HU216864B

HU216864B - Eljárás anti-D immunglobulin-G koncentrátum előállítására és ilyen koncentrátumot tartalmazó gyógyászati készítmények

Info

Publication number: HU216864B
Application number: HU9502514A
Authority: HU
Inventors: Gerhard Hodler; Peter Lerch; Martin Stucki
Original assignee: Rotkreuzstiftung Zentrallaboratorium Blutspendedienst Srk
Priority date: 1993-12-27
Filing date: 1994-12-22
Publication date: 1999-09-28
Also published as: AU1414395A; DE59309332D1; ES2129076T3; NO315331B1; JP2926463B2; DK0659767T4; HUT73376A; ES2129076T5; GR3029817T3; DK0659767T3; EP0659767B1; FI946103A; KR100368563B1; CZ286271B6; PL310435A1; US5593675A; HU9502514D0; CA2138921A1; EP0659767B2; TW311884B

Abstract

A találmány tárgya eljárás Anti-D IgG-tartalmú hűmán plazmából vagyanti-D IgG-tartalmú plazmafrakcióból anti-D imműnglőbűlin-G-készítményelőállítására, mely eljárás szerint: i) a plazmát vagy plazmafrakciót3,5–6,5 pH-érték és 2–4 mS/cm kőndűktivitás mellett, fűnkcióscsőpőrtként karbőxi-metil-csőpőrtőkat tartalmazó adszőrbensalkalmazásával iőncserélő kr matőgráfiás lépésnek vetik alá, melyneksőrán az anti-D IgG az adszőrbenshez kötődik; ii) a kötődött anti-DIgG-t tartalmazó adszőrbenst először 5–8 pH-érték és 2–4 mS/cmkőndűktivitás mellett mősófőlyadékkal mőssák, azűtán az anti-D IgG-telűálják; majd iii) az elűált anti-D IgG-t a nem kívánt összetevőkeltávőlítása céljából 6–8 pH-érték és 2–4 mS/cm kőndűktivitás mellettiőncserélő tűlajdőnsággal rendelkező alkalikűs adszőrbenssel k zelik,végül az anti-D IgG-t kőncentrálják. A nagy hatásfőkkal előállítőtt,nem fertőző anti-D-kőncentrátűm specifikűs aktivitása magas, 1 grammössz-IgG-ben több, mint 1% anti-D IgG található. A találmány tárgyátképezik a találmány szerinti eljárás alkalmazásával előállítőttgyógyászati készítmények is. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás anti-D (anti-rhesus) immunglobulin-G- (anti-D IgG-) koncentrátum előállítására. A találmány tárgyát képezik aktív összetevőként a találmány szerinti eljárás alkalmazásával előállított anti-D IgG-koncentrátumot tartalmazó gyógyászati készítmények is.

A találmány szerinti eljárás alkalmazásával előállított hatóanyagok előnyösen alkalmazhatók rhesus-ellenanyaggal érzékenyített terhes nők kezelésére.

A ,,morbus hemoliticus neonatorum ” a fejlődő magzat és az újszülött hemolitikus anémiája (a vörösvértestek feloldódásával járó vérszegénység), melyet anyai antitestek okoznak. Ezek az ellenanyagok a magzati vörösvértestek felszínén található antigének ellen irányulnak. Keletkezésükben a rhesus, az ABO vagy egyéb vércsoport-rendszerek játszanak szerepet.

A rhesus vércsoport-antigének közül a legfontosabbak a D-antigének, kevésbé immunogén hatásúak az antithetikus C-, c-, E-, e-, valamint D“-antigének; ezenkívül több, mint 40 további rhesus-antigén ismert. Klinikai szempontból a rhesus-inkompatibilitásért elsősorban a vörösvértesteken található membránproteinek, a D rhesus-antigének (RhD; Rh_(l) felelősek, melyeket nemrégiben klónoztak és elsődleges szerkezetüket leírták [Le Van Kim és munkatársai: PNAS USA 89, 10925 (1992)]. A D-antigének az Európában élő kaukázusi embertípus körülbelül 85%-ánál megtalálhatók. A D-antigénekkel rendelkező egyéneket Rh-pozitívnak nevezzük. A D-antigénekkel nem rendelkező egyéneket Rh-negatívnak nevezzük. Az anti-D-specifitással rendelkező ellenanyagok a leggyakoribb rendellenes rhesus-ellenanyagok, melyek elsősorban rhesus-inkompatibilis terhességek folyamán vagy rhesus-inkompatibilis vér transzfuzióját követően keletkeznek. Az antiD-ellenanyagok főként az 1. és 3. IgG-alosztályokba tartoznak (IgGl és IgG3).

A rhesus-ellenanyaggal érzékenyített terhes nők kezelésére alkalmazható csalhatatlan, hatékony oki kezelés napjainkig nem ismert. Mivel deszenzibilizálás szintén nem lehetséges, a rhesus-ellenanyagokkal létrejövő szenzibilizálódásnak a szülőképes korban levő Rh-negatív asszonyokban anti-D immunglobulin adásával történő megelőzése alapvető fontosságú.

