FI112168B - Menetelmä anti-D-immunoglobuliini G-konsentraatin valmistamiseksi - Google Patents

Description

112168

Menetelmä anti-D-immunoglobuliini G -konsentraatin valmistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää uuden anti-D (anti-5 reesus) -immunoglobuliini G (anti-D-IgG) -konsentraatin valmistamiseksi.

Sikiöillä ja vastasyntyneillä esiintyvästä hemo-lyyttisestä anemiasta, jonka aiheuttavat äidin vasta-aineet, käytetään yleisesti nimitystä morbus haemolyticus 10 neonatorum. Nämä vasta-aineet ovat lapsen erytrosyyteillä olevien antigeenien vastaisia. Tällöin on kyse joko reesus-, ABO- tai muiden veriryhmäjärjestelmien antigeeneistä.

Tärkeimmät reesusveriryhmäantigeenit ovat D, immu- nogeenisesti selvästi vähemmän tehokkaat antigeenit C,c ja 15 E,e samoin kuin Du; niiden ohella tunnetaan yli 40 muuta reesusantigeenia. Kliinisesti tärkeä reesusyhteensopimatto- muuden yhteydessä on ennen kaikkea reesusantigeeni D (RhD;

Rh0) , erytrosyyttien pintaproteiini, joka on vähän aikaa sitten kloonattu ja jonka primaarirakennetta on kuvattu [Le 20 Van Kim et ai., PNAS USA 89 (1992) 10925]. D-antigeeni . esiintyy noin 85 %:lla Euroopan valkoihoisista; näitä yksi- » · ·_ löitä kutsutaan reesuspositiivisiksi. Yksilöitä, joilta • · puuttuu D-antigeeni, kutsutaan reesusnegatiivisiksi. Anti- t ‘ * D-spesifiset vasta-aineet ovat yleisimpiä poikkeavia ree- .· 25 susantigeeneja, ja niitä ilmaantuu ennen kaikkea reesusyh- , teensopimat torni en raskauksien aikana ja reesusyhteensopi- : mattoman veren annon jälkeen. Anti-D-vasta-aineet kuuluvat pääasiassa IgG-alaryhmiin 1 ja 3 (IgGl ja IgG3).

Tähän mennessä ei reesusherkistyneiden raskaana ·. 30 olevien naisten ollessa kyseessä ole tunnettu varmasti tehoavaa kausaalista hoitoa. Koska desensibilisaatiokaan ·* ei ole mahdollista, on hedelmällisessä iässä olevien ree- > * 2 112168 susnegatiivisten naisten kohdalla reesusherkistymisen ennaltaehkäisy anti-D-immunoglobuliinilla erityisen tärkeää.

Ilman hoitoa jopa 17 % ensimmäistä kertaa raskaana olevista, joilla on reesusasetelma (äiti reesusnegatiivi-5 nen, lapsi reesuspositiivinen), herkistyy raskautensa tai synnytyksen aikana reesusantigeenille.

Anti-D-valmisteita on käytetty menestyksellisesti yli 30 vuotta estämään reesusnegatiivisten tai Du-positii-visten naisten reesusherkistymistä reesustekijää D tai Du 10 vastaan ja siten vastasyntyneiden anti-D-peräisiä sairauksia, reesuserytroblastooseja, kaikissa muodoissaan.

Reesusherkistymisen vaara kasvaa sikiön reesuspo-sitiivisten erytrosyyttien huuhtoutumisen lisääntyessä. WH0:n suosittelema hoitoannos, 200 pg anti-D-IgG:tä, riit-15 tää synnytystä seuraavana ennaltaehkäisynä neutraloimaan korkeintaan 10 ml sikiön erytrosyyttejä (vastaa noin 20 ml:aa sikiön verta) ja estää siten, suurempienkin huuhtoutumisten yhteydessä, reesusherkitymisen noin 90 %:ssa tapauksista; siksi vain 1-2 %:lla kaikista ensi kertaa 20 raskaana olevista, joilla on reesusasetelma, on odotettavissa herkistyminen reesusantigeenille. Raskauden aikana : ',· tehtävällä rutiininomaisella lisäehkäisyllä (synnytystä : edeltävällä profylaksialla) voidaan herkistymisriskiä pie- ·, ·· nentää vielä edelleen 0,1 - 0,2 %:iin kaikista ensi kertaa ; 25 raskaana olevista.

Anti-D:tä käytetään lisäksi myös sen jälkeen kun t ^ reesusnegatiivisille vastaanottajille on virheellisesti * · annettu reesuspositiivistä verta; tällöin annostus on sovitettava reesuspositiivisten erytrosyyttien saantimää- ;* 30 rään.

·' Joitakin vuosia on keskusteltu myös anti-D-immuno- globuliinin käytöstä idiopaattisen trombosytopeenisen pur-; puran (ITP) hoidossa.

