
ｎ９／！Ｋｇ／日の範囲の一回又は多数回の単位投薬量
で静脈内的に患者に投与することができる。筋肉内投与
の場合、個々の投薬量はいくらが量が多い。本調製物は
外科的又は化学的処置と関連させて患者に投与してもよ
い。

「単位投薬量」とは、温血動物に対する１回の投薬量と
して適当な物理的に区別された単位に関するものであり
、各単位は本発明の調製物との関連において所望の治療
効果を生じさせると計算される予じめ決められた竜の活
性物質を含有する。

本発明の新規な単位投薬量に対する特徴は、（ａ）活性
物質の独特な特徴、（ｂ）達成しつる特別な薬理学的又
は治療学的効果、及び（ｃ１本明細書に詳細に開示され
る如き動物に使用するためのそのような活性物質を混合
する技術の制限、によって示され且つそれに直接関係し
、これが本発明の特徴をなす。

本発明の組成物の製造に適当な免疫グロブリンは、所望
の純度の基準に合う限シにおいていずれの起源に由来し
ていてもよい。種々の免疫グロブリンの回収及び精製法
、例えばイオン交換樹脂法、親和性クロマトグラフィー
は技術的に公知であり、本発明の目的にも適当である。

参照例えばシルトｙ　（Ｚｏｌ　ｔｏｎ）らによる米国
特許第４．４３４．０９３号及びゾルトンらによる１９
８４年１２月１０日付けの関連米国特許願第６８０．１
９１号、及びスタンウオース（Ｓｔａｎｗｏｒｔｈ）、
ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）１８８．１５６〜１５７（
１９６０）。

一般に本発明の調製物は、必要な濃度及び純度の所望の
免疫グロブリン例えば人間のガンマグロブリンの水性溶
液を与え、次いでこれと、存在する免疫グロブリンの凝
集を禁止させるのに十分な量のヒスチジンと一緒にする
ことによって混合される。得られる溶液の水素イオン濃
度は、少くとも約６．０であるが、高々７．０のｐＨ値
に調整される。随時グリシンも上述の量で添加しつる。

同様シ に必要ならば得られる溶液の伝導性は技術的に公知の方
法によシ上述の範囲に調整される。

次の詳細な実施例は本発明を更に例示する。

実施例１二人間の血漿プールの調製 予じめＲｈ−（＋１赤血球で超免疫化したＲｈ−（−）
供与者の多数から血液単位を集めた。各単位を標準法に
よって遠心分離にかけて、血小板の貧弱な血漿を得た。

これをそれぞれ採集の４時間以内に凍結した。これらの
単位を必要となるまで凍結して貯蔵した。この凍結した
単位を、分別を開始する日に融解し、−緒に集めた。融
解した血漿中に存在することが観察された冷却沈殿物を
標準法により除去した。この工程から得られた上澄液は
所望のガンマグロブリンを含有した。これを２〜８℃に
維持し、次の分別に備えた。

実施例２：イオン交換クロマトグラフィーに先立つ試料
の準備 上記実施例１で調製した上澄液（Ｓ、ＳＺ）は７３．７
μｆ／ａｔの出発の抗り活性を含有した。これをミリポ
ア（Ｍｉ　Ｉ　１１ｐｏｒｅ）限外濾過装置及びカラム
平衡と展開緩衛剤、即ち０．０５　Ｍイミダシー−ルー
０．０２３　Ｍ塩化ナトリウム緩衝剤、ｐＨ７，５±０
．１を用いて透析した。この工程は、血漿試料をイオン
交換樹脂を含有するカラムに引き続き適用する時、血漿
の伝導状態は樹脂が膨張又は収縮のいずれもしないよう
なものであるとｈうごとを保証した。透析した試料を、
次の工程の開始前に１５〜２０℃に保った。透析した試
料の容量は５．４ｔであった。

