PL180358B1 - Sposób wytwarzania koncentratu anty-D immunoglobuliny G PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL - Google Patents

Abstract

1 . Sposób wytwarzania koncentratu anty-D immunoglobuliny G o aktywnosci wlasci- wej ponad 2% anty-D IgG na gram calkowitej IgG, z ludzkiego osocza, znamienny tym, ze osocze Rh-ujemnych dawców krwi uczulonych na czynnik rezusa D, lub frakcje osocza za- wierajaca anty-D IgG A) o pH w zakresie 3,5 - 6,5 i o przewodnictwie w zakresie 2 - 4 mS/cm, poddaje sie chromatografii jonowymiennej na adsorbencie zawierajacym grupy karboksymetylowe jako grupy funkcyjne, tak ze anty-D IgG zostanie zwiazana z adsorbentem, B) adsorbent ze zwiazana anty-D IgG przeplukuje sie najpierw roztworem przemy- wajacym o pH w zakresie 5 - 8 i o przewodnictwie w zakresie 2 - 4 mS/cm, po czym anty-D IgG eluuje sie, a nastepnie C) eluowana anty-D IgG przy pH w zakresie 6 -8 oraz przewodnictwie w zakresie 2 - 4 mS/cm poddaje sie obróbce alkalicznym adsorbentem o wlasciwosciach jono- wymiennych w celu zwiazania niepozadanych skladników, a na koniec anty-D IgG zateza sie. PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowego koncentratu anty-D (anty-rezusowej) immunoglobuliny G (anty-D IgG), do środka farmaceutycznego zawierającego taki koncentrat jako składnik aktywny.

Choroba hemołityczna noworodków stanowi ogólne określenie niedokrwistości hemolitycznej płodów i noworodków spowodowanej przez przeciwciała matki. Przeciwciała te skierowane są przeciw antygenom na powierzchni erytrocytów płodowych. Dotyczy to antygenów Rh, AB O lub innych układów grup krwi.

Do najważniejszych antygenów grup krwi (rezusa) należąD, wyraźnie mniej immunogeniczne antygeny antytetyczne C, c i E, e, a także D^u; znanych jest ponad 40 innych antygenów (rezusa) Rh. Znaczenie kliniczne z uwagi na niezgodność Rh ma przede wszystkim antygen D rezusa (RhD; Rh₀), białko błonowe erytrocytów, które zostało ostatnio sklonowane, a jego struktura podstawowa została opisana (Le Van Kim i inni, PNAS USA, 89,10925,1992). Antygen D znaleźć można u około 95% ludzi rasy kaukaskiej w Europie. Osobnicy zawierający antygen D są określani jako Rh-dodatni. Osobnicy nie zawierający antygenu D określani są jako Rh-ujemni. Przeciwciała o specyficzności anty-D stanowią najbardziej rozpowszechnione nieregularne przeciwciała Rh i powstają przede wszystkim w czasie ciąży z niezgodnością Rh oraz po transfuzji krwi o niezgodnym Rh. Przeciwciała anty-D należą przede wszystkim do podklas IgG 1 i 3 (IgGl i IgG3).

Dotychczas brak jest niezawodnego, skutecznego przyczynowego leczenia ciężarnych kobiet uczulonych na Rh. W związku z tym, że odczulanie nie jest możliwe, zapobieganie uczulenia na Rh za pomocą immunoglobuliny anty-D ma decydujące znaczenie dla Rh-ujemnych kobiet podczas ciąży.

Bez leczenia do 17% kobiet w I ciąży z konfliktem Rh (matka Rh-ujemna, dziecko Rh-dodatnie) zostałoby uczulonych na antygen Rh w czasie ciąży lub podczas porodu.

Preparaty anty-D stosowane są z powodzeniem od ponad 30 lat, aby zapobiec uczulenia na (rezusa) Rh-ujemnych lub odpowiednio D^u-dodatnich kobiet odpowiednio w odniesieniu do czynnika rezusa D lub D^u, a tym samym zapobiec chorobom noworodków związanym z anty-D, a zwłaszcza erytrobłastozie rezusowej we wszystkich postaciach.

Ryzyko uczulenia na Rh wzrasta wraz z ilością dopływających płodowych erytrocytów Rh-dodatnich. Zalecana przez WHO (Międzynarodową Organizację Zdrowia) dawka lecznicza 200 pg anty-D IgG w profilaktyce poporodowej wystarcza do zobojętnienia do 10 ml erytrocytów płodowych (co odpowiada około 20 ml krwi płodowej) i w związku z tym chroni przed uczuleniem Rh u około 90% przypadków, nawet przy większym dopływie; w związku z tym oczekuje się występowania uczulenia na antygen rezusa jedynie u 1 - 2% spośród wszystkich kobiet w I ciąży z konfliktem Rh. Stosując dodatkowo rutynowąprofilaktykę rezusową w czasie ciąży (profilaktykę przedporodową) ryzyko uczulenia można zmniejszyć do 0,1 - 0,2% kobiet w I ciąży z konfliktem Rh.