,, , Lihaksensisäisesti ja laskimonsisäisesti injektoi- 35 dun IgG:n farmakokinetiikka elimistössä osoittaa selvästi, 3 112168 että laskimonsisäistä antoa on pidettävä ehdottamasti edullisempana. Lihaksensisäisen injektoinnin yhteydessä on lihasvarastosta tapahtuvan hitaan resorption ja paikallisen proteolyysin vuoksi otettava huomioon maksimiaktiivi-5 suuden viivästyminen ja vaikutuksen heikentyminen. Plasman korkein IgG-pitoisuus saavutetaan terveiden henkilöiden kohdalla vasta neljän ja vuodepotilaiden kohdalla vasta kuuden vuorokauden kuluttua injektoinnista; lisäksi plasman maksimi-IgG-pitoisuus on terveillä henkilöillä vain 10 noin 30 % ja vuodepotilailla vain 20 % injektoidusta annoksesta.

Laskimonsisäinen käyttö tuo sen sijaan mukanaan olennaisia etuja. Vain tämän antomuodon yhteydessä koko annettu annos vaikuttaa heti riippumatta ruumiillisesta 15 aktiivisuudesta; plasman IgG-taso laskee 5 vuorokauden kuluessa käytännöllisesti katsoen riippumatta ruumiillisesta aktiivisuudesta noin 35 - 40 %:iin annetusta annoksesta ja saavuttaa siten vasta viidentenä päivänä arvoja, jotka ovat vertailukelpoisia lihaksensisäisen injektoinnin 20 jälkeen saavutetun korkeimman pitoisuuden kanssa [Morell, A. et ai., Vox Sang. 38 (1980) 272].

Immunoglobuliinivalmisteiden valmistukseen tuotan-tornittakaavassa käytetään nykyisin erilaisia fraktiointi-menetelmiä: . ·. 25 Kylmässä tehtävät alkoholisaostukset, esimerkiksi I, Cohnin mukaan, tai muunnetut Cohnin mukaiset menetelmät, ! soveltuvat ennen kaikkea plasmamäärien käsittelyyn, jotka ovat yli 500 1 viikossa. Erikoiskäsittelyllä, esimerkiksi käsittelemällä pepsiinillä pH-arvon 4 vallitessa, voidaan 30 tällä tavalla eristetyistä immunoglobuliineista tehdä so-pivia laskimonsisäiseen käyttöön. Muut saostusmenetelmät perustuvat immunoglobuliinien spesifiseen saostamiseen ammoniumsulfaatilla, natriumsulfaatilla, polyeteeniglyko-lilla, kapryylihapolla tai rivanolilla (katsaus aiheeseen: 4 112168

Curling, J. M. teoksessa Separation of plasma proteins, toim. J. M. Curling, Pharmacia, Uppsala, Ruotsi 1983).

Ensimmäistä menetelmää immunoglobuliinien eristämiseksi tekemällä panosadsorptio ioninvaihtimilla on kuvattu 5 jo vuonna 1964 [Baumstark, J. S. et ai., Arch. Biochem. Biophys. 108 (1964) 514]. Seuraavina vuosina kehitettiin myös joukko pylväsmenetelmiä (julkaisut CH-A 572 745; US-A 3 869 436 ja EP-A 0 085 747), ja niitä on käytetty muun muassa myös anti-D-immunoglobuliinin fraktiointiin 10 [Friesen, A. D. et ai., J. Appi. Biochem. 3 (1981) 164].

Kaikilla kuvatuilla menetelmillä on saavutettu korkean puhtausasteen ja muuttumattoman IgG-alaryhmäjakautuman ohella korkea IgG-kokonaissaanto, mutta ei määrättyjen IgG-alaryhmien tai spesifisten IgG-molekyylien, kuten esi-15 merkiksi anti-D-IgG:n, spesifistä rikastusta.

Useimmat anti-D-hyperimmunoglobuliinivalmisteet soveltuvat ainoastaan lihaksensisäiseen antoon. Maailmanmarkkinoilla on vain muutamia laskimonsisäiseen antoon sopivia valmisteita. Yksi tällainen valmiste on hakijan 20 immunoglobuliini Anti-D SRK, joka valmistetaan Kistlerin ja Nitschmannin fraktiointimenetelmällä [Kistler, P. ja *: Nitschmann, H., Vox Sang. 7 (1962) 414] ja tehdään laski- ; monsisäiseen antoon sopivaksi pH-arvon 4 vallitessa tehtä- •J väliä lievällä pepsiinikäsittelyllä. Koska tällaisen frak- . ·. 25 tiointimenetelmän yhteydessä spesifisen anti-D-vasta-ai- neen saanto on pieni ja anti-D-hyperimmuuniplasma on sa-! maila harvinaista, tarvitaan uutta menetelmää, jolla saa daan, toisin kuin kuvatuilla menetelmillä, myös pitoisuudeltaan pienestä anti-D-plasmasta suurella saannolla puh- ·* 30 dasta IgG-valmistetta, jolla on korkea anti-D-ominaisak- *...· tiivisuus.