実施例３：イオン交換クロマトグラフィーＱＡＥ−セフ
ァデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ａ−５０アニオン交換
樹脂（乾燥室ｔ８００ｆ；ロット番号１２７７３）を、
その製造業者ファーマシア・ファイン・ケミカルズ（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ　ＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ　、　
Ｐｉｓｃａｔ、ａｗａｙ　、　Ｎ、　Ｊ　、　）の教示
に従い、上記実施例２に特徴づけた緩衝剤で洗浄し、膨
潤させ且つ平衡化させた。この樹脂スラリーをプラスチ
ックのカラム（高さ１５ｃｒｒＬ×直径３７．。

ｃＩｒＬ）中に装填し、最終的な床の容量を１６．Ｏｌ
とした。上記実施例２からの透析した血漿試料をこの充
填カラムに適用し、そして流速１．５／、／時及び温度
２０±５℃において樹脂中を流下させた。

この工程中血漿蛋白の大部分は正に荷電したイオンに結
合し、一方ガンマグロプリンの殆んどは結合せずに、直
接カラムの底部から流出した。そしてこれを集めた。

血漿試料のすべてが樹脂床に入った後、上述のカラム緩
衝剤を連続的にカラム中〈通じた。次いで標準的な実験
室用の分光計でＯＤ□。（波長２８０ナノメータにおけ
る吸光度）の読みを測定することによってカラムからの
流出物を蛋白の存在に対して監視した。この読みはカラ
ム緩衝剤のそれを参照にした。２８０　ｎｍの読みの増
加が観察された時流出物画分の集収を開始した。ＯＤ！
８゜ｎｍの読みが最初のベースラインの読みの２０〜３
０％に戻るまで収集を続けた。ガンマグロブリンに富む
集めた生成物は、１７．８５／、の容量と０．１重量％
以下の蛋白濃度を有することが観察された。抗り活性の
回収は約８０Ｘであることがわかった。

得られた希ガンマグロブリン生成物を２〜８℃に保ち、
次いで２５０±２５μｆ抗−Ｄ／、／の所望の抗体能力
まで濃縮した。

実施例４二生成物の濃縮 上記実施例３で得た希生成物を、分子食１０，０００を
保留する膜を備えたミＩＪポア限外濾過装置を用いて約
２０倍に濃縮した。

実施例５：安定剤溶液を用いる最終生成物の透析上記実
施例４に記述した如く濃縮した後及び依然同一の限外濾
過装置にある間に、濃縮された生成物の容量を本安定剤
溶液、即ち０．０５Ｍヒスチジン−０，１Ｍグリシン、
ｐＨ６，４±０．１で４回交換した。最終の容量又は濃
縮された生成物は１．３５ｔであると推定できた。濃縮
された生成物中の蛋白濃度は１．４重量％であり、それ
は６．４°±０．１のｐＨと５℃において２．．７ミリ
ジーメンス±０．２７の伝導性を有した。

実施例６：無菌濾過と薬ビンへの注入 上記実施例５で安定化され且つ上記実施例３に報告した
ような抗体能力を有する濃縮された生成物を０．２２ミ
クロンのフィルターを通して無菌濾過し、１．２　ｄ　
／薬ビンの最終容量で薬ビンに入れた。充填した薬ビン
を、栓をし、密閉し、そして２〜８℃で３年間貯蔵した
。濃縮且つ安定化された生成物のいくつかの画分を貯蔵
前に凍結乾燥し、次いで凍結乾燥状態で貯蔵した。３年
間にわたって繰返し試験した時、ヒスチジンで安定化し
且つ貯蔵した生成物は凝集物と抗補体活性を有さず、従
ってＩＶ注射に安定であることがわかった。

ヒスチジン及びグリシンは純粋形で容易に入手でき且つ
水性溶液において良好な安定性を有する。

生理学的にはそれらは安全であり、粉末の蛋白調製物に
おける栄養補充物として使用される。しかしながら、本
発明はヒスチジンとグリシンの新規な組合せ物を意図し
、生物学的系では予想しえないことが起こりつるから、
本発明の目的に対するそれらの安定化溶質としての使用
を、以下に報告する如き安全性の研究において試験した
。