Na dodatek anty-D jest również stosowana po nieprawidłowej transfuzji Rh-dodatniej krwi Rh-ujemnym biorcom; dawkę należy dopasować do ilości wprowadzonych Rh-dodatnich erytrocytów.

Od szeregu lat dyskutuje się nad zastosowaniem immunoglobuliny anty-D w leczeniu samoistnej plamicy małopłytkowej (ITP).

Badania farmakokinetyczne IgG wstrzykniętej do organizmu domięśniowo i dożylnie wykazują wyraźnie, że podawanie dożylne jest korzystne pod wszelkimi względami. Przy iniekcji domięśniowej należy oczekiwać opóźnienia maksimum aktywności oraz spadku skuteczności z uwagi na powolne wchłanianie depotu i miejscowąproteolizę. Maksymalnego stężenia IgG w osoczu nie osiąga się u zdrowych badanych osobników przed upływem 4 dni po iniekcj i, a u obłożnie chorych osobników przed upływem 6 dni po iniekcji. Ponadto maksymalne stężenie IgG w osoczu badanych zdrowych osób wynosi jedynie około 30%, a u osób obłożnie chorych jedynie 20% dawki wstrzykniętej.

W porównaniu z iniekcją domięśniową podawanie dożylne ma istotne zalety. Tylko przy takim sposobie podawania cała podana dawka działa niezależnie od aktywności fizycznej osob

180 358 nika; poziom IgG w osoczu spada w ciągu 5 dni, praktycznie niezależnie od aktywności ciała, do około 3 5 - 40% podanej dawki, tak że dopiero w piątym dniu uzyskuje się wielkości porównywalne z maksymalnym stężeniem osiąganym po iniekcji domięśniowej (A. Moreli i inni, Vox Sang. 38, 272, 1980).

Przy wytwarzaniu preparatów immunoglobuliny w skali przemysłowej obecnie wykorzystuje się różne sposoby frakcjonowania:

Sposoby strącania zimnym etanolem, np. metodą Cohn'a lub zmodyfikowaną metodą Cobńa, sąprzydatne przede wszystkim przy przeróbce osocza w ilościach ponad 500 litrów/tydzień. W wyniku specjalnej obróbki, np. pepsynąprzy pH 4, uzyskiwać można wydzielone w ten sposób immunoglobuliny dobrze przyjmowane przy podawaniu dożylnym. Inne sposoby strącania oparte są na specyficznym strącaniu immunoglobuliny siarczanem amonowym, siarczanem sodowym, glikolem polietylenowym, kwasem kaprylowym lub rywanolem (Przegląd - patrz J. M. Curling, Separation of Plasma Proteins, J. M. Curling, red., 1983, Pharmacia, Uppsala, Szwecja).

Sposób wydzielania immunoglobuliny na drodze periodycznej adsorpcji na jonitach po raz pierwszy opisano już w 1964 roku (J. S. Baumstark i inni, Arch. Biochem. Biophys., 108, 514, 1964). W następnych latach opracowano również szereg metod kolumnowych (CH-A-572745; US-A-3 869 436; EP-A-0 085 747), które zastosowano między innymi do frakcjonowania immunoglobuliny anty-D (A. D. Friesen i inni, Journal of Appl. Biochem. 3, 164, 1981).

Nieoczekiwanie, sposobem według wynalazku otrzymano preparat anty-D immunoglobuliny G o aktywności właściwej ponad 2% anty-D IgG na gram całkowitej IgG - jak to wskazuje przykład I, a więc zaskakująco wyższą aktywność właściwą 10-20 razy wyższą w porównaniu do aktywności właściwej tego samego preparatu, rzędu 0,23 do 0,30, otrzymywanego sposobami znanymi z opisu patentowego EP 085 747 oraz publikacji „Journal of Applied Biochemistry”, vol. 3, 1981, New York, page 164-173.

Prowadzona sposobem według wynalazku chromatografia jonowymienna ludzkiego osocza przez zastosowaniem specjalnych warunków: np. pH, chromatografii na żelu kationitu, pozwoliła na usunięcie, jak oczekiwano, albumin i a- i β- globuliny ale również, nieoczekiwanie usunięto ponad 90% wszystkich cząsteczek IgG.

