JP2926463B2 - 抗ｄ−免疫グロブリンｇの濃縮物の製造方法、それを含む製薬的調剤 - Google Patents
抗ｄ−免疫グロブリンｇの濃縮物の製造方法、それを含む製薬的調剤Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、抗Ｄ−（抗−Ｒｈ）免
疫グロブリンＧ（抗Ｄ−ＩｇＧ）の新しい濃縮物の製造
方法及び該濃縮物を活性成分として含む製薬的調剤に関
する。
疫グロブリンＧ（抗Ｄ−ＩｇＧ）の新しい濃縮物の製造
方法及び該濃縮物を活性成分として含む製薬的調剤に関
する。
【０００２】
【従来の技術】新生児溶血病は、母体の抗体により引き
起こされる胎児及び新生児の溶血性貧血の一般的名称で
ある。これらの抗体は、胎児の赤血球表面上の抗原に対
立するものである。それに関与しているのは、Ｒｈ式、
ＡＢＯ式、あるいは、他の血液型系のいずれかの抗原で
ある。
起こされる胎児及び新生児の溶血性貧血の一般的名称で
ある。これらの抗体は、胎児の赤血球表面上の抗原に対
立するものである。それに関与しているのは、Ｒｈ式、
ＡＢＯ式、あるいは、他の血液型系のいずれかの抗原で
ある。
【０００３】Ｒｈ式血液群の最も重要な抗原は、Ｄ、明
らかに免疫原性の少ない相対立する抗原Ｃ、ｃ及びＥ、
ｅ、並びにＤｕ；更に４０以上のＲｈ抗原が知られてい
る。Ｒｈ不適合で臨床的に重要なのは、中でもＲｈ抗原
Ｄ（ＲｈＤ；Ｒｈ０）であり、最近クローン化された赤
血球の膜蛋白とその１次構造は、（Le Van Kim ら .PN
AS USA, 89,10925,1992 )に記載されている。Ｄ抗原
は、ヨーロッパに住むコーカサス人のほぼ８５％に見い
だされる。Ｄ抗原を持つ人は、Ｒｈ陽性と呼ばれ、Ｄ抗
原を持たない人は、Ｒｈ陰性と呼ばれる。特異的な抗Ｄ
抗体は、最も一般的な不規則Ｒｈ抗体で、中でも、Ｒｈ
−不適合妊娠とそれに引き続くＲｈ−不適合な血液が混
ざる際に起こる。抗Ｄ抗体は、主としてＩｇＧサブクラ
ス１及び３（ＩｇＧ１及びＩｇＧ３）に属す。
らかに免疫原性の少ない相対立する抗原Ｃ、ｃ及びＥ、
ｅ、並びにＤｕ；更に４０以上のＲｈ抗原が知られてい
る。Ｒｈ不適合で臨床的に重要なのは、中でもＲｈ抗原
Ｄ（ＲｈＤ；Ｒｈ０）であり、最近クローン化された赤
血球の膜蛋白とその１次構造は、（Le Van Kim ら .PN
AS USA, 89,10925,1992 )に記載されている。Ｄ抗原
は、ヨーロッパに住むコーカサス人のほぼ８５％に見い
だされる。Ｄ抗原を持つ人は、Ｒｈ陽性と呼ばれ、Ｄ抗
原を持たない人は、Ｒｈ陰性と呼ばれる。特異的な抗Ｄ
抗体は、最も一般的な不規則Ｒｈ抗体で、中でも、Ｒｈ
−不適合妊娠とそれに引き続くＲｈ−不適合な血液が混
ざる際に起こる。抗Ｄ抗体は、主としてＩｇＧサブクラ
ス１及び３（ＩｇＧ１及びＩｇＧ３）に属す。
【０００４】今日まで、Ｒｈ感作された妊婦に、確実に
有効な原因療法は、知られていない。同様に脱感作は不
可能であり、抗Ｄ免疫グロブリンを用いてＲｈ感作させ
る予防法は、出産年齢に当たるＲｈ陰性の婦人には、極
めて重要である。その療法を行わねば、初回妊娠でＲｈ
群（母親がＲｈ陰性、子供がＲｈ陽性）の婦人は、１７
％までが、妊娠中、又は、分娩時に、Ｒｈ抗原に感作さ
れる様になるだろう。
有効な原因療法は、知られていない。同様に脱感作は不
可能であり、抗Ｄ免疫グロブリンを用いてＲｈ感作させ
る予防法は、出産年齢に当たるＲｈ陰性の婦人には、極
めて重要である。その療法を行わねば、初回妊娠でＲｈ
群（母親がＲｈ陰性、子供がＲｈ陽性）の婦人は、１７
％までが、妊娠中、又は、分娩時に、Ｒｈ抗原に感作さ
れる様になるだろう。
【０００５】Ｒｈ陰性、あるいは、それぞれＤｕ陽性の
婦人の、ＲｈＤ因子または、それぞれＤｕに対するＲｈ
感作を防ぐため、従って、新生児の抗Ｄ関与の病気、す