Tämän keksinnön yhtenä päämääränä on siten saada , ·. aikaan menetelmä puhtaan anti-D-konsentraatin valmistami seksi, jolla rikastetaan spesifisesti IgG-alaryhmien 1 ja • >' 35 3 anti-D-immunoglobuliineja. On havaittu, että tämä voi- 5 112168 daan tehdä yllättävän yksinkertaisesti, eliminoiden samalla yli 85 % epäspesifisestä IgG:stä ja lähes kaikki epätoivotut muut plasman komponentit, tekemällä keksinnön mukaisissa olosuhteissa kationinvaihtokromatografia erityisesti va-5 littujen ja spesifisesti immunisoitujen nais- ja mies-luovuttajien veriplasmalle tai siitä saaduille immunoglobu-liinipitoisille fraktioille, joissa anti-D-IgG-pitoisuus on edullisesti yli 30 Mg/ml. Suurella saannolla saadulla anti-D-konsentraatilla on lisäksi kohonnut ominaisaktiivisuus 10 (anti-D-IgG-grammamäärä kokonais-IgG-grammamäärää kohden), ja se voidaan jatkopuhdistaa tekemällä lisäkäsittelyjä io-ninvaihtimilla tai alumiinihydroksidigeelillä joko erikseen tai sopivana yhdistelmänä.

Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettu 15 anti-D-valmiste, joka sisältää vain hyvin pieniä määriä im-munoglobuliini A:ta, on sopivaa laskimonsisäiseen käyttöön ja jota voidaan varastoida useita kuukausia joko kylmäkuivattuna tai edullisesti liuoksena, kun siihen on lisätty sopivia stabilointiaineita. On havaittu, että keksinnön mu-20 kaisesti ehdotetulla menetelmällä valmistettu puhdas anti-,, . D-konsentraatti täyttää nämä vaatimukset, ts. sillä on mm.

| tähän asti saavuttamaton ominaisaktiivisuus, se on sopivaa laskimonsisäiseen antoon ja sen IgA-pitoisuus on äärimmäi-* · sen pieni. Lisäksi tällä anti-D-konsentraatilla on normaa- 25 lista poikkeava IgG-alaryhmäjakautuma; menettely rikastaa :* voimakkaasti IgG-alaryhmiä 1 ja 3, mutta vähentää voimak- kaasti alaryhmiä 2 ja 4.

Tämä keksintö koskee siten menetelmää sellaisen an-ti-D-immunoglobuliini G -valmisteen valmistamiseksi, jon-·. 30 ka ominaisaktiivisuus on yli 1 paino-% anti-D-IgG:tä koko- nais-IgG:stä, ihmisplasmasta, jossa menetelmässä reesuste-kijälle D herkistyneiden nais- tai miesluovuttajien ree- ,,· susnegatiivisesta verestä saadulle plasmalle tai anti-D- r.\ IgG:tä sisältävälle plasmafraktiolle 35 6 112168 A) tehdään ioninvaihtokromatografia pH-alueella 3,5 - 6,5 ja johtavuusarvon ollessa 2-4 mS/cm käyttämällä adsorbenttia, joka sisältää karboksimetyyliryhmiä funktionaalisina ryhminä, jolloin anti-D-IgG sitoutuu adsor- 5 bentille, B) sitoutunutta anti-D-IgG:tä sisältävä adsorbentti huuhdotaan ensin pesuliuoksella, jonka pH on alueella 5 -8 ja johtavuusarvo alueella 2-4 mS/cm, ja eluoidaan sitten anti-D-IgG ja 10 C) käsitellään eluoitu anti-D-IgG pH-arvon ollessa 6 - 8 ja johtavuusarvon ollessa 2-4 mS/cm emäksisellä adsorbentilla, jolla on ioninvaihto-ominaisuuksia, epätoivottavien komponenttien sitomiseksi ja konsentroidaan lopuksi anti-D-IgG.

15 Keksinnön mukaisella menetelmällä voidaan valmistaa anti-D-immunoglobuliinia suoraan ihmisplasmasta. Tähän käytettävä lähtömateriaali on reesusnegatiivisten, reesus-tekijälle D herkistyneiden nais- ja miesluovuttajien plasma. Plasmafereesin avulla saadut yksittäiserät pakastetaan 20 edullisesti, sulatetaan varovasti lämpötilassa 0 - 4 °C ennen fraktiointia ja yhdistetään. Yhdistettyjen plasma- “ erien anti-D-IgG-pitoisuuden tulisi olla yli 10 pg/ml, ; edullisesti yli 30 pg/ml. Kationinvaihtokromatografiaan ·· käytettävä plasmafraktio voidaan esipuhdistaa millä tahan- . ·. 25 sa tunnetulla menetelmällä, esimerkiksi erottamalla kryo- globuliinit tai tekemällä fraktiointisaostus alkoholilla [Cohn, E. J. et ai., J. Am. Chem. Soc. 68 (1946) 459; Kistler, P. ja Nitschmann, H., Vox Sang. 7 (1962) 414], muilla saostusmenetelmillä, kuten saostamalla immunoglobu-30 liinit ammoniumsulfaatilla, natriumsulfaatilla, polyetee- niglykolilla, kapryylihapolla tai rivanolilla, tai jolla-kin kromatografiamenetelmällä tai mainitunlaisten menetelmien yhdistelmällä. Ennen kationinvaihtokromatografiaa on edullista suodattaa kryoglobuliiniton plasma tai tasapai-35 notuspuskuriin liuotettu immunoglobuliinia sisältävä plas- 7 112168 mafraktio ja käsitellä se vaipallisten virusten inaktivoi-miseksi biologisesti yhteensopivalla orgaanisella liuot-teella, kuten esimerkiksi tri-n-butyylifosfaatilla, ja detergentillä, kuten esimerkiksi 0-(4-(l,l,3,3-tetrametyy-5 libutyyli)fenyyli]deka(oksietyleenillä) (Triton" X-100)