Kezelés nélkül a kedvezőtlen rhesus-konstellációval rendelkező (az anya Rh-negatív, a gyermek Rh-pozitív) primigravidák (első ízben terhes nők) a terhesség vagy a szülés folyamán 17%-ban szenzibilizálódnak rhesusantigénnekkel.

Az anti-D-készítményeket több, mint 30 éve sikeresen alkalmazzák az Rh-negatív vagy D^u-pozitív asszonyokban a D-rhesus-faktorral vagy a D^u-faktorral történő rhesus-szenzibilizálódás megelőzésére, valamint az anti-D-ellenanyagokkal kapcsolatosan az újszülöttekben létrejövő betegségek kialakulásának, nevezetesen a rhesus-erithroblasztózis valamennyi formájának megakadályozására.

A rhesus-szenzibilizálódás veszélye a bejutott magzati Rh-pozitív vörösvértestek mennyiségével arányosan fokozódik. A WHO által szülés utáni profilaktikus kezelésre javasolt dózis 200 pg anti-D IgG, amely elegendő ml magzati vörösvértest neutralizálására (ez megfelel körülbelül 20 ml magzati vérnek), így az esetek körülbelül 90%-ában, még nagyobb mértékű vér bejutását követően is védelmet nyújt az Rh-szenzibilizálódással szemben; következésképp, a megfelelő rhesus-konstellációval rendelkező primigravidáknál a rhesus-antigénekkel történő szenzibilizálódás még 1-2%-ban előfordulhat. Valamennyi megfelelő rhesus-konstellációval rendelkező primigravidánál a terhesség alatt rutinszerűen végzett további rhesus-profilaxis („antepartum profilaxis”) a szenzibilizálódás megmaradó kockázatát 0,1-0,2%-ra tovább csökkenti.

Anti-D-ellenanyagokat alkalmaznak továbbá, Rh-negatív recipiensekbe Rh-pozitív vér téves transzfuzióját követően; a dózist ekkor a bejutott Rh-pozitív vörösvértestek mennyiségének megfelelően kell megállapítani.

Néhány éve vitatják az anti-D immunglobulinoknak idiopátiás tromocitopéniás purpura (ITP) kezelésében történő hatékonyságát.

Az intramuszkulárisan (izomba) és intravénásán injektált IgG farmakokinetikájának vizsgálata a gazdaszervezetben világosan azt mutatja, hogy feltétlenül az intravénás beadás előnyös. Az intramuszkuláris injektálást követően az izomraktárból történő lassú felszívódás, és a helyi proteolízis következtében a maximális aktivitás várhatóan késleltetett, és a hatékonyság csökken. Az IgG plazmakoncentrációja az injektálást követően egészséges vizsgálati személyekben négy nap, a vizsgált, ágyhoz kötött betegekben hat nap múlva érte el a maximális értéket. Továbbá, a maximális IgG-plazmakoncentráció egészséges vizsgálati személyekben az injektált dózisnak csupán 30%-a, a vizsgált, ágyhoz kötött betegekben csupán 20%-a volt.

Összehasonlításképp, az intravénás adagolás jelentős előnyökkel jár. Csak az ilyen beadás útján képes a teljes beadott dózis a fizikai aktivitástól függetlenül kifejteni hatását; az IgG plazmaszintje 5 nap során a fizikai aktivitás fokától gyakorlatilag függetlenül a beadott dózis körülbelül 35-40%-ára csökken, és így csak az ötödik napon ér el az intramuszkuláris injektálással elérhető maximális plazmakoncentrációnak megfelelő értéket [Morell A. és munkatársai: Vox Sang. 38 272 (1980)].

Immunglobulinkészítmények ipari méretekben történő előállítására napjainkban különböző frakcionálási eljárásokat alkalmaznak:

A hideg etanolprecipitációs eljárások, például a Cohn szerinti eljárások, vagy Cohn eljárásán alapuló, módosított eljárások különösen heti 500 liter feletti plazmamennyiség előállítására alkalmazhatók. Bizonyos kezelésekkel, például pH 4 mellett pepszinnel történő kezeléssel az ily módon izolált immunglobulinok intravénás beadással jól tolerálható készítménnyé alakíthatók. Más precipitációs eljárások az immunglobulinok ammónium-szulfáttal, nátrium-szulfáttal, polietilénglikollal, kaprilsawal vagy rivanollal történő specifikus kicsapódásán alapulnak [lásd az alábbi összefoglalót: Curling J. M.: „Separation of Plasma Proteins”, szerkesztő: J. M. Curling, (1983) Pharmacia, Uppsala, Svédország].

HU 216 864 Β

Immunglobulinkeverékek nagy tételben, ioncserélő gyantán történő adszorpcióján alapuló izolálást eljárást először 1964-ben írtak le [Baumstark J. S. és munkatársai: Arch. Biochem. Biophys.: 108, 514 (1964)]. A következő években számos oszlopkromatográfiás eljárást is kifejlesztettek (CH-A-572745; US-A-3 869436; EP-A-0085747) és alkalmaztak, többek között anti-D immunglobulinok frakcionálására [Friesen A. D. és munkatársai: J. Appl. Biochem. 3, 164 (1981)].