実施例７：ヒスチジン及びグリシン溶液のマウスにおけ
る安全性の研究 ヒスチジン及びグリシン溶液（病原体を含まない水中０
．０５ＭのＬ−ヒスチジン塩酸塩モノハイトレー）、０
．０１０Ｍグリシン、０．００３％チメロサ／Ｌ／　（
ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ）　；　ｐＨ６，４±０．１：０
〜５℃における伝導度３．０±０．３ｍ５）を、グリシ
ン及び食塩溶液（病原体を含まない水中０．２０　Ｍグ
リシン、０．０５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５６’チ
メロサル：ｐＨ７，４５±０．１５：０〜５℃における
伝導度３．０±０．１ｍ８）及び食塩対照溶液（病原体
を含まない水中０．９０％塩化ナトリウム、０．００３
％チメロサル：ｐＨ６，４±０．１）と比較しつつ筋肉
内で試験した。

各溶液を０．２１１７，２週間にわたって週３回マウス
の大腿筋肉中へ注射することによって投与した。

この投薬量は人間の１回の投薬量を少くとも１０００倍
に誇張できるように計算したものである。

すべてのマウスは２週間の試験に生き残り、処置と関、
連した不適当な化学的作用を示さなかった。

グリシン−食塩溶液を受けた１つのマウスは試験期間に
体重が減少（Ｉｆ）した。これは有意な体重減少とは見
なされない。

検死では、筋肉内注射部位に殆んど反応が見られず、ま
た処置と関連する内臓の組織変化は存在しなかった。選
別した組織（例えば肺、心臓、肝Ｉ！組ひ臓、腎臓、及
び両後足の注射部位）の顕微鏡検査は種々の注射した溶
液と関連した影響を示さなかった。唯一の注射部位の変
化は針をさした外傷であった。

実施例８：ヒスチジン及びグリシン溶液のモルモットに
おける安全性の研究 上記実施例７に報告した研究に用いたものと同一の溶液
を、モルモットに関する１４日間の皮下の安全性の研究
に使用した。＃Ｉ原体を含まない水中の且つｐＨ値を６
．４±０．１に調節した５重量％のし一ヒスチジン塩酸
塩モノハイドレート溶液も使用した。各試験溶液を、少
くとも７日の間保証された５匹の雄の大人に成長したモ
ルモット［バートリー・デツセンダン）　（Ｈａｒｔｌ
ｙ　　Ｄｅｓｃｅｎｄａｎｔ）；体重４００ｇ＋］に注
射した。

各動物の背中を１回目の注射５日前にそった。

各動物に、中央線付近の背中に試験溶液０．ｉｃｅを３
回（１日、１０日及び１４日日月投薬した。

各動物を、そのいずれかの異常性に対して毎日ａ察した
。各動物に対する注射部分も、赤色化又は膨れに関して
注射から２４及び４８時間において観察した。

この試験の期間中、試験溶液に対する反応は顕著でなか
った。ヒスチノンーグリシン試験溶液を受けた１匹のモ
ルモ、ットは試験期間中の冷たさのために病気（下剤、
体重減少、寒気、鼻からの分泌）になったけれど、この
動物も注射した試験溶液に対して観察されうる反応を示
さなかった。これらの実験及びその結果を下表Ｉ〜■に
示す。

ｒＩＳＩ表 対照物（・）８４．２４２　　□５，００９　　　。、
１□２プリノｂ） した人間の精製が 、、？グ。ブ、、、（ｂ） （ａ）　　対照物は市販品であり、冷アルコール法に由
来する１５．０重量％の蛋白、人間のがンマグロプリン
生成物であった。この試料はすべての３つの成分を測定
しうる量で含有すると思われる。

（ｂ）　　精製〃ンマグロプリンを製造するために用い
る方法は上記実施例１〜６に記述した如きイオン交換ク
ロマトグラフィーであった０両試料に対して同一の起源
を用いた。この最終蛋白濃度は１゜４眞量％であった。

両試料を２〜８℃で開けずに２４時間貯蔵した。

（ｃ）　　ベルトリニ（Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉ）、バ’７
クスーサング、４３，８７（１９８２）に公開された報
告に基づいてＴＳＫ−３０００ＳＷカラムを用いること
により、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析
を行なった。流速は０，５ａ＋ｆ／分であり、検知器の
波長を２８０ｎｍに設定した。凝集物が存在すある場合
、それは約１３．６分で流出し、次いで二量体ピークが
約１６．５分でまた単量体ビ一りが約１９．５分で流出
した。