Horowitzin mukaisesti [Thrombosis and Haemostasis 65 (1991) 1163]. Plasma-liuote-detergenttiseosta inkuboidaan sitten lämpötilassa 37 “C. Tällöin tapahtuu faasien erottuminen. Kirkas alempi faasi erotetaan, laimennetaan, suo-10 datetaan ja säädetään kationinvaihtokromatografian tasa-painotusolosuhteisiin; lämpötila on jatkovaiheissa yleensä yli 10 °C ja edullisesti 20 - 25 °C. Ensimmäisessä pääpuh-distusvaiheessa sidotaan anti-D-igG esikäsitellystä tuotteesta heikosti happamalle ioninvaihtogeelille, jossa on 15 edullisesti karboksimetyyli (CM) -ryhmiä funktionaalisina ryhminä. Vieraat proteiinit huuhtoutuvat tällöin pois yli 98-%:isesti; samoin virusten inaktivointiin käytetyt liuotteet ja detergentit poistuvat tällöin. Tällä menette-lyvaiheella spesifisesti rikastettu, IgG-alaryhmiin 1 ja 3 20 kuuluva anti-D-IgG eluoidaan ioninvaihtogeeliltä nosta malla johtavuus edullisesti arvon 10 mS/cm yläpuolelle. Eluaatti on puhdas IgG-fraktio; se sisältää alle 15 % ko-, konais-IgG-molekyyleistä, ja sillä on muuttunut IgG-ala- ryhmäjakautuma: IgGl ja IgG3 ovat voimakkaasti rikastunei- ·. 25 ta ja IgG2 ja IgG4 voimakkaasti vähentyneitä. Sen jälkeen tämä anti-D-IgG-fraktio jatkopuhdistetaan käsittelemällä » ! toisella, heikosti emäksisellä ioninvaihtogeelillä, jossa • * * on edullisesti dietyyliaminoetyyli (DEAE) -ryhmiä funktionaalisina ryhminä, jolloin anti-D-IgG ei sitoudu valituis-30 sa olosuhteissa ioninvaihtimeen. Puhdistettu anti-D-IgG- fraktio sidotaan konsentroinnin tekemiseksi edullisesti toisen kerran CM-ioninvaihtogeelille, eluoidaan sopivissa olosuhteissa mahdollisimman väkevänä ja formuloidaan lopputuotteeksi. Keksinnön mukaisten olosuhteiden saavuttami- ·* 35 sen kannalta ei ole merkitystä sillä, eluoidaanko anti-D- • » · 8 112168

IgG-fraktio suurentamalla ionivahvuutta, muuttamalla pH-arvoa vai koostumukseltaan muunnetun puskurin avulla. Epätoivottavien komponenttien, kuten esimerkiksi proteaasien, poistamiseksi edelleen voidaan immunoglobuliiniliuos käsi-5 teliä menettelyn missä tahansa vaiheessa lisäksi adsorben-tilla, kuten esimerkiksi alumiinihydroksidigeelillä. Liuo-te-detergenttikäsittely voidaan haluttaessa korvata tai sitä voidaan täydentää muulla tunnetulla menettelyllä virusten inaktivoimiseksi, esimerkiksi lämpökäsittelyllä, 10 kuten esimerkiksi pastöroinnilla.

Keksinnön mukaisesti valmistettu anti-D-IgG on stabiilia juoksevana. Se on lisäksi laskimonsisäiseen käyttöön soveltuvaa, sen IgA-pitoisuus on alle 5 pg/ml, ja sen IgG-pitoisuus on 1 - 10 mg/ml. pH-arvo on noin 5,2. Val-15 miste sisältää edullisesti korkeintaan 25 mmol/1 fosfaattia, korkeintaan 200 mmol/1 NaCl:a ja korkeintaan 100 mg/ ml ihmisen albumiinia ja haluttaessa 250 - 300 mmol/1 aminohappoa, kuten esimerkiksi glysiiniä, tai korkeintaan 100 mg/ml disakkaridia, kuten esimerkiksi sakkaroosia, tai 20 50 mg/ml monosakkaridia, kuten esimerkiksi mannitolia.

Keksinnön mukaisesti valmistettu anti-D-IgG voidaan : vaihtoehtoisesti kylmäkuivata pH-arvon ollessa noin 6,6 • · anti-D-IgG-annoksena 200 pg lisäten disakkaridia, kuten esimerkiksi 100 mg/ml sakkaroosia.