A fent leírt eljárások alkalmazásával nagy mennyiségű, nagy tisztaságú, változatlan IgG-alosztály-megoszlással rendelkező teljes IgG nyerhető, de azok nem teszik lehetővé meghatározott IgG-alosztályok vagy meghatározott IgG-molekulák, mint például anti-D IgG-molekulák koncentrálását.

A legtöbb anti-D hiperimmunglobulin-készítmény csak intramuszkulárisan (izomba adva) alkalmazható. Világszerte csak néhány intravénásán jól tolerálható készítmény van forgalomban. Az egyik ilyen készítmény a feltalálók által előállított anti-D SRK-immunglobulin, melyet Kisdér és Nitschmann frakcionálási eljárása szerint állítottunk elő [Kistler P és Nitschmann H.: Vox Sang. 7,414 (1962)], melyet pH 4-en végzett kíméletes pepszinkezeléssel intravénásán jól tolerálhatóvá tettünk. Mivel a fenti típusú frakcionálási eljárással igen kis mennyiségű specifikus anti-D-ellenanyag nyerhető, és mivel az anti-D hiperimmunplazma nagyon ritka, szükség van olyan új eljárásokra, melyekkel szemben az előbbiekben leírt eljárásokkal alacsony titerű gyűjtött anti-D-plazmából is nagy mennyiségű, és magas specifikus anti-D-aktivitással rendelkező tiszta IgG-készítmény állítható elő.

A találmány tárgyát képezi tehát tiszta anti-D-koncentrátum előállítására szolgáló eljárás, mely koncentrátumban az IgG-1. és IgG-3. alosztályba tartozó anti-D immunglobulinok különösen koncentráltan fordulnak elő. Kimutattuk, hogy ez meglepően egyszerű módon elérhető, a nem specifikus IgG-ok több, mint 85%-ának és csaknem az összes egyéb, nem kívánt plazmaösszetevőnek egyidejű eltávolításával, mely eljárás szerint, előnyösen 30 pg/ml anti-D IgG-titer feletti titerrel rendelkező, specifikusan kiválasztott és specifikusan immunizált véradókból származó vérplazmát vagy abból nyert immunglobulintartalmú frakciókat a találmány szerinti feltételek mellett kationcserélő kromatográfiával frakcionálunk. A nagy mennyiségben nyert anti-D-koncentrátum ezenfelül fokozott specifikus aktivitással rendelkezik (az össz-IgG-ben található anti-D IgG grammban kifejezett mennyisége magas), és további ioncserélők vagy alumínium-hidroxid-gél egyedüli vagy megfelelő kombinációban történő alkalmazásával tovább tisztítható.

A találmány tárgyát képezi továbbá, IgA-t csak nyomokban tartalmazó, intravénásán jól tolerálható, és megfelelő stabilizálószerek hozzáadását követően az aktivitás csökkenése nélkül, liofilizálva vagy előnyösen oldatban több hónapig tárolható anti-D-készítmény. Azt találtuk, hogy a találmány szerinti eljárással előállított tiszta anti-D-koncentrátum megfelel ezeknek a követelményeknek, azaz többek között olyan specifikus aktivitással rendelkezik, melyet eddig nem sikerült elérni, intravénásán beadva jól tolerálható és különösen alacsony IgA-tartalmú. Továbbá, az anti-D-koncentrátumban az IgG-alosztályok megoszlása eltér a normálistól, amenynyiben az eljárás révén az 1. és 3. IgG-alosztályok feldúsulnak, míg a 2. és 4. alosztályok mennyisége nagymértékben csökken.

A találmány tárgyát képezi tehát humán plazmából 1 gramm össz-IgG-ben több, mint 1% anti-D IgG-t tartalmazó, specifikus aktivitással rendelkező anti-D immunglobulin-G-készitmény előállítására szolgáló eljárás, mely eljárás szerint rhesus-D faktorral immunizált Rh-negatív véradóktól származó vért vagy anti-D IgG-t tartalmazó plazmafrakciót

i) 3,5-6,5 pH-érték és 2-4 mS/cm konduktivitás mellett, funkciós csoportként karboxi-metil-csoportokat tartalmazó adszorbens alkalmazásával ioncserélő kromatográfiás lépésnek vetjük alá, melynek során az antiD IgG az adszorbenshez kötődik, ii) a kötődött anti-D IgG-t tartalmazó adszorbenst először 5-8 pH-érték és 2-4 mS/cm konduktivitás mellett mosófolyadékkal mossuk, majd az anti-D IgG-t eluáljuk, majd iii) az eluált anti-D IgG-t a nem kívánt összetevők eltávolítása céljából 6-8 pH-érték és 2-4 mS/cm konduktivitás mellett ioncserélő tulajdonsággal rendelkező, alkalikus adszorbenssel kezeljük, végül az anti-D IgG-t koncentráljuk.