Frakcja anty-D zawiera jeszcze około 9% całkowitych cząsteczek IgG w składzie około 84% IgG, 7% IgG2 i 9% IgG3, jednocześnie frakcja ta zawiera jeszcze około 80% właściwych cząstek anty-D-IgG.

Dzięki temu, w sposobie według wynalazku otrzymano zaskakująco wyższą aktywność właściwą stosunkowo czystą substancję aktywną oraz o możliwie wysokim stężeniu w porównaniu ze znanymi ze stanu techniki cytowanymi powyżej, sposobami.

Wszystkie opisane sposoby umożliwiają uzyskiwanie wysokiej wydajności IgG jako całości o wysokim poziomie czystości i o niezmienionym rozrzucie podklas IgG, ale bez odpowiedniego zatężania pewnych podklas IgG lub określonych cząsteczek IgG takich jak np. anty-D IgG.

Większość preparatów immunoglobuliny anty-D nadaje się jedynie do podawania domięśniowego. W całym świecie na rynku znajduje się jedynie kilka preparatów dobrze tolerowanych przy podawaniu dożylnym. Jeden z takich preparatów stanowi immunoglobulina anty-D SRK wytwarzana metodą frakcjonowania Kistlera i Nitschmanna (P. Kistler i H. Nitschmann, Vox Sang, 7, 414, 1962), której dobre tolerowanie przy podawaniu dożylnym zapewnia się poprzez łagodną obróbkę pepsynąprzy pH 4. W związku z tym, że przy takim sposobie frakcjonowania wydajność specyficznych przeciwciał anty-D j est bardzo mała, a równocześnie hiper-immunizowane osocze należy do rzadkości, istnieje zapotrzebowanie na nowy sposób, który w przeciwieństwie do sposobów opisanych, mógłby zapewnić uzyskanie, nawet z puli osocza o niskim mianie anty-D, czystego preparatu IgG o wysokiej zawartości i aktywności właściwej anty-D.

Celem wynalazku jest dostarczenie sposobu wytwarzania czystego koncentratu anty-D, o szczególnie wysokim stężeniu podklas IgG 1 i 3 immunoglobuliny anty-D. Stwierdzono, że można to osiągnąć w zaskakująco prosty sposób, usuwając równocześnie ponad 85% niespecyficznej IgG oraz prawie wszystkie niepożądane inne składniki osocza, z osocza krwi lub uzyska

180 358 nych z niego frakcji zawierających immunoglobulinę, specjalnie dobranych i specjalnie immunizowanych dawców krwi o mianie wynoszącym korzystnie ponad 30 μΐ/rnl anty-D IgG, w wyniku chromatografii jonowymiennej sposobem według wynalazku. Koncentrat anty-D uzyskany z wysoką wydajnością wykazuje ponadto zwiększoną aktywność właściwą (gramy anty-D IgG na gram całkowitej IgG), a ponadto można go bardziej oczyszczać w wyniku dodatkowej obróbki na innych jonitach lub na żelu wodorotlenku glinu, stosując pojedynczą obróbkę lub odpowiednie kombinacje.

Innym celem wynalazku jest dostarczenie preparatu anty-D zawierającego jedynie śladowe ilości IgA, dobrze tolerowanego przy podawaniu dożylnym, który po dodaniu odpowiednich stabilizatorów, po liofilizowaniu lub, korzystnie, w roztworze, można przechowywać przez szereg miesięcy bez utraty aktywności. Stwierdzono, że czysty koncentrat anty-D wytworzony sposobem według wynalazku spełnia te wymagania, to znaczy między innymi wykazuje aktywność właściwą nie osiąganą nigdy przedtem, jest dobrze tolerowany przy podawaniu dożylnym i wykazuje wyjątkowo niską zawartość IgA. Na dodatek koncentrat anty-D wykazuje nienormalny rozrzut podklas IgG, gdyż jest znacznie wzbogacony w podklasy IgG 1 i 3, a znacznie zubożony w podklasy 2 i 4.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania preparatu immunoglobuliny G anty-D o aktywności właściwej ponad 2% IgG anty-D na gram całkowitej IgG, z ludzkiego osocza, polegający na tym, że osocze Rh-ujemnych dawców krwi uczulonych na czynnik rezusa D, lub frakcję osocza zawierającą anty-D IgG

A) o pH w zakresie 3,5 - 6,5 i o przewodnictwie w zakresie 2-4 mS/cm, poddaje się chromatografii jonowymiennej na adsorbencie zawierającym grupy karboksymetylowe jako grupy funkcyjne, tak że anty-D IgG zostanie związana z adsorbentem,

B) adsorbent ze związaną anty-D IgG przepłukuje się najpierw roztworem przemywającym o pH w zakresie 5 - 8 i o przewodnictwie w zakresie 2-4 mS/cm, po czym anty-D IgG eluuje się, a ponadto

C) eluowaną anty-D IgG przy pH w zakresie 6-8 oraz przewodnictwie w zakresie 2-4 mS/cm poddaje się obróbce alkalicznym adsorbentem o właściwościach jonowymiennych w celu związania niepożądanych składników, a na koniec anty-D IgG zatęża się.