, ·. 25 Liitteenä oleva kuvio valaisee keksintöä sitä ra- joittamatta. Se esittää esimerkin 1 mukaisen ensimmäisen t ! kationinvaihtokromatografian tyypillistä kromatogrämmiä.

• ·

Keksintöä valaistaan tarkemmin seuraavin esimerkein.

>' 30 Esimerkki 1 ,· Lähtömateriaali on plasma, jota saatiin reesusnega- . tiivisilta naisilta tai miehiltä, jotka olivat antaneet

herkistää itsensä reesustekijää D vastaan huolellisesti valituilla erytrosyyteillä. Kustakin verenluovuttajasta 35 testataan HBs-antigeenin, HIV-vasta-aineiden, hepatiitti C

9 112168 -vasta-aineiden ja kohonneen ALAT-aktiivisuuden poissaolo. Plasmafereesilla saatu plasma pakastetaan yksinään, sulatetaan varovasti lämpötilassa 0 - 4 °C ennen fraktiointia ja yhdistetään muihin plasmaeriin. Yhdistetyt jäättömät 5 plasmat, joiden anti-D-IgG-pitoisuus on 25 pg/ml, sentri-fugoidaan läpivirtaussentrifugilla (Cepa, Lahr, Sakasa) lämpötilassa 2 - 4 °C (1 1/min; kierrosnopeus 1 200 min'1). Supernatantti suodatetaan 1,2 pm:n suodattimen läpi (Opti-capR, Millipore, Bedford, MA, USA). Sen jälkeen inaktivoi-10 daan virukset Horowitzin et ai. mukaisesti [Thrombosis and Haemostasis 65 (1991) 1163] käsittelemällä 4-4,5 tuntia lämpötilassa 30 °C liuote-detergenttiseoksella, joka sisältää 1 %:n TritonR X-100:aa (Rohm und Haas, Frankfurt, Saksa) ja 1 %:n tri-n-butyylifosfaattia (Merck, Darmstadt, 15 Saksa). Liuoksen, jolle on tehty virusten inaktivointi, annetaan seistä 10 - 18 tuntia lämpötilassa 37 °C. Kirkas alempi kerros erotetaan ja suodatetaan 0,2 pm:n suodattimen läpi (Sealkleen NFP 7002, Pali, Dreieich. Saksa). 25 1 liuote-detergenttiseoksella käsiteltyä, suodatettua plas-20 maa laimennetaan natriumfosfaattipuskurilla (10 mmol/1) tasapainotuspuskurin johtavuusarvoon (natriumfosfaattipus-: kuri, 50 mmol/1, pH 5,5, 3,2 mS/cm), säädetään pH arvoon : 5,5, suodatetaan 1,2 pm:n suodattimen läpi (OpticapR, Mil- lipore, Bedford, MA, USA) ja sidotaan pylväässä, jonka , ·. 25 pohjapinta-ala on 314 cm2 ja kerroksen korkeus 16 cm, vir- • t tausnopeudella 150 cm/h MacroPrep” 50 CM:lie (Bio Rad, t ! Hercules, CA, USA); geeli on tasapainotettu ennalta nat- » · riumfosfaattipuskurilla (50 mmol/1, pH 5,5). Lämpötila pidetään alueella 20 - 25 °C. Pylväs huuhdotaan sitten 30 40-kertaisella tilavuudella natriumfosfaattipuskuria (25 mmol/1, pH 7,0) ja eluoidaan anti-D-pitoinen IgG-fraktio . natriumfosfaattipuskurilla (25 mmol/1), johon on lisätty 0,2 mol/1 natriumkloridia (pH 7,5). Kuvio esittää tyypillistä kromatogrammia, jollainen saadaan edellä esitetyssä • ‘ 35 käsittelyssä. Diagrammi esittää aallonpituudella 280 nm 10 112168 mitattua optista tiheyttä (OD) ajan (t) funktiona. Siitä on nähtävissä, että suurin osa epätoivottavista tuotteista erottuu lisäyksen ja huuhtomisen aikana, kun taas eluu-tiossa ilmenee kapea päähuippu, joka sisältää toivottua 5 anti-D-IgG:tä voimakkaasti rikastuneena IgG-osafraktiossa. Ominaisaktiivisuus on tällöin yli 2 paino-% anti-D-IgG:tä kokonais-IgG:stä. Eluaatti laimennetaan vedellä johtavuus-arvoon 3,3 mS/cm (1 tilavuusosa eluaattia + noin 5 tila-vuusosaa vettä), säädetään pH NaOH-liuoksella (0,2 mol/1) 10 arvoon 7,5 ja tehdään 2,5 tuntia kestävä adsorbointi käyttämällä 100 g kuivaa DEAE-SephadexR A50:ä (Pharmacia, Uppsala, Ruotsi). DEAE-geeli tasapainotetaan ennalta natrium-fosfaattipuskurilla (25 mmol/1, pH 7,5). Sitoutumaton anti-D-IgG- fraktio erotetaan suodattamalla polypropeenikan-15 kaan läpi ja säädetään pH arvoon 5,5. DEAE-suodos sidotaan konsentroinnin tekemiseksi toisen kerran MacroPrepR 50 CM:lie (Bio Rad, Hercules, CA, USA) pylväässä, jonka pohjapinta-ala on 78,5 cm2 ja kerroksen korkeus 10 cm, virtausnopeudella 60 cm/h; geeli on tasapainotettu ennal-20 ta natriumfosfaattipuskurilla (50 mmol/1, pH 5,5). Anti-D-pitoinen IgG-fraktio eluoidaan natriumfosfaattipusku- • ,·' rilla (25 mmol/1), johon on lisätty 0,2 mol/1 natriumklo- : ridia (pH 5,5). CM-geelit regeneroidaan NaOH-liuoksella : ·* (1 ekv/1) ja pestään pyrogeenittömiksi, ja ne voidaan ; 25 käyttää vähintään 20 kertaa uudelleen; DEAE-geeli heite- tään pois yhden käyttökerran jälkeen.