A találmány szerinti eljárással immunglobulinok nyerhetők közvetlenül humán plazmából. A kiindulási anyag rhesus-D faktorral érzékenyített Rh-negatív donorok plazmája. A plazmaferezissel kapott egyes mintákat előnyösen lefagyasztjuk, és a frakcionálási, valamint elegyítést megelőzően 0-4 °C-on óvatosan felolvasztjuk. Az összegyűjtött plazmának milliliterenként több, mint 10 pg anti-D IgG-t, előnyösen 30 pg anti-D IgG-t kell tartalmaznia. A kationcserélő kromatográfiás eljárásnál használt plazmafrakciót előzőleg a technika állása szerint ismert módszerekkel tisztíthatjuk, például a krioglobulinok elválasztásával vagy etanollal végzett frakcionált precipitációval [Cokin E. J. és munkatársai: J. Am. Chem. Soc. 68, 459 (1946); Kistler és Nitschmann H.: Vox. Sang. 7, 414 (1962)] vagy más precipitációs eljárással, mint például ammónium-szulfáttal, nátriumszulfáttal, polietilénglikollal, kaprilsawal vagy rivanollal végzett precipitációval, vagy valamely kromatográfiás módszerrel vagy a fenti eljárások kombinációjával. A találmány szerinti kationcserélő kromatográfiát megelőzően az ekvilibráló pufferben oldott krioglobulinmentes plazmát vagy immunglobulintartalmú plazmafrakciót szüljük, és a rejtett vírusok inaktiválása céljából Horowitz eljárása szerint [Thrombosis and Haemostasis 65, 1163 (1991)] egy biológiailag összeférhető szerves oldószerrel, mint például tri(n-butil)-foszfáttal és detergenssel, mint például O[4-(l,l,3,3-tertametil-butil)-fenil]deka(oxi-etilén) detergenssel (Triton®-X-100 detergenssel) kezeljük. A plazma, oldószer és detergens elegyét ezután 37 °C-on inkubáljuk. Eközben a fázisok szétválnak. A feltisztult alsó fázist eltávolítjuk, hígítjuk, szűrjük és a kationcserélő kromatográfiánál alkalmazott egyensúlyi feltételeknek megfelelően állítjuk be, a kö3

HU 216 864 Β vetkező lépéseknél általában 10 °C-nál magasabb, előnyösen 20-25 °C hőmérsékletet alkalmazunk. Az első fő tisztítási lépés során, az előkezelt termékben található anti-D IgG-t előnyösen karboxi-metil (CM) funkciós csoportokkal rendelkező, gyengén savas ioncserélő gélhez kötjük. Ezáltal az idegen proteinek több, mint 98%át kimossuk; ennek során ugyancsak eltávolítjuk a vírusinaktiválásra használt oldószert és detergenst. A fenti eljárás során specifikusan koncentrálódott, IgG-1. és IgG-3. alosztályokba tartozó anti-D IgG-t növekvő konduktivitás mellett, előnyösen 10 mS/cm konduktivitás feletti érték mellett az ioncserélő gélről eluáljuk. Az eluátum tiszta IgG-ffakció; 15%-nál kevesebb össz-IgGfrakciót tartalmaz, és benne az IgG-alosztályok megoszlása megváltozott: az IgG-1. és IgG-3. alosztályok erősen koncentrálódtak, az IgG-2. és IgG-4. alosztályok mennyisége nagymértékben csökkent. Ezt az anti-D IgG-frakciót ezután tovább tisztítjuk egy második, gyengén alkalikus, előnyösen dietil-amino-etil (DEAE) funkciós csoportokat tartalmazó ioncserélő géllel történő kezeléssel, a választott feltételek mellett az anti-D IgG nem kötődik az ioncserélő gélhez. A koncentráció növelése céljából a tisztított anti-D IgG-frakciót előnyösen ismét egy CM-ioncserélő gélhez kötjük, és azt megfelelő feltételek alkalmazásával olyan koncentráltan eluáljuk, amennyire ez lehetséges, majd a végső készítménnyé alakítjuk. A találmány szerinti feltételek elérése szempontjából lényegtelen, hogy az anti-D IgG-frakciót az ionkoncentráció növelésével, a pH-érték változtatásával vagy eltérő összetételű puffer alkalmazásával eluáljuk. További nem kívánt összetevők, például proteázok koncentrációjának csökkentése érdekében, az immunglobulinoldatot az eljárás bármely fázisában adszorbenssel, mint például alumínium-hidroxid-géllel kezelhetjük. Az oldószer-detergens kezelést helyettesíthetjük vagy kiegészíthetjük bármely ismert, vírusinaktiválásra/eltávolításra alkalmazható eljárással, például hőkezeléssel, mint például pasztőrözéssel vagy nanoszűréssel.

A találmány szerinti eljárással előállított anti-D IgG folyadékban stabil. Ezenkívül intravénásán beadva jól tolerálható, IgA-tartalma kisebb, mint 5 μg/ml és IgGtartalma 1-10 mg/ml. A pH körülbelül 5,2. A készítmény előnyösen, maximálisan 25 mmol/1 foszfátot, 200 mmol/1 NaCl-ot, 100 mg/ml humán albumint, kívánt esetben 250-300 mmol/1 valamely aminosavat, például glicint, 100 mg/ml diszacharidot, például szacharózt vagy 50 mg/ml monoszacharidot, például mannitolt tartalmaz.