Sposobem według wynalazku immunoglobulinę uzyskać można bezpośrednio z ludzkiego osocza. Wyjściowy materiał stanowi osocze Rh-ujemnych dawców uczulonych na czynnik D rezusa. Poszczególne dawki uzyskane w wyniku plazmaferezy korzystnie zamraża się i ostrożnie odmraża się w 0 - 4°C przez frakcjonowanie, po czym uśrednia się. Uśrednione osocze powinno zawierać ponad 10 pg anty-D IgG na ml, korzystnie ponad 30 pg anty-D IgG na ml. Frakcję osocza stosowaną w chromatografii jonowymiennej można wstępnie oczyszczać znanymi sposobami takimi jak np. oddzielanie krioglobulin lub strącanie frakcjonujące za pomocą etanolu (E. J. Cohn i inni, J. Am. Chem. Soc. 68,459,1946; Kistler i H. Nitschmann, Vox Sang. 7,414,1962) albo innymi sposobami strąceniowymi takimi jak strącanie immuno globulin siarczanem amonowym, siarczanem sodowym, glikolem polietylenowym, kwasem kaprylowym lub rywanolem, metodą chromatograficzną albo stosując kombinację podanych sposobów. Przed przeprowadzeniem chromatografii jonowymiennej sposobem według wynalazku osocze wolne od krioglobuliny lub frakcję osocza zawierającą immunoglobulinę rozpuszczoną w buforze do ekwilibracji korzystnie sączy się i w celu zdezaktywowania ukrytych wirusów poddaje się obróbce biokompatybilnym rozpuszczalnikiem organicznym takim jak np. fosforan tri(n-butylu) i detergentem takim jak np. 0-[4-(l,l,3,3-tetrametylobutylo)fenylo]deka(oksyetylen) (Triton® Χ-100), zgodnie ze sposobem opisanym przez Horowitza (Thrombosis and Haemostasis 65, 1163, 1991). Mieszaninę osocza, rozpuszczalnika i detergentu inkubuje się następnie w 37°C. W warunkach tych następuje rozdział faz. Klarowną dolną fazę oddziela się, rozcieńcza, sączy i nastawia na warunki ekwilibracji chromatografii jonowymiennej , przy czym temperatura w następnych etapach wynosi z reguły ponad 10°C, a korzystnie 20 - 25°Ć. W pierwszym etapie oczyszczania anty-D IgG z poddanego wstępnej obróbce produktu wiąże się ze słabo kwaśnym żelem jonowymiennym, korzystnie zawierającym

180 358 karboksymetylowe (CM) grupy funkcyjne. W ten sposób wymyte zostaje ponad 98% obcych białek; równocześnie następuje usunięcie rozpuszczalnika i detergentu stosowanego do dezaktywacji wirusów. Anty-D IgG podklas 1 i 3 IgG specyficznie zatężone w tym etapie eluuje się z żelu jonowymiennego podwyższając przewodnictwo korzystnie do poziomu ponad 10 mS/cm. Eluat stanowi czysta frakcja IgG; zawiera on mniej niż 15% całkowitej frakcji IgG i wykazuje zmieniony rozrzut podklas IgG: IgGl i IgG3 są silnie zatężone, a ilości IgG2 i IgG4 są znacznie zmniejszone. Taką frakcję anty-D IgG oczyszcza się dalej stosując obróbkę drugim, słabo alkalicznym żelem jonowymiennym, korzystnie z dietyloaminoetylowymi (DEAE) grupami funkcyjnymi, przy czym w wybranych warunkach anty-D IgG nie wiąże się z wymieniaczami jonowymi. W celu zwiększenia stężenia oczyszczoną frakcję anty-D IgG korzystnie wiąże się po raz drugi z żelem jonowymiennym CM, po czym eluuje się jąmożliwie w jak najbardziej stężonej formie w odpowiednich warunkach i przerabia na produkt finalny. W celu uzyskania warunków według wynalazku nie ma istotnego znaczenia, czy frakcję anty-D IgG eluuje się zwiększając stężenie jonów, zmieniając pH czy też zmieniając skład buforu. W celu zmniejszenia stężenia kolejnych niepożądanych zanieczyszczeń roztwór można dodatkowo poddać obróbce adsorbentem takim jak np. żel wodorotlenku glinu, w dowolnym stadium procesu. Obróbkę rozpuszczalnikiem/detergentem można zastąpić lub uzupełnić dowolnym znanym etapem dezaktywacji/usuwania wirusów, stosując np. obróbkę cieplną taką jak np. pasteryzacja, albo nanofiltrację.