Esimerkki 2 • · Lähtömateriaali on plasma, jota saatiin reesusnega- tiivisilta naisilta tai miehiltä, jotka olivat antaneet ·’ 30 herkistää itsensä reesustekijää D vastaan huolellisesti »

valituilla erytrosyyteillä. Kustakin verenluovuttajasta : testataan HBs-antigeenin, HIV-vasta-aineiden, hepatiitti C

-vasta-aineiden ja kohonneen ALAT-aktiivisuuden poissaolo. Plasmafereesilla saatu plasma pakastetaan yksinään, sula-35 tetaan varovasti lämpötilassa 0 - 4 °C ennen fraktiointia 11 112168 ja yhdistetään muihin plasmaeriin. Yhdistetyt jäättömät plasmat, joiden anti-D-IgG-pitoisuus on 25 pg/ml, sentri-fugoidaan läpivirtaussentrifugilla (Cepa, Lahr, Sakasa) lämpötilassa 2 - 4 °C (1 1/min; kierrosnopeus 1 200 min'1).

5 Supernatantti suodatetaan 1,2 pm:n suodattimen läpi (Opti-capR, Millipore, Bedford, MA, USA). Sen jälkeen inaktivoi-daan virukset Horowitzin et ai. mukaisesti [Thrombosis and Haemostasis 65 (1991) 1163] käsittelemällä 4-4,5 tuntia lämpötilassa 30 °C liuote-detergenttiseoksella, joka si-10 sältää 1 %:n TritonR X-100:aa (Rohm und Haas, Frankfurt, Saksa) ja 1 %:n tri-n-butyylifosfaattia (Merck, Darmstadt, Saksa). Liuoksen, jolle on tehty virusten inaktivointi, annetaan seistä 10 - 18 tuntia lämpötilassa 37 °C. Kirkas alempi kerros erotetaan ja suodatetaan 0,2 pm:n suodatti-15 men läpi (Sealkleen NFP 7002, Pali, Dreieich. Saksa). 25 1 liuote-detergenttiseoksella käsiteltyä, suodatettua plasmaa laimennetaan natriumfosfaattipuskurilla (10 mmol/1) tasapainotuspuskurin j ohtavuusarvoon (natriumfosfaattipus-kuri, 50 mmol/1, pH 5,5, 3,2 mS/cm), säädetään pH arvoon 20 5,5, suodatetaan 1,2 pm:n suodattimen läpi (OpticapR, Mil lipore, Bedford, MA, USA) ja sidotaan pylväässä, jonka • pohjapinta-ala on 314 cm ja kerroksen korkeus 16 cm, vir-tausnopeudella 150 cm/h MacroPrepR 50 CM:lie (Bio Rad, • * >

Hercules, CA, USA); geeli on tasapainotettu ennalta nat-, 25 riumfosfaattipuskurilla (50 mmol/1, pH 5,5). Lämpötila pidetään alueella 20 - 25 °C. Pylväs huuhdotaan sitten 40-kertaisella tilavuudella natriumfosfaattipuskuria (25 mmol/1, pH 7,0) ja eluoidaan anti-D-pitoinen IgG-fraktio ,, natriumfosfaattipuskurilla (25 mmol/1), johon on lisätty • 30 0,2 mol/1 natriumkloridia (pH 7,5). Eluaatti, jonka pH on 6,6 ja johon on lisätty 100 mg/ml sakkaroosia, suodatetaan : anti-D-IgG-annoksena 200 pg 0,2 pm:n suodattimen läpi (MillidiskRMCGL-10, Millipore, Bedford, MA, USA) ja kylmä-kuivataan sitten.