A találmány szerint előállított anti-D IgG kívánt esetben, körülbelül pH 6,6 mellett, egy diszacharid, például 100 mg/ml szacharóz hozzáadásával 200 pg anti-D IgG dózisokban liofdizálható.

A leíráshoz csatolt ábra a találmány szerinti megoldás szemléltetését szolgálja, anélkül azonban, hogy igényünket azzal korlátoznánk. Az ábra az 1. példában ismertetett első kationcserélő kromatográfiával kapott tipikus kromatogramot ábrázol.

A találmány szerinti eljárást a pontosabb értelmezhetőség céljából az alábbi, konkrét megvalósítási példákon keresztül kívánjuk szemléltetni.

1. példa

A kiindulási anyag gondosan kiválasztott vörösvértestek alkalmazásával rhesus-D-faktorral szemben érzékenyített Rh-negatív nők vagy Rh-negatív férfiak plazmája volt. Valamennyi véradótól származó vért megvizsgáltunk Hbs-antigének, HIV-ellenanyagok, hepatitisz-C ellenanyagok jelenlétére, valamint emelkedett ALAT-aktvitásra nézve. A plazmaferezissel kapott plazmákat külön-külön lefagyasztottuk, és a frakcionálást megelőzően 0-4 °C-on óvatosan felolvasztottuk, majd összekevertük. A 25 pg/ml anti-D IgG-t tartalmazó, jégmentes, elegyített plazmát 2-4 °C-on, átfolyó centrifugában (Cepa, Lahr, Németország) centrifugáltuk (1 1/perc; 12000 fordulat/perc). A felülúszót 1,2 pm áteresztőképességű szűrőn átszűrtük (Opticap®, Millipore, Bedford MA, USA). Ezt követően 1% Triton®-X-100 (Rohm és Hass, Frankfurt, Németország) és 1% tri(n-butil)foszfát (Merck, Darmstadt, Németország) alkalmazásával, 4-4,5 órán át, 30 °C-on végzett oldószer/detergens kezeléssel Horowitz és munkatársai szerint vírusinaktiválást végeztünk [Thrombosis and Haemostasis 65, 1163 (1991)]. A vírusinaktivált oldatot 10-18 órán át 37 °C-on állni hagytuk. A feltisztult alsó fázist eltávolítottuk és 0,2 pm áteresztőképességű szűrőn átszűrtük (Sealkleen NFP 7002, Pali, Dreieich, Németország). Huszonöt (25) liter oldószerrel és detergenssel kezelt plazmát 10 mmol/1 nátrium-foszfátpufferben hígítottunk az ekvilibráló puffer konduktivitásának eléréséig (50 mmol/1 nátrium-foszfátpuffer, pH 5,5; 3,2 mS/cm), a pH-t 5,5-re állítottuk, 1,2 pm áteresztőképességű szűrőn átszűrtük (Opticap®, Millipore, Bedford MA, USA) és egy 706 cm² alapterülettel és 7,5 cm magassággal rendelkező oszlopban 150 cm/óra átfolyási sebesség mellett, előzőleg 50 mmol/1 nátrium-foszfátpufferrel (pH 5,5) ekvilibrált MacroPrep®-CM-gélhez kötöttük (BioRad, Hercules CA; USA). A hőmérsékletet 20-25 °C között tartottuk. Az oszlopot ezután 40-szeres oszloptérfogatnak megfelelő, 25 mmol/1 nátrium-foszfátpufferrel mostuk (pH 7,0) és az anti-D-t tartalmazó IgG-frakciót 25 mmol/1 nátrium-foszfátpuffert és 0,2 mol/1 nátriumkloridot tartalmazó pufferrel (pH 7,5) eluáltuk. A fenti kezeléssel kapott tipikus kromatogramot ábrázol az egyetlen csatolt ábra. A diagramon a 280 nm-en mért optikai denzitást (OD) ábrázoltuk az idő függvényében (t). Ezen látható, hogy az anyag felvitele és a mosás során a nem kívánt termékek nagy részét elválasztottuk, míg az eluálás során egy nagyméretű keskeny csúcs jelentkezett, amely egy IgG-alfrakcióban erősen koncentrálva tartalmazta a kívánt anti-D IgG-t. Az így kapott specifikus aktivitás 1 gramm össz-IgG-ben több, mint 2% anti-D IgG volt. Az eluátumot 3,3 mS/cm konduktivitás eléréséig vízben hígítottuk (1 térfogat eluátum + körülbelül 5 térfogat víz), a pH-t 0,2 mol/1 koncentrációjú NaOH-oldattal 7,5-re állítottuk be, és egy tételben, 2,5 óráig szárazon, 100 g tömegű DEAE-Sephadex®-A50-gélre adszorbeáltuk. A DEAEgélt előzőleg 25 mmol/1 nátrium-foszfátpufferrel ekvilibráltuk (pH 7,5). A nem kötődött anti-D IgG-frakciót polipropilén szűrőn átszűrtük és a pH-t 5,5-re állítottuk. A koncentráció növelése céljából a DEAE-szűrt