Anty-D IgG wytworzona sposobem według wynalazku jest stabilna w stanie płynnym. Jest ona również dobrze tolerowana przy podawaniu dożylnym, zawiera IgA w ilości poniżej 5 pg/ml oraz IgG w ilości 1 - lOpg/ml. pH wynosi około 5,2. Preparat korzystnie zawiera do 25 mM fosforanu, do 200 mM NaCl i do 100 mg/ml ludzkiej albuminy, a ewentualnie 250 - 300 mM aminokwasu takiego jak np. glicyna, do 100 mg/ml dwucukru takiego jak np. sacharoza lub 50 mg/ml monocukru takiego jak np. mannitol.

Anty-D IgG wytworzoną sposobem według wynalazku można liofilizować przy pH około 6,6 z dodatkiem dwucukru, np. 100 mg/ml sacharozy, przy dawce 200 pg anty-D IgG.

Załączony rysunek ilustruje wynalazek nie narzucając przy tym jakichkolwiek ograniczeń. Przedstawiono na nim typowy chromatogram pierwszej chromatografii jonowymiennej opisanej w przykładzie I.

Sposób według wynalazku dokładniej wyjaśniają poniższe przykłady.

Przykład I. Wyjściowy materiał stanowiło osocze Rh-ujemnych kobiet lub Rh-ujemnych mężczyzn, uczulonych na czynnik D rezusa odpowiednio dobranymi erytrocytami. Każdąpartię krwi zbadano na obecność antygenów HBs, przeciwciał HIV i przeciwciał zapalenia wątroby C oraz podwyższoną aktywność AL AT. Poszczególne porcje osocza uzyskane na drodze plazmaferezy zamrażano i przed frakcjonowaniem ostrożnie odmrażano w 0 - 4°C i uśredniano. Uśrednione osocze nie zawierające lodu o zawartości anty-D 25 pg/ml odwirowywano (1 litr/minutę, 12000 obrotów/minutę) w wirówce o działaniu ciągłym (Cepa, Lahr, Niemcy) w 2 - 4°C. Supematant sączono przez filtr 1,2 pm (Opticap®, Millipore, Bedford MA, USA). Następnie przeprowadzano dezaktywację wirusów metodą Horovitza i innych (Thrombosis and Haemostasis 65,1163,1991), stosując obróbkę rozpuszczalnikiem/detergentem, 1% Triton® Χ-100 (Rhom and Haas, Frankfurt, Niemcy) i 1% fosforanu tri(n-butylu) (Merck, Darmstadt, Niemcy), przez 4 - 4,5 godziny w 30°C. Roztwór po dezaktywacji wirusów odstawiono na 10 - 18 godzin w 37°C. Klarowną dolną fazę oddzielano i sączono przez filtr 0,2 pm (Sealkleen NFP 70002, Pall, Dreieich, Niemcy). 25 litrów przesączonego osocza po obróbce rozpuszczalnikiem i detergentem rozcieńczono buforem, 10 mM fosforanem sodowym do uzyskania przewodnictwa buforu ekwilibracyjnego (50 mM fosforan sodowy, pH 5,5, 3,2 mS/cm), pH doprowadzono do 5,5 przesączono przez filtr 1,2 pm (Opticap®, Millipore, Bedford MA, USA) i związano z MacroPrep® 50 CM (BioRad, Hercules CA, USA) w kolumnie o przekroju 706 cm² i wysokości złoża 7,5 cm, przy szybkości przepływu 150 cm/godzinę, przy czym wstępnie przeprowadzono ekwilibrację żelu buforem, 50 mM fosforanem sodowym o pH 5,5. Utrzymywano temperaturę 20 - 25°C. Kolumnę przemyto następnie buforem, 25 mM