12 112168

Esimerkki 3 5 ml liuote-detergenttiseoksella käsiteltyä plasmaa laimennetaan tasapainotuspuskurin johtavuusarvoon (3,3 mS/ cm) ja käsitellään kromatografisesti pylväässä, jonka poh-5 japinta-ala on 2 cm2 ja kerroksen korkeus 5 cm, virtausnopeudella 30 cm/h DEAE-SephadexR A50:ä (Pharmacia, Uppsala, Ruotsi). Geeli tasapainotetaan ennalta natriumfosfaatti-puskurilla (25 mmol/1, pH 7,5). Lämpötila pidetään alueella 20 - 25 °C. Sitoutumattoman IgG-fraktion pH säädetään 10 lisäpuhdistusta varten HCl-liuoksella (0,2 mol/1) arvoon 5,5 ja johtavuus arvoon 3,2 mS/cm, ja tehdään sitominen pylväässä, jonka pohjapinta-ala on 0,8 cm2 ja kerroksen korkeus 6,5 cm, virtausnopeudella 230 cm/h MacroPrepR 50 CM:lle (BioRad, Hercules, CA, USA); geeli on tasapaino-15 tettu ennalta natriumfosfaattipuskurilla (50 mmol/1, pH 5,5). Anti-D-pitoinen IgG-fraktio eluoidaan natriumfosfaattipuskurilla (25 mmol/1), johon on lisätty 0,2 mol/1 natriumkloridia (pH 5,5), ja formuloidaan lopputuotteeksi. DEAE-SephadexR A50 -geeli heitetään pois yhden käyttökerran 20 jälkeen; MacroPrepR 50 CM -geeli regeneroidaan NaOH-liuok-sella (1 ekv/1) ja pestään pyrogeenittömiksi, ja se voi-• ; daan käyttää vähintään 20 kertaa uudelleen.

; Esimerkki 4 • > > ·; j Toistetaan esimerkkien 1-3 mukainen menettely , , 25 käyttämällä lähtömateriaalina plasman sijasta immunoglobu- liinipitoista plasmafraktiota, joka valmistetaan vastaavasta määrästä lähtöaineplasmaa ottamalla talteen fraktio I+II+III tai fraktio II+III Cohnin mukaisesti [Cohn, E. J. et ai., J. Am. Chem. Soc. 68 (1946) 459] tai sakka A tai 30 gammaglobuliinisakka Kistlerin ja Nitschmannin mukaisesti • [Kistler, P. ja Nitschmann, H., Vox Sang. 7 (1962) 414] ja ; liuottamalla se tasapainotuspuskuriin, johon on lisätty 30 g/1 proteiinia, jolloin saadaan vastaavia tuloksia.

13 112168

Esimerkki 5

Toistetaan esimerkkien 1-4 mukainen menettely eluoimalla anti-D-pitoinen IgG-fraktio natriumfosfaatti-puskurin (25 mmol/1) + natriumkloridin (0,2 mol/1, pH 7,5) 5 sijasta liuoksella, joka sisältää 0,1 mol/1 glysiiniä + 0,5 mol/1 natriumkloridia (pH 9), tai yleisesti ottaen muuttamalla pH-arvoa ja/tai ionivahvuutta ja/tai muuttamalla muuten puskurin koostumusta MacroPrepR 50 CM -geeliltä (BioRad, Hercules, CA, USA), jolloin saadaan vastaavia 10 tuloksia.

Esimerkki 6

Toistetaan esimerkkien 1 ja 2 mukainen menettely huuhtomalla MacroPrepR 50 CM -geeli (BioRad, Hercules, CA, USA) natriumfosfaattipuskurin (25 mmol/1, pH 7,0) sijasta 15 glysiiniliuoksella (10 mmol/1, pH 9), jolloin saadaan vastaavia tuloksia.

Esimerkki 7

Esimerkin 1 mukaisesti valmistettu konsentroitu anti-D-eluaatti säädetään seuraaviin olosuhteisiin: 20

Juokseva Juokseva Juokseva Juokseva ' valmiste valmiste valmiste valmiste : i ii m iv • Anti-D 100 pg/ml 100 pg/ml 100 pg/ml 100 pg/ml 25 Glysiini 20,6 mg/ml 20,6 mg/ml 20,6 mg/ml 20,6 mg/ml

Albumiini - 10 mg/ml 50 mg/ml 100 mg/ml pH 5,20 5,20 5,20 5,20 t

Annos 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml

Juokseva Juokseva Juokseva Juokseva 30 valmiste valmiste valmiste valmiste

V VI VII VIII

; Anti-D 100 pg/ml 100 pg/ml 100 pg/ml 100 pg/ml D-mannitoli 50 mg/ml 50 mg/ml 50 mg/ml 50 mg/ml

Albumiini - 10 mg/ml 50 mg/ml 100 mg/ml 35 pH 5,20 5,20 5,20 5,20

Annos 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 14 112168 suodatetaan 0,2 μπι:η suodattimen läpi (MillipakR-20, Milli-pore, Bedford, MA, USA) ja pakataan steriilisti lasisiin valmisruiskuihin (Vetter, Ravensburg, Saksa).

Esimerkki 8 5 Esimerkin 1 mukaista DEAE-suodosta käsitellään pH- arvon 5,5 vallitessa 30 minuuttia lämpötilassa 20 - 25 °C käyttämällä 0,2 g alumiinihydroksidigeeliä grammaa kohden proteiinia ja jatkokäsitellään sitten esimerkin 1 mukaisesti .