HU 216 864 Β anyagot egy 71 cm² alapterülettel és 12,5 cm magassággal rendelkező oszlopban 230 cm/óra átfolyási sebesség mellett ismét, előzőleg 50 mmol/1 nátrium-foszfátpufferrel (pH 5,5) ekvilibrált MacroPrep®-50-CMgélhez kötöttük (BioRad, Hercules, CA, USA). Az antiD-ellenanyagot tartalmazó IgG-frakciót 25 mmol/1 nátrium-foszfátpuffert és 0,2 mol/1 nátrium-kloridot tartalmazó pufferrel eluáltuk (pH 5,5). A CM-géleket 1 normáid NaOH-oldattal regeneráltuk és pirogénmentessé mostuk, így az legalább húsz alkalommal újból használható. A DEAE-gélt egyszeri használatot követően eldobtuk.

2. példa

A kiindulási anyag gondosan kiválasztott vörösvértestek alkalmazásával rhesus-D faktorral szemben érzékenyített Rh-negatív nők vagy Rh-negatív férfiak plazmája volt. Valamennyi véradótól származó vért megvizsgáltunk Hbs-antigének, HIV-ellenanyagok, hepatitisz-C ellenanyagok jelenlétére, valamint emelkedett ALAT-aktivitásra nézve. A plazmaferezissel kapott plazmákat külön-külön lefagyasztottuk, és a frakcionálási megelőzően 0-4 °C-on óvatosan felolvasztottuk, majd összekevertük. A jégmentes elegyített plazmát 2-4 °C-on, folyamatos centrifugában (Cepa, Lahr, Németország) centrifugáltuk (1 1/perc; 12000 fordulat/perc). A felülúszót 1,2 pm áteresztőképességű szűrőn átszűrtük (Opticap®, Millipore, Bedford MA, USA). Ezt követően 1% Triton®-X-100 (Rohm és Haas, Frankfurt, Németország) és 1% tri(n-butil)-foszfát (Merck, Darmstadt, Németország) alkalmazásával, 4-4,5 órán át, 30 °C-on végzett oldószer/detergens kezeléssel Horowitz és munkatársai szerint vírusinaktiválást végeztünk [Thrombosis and Haemostasis 65, 1163 (1991)]. A vírusinaktivált oldatot 10-18 órán át 37 °C-on állni hagytuk. A feltisztult alsó fázist eltávolítottuk és 0,2 pm áteresztőképességű szűrőn átszűrtük (Sealkleen NFP 7002, Pali, Dreieich, Németország). Huszonöt liter térfogatú, oldószerrel és detergenssel kezelt plazmát 10 mmol/1 nátrium-foszfátpufferben hígítottunk az ekvilibráló puffer konduktivitásának eléréséig (50 mmol/1 nátrium-foszfátpuffer, pH 5,5; 3,2 mS/cm), a pH-t 5,5-re állítottuk, 1,2 pm áteresztőképességű szűrőn átszűrtük (Opticap®, Millipore, Bedford MA, USA), és egy 706 cm² alapterülettel és 7,5 cm magassággal rendelkező oszlopban 150 cm/óra átfolyási sebesség mellett, előzőleg 50 mmol/1 nátrium-foszfát-pufferrel (pH 5,5) ekvilibrált MacroPrep®-CM-gélhez kötöttük (BioRad, Hercules CA; USA). A hőmérsékletet 20-25 °C között tartottuk. Az oszlopot ezután 40-szeres oszloptérfogatnak megfelelő 25 mmol/1 nátrium-foszfát-pufferrel mostuk (pH 7,0) és az anti-D-t tartalmazó IgG-frakciót 25 mmol/1 nátrium-foszfát-puffert és 0,2 mol/1 nátrium-kloridot tartalmazó pufferrel (pH 7,5) eluáltuk. A pH-t 6,6-ra állítottuk, és az eluátumot 100 mg/ml szacharóz hozzáadását követően 200 pg anti-D IgG-t tartalmazó dózisokban 0,2 pm áteresztőképességű szűrőn átszűrtük (Millidisk® MCGL-10, Millipore, Bedford MA, USA), majd liofílizáltuk.