180 358 fosforanem sodowym o pH 7,0 w ilości równej 40 objętościom kolumny, po czym frakcję IgG zawierającą anty-D eluowano 25 mM fosforanem sodowym + 0,2 M chlorkiem sodowym, o pH 7,5. Typowy chromatogram uzyskany przy takiej obróbce przedstawiono na załączonym rysunku. Rysunek przedstawia wykres gęstości optycznej (OD) zarejestrowanej przy 280 nm w funkcji czasu (t). Na podstawie wykresu można stwierdzić, że w czasie obciążenia i przemywania oddzielonych zostaje większość niepożądanych produktów, natomiast w czasie eluowania pojawia się główny, wąski pik zawierający pożądaną anty-D IgG z silnie zatężonąpodfrakcjąlgG. Uzyskana aktywność właściwa wynosi ponad 2% anty-D IgG na gram całkowitej IgG. Eluat rozcieńczano wodą do przewodnictwa 3,3 mS/cm (1 objętość eluatu + około 5 objętości wody), pH doprowadzono do 7,5 za pomocą 0,2 M NaOH i przeprowadzono 2,5-godzinną periodyczną adsorpcję na 100 g suchego DEAE-Sephadex® A50 (Pharmacia, Uppsala, Szwecja). Żel DEAE został poddany wstępnej ekwilibracji buforem, 25 mM fosforanem sodowym o pH 7,5. Niezwiązaną frakcję anty-D IgG przesączono przez sito polipropylenowe i pH nastawiono na 5,5. W celu zwiększenia stężenia przesącz z DEAE związano po raz drugi z MacroPrep® 50 CM (BioRad, Hercules CA, USA) w kolumnie o przekroju 71 cm² i wysokości złoża 12,5 cm, przy szybkości przepływu 230 cm/godzinę, przy czym wstępnie przeprowadzono ekwilibrację żelu buforem, 50 mM fosforanem sodowym o pH 5,5. Frakcję IgG zawierającąanty-D eluowano 25 mM fosforanem sodowym + 0,2 M chlorkiem sodowym, pH 5,5. Żele CM regeneruje się 1 N NaOH i po przemyciu wodą wolną od pirogenów można je ponownie użyć co najmniej 20 razy. Żel DEAE wyrzuca się po jednorazowym użyciu.

Przykład II. Wyjściowy materiał stanowiło osocze Rh-ujemnych kobiet lub Rh-ujemnych mężczyzn, uczulonych na czynnik D rezusa odpowiednio dobranymi erytrocytami. Każdąpartię krwi zbadano na obecność antygenów HBs, przeciwciał HIV i przeciwciał zapalenia wątroby C oraz podwyższoną aktywność AL AT. Poszczególne porcje osocza uzyskane na drodze plazmaferezy zamrażano i przed frakcjonowaniem ostrożnie odmrażano w 0 - 4°C i uśredniano. Uśrednione osocze nie zawierające lodu odwirowywano (1 litr/minutę, 12000 obrotów/minutę) w wirówce o działaniu ciągłym (Cepa, Lahr, Niemcy) w 2 - 4°C. Supernatant sączono przez filtr 1,2 pm (Opitcap®, Millipore, Bedford MA, USA). Następnie przeprowadzano dezaktywację wirusów metodą Horowitza i innych (Thrombosis and Haemostasis 65,1163, 1991), stosując obróbkę rozpuszczalnikiem/detergentem, 1% Triton® Χ-100 (Rohm andHass, Frankfurt, Niemcy) i 1% fosforanu tri(n-butylu) (Merck, Darmstadt, Niemcy), przez 4 - 4,5 godziny w 30°C. Roztwór do dezaktywacji wirusów odstawiano na 10 -18 godzin w 37°C. Klarownądolnąfazę oddzielano i sączono przez filtr 0,2 pm (Sealkleen NFP 70002, Pall, Dreieich, Niemcy). 25 litrów przesączonego osocza po obróbce rozpuszczalnikiem i detergentem rozcieńczono buforem, 10 mM fosforanem sodowym do uzyskania przewodnictwa buforu ekwilibracyjnego (50 mM fosforan sodowy, pH 5,5,3,2 mS/cm), pH doprowadzono do 5,5 przesączono przez filtr 1,2 pm (Opitcap®, Millipore, Bedford MA, USA) i związano z MacroPrep® 50 CM (BioRad, Hercules CA, USA) w kolumnie o przekroju 706 cm² i wysokości złoża 7,5 cm, przy szybkości przepływu 150 cm/godzinę, przy czym wstępnie przeprowadzono ekwilibrację żelu buforem, 50 mM fosforanem sodowym o pH 5,5. Utrzymywano temperaturę 20 -25°C. Kolumnę przemyto następnie buforem, 25 mM fosforanem sodowym o pH 7,0 w ilości równej 40 objętościom kolumny, po czym frakcję IgG zawierającą anty-D eluowano 25 mM fosforanem sodowym + 0,2 M chlorkiem sodowym, o pH 7,5. Po uzyskaniu pH 6,6 i dodaniu 100 mg/ml sacharozy przy dawce 200 pg anty-D IgG eluat przesączono przez filtr 0,2 pm (Millidisk® MCGL-10, Millipore, Bedford MA, USA), a następnie liofilizowano.