10 Esimerkki 9

Toistetaan esimerkkien 1-6 mukainen menettely käyttämällä MacroPrepR 50 CM:n sijasta jotakin seuraavista geeleistä, joissa on samoja funktionaalisia ryhmiä; CM-SpherodexR (Sepracor IBF, Villeneuve la Garenne, Ranska), 15 CM-TrisacrylR (Sepracor IBF, Villeneuve la Garenne, Ranska), CM-SepharoseR FF (Pharmacia, Uppsala, Ruotsi) tai FractogelR TSK CM-650 (Merck, Darmstadt, Saksa), jolloin saadaan vastaavia tuloksia.

Esimerkki 10 20 Toistetaan esimerkkien 1 ja 3 - 6 mukainen menette ly käyttämällä DEAE-SephadexR A50:n sijasta MacroPrepR DEAE:ta (BioRad, Hercules, CA, USA), jolloin saadaan vas-taavia tuloksia.

Edellisissä esimerkeissä 1-6 tehdyt kromatogra-*. 25 fiatoimenpiteet voidaan toteuttaa valinnan mukaan panos-, pylväs- tai kalvokromatografisesti saaden vastaavia tulok- » , ! siä.

Claims (11)

15 112168

1. Menetelmä anti-D-immunoglobuliini G -valmisteen valmistamiseksi, jonka ominaisaktiivisuus on yli 1 5 paino-% anti-D-IgG:tä grammaa kohti kokonais-IgG:tä, ih-misplasmasta, tunnettu siitä, että reesustekijäl-le D herkistyneiden luovuttajien reesusnegatiivisesta verestä saadulle plasmalle tai anti-D-IgG:tä sisältävälle plasmafraktiolle

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa C) konsentroidaan < · anti-D-IgG toistamalla vaiheet A) ja B) vähintään kerran.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, ; 25 tunnettu siitä, että lähtömateriaalina käytetään ·. plasmaa, joka on esikäsitelty emäksisellä adsorbentilla, . ·. jolla on ioninvaihto-ominaisuuksia, epätoivottavien kompo nenttien sitomiseksi.

... 4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että plasman tai plasmat raktion ;·* proteaasipitoisuutta vähennetään inkuboimalla adsorbentin, :: : kuten alumiinihydroksidigeelin, kanssa.

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen me-netelmä, tunnettu siitä, että kaikki ioninvaihto-* 35 kromatografiatoimenpiteet ja tarvittaessa muut adsorptio- 16 112168 toimenpiteet toteutetaan valinnan mukaan panos-, pylväs-tai kalvokromatografisesti.

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa C) käy- 5 tettävä emäksinen adsorbentti sisältää dietyyliaminoetyy-liryhmiä funktionaalisina ryhminä.

7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa B) tehtävä eluointi toteutetaan muuttamalla pH-arvoa ja/tai pusku- 10 rin koostumusta, esimerkiksi muuttamalla sen ionivahvuutta tai vastaavasti johtavuutta.

8. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se käsittää vähintään yhden virusten inaktivoimistoimenpiteen.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että virusten inaktivoimistoimen-pide käsittää plasman tai anti-D-IgG:tä sisältävän fraktion käsittelyn detergentillä ja tri-n-butyylifosfaatilla, jolloin liuotinta ja detergenttiä sisältävän seoksen faa-20 sit erotetaan ja käytetään kirkas alempi faasi.

10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, ·* tunnettu siitä, että virusten inaktivoimistoimen- .· pide on lämpökäsittely.

10 A) tehdään ioninvaihtokromatografia pH-alueella 3,5 - 6,5 käyttämällä adsorbenttia, joka sisältää karbok-simetyyliryhmiä funktionaalisina ryhminä, jolloin anti-D-IgG sitoutuu adsorbentille, B) sitoutunutta anti-D-IgG:tä sisältävä adsorbent-15 ti huuhdotaan ensin pesuliuoksella ja eluoidaan sitten an- ti-D-IgG ja lisäksi C) käsitellään eluoitu anti-D-IgG emäksisellä ad-sorbentilla, jolla on ioninvaihto-ominaisuuksia, epätoivottavien komponenttien sitomiseksi ja konsentroidaan lo- 20 puksi anti-D-IgG.

11. Jonkin patenttivaatimuksista 1-10 mukainen : 25 menetelmä, tunnettu siitä, että lähtöaineplasmal- ;· le tai lähtöaineplasmafraktiolle toteutetaan ennen vai- ; heessa A) tehtävää ioninvaihtokromatografiatoimenpidettä vähintään yksi seuraavista toimenpiteistä: :v. a) plasman jäädyttäminen, jolloin kylmässä muodos- 30 tunut sakka erotetaan sulatuksen jälkeen ennen jatkokäyt-töä suodattamalla, ja/tai sentrifugoimalla; V,· b) käsittely liuotin-detergenttiseoksella, inku- /,_bointi lämpötilassa noin 37 °C ja faasien erotus. i * 17 112168