3. példa

Öt (5) ml térfogatú, előzőleg oldószerrel és detergenssel kezelt plazmát az ekvilibráló puffer konduktivitásának eléréséig hígítottunk (3,3 mS/cm), majd 2 cm² alapterülettel és 5 cm magassággal rendelkező DEAE-Sephadex®-A50-gélt (Pharmacia, Uppsala, Svédország) tartalmazó oszlopon, 30 cm/óra átfolyási sebesség mellett kromatografáltunk. Előzőleg a gélt 25 mmol/1 nátrium-foszfát-pufferrel (pH 7,5) ekvilibráltuk. A hőmérsékletet körülbelül 20-25 °C között tartottuk. További tisztítás céljából a gélhez nem kötődött IgG-frakció pH-ját 0,2 mol/1 koncentrációjú HCl-oldattal 5,5-re állítottuk 3,2 mS/cm konduktivitás eléréséig, majd egy 0,8 cm² alapterülettel és 6,5 cm magassággal rendelkező oszlopban 230 cm/óra átfolyási sebesség mellett, előzőleg 50 mmol/1 nátrium-foszfát-pufferrel (pH 5,5) ekvilibrált MacroPrep®-50-CM-gélhez kötöttük (BioRad, Hercules CA; USA). Az anti-D IgG-t tartalmazó IgG-frakciót 25 mmol/1 foszfátpuffert és 0,2 mol/1 NaCl-ot tartalmazó pufferrel eluáltuk (pH 5,5), majd a végső készítménnyé alakítottuk. A DEAE-Sephadex®-A50 gélt egyszeri használatot követően eldobtuk. A MacroPrep®-50-CM-gélt 1 normál/1 NaOH-oldattal regeneráltuk, pirogénmentessé mostuk, így az legalább húsz alkalommal újra felhasználható.

4. példa

Az 1-3. példák szerinti eljárásokat ismételtük meg, azzal az eltéréssel, hogy kiindulási anyagként plazma helyett immunglobulintartalmú plazmafrakciót alkalmaztunk, melyet megfelelő mennyiségű kiindulási plazmából nyertünk oly módon, hogy a Cohn eljárása szerint kapott I. + 11.+111. frakciókat vagy II.+III. frakciókat [Cohn E. J. és munkatársai: J. Am. Chem. Soc. 68 459 (1949)] vagy Kistler és Nitschmann eljárása szerinti A-precipitátumot vagy gamma-globulinprecipitátumot [Kistler P. és Nitschmann H.: Vox Sang. 7, 414 (1962)] állítottunk elő és azt 30 g/1 koncentráció eléréséig ekvilibráló pufferben hígítottuk, a fenti eljárások alkalmazásával hasonló eredményeket kaptunk.

5. példa

Az 1 -4. példák szerinti eljárásokat ismételtük meg, azzal az eltéréssel, hogy a MacroPrep®-50-CM-gélről (BioRad, Hercules CA; USA) az anti-D-tartalmú IgGfrakciót 25 mmol/1 foszfátpuffert és 0,2 mol/1 NaCl-ot tartalmazó puffer (pH 7,5) helyett 0,1 mol/1 glicint és 0,5 mol/1 nátrium-kloridot tartalmazó pufferrel (pH 9) vagy általánosságban pH-változtatással és/vagy az ionerősség változtatásával és/vagy a puffer összetételének egyéb változtatásával eluáltuk, a fenti eljárásokkal hasonló eredményeket kaptunk.

6. példa

Az 1-2. példák szerinti eljárásokat ismételtük meg, azzal az eltéréssel, hogy a MacroPrep®-50-CM-gélt (BioRad, Hercules CA; USA) 25 mmol/1 foszfátpuffer (pH 7,0) helyett 10 mmol/1 glicinnel mostuk (pH 9,0), a fenti eljárással hasonló eredményt kaptunk.

HU 216 864 Β

7. példa

Az 1. példa szerint előállított anti-D-tartalmú eluátum összetételét az alábbi feltételeknek megfelelően módosítottuk:

	1. folyékony készítmény	2. folyékony készítmény	3. folyékony készítmény	4. folyékony készítmény
anti-D	100 pg/ml	100 pg/ml	100 pg/ml	100 pg/ml
glicin	20,6 mg/ml	20,6 mg/ml	20,6 mg/ml	20,6 mg/ml
albumin	-	10 mg/ml	50 mg/ml	100 mg/ml
PH	5,20	5,20	5,20	5,20
dózis	2 ml	2 ml	2 ml	2 ml

	5. folyékony készítmény	6. folyékony készítmény	7. folyékony készítmény	8. folyékony készítmény
anti-D	100 pg/ml	100 pg/ml	100 pg/ml	100 pg/ml
mannitol	50 mg/ml	50 mg/ml	50 mg/ml	50 mg/ml
albumin	-	10 mg/ml	50 mg/ml	100 mg/ml
PH	5,20	5,20	5,20	5,20
dózis	2 ml	2 ml	2 ml	2 ml

és 0,2 pm áteresztőképességű szűrőn (Millipack®-20, Millipore, Bedford MA, USA) történő szűrést követően steril körülmények mellett, azonnal felhasználható Hypac-fecskendőkbe töltöttük (Vetter, Ravensburg, Németország).

8. példa

Az 1. példa szerinti DEAE-szűrt anyagot 30 percig, 20-25 °C-on, körülbelül pH 5,5 mellett, 1 gramm proteinre számítva 0,2 g alumínium-hidroxid-géllel kezeltük, majd folytattuk az 1. példában leírt eljárást.