第１表におけるデータは、２年の貯蔵期間中にＬ−ビス
チジンで安定化された〃ンマグロプリンが認めうる凝集
物の生成を示さなかったことを示す。

第■表 熱ストレス試験の結果（“） 量％ＩｇＧ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　６．７剤の比較 重量％ＩｇＧ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　５゜０■、安定剤の性能に及ぼすｐＨの影響の評価重
量％Ｉ　ｇＧ　　　　　　　　　　６．４　　　５．４
ｆＥｊｌｔ％Ｉ　ｇＧ　（ｂ）７，２　　６９．０（ａ
）　　７−ｒ−ルナンデス（Ｆ　ｅｒｎａｎｄｅｓ）及
びルンドプラド（Ｌ　ｕｎｄｂｌａｄ）、ボックス・サ
ング、３９．１０１（１９８０）に概述される方法に従
って熱ストレス試験を行なった。

（ｂ）　　水性ＮａＯＨ溶液（十分量）の添加によって
ｐＨを調節した。

上記表に示したデータは、グリシン−食塩緩衝剤が蛋白
濃度が比較的低い精製した液体〃ンマグロプリン生成物
の安定化に対して適当でないことを示す。また上記デー
タは僅かに酸性範囲のｐＨ値においてそのような生成物
を安定化させるためにヒスチジンを利用することによる
予期を越えた利点も示す。

第１１１表 年月を経た安定化された低蛋白生成物の抗補体活性の測
定 対照試料　　　　　　　　　　　　１：６４（ａ）　　
上述のグロブリンの抗補体活性は、７り−ゼン（Ｆｒｉ
ｅｓｅｎ）ら、ノエイ・アプライド・バイオケミストリ
ー（Ｊ、　　Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ｂｉｏｅｈｅｔａｉｓ
Ｌｒｙ、３゜１６４〜１７５（１９８１）に記述された
方法で決定した。ＩｇＧ溶液の連続的な２倍の希釈物を
補体５ＣＨ，、単位と共に培養した。４℃で夜通し培養
した後、１％の増感したヒツジの赤血球を添加し、３７
℃で３０分間培養した。抗補体活性は少くとも５０％の
溶血を示す希釈液ｌ１ｌｉ当りの蛋白濃度Ｂとして表現
した。

（ｂ）　　この生成物は実施例１〜６に記述した如（イ
オン交換によりＭ製した人間のガンマグロブリンを用い
て精製した。試料の最終蛋白濃度は１゜４重量％であっ
た。この生成物を液体として密閉容器中に貯戊した。

第■表のデータは、本発明に従って安定化した組成物が
抗補体活性を実質的に示さないことを示す。

第■表 Ｑ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　８
．４００．４０６゜７５ １．００　　　　　　　　　　　　　　　　　　６゜９
０１．８０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６
．９５２．５０　　　　　　　　　　　　　　　　　　
６，９５２゜７５　　　　　　　　　　　　　　　　　
　７．００３．８０　　　　　　　　　　　　　　　　
　　７．００（、）　　実施例１〜５に記述した如（イ
オン交換で精製した人間の〃ンマグロプリン試料。乾燥
、した生成物を、標準的なグリシン−食塩緩衝液（０゜
２Ｍ−０，０５Ｍ）、ｐＨ６，４、に種々の量で添加し
た。

（ｂ）　　標準的な実験室法により２０〜２５℃でｐＨ
を測定。

第■表のデータは、標準的なグリシン−食塩緩衝剤の緩
衝能力が試験した蛋白濃度に対して不適当であることを
示す。緩衝能力が適当ならば、試料のｐｔｒ値の変化が
観Ｖ／−されない。

第１表 最終安定化緩衝剤における異なる里のグリシンの影響 の〃ンマグロブリ ン の〃ンマグロプリ ν （ａ）　　精製されたがンマグロプリンを製造するため
に用いた方法は上記実施例１〜６に示した如きイオン交
換クロマトグラフィーであった。最終の蛋白濃度は１．
２重葉％であった。両試料を、上記試験面に２〜８℃で
１ケ月間、開けずに貯蔵した。