なわち全ての形態のＲｈ赤芽球症を妨げる為、抗Ｄ調剤
は、３０年以上も成功裡に使用されてきた。Ｒｈ感作の
危険性は、胎児のＲｈ陽性赤血球の流入量と共に増加す
る。ＷＨＯにより分娩後の予防として、勧められている
抗Ｄ−ＩｇＧ処理量２００μg は、胎児赤血球１０mlま
で（胎児血約２０mlに相当する）を中和するのに充分で
あり、従って、流入量が増加しても、患者の約９０％の
Ｒｈ感作は、防ぐ事ができるが、依然として、Ｒｈ群を
持つ全初妊婦の１〜２％で、Ｒｈ抗原に対する感作が予
想されることになる。妊娠中さらに付加される決まり切
ったＲｈ予防法（分娩前予防法）を通して、残された感
作の危険性は、Ｒｈ群を持つ全初妊婦の０．１〜０．２
％まで減少させることができる。
婦人の、ＲｈＤ因子または、それぞれＤｕに対するＲｈ
感作を防ぐため、従って、新生児の抗Ｄ関与の病気、す
なわち全ての形態のＲｈ赤芽球症を妨げる為、抗Ｄ調剤
は、３０年以上も成功裡に使用されてきた。Ｒｈ感作の
危険性は、胎児のＲｈ陽性赤血球の流入量と共に増加す
る。ＷＨＯにより分娩後の予防として、勧められている
抗Ｄ−ＩｇＧ処理量２００μg は、胎児赤血球１０mlま
で（胎児血約２０mlに相当する）を中和するのに充分で
あり、従って、流入量が増加しても、患者の約９０％の
Ｒｈ感作は、防ぐ事ができるが、依然として、Ｒｈ群を
持つ全初妊婦の１〜２％で、Ｒｈ抗原に対する感作が予
想されることになる。妊娠中さらに付加される決まり切
ったＲｈ予防法（分娩前予防法）を通して、残された感
作の危険性は、Ｒｈ群を持つ全初妊婦の０．１〜０．２
％まで減少させることができる。
【０００６】更に、抗−Ｄは、Ｒｈ陽性血がＲｈ陰性の
患者へ、誤って輸血された時にも、同様に使用される。
その場合、抗−Ｄ量は、Ｒｈ陽性赤血球の流入量に対し
て決められなければならない。抗Ｄ−ＩｇＧを、自然発
生的な、血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）に使用する事の
是非は、何年か議論中である。
患者へ、誤って輸血された時にも、同様に使用される。
その場合、抗−Ｄ量は、Ｒｈ陽性赤血球の流入量に対し
て決められなければならない。抗Ｄ−ＩｇＧを、自然発
生的な、血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）に使用する事の
是非は、何年か議論中である。
【０００７】生体内に抗Ｄを筋肉内及び静脈注射した時
の薬力学は、静脈内適用が好ましいことを明白に示して
いる。筋肉内注射では、最大活性の遅れと有効性の消失
が予期されるからであるが、それは、筋肉貯蔵所からの
吸収が緩慢な事と局所的な蛋白分解による。健康なテス
ト患者で、注射後４日までは、最大ＩｇＧ血漿濃度に達
しないが、寝たきりのテスト患者では、注射後６日でも
達しない。更に健康なテスト患者では、最大ＩｇＧ血漿
濃度は、注射量の約３０％のみ、寝たきりテスト患者で
は、２０％のみである。
の薬力学は、静脈内適用が好ましいことを明白に示して
いる。筋肉内注射では、最大活性の遅れと有効性の消失
が予期されるからであるが、それは、筋肉貯蔵所からの
吸収が緩慢な事と局所的な蛋白分解による。健康なテス
ト患者で、注射後４日までは、最大ＩｇＧ血漿濃度に達
しないが、寝たきりのテスト患者では、注射後６日でも
達しない。更に健康なテスト患者では、最大ＩｇＧ血漿
濃度は、注射量の約３０％のみ、寝たきりテスト患者で
は、２０％のみである。
【０００８】比較すると、静脈内適用は、かなりの利点
がある。この種の適用でのみ、物理活性如何に関わら
ず、全投与量が有効である。ＩｇＧ血漿レベルは、実
際、体内活性に関係なく投与量の約３５％〜４０％に、
５日経過中に下落し、筋肉内注射後に達成された、最大
血漿濃度に比較しうる値には、５日目に初めて到達す