9. példa

Az 1 -6. példák szerinti eljárásokat ismételtük meg, azzal az eltéréssel, hogy a MacroPrep®-50-CM-gél (BioRad, Hercules CA; USA) helyett a megfelelő funkciós csoporttal rendelkező alábbi gélek közül valamelyiket alkalmaztuk: CM-Spherodex® (Biosepra, Villeneuve la Garenne, Franciaország), CM-Trisacryl® (Biosepra, Villeneuve la Garenne, Franciaország), CM-Sepharose®-FF (Pharmacia, Uppsala, Svédország) vagy Fractogel®-TSK CM-650 (Merck, Darmstadt, Németország), a fenti gélek alkalmazásával hasonló eredményeket kaptunk.

10. példa

Az 1. példa szerinti, valamint a 3-6. példák szerinti eljárásokat ismételtük meg, azzal az eltéréssel, hogy DEAE-Sephadex®-A50-gél helyett MacroPrep®-DEAE-gélt (BioRad, Hercules CA; USA) alkalmaztunk, a fenti gélek alkalmazásával hasonló eredményeket kaptunk.

A fenti 1-6. példákban említett kromatográfiás lépéseket végezhetjük batch-, oszlop- vagy membránkromatográfiás lépésekként is, a különböző módszerek alkalmazásával hasonló eredményeket kapunk.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás anti-D immunglobulin-G-készítmény előállítására humán plazmából, melynek specifikus aktivitása 1 gramm össz-IgG-ben több, mint 1% antiD IgG, azzal jellemezve, hogy rhesus-D-faktorral érzékenyített donoroktól nyert rhesus-negativ vérből előállított plazmát vagy anti-D IgG-t tartalmazó plazma-frakciót

i) 3,5-6,5 pH-érték és 2-4 mS/cm konduktivitás mellett, funkciós csoportként karboxi-metil-csoportokat tartalmazó adszorbens alkalmazásával ioncserélő kromatográfiás lépésnek vetjük alá, melynek során az antiD IgG az adszorbenshez kötődik, ii) a kötődött anti-D IgG-t tartalmazó adszorbenst először 5 és 8 közötti pH-érték és 2-4 mS/cm konduktivitás mellett mosófolyadékkal mossuk, ezután az antiD IgG-t eluáljuk, majd iii) az eluált anti-D IgG-t a nem kívánt összetevők eltávolítása céljából 6-8 pH-érték és 2-4 mS/cm konduktivitás mellett ioncserélő tulajdonsággal rendelkező alkalikus adszorbenssel kezeljük, és végül az anti-D IgG-t koncentráljuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az anti-D IgG-t az iii) lépésben oly módon koncentráljuk, hogy az i) és ii) lépéseket legalább egyszer megismételjük.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kiindulási anyagként a nem kívánt összetevők megkötése céljából, előzőleg ioncserélő tulajdonsággal rendelkező bázikus adszorbenssel kezelt plazmát alkalmazunk.
4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a plazma vagy plazmafrakció proteáztartalmát adszorbenssel, például alumínium-hidroxidgéllel történő inkubálás útján csökkentjük.

HU 216 864 Β
5. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy valamennyi ioncserélő kromatográfiás lépést, és kívánt esetben a további adszorpciós lépéseket batch-, oszlop- vagy membránkromatográfiás lépésként végzünk.
6. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az iii) lépés szerint dietil-amino-etilfiinkciós csoportokat tartalmazó alkalikus adszorbenst alkalmazunk.
7. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ii) lépés szerint az elúciót pH-változtatással és/vagy a pufferösszetétel változtatásával végezzük, például a pufferösszetétel ionkoncentrációjának vagy konduktivitásának megváltoztatása útján.
8. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eljárás során legalább egy vírusinaktíválási lépést is végrehajtunk.
9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vírusinaktiválási lépés során a plazmát vagy az anti-D IgG-tartalmú plazmafrakciót detergenssel és tri(nbutil)-foszfáttal kezeljük, az oldószert és detergenst tartalmazó elegyet fázisokra választjuk szét, és a továbbiakban a tiszta alsó fázist használjuk.
10. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vírusinaktiválási lépésben hőkezelést hajtunk végre.
11. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eljárás során legalább egy víruseltávolítási lépést végrehajtunk.
12. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a víruseltávolítási lépésben nanoszűrést hajtunk végre.
13. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kiindulási plazmát vagy plazmafrakciót az i) lépésben végzett ioncserélő kromatográfiát megelőzően az alábbi lépések legalább egyike szerint kezeljük:

a) a plazmát lefagyasztjuk, a krioprecipitátumot olvasztást követően és a további felhasználást megelőzően szűréssel és/vagy centrifugálással szétválasztjuk,

b) a plazmát oldószer-detergens keverékkel kezeljük, körülbelül 37 °C-on inkubáljuk, és a fázisokat elválasztjuk.
14. Gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás alkalmazásával lett előállítva, és gyógyászatilag elfogadható hordozó- és/vagy egyéb adalékanyagokat is tartalmaz.
15. A 14. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy 20-200 pg/ml anti-D IgG-t, kevesebb, mint 5 pg/ml IgA-t tartalmaz, teljes proteintartalma legfeljebb 10%, a pH-értéke 5,0 és 7,5, előnyösen 5,0 és 5,5 közötti, és glicin vagy cukor és NaCl kombinációjának hozzáadásával beállított ozmolaritása enyhén hipertóniás.