（ｂ）　　ベルトルニ、ボックス・サング、４３．８７
（１９８２）の報告に基づ＜ＴＳＫ−３０００ＳＷカラ
ムを用いて高速液体クロマトグラフィー分析を行なった
。流速は０．５ｍｉ／分であり、検知器の波長を２８０
ｎＩ１１に設定した。凝集物は存在する場合的１３．６
分に流出した。次いで二量体ピークが約１６．５分に、
また単量体ピークが約１９．５分に観察された。

第１表のデータは、本溶液の安定化効果が、約０．０１
〜約０．５Ｍのグリシンの濃度範囲内においてグリシン
濃度に依存しないことを示す。

以上本発明を人間の〃ンマグロプリンを参照して主に記
述し且つ例示してきたけれど、上述の安定化法は他の免
疫グロブリンにも適用しうる。例えばナイマン（Ｎ　ｉ
ｍａｎ）ら、ブロクψナトル・アカド・サイ（Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔ’　ｌ　　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）Ｕ。

Ｓ、Ａ、、１東、４９４９〜４う５３（１９８３）に及
びヒプリドｖ’テクニクス（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　　Ｔ
ｅｃｈ＋＋１ｑｕｅｓ）、ＥＭＢＯ，ＳＫＭＢ：ｌ−ス
（Ｃｏｕｒｓｅ）１９８０１バーゼル（Ｂａｓｅｌ）、
コールド・スプリングＩＩバーｔ＜−ａラボラトリ−（
Ｃｏｌｄ　　Ｓ　ｐｒｉｎｇＨａｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ）（Ｃｏｌｄ　　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
。

Ｍａｉｎｅ）に記述されている如きヒプリドマ（ｈｙｂ
ｒｉｄｏｗ＋ａ）法を用い製造される全生米の抗体も、
上に教示したように有利に安定化でき、貯蔵でき且つ中
でも治療のために使用することができる。更にモノクロ
ーナル抗体は、試験管内でのヒプリドマの培養上澄液か
らばかりでなく、所望のヒブリドマを導入した哺乳動物
の腹水（ａｓｃｉｔｅｓ）液体から一般により濃縮され
た形態で得ることができる。ここに腹水液体を用いるモ
ノクローナル抗体の製造は技術的に良く知られている。