る。( Morell, A. et al. Vox Sang. 38, 272, 1980
) 。
がある。この種の適用でのみ、物理活性如何に関わら
ず、全投与量が有効である。ＩｇＧ血漿レベルは、実
際、体内活性に関係なく投与量の約３５％〜４０％に、
５日経過中に下落し、筋肉内注射後に達成された、最大
血漿濃度に比較しうる値には、５日目に初めて到達す
る。( Morell, A. et al. Vox Sang. 38, 272, 1980
) 。
【０００９】免疫グロブリン調剤に対しては、今日、産
業規模で、種々の分別プロセスが使用されている。冷エ
タノール沈殿法又は、例えば、コーン（Ｃｏｈｎ）に従
い、あるいは、コーンに基づいて改良した方法では、と
りわけ、１週間につき５００ｌ以上の血漿量を処理する
には、適当である。例えば、ｐＨ４ペプシンで、特別な
処理をすると、単利された免疫グロブリンは、静脈内で
の耐容性が充分である様にすることができる。他の沈殿
法は、硫安、硫酸ナトリウム、ポリエチレングリコー
ル、カプリル酸、及びリバノールに依る、免疫グロブリ
ンの特異的な沈殿に基づいている、（概要は、Curling,
J. M.「血漿蛋白の分離」、 J. M.Curling, ed., 198
3, Pharmacia, Uppsala, スウェーデン）。
業規模で、種々の分別プロセスが使用されている。冷エ
タノール沈殿法又は、例えば、コーン（Ｃｏｈｎ）に従
い、あるいは、コーンに基づいて改良した方法では、と
りわけ、１週間につき５００ｌ以上の血漿量を処理する
には、適当である。例えば、ｐＨ４ペプシンで、特別な
処理をすると、単利された免疫グロブリンは、静脈内で
の耐容性が充分である様にすることができる。他の沈殿
法は、硫安、硫酸ナトリウム、ポリエチレングリコー
ル、カプリル酸、及びリバノールに依る、免疫グロブリ
ンの特異的な沈殿に基づいている、（概要は、Curling,
J. M.「血漿蛋白の分離」、 J. M.Curling, ed., 198
3, Pharmacia, Uppsala, スウェーデン）。
【００１０】イオン交換体でバッチ吸収により免疫グロ
ブリンを単離する方法は、１９６４年ごろ初めて記載さ
れた（Baumstark, J. S 等. Arch. Biochem. Biophys.,
108,514, 1964 )。その後何年か経って 多くのカラム
に依る方法が発展し（CH-A-572745;US-A-3, 869, 436;
EP-A-O 085 747）、抗Ｄ−ＩｇＧの分別にも使用されて
きた(Friesen, A.D.等J. Appl, Biochem. 3,164, 198
1)。
ブリンを単離する方法は、１９６４年ごろ初めて記載さ
れた（Baumstark, J. S 等. Arch. Biochem. Biophys.,
108,514, 1964 )。その後何年か経って 多くのカラム
に依る方法が発展し（CH-A-572745;US-A-3, 869, 436;
EP-A-O 085 747）、抗Ｄ−ＩｇＧの分別にも使用されて
きた(Friesen, A.D.等J. Appl, Biochem. 3,164, 198
1)。
【００１１】上記記載の全ての方法で達成されたのは、
高収量、高純度、かつ、サブクラス分布も変化しないＩ
ｇＧであるが、あるＩｇＧサブクラス、あるいは、抗Ｄ
−ＩｇＧのような特異的ＩｇＧ分子の特異的な濃度は、
得られなかった。抗Ｄの超免疫グロブリン調剤の大半
は、筋肉内適用のみに有効である。世界的には、静脈内
で充分耐容性のある調剤は、市場では、わずかである。
そのような１つの調剤として現在適用されているのは、
免疫グロブリン抗Ｄ−ＳＲＫであり、Kistler とNitsch
imann の分別法により産生されており、( Kistler, P.