Przykład III. 5 ml osocza po obróbce rozpuszczalnikiem i detergentem rozcieńczono do uzyskania przewodnictwa buforu ekwilibracyjnego (3,3 mS/cm) i chromatografowano w kolumnie o przekroju 2 cm² o wysokości złoża 5 cm przy szybkości przepływu 30 cm/godzinę, stosując DEAE Sephadex® A50 (Pharmacia, Uppsala, Szwecja). Żel był uprzednio ekwilibrowany buforem, 25 mM fosforanem sodowym o pH 7,5. Utrzymywano temperaturę około 20 25°C. W celu dokładniejszego oczyszczenia niezwiązanąfrakcję IgG doprowadzono do pH 5,5 za pomocą0,2 M HC1 i do przewodnictwa 3,2 mS/cm, po czym związano z MacroPrep® 50 CM

180 358 (BioRad, Hercules CA, USA) w kolumnie o przekroju 0,8 cm^{i 2} i wysokości złoża 6,5 cm, przy szybkości przepływu 230 cm/godzinę, przy czym wstępnie przeprowadzono ekwilibrację żelu buforem, 50 mM fosforanem sodowym o pH 5,5. Frakcję IgG zawierającąanty-D eluowano 25 mM fosforanem sodowym + 0,2 M chlorkiem sodowym, pH 5,5 i przerobiono na produkt finalny. Żel DEAE Sephadex® A50 wyrzuca się po jednorazowym użyciu; żel MacroPrep® 50 CM regeneruje się 1 N NaOH i po przemyciu wodą wolną od pirogenów można je ponownie użyć co najmniej 20 razy.

Przykład IV. Obróbkę według przykładów I - III powtórzono, ale zamiast osocza zastosowano jako materiał wyjściowy frakcję osocza zawierającą immunoglobulinę, uzyskaną z odpowiedniej ilości wyjściowego osocza, z którego otrzymano frakcję I + II + III lub frakcję II + III według Cohn'a (E. J. Cohn i inni, J. Am. Chem. Soc. 68,459,1949) lub precypitat A albo precypitat γ-globuliny według Kistlera i Nitschmanna (P. Kistler i H. Nitschmann, Vox Sand, 7, 414, 1962), po czym rozpuszczono w buforze ekwilibracyjnym do zawartości białka 30 g/litr, uzyskując analogiczne wyniki.

Przykład V. Obróbkę według przykładów I - IV powtórzono, przy czym frakcję IgG zawierającą anty-D eluowano z żelu MacroProp® 50 CM (BioRad, Hercules CA, USA) mieszanką 0,1 M glicyna + 0,5 M chlorek sodowy o pH 9, albo zmieniając pH i/lub zmieniając siłę jonową i/lub wprowadzaj ąc inne zmiany w składzie buforu, zamiast mieszaniny 25 mM fosforan sodowy + 0,2 M chlorek sodowy, o pH 7,5, uzyskując analogiczne wyniki.

Przykład VI. Obróbkę według przykładu I-II powtórzono, stosując do przemywania MacroPrep® 50 CM (BioRad, Hercules CA, USA) 10 mM glicynę o pH 9 zamiast 25 mM fosforanu sodowego o pH 7,0, uzyskując analogiczne wyniki.

Przykład VII. Przygotowano następujące preparaty eluatu anty-D z przykładu I:

	Ciekły preparat I	Ciekły preparat II	Ciekły preparat III	Ciekły preparat IV
anty-D	100 pg/ml	100 pg/ml	100 pg/ml	100 pg/ml
glicyna	20,6 mg/ml	20,6 mg/ml	20,6 mg/ml	20,6 mg/ml
albumina	-	10 mg/ml	50 mg/ml	100 mg/ml
pH	5,20	5,20	5,20	5,20
dawka	2 ml	2 ml	2 ml	2 ml
	Ciekły preparat V	Ciekły preparat VI	Ciekły preparat VII	Ciekły preparat VIII
anty-D	100 pg/ml	100 pg/ml	100 pg/ml	100 pg/ml
D-mannitol	50 mg/ml	50 mg/ml	50 mg/ml	50 mg/ml
albumina	-	10 mg/ml	50 mg/ml	100 mg/ml
pH	5,20	5,20	5,20	5,20
dawka	2 ml	2 ml	2 ml	2 ml

i po przesączeniu przez filtr 0,2 pm (Millipak®-20, Millipore, Bedford MA, USA) preparatami napełniono w sterylnych warunkach strzykawki Hypac do bezpośredniego użycia (Vetter, Ravensburg, Niemcy).