しかしながら、そのような抗体は本発明の特徴を利用す
ることにより有利に安定化でき且つ後の用途のために貯
蔵することができる。

上記議論及び実施例は本発明の例示としてであり、それ
を限定するものとは見なされない。本発明の精神及び範
囲内に入る他の変化も同業者には可能であり且つ容易に
想定しうる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、生理学的に有効な濃度の免疫グロブリンの水溶液を
   含んでなる安定化された免疫グロブリン調製物であつて
   、該溶液が抗補体活性を実質的に有さず、ヒスチジンを
   該免疫グロブリンの凝集を禁止するのに十分な濃度で含
   有し、少くとも約６．０で、７．０より大きくないｐＨ
   値と５℃において約２〜約４ミリジーメンスの伝導度を
   有する調製物。 ２、免疫グロブリンの濃度が高々約５重量％である特許
   請求の範囲第１項記載の調製物。 ３、免疫グロブリンの濃度が約０．０５〜約５重量％で
   あり、ヒスチジンの濃度が約０．０２５Ｍ〜約０．２Ｍ
   であり、そして調製物が更にグリシンを約０．０５Ｍ〜
   約０．５Ｍの濃度で含有する特許請求の範囲第１項記載
   の調製物。 ４、免疫グロブリンの濃度が約１〜約２重量％であり、
   ヒスチジンの濃度が約０．０５Ｍであり、そしてグリシ
   ンの濃度が約０．１Ｍである特許請求の範囲第３項記載
   の調製物。 ５、水溶液が約６．２〜約６．６のｐＨ値を有し、そし
   て伝導度が５℃において約２．５〜約３．５ミリジーメ
   ンスである特許請求の範囲第１項記載の調製物。 ６、水溶液が約６．４のｐＨ値を有し、そして伝導度が
   ５℃において約２．７ミリジーメンスである特許請求の
   範囲第１項記載の調製物。 ７、免疫グロブリンがガンマグロブリンである特許請求
   の範囲第１項記載の調製物。 ８、免疫グロブリンがモノクローナル抗体である特許請
   求の範囲第１項記載の調製物。 ９、実質的に抗補体活性を示さず且つ約０．０５〜約５
   重量％のガンマグロブリン、ガンマグロブリンの凝集を
   禁止するのに十分な濃度のヒスチジン、及び約０．０５
   〜約０．５Ｍの濃度のグリシンを含む水溶液を含んでな
   る安定化されたガンマグロブリン組成物であつて、該水
   溶液が少くとも約６．０であるが高々７．０のｐＨ値と
   ５℃において約２〜約４ミリジーメンスの伝導度を有す
   る組成物。 １０、ヒスチジンがＬ−ヒスチジンである特許請求の範
   囲第９項記載の安定化された組成物。 １１、溶液のｐＨ値が約６．２〜約６．６であり、そし
   て伝導度が５℃において約２．５〜約３．５ミリジーメ
   ンスである特許請求の範囲第９項記載の安定化された組
   成物。 １２、溶液のｐＨ値が約６．４であり、そして伝導度が
   ５℃において約２．７ミリジーメンスである特許請求の
   範囲第９項記載の安定化された組成物。 １３、ヒスチジンがＬ−ヒスチジンであり、約０．０２
   ５〜約０．２Ｍの濃度で存在する特許請求の範囲第９項
   記載の安定化された組成物。 １４、ヒスチジンがＬ−ヒスチジンであり且つ約０．０
   ５Ｍの濃度で存在し；グリシが約０．１Ｍの濃度で存在
   し；そして該水溶液が約６．４のｐＨ値と５℃において
   約２．７ミリジーメンスの伝導度を有する特許請求の範
   囲第９項記載の安定化された組成物。 １５、ガンマグロブリンが約１〜約２重量％の量で存在
   し；ヒスチジンがＬ−ヒスチジンであり且つ約０．０５
   Ｍの濃度で存在し；グリシンが約０．１Ｍの濃度で存在
   し；そして該水性溶液が約６．４のｐＨ値と５℃におい
   て約２．７ミリジーメンスの伝導度を有する、特許請求
   の範囲第９項記載の安定化された組成物。 １６、免疫グロブリンの水性溶液を調製し；該溶液を、
   存在する免疫グロブリンの凝集を禁止するのに十分な量
   のヒスチジンと一緒にし；得られる溶液の水素イオン濃
   度を少くとも約６．０であつて高々７．０の値に調節し
   ；そして必要ならば得られる溶液の伝導度を５℃におい
   て約２〜約６ミリジーメンスの値に調節する、工程を含
   んでなる免疫グロブリンの安定化法。 １７、免疫グロブリンが少くとも約９５％の純度を有す
   る人間のガンマグロブリンであり、ヒスチジンがＬ−ヒ
   スチジンであり、そして得られる溶液のｐＨ値を約６．
   ４に調整し且つ得られる溶液の伝導度を５℃において約
   ２．７ミリジーメンスに調節する特許請求の範囲第１６
   項記載の方法。 １８、更にグリシンを、得られる溶液中に約０．０５〜
   約０．５Ｍのグリシン濃度を与えるのに十分な量で該溶
   液と一緒にする特許請求の範囲第１７項記載の方法。 １９、免疫グロブリンが少くとも約９９．５％の純度を
   有し且つ約０．０５〜約５重量％の濃度で存在し、Ｌ−
   ヒスチジンを、約０．０２５〜約０．２Ｍの溶液濃度を
   与える量で該溶液と一緒にし、更にグリシンを、約０．
   ０５〜約０．５Ｍの溶液濃度を与える量で該溶液と一緒
   にし、そして該溶液のｐＨを約６．４の値に調整し且つ
   得られる溶液の伝導度を５℃において２．７ミリジーメ
   ンスに調整する、特許請求の範囲第１６項記載の方法。