とNischmann, H. Vox Sang,7,414, 1962 ) 、ｐＨ４で
穏やかなペプシン処理をする方法で、静脈内には充分耐
容性がある。しかし、このタイプの分別法では、特異的
抗Ｄ抗体の収量はごく少なく、同時に抗Ｄ超免疫血漿は
希であるので、上記記載の方法とは異なり、低力価の抗
Ｄ血漿プールから高収量、高特異的抗Ｄ活性を持つ純粋
なＩｇＧ調剤をもたらす新しい方法が必要とされてき
た。
高収量、高純度、かつ、サブクラス分布も変化しないＩ
ｇＧであるが、あるＩｇＧサブクラス、あるいは、抗Ｄ
−ＩｇＧのような特異的ＩｇＧ分子の特異的な濃度は、
得られなかった。抗Ｄの超免疫グロブリン調剤の大半
は、筋肉内適用のみに有効である。世界的には、静脈内
で充分耐容性のある調剤は、市場では、わずかである。
そのような１つの調剤として現在適用されているのは、
免疫グロブリン抗Ｄ−ＳＲＫであり、Kistler とNitsch
imann の分別法により産生されており、( Kistler, P.
とNischmann, H. Vox Sang,7,414, 1962 ) 、ｐＨ４で
穏やかなペプシン処理をする方法で、静脈内には充分耐
容性がある。しかし、このタイプの分別法では、特異的
抗Ｄ抗体の収量はごく少なく、同時に抗Ｄ超免疫血漿は
希であるので、上記記載の方法とは異なり、低力価の抗
Ｄ血漿プールから高収量、高特異的抗Ｄ活性を持つ純粋
なＩｇＧ調剤をもたらす新しい方法が必要とされてき
た。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明の目的
は、ＩｇＧサブクラス１と３の抗Ｄ免疫グロブリンが特
異的に濃縮される、純粋な抗Ｄ濃縮物を製造する方法を
提供することである。この事は、特別に選ばれ且つ特別
に免疫された血液提供者の、好ましくは抗Ｄ−ＩｇＧ３
０μg ／ml以上の力価を持つ血液の血漿、またはそこか
ら得られた免疫グロブリンを含む分画を、本発明に従っ
た条件下、陽イオン交換クロマトグラフィにかけるとい
う、驚くほど単純な方法で行うことができ、同時に、非
特異的ＩｇＧの８５％以上と不要な他の血漿成分のほと
んどを除去する事ができるということが、見出された。
高収量で得られた抗Ｄ濃縮物は、更に増強された特異活
性も有し（全ＩｇＧ１グラム当たりの抗Ｄ−ＩｇＧのグ
ラム単位）も有し、他のイオン交換体、水酸化アルミニ
ウムゲルを個別に、または適当に組み合わせて、付加的
に処理する事により、更に精製する事ができる。
は、ＩｇＧサブクラス１と３の抗Ｄ免疫グロブリンが特
異的に濃縮される、純粋な抗Ｄ濃縮物を製造する方法を
提供することである。この事は、特別に選ばれ且つ特別
に免疫された血液提供者の、好ましくは抗Ｄ−ＩｇＧ３
０μg ／ml以上の力価を持つ血液の血漿、またはそこか
ら得られた免疫グロブリンを含む分画を、本発明に従っ
た条件下、陽イオン交換クロマトグラフィにかけるとい
う、驚くほど単純な方法で行うことができ、同時に、非
特異的ＩｇＧの８５％以上と不要な他の血漿成分のほと
んどを除去する事ができるということが、見出された。
高収量で得られた抗Ｄ濃縮物は、更に増強された特異活
性も有し（全ＩｇＧ１グラム当たりの抗Ｄ−ＩｇＧのグ
ラム単位）も有し、他のイオン交換体、水酸化アルミニ
ウムゲルを個別に、または適当に組み合わせて、付加的
に処理する事により、更に精製する事ができる。
【００１３】本発明のもう一つの目的は、静脈内に充分
耐容性があり、しかも、適当な安定剤の添加により、あ
るいは凍結乾燥、好ましくは溶液で、活性の損失なく、
数カ月貯蔵する事がでる、ＩｇＡを痕跡程度のみ含む抗
Ｄ調剤を提供することである。
耐容性があり、しかも、適当な安定剤の添加により、あ
るいは凍結乾燥、好ましくは溶液で、活性の損失なく、
数カ月貯蔵する事がでる、ＩｇＡを痕跡程度のみ含む抗
Ｄ調剤を提供することである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】従って本発明は、ヒト血
漿から、全ＩｇＧ１グラム当たり１％以上の抗Ｄ−Ｉｇ
Ｇの特異活性を有する, 抗Ｄ免疫グロブリン調剤を製造
する方法であり、Ｒｈ因子Ｄに感作された、Ｒｈ陰性供
給者の血液からの血漿、あるいは、抗Ｄ−ＩｇＧを含む
血漿分画を、 Ａ）ｐＨ３．５〜６．５の範囲で、電導度は、２〜４mS
／cmにて、官能基としてカルボキシメチル基を持つ、抗
Ｄ−ＩｇＧが結合する吸着剤を用いて、イオン交換クロ
マトグラフィーにかける、 Ｂ）抗Ｄ−ＩｇＧの結合した吸着剤を、まず、ＰＨ５〜
８、電導度２〜４mS／cmの洗浄液で洗浄、続いて抗Ｄ−
ＩｇＧを溶出し、次いで、 Ｃ）ｐＨ６〜８、電導度２〜４mS／cmで溶出した抗Ｄ−
ＩｇＧを、不要な成分と結合させるためイオン交換特性
を有するアルカリ吸着剤で処理することにより、抗Ｄ−
ＩｇＧが、濃縮されるものである。
漿から、全ＩｇＧ１グラム当たり１％以上の抗Ｄ−Ｉｇ
Ｇの特異活性を有する, 抗Ｄ免疫グロブリン調剤を製造
する方法であり、Ｒｈ因子Ｄに感作された、Ｒｈ陰性供
給者の血液からの血漿、あるいは、抗Ｄ−ＩｇＧを含む
血漿分画を、 Ａ）ｐＨ３．５〜６．５の範囲で、電導度は、２〜４mS
／cmにて、官能基としてカルボキシメチル基を持つ、抗
Ｄ−ＩｇＧが結合する吸着剤を用いて、イオン交換クロ
マトグラフィーにかける、 Ｂ）抗Ｄ−ＩｇＧの結合した吸着剤を、まず、ＰＨ５〜
８、電導度２〜４mS／cmの洗浄液で洗浄、続いて抗Ｄ−
ＩｇＧを溶出し、次いで、 Ｃ）ｐＨ６〜８、電導度２〜４mS／cmで溶出した抗Ｄ−
ＩｇＧを、不要な成分と結合させるためイオン交換特性
を有するアルカリ吸着剤で処理することにより、抗Ｄ−
ＩｇＧが、濃縮されるものである。
【００１５】本発明に従って提案された方法により得ら
れた純粋な抗Ｄ濃縮物は、これらの要求を満たしている
ということ、すなわち、中でも、今まで達成されなかっ
た特異活性を有し、静脈内に充分耐容性があり、しかも
ＩｇＡの混入が極めてわずかであるということがわかっ
た。更に、抗Ｄ濃縮物は、変則的なＩｇＧサブクラス分
布を持つ、つまり、この方法によると、ＩｇＧサブクラ
ス１と３は、非常に富み、サブクラス２と４は、極めて
少ない。
れた純粋な抗Ｄ濃縮物は、これらの要求を満たしている
ということ、すなわち、中でも、今まで達成されなかっ
た特異活性を有し、静脈内に充分耐容性があり、しかも
ＩｇＡの混入が極めてわずかであるということがわかっ
た。更に、抗Ｄ濃縮物は、変則的なＩｇＧサブクラス分
布を持つ、つまり、この方法によると、ＩｇＧサブクラ
ス１と３は、非常に富み、サブクラス２と４は、極めて
少ない。
【００１６】本発明に従えば、免疫グロブリンは、ヒト
血漿から直接得ることができる。出発物質は、Ｒｈ因子