Przykład VIII. Do przesączu po DEAE z przykładu I o pH około 5,5 dodano na 30 minut w 20 - 25°C 0,2 g żelu wodorotlenku glinu/g białka, przeprowadzając następnie obróbkę jak w przykładzie I.

180 358

Przykład IX. Obróbkę według przykładów I - VI powtórzono, stosując zamiast MacroPrep® 50 CM jeden z następujących żeli z takimi samymi grupami funkcyjnymi: CM-Spherodex® (Biosepra, Villenueve, la Garenne, Francja), CM-Trisacryl® (Biosepra, Villenueve, la Garenne, Francja), CM-Sepharose® FF (Pharmacia, Uppsala, Szwecja) lub Fractogel® TSK CM-650 (Merck, Darmstadt, Niemcy), uzyskując analogiczne wyniki.

Przykład X. Obróbkę według przykładu I oraz przykładów III - VI powtórzono, ale zamiast DEAE-Sephadex® A50 stosując MacroPrep® DEAE (Biorad, Elercules, USA), uzyskując analogiczne wyniki.

Chromatografię we wspomnianych przykładach I - VI można prowadzić jako chromatografię periodyczną w kolumnie lub membranową uzyskując analogiczne wyniki.

180 358

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz. Cena 2,00 zł.

Claims (11)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania koncentratu anty-D immunoglobuliny G o aktywności właściwej ponad 2% anty-D IgG na gram całkowitej IgG, z ludzkiego osocza, znamienny tym, że osocze Rh-ujemnych dawców krwi uczulonych na czynnik rezusa D, lub frakcję osocza zawierającą anty-D IgG

   A) o pH w zakresie 3,5 - 6,5 i o przewodnictwie w zakresie 2-4 mS/cm, poddaje się chromatografii jonowymiennej na adsorbencie zawierającym grupy karboksymetylowe jako grupy funkcyjne, tak że anty-D IgG zostanie związana z adsorbentem,

   B) adsorbent ze związaną anty-D IgG przepłukuje się najpierw roztworem przemywającym o pH w zakresie 5 - 8 i o przewodnictwie w zakresie 2 - 4 mS/cm, po czym anty-D IgG eluuje się, a następnie

   C) eluowaną anty-D IgG przy pH w zakresie 6-8 oraz przewodnictwie w zakresie 2 - 4 mS/cm poddaje się obróbce alkalicznym adsorbentem o właściwościach jonowymiennych w celu związania niepożądanych składników, a na koniec anty-D IgG zatęża się.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że anty-D IgG zatęża się w etapie C), a etapy A) oraz B) powtarza się co najmniej jeden raz.
3. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako materiał wyjściowy stosuje się osocze poddane wstępnej obróbce zasadowym adsorbentem o właściwościach jonowymiennych w celu związania niepożądanych składników.
4. 4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że zawartość proteazy w osoczu lub we frakcji osocza zmniejsza się prowadząc inkubację z adsorbentem takim jak żel wodorotlenku glinu.
5. 5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że wszystkie etapy chromatografii jonowymiennej oraz w razie potrzeby kolejne etapy adsorpcji przeprowadza się jako chromatografię periodyczną, chromatografię kolumnową lub chromatografię membranową.
6. 6. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że alkaliczny adsorbent stosowany w etapie C) zawiera grupy dietyloaminoetylowe jako grupy funkcyjne.
7. 7. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że eluowanie w etapie B) przeprowadza się zmieniając pH i/lub zmieniając skład buforu, np. zmieniając odpowiednio stężenie jonów lub przewodnictwo kompozycji.
8. 8. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że obejmuje co najmniej jeden etap dezaktywacji wirusów.
9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że w etapie dezaktywacji wirusów przeprowadza się obróbkę osocza lub jego frakcji zawierającej anty-D IgG detergentem i fosforanem tri(n-butylu), po czym fazy mieszaniny zawierającej rozpuszczalnik i detergent rozdziela się i wykorzystuje się klarowną fazę dolną.
10. 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie dezaktywacji wirusów przeprowadza się obróbkę cieplną.
11. 11. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że wyjściowe osocze lub wyjściową frakcję osocza przed chromatografią jonowymienną w etapie A) poddaje się obróbce w co najmniej jednym z następujących etapów:

    a) zamrażanie osocza, przy czym krioprecypitat odsącza się i/lub odwirowuje po odmrożeniu, a przed dalszym wykorzystaniem, oraz

    b) obróbka rozpuszczalnikiem i detergentem, inkubowanie w około 37°C i rozdzielanie faz.

    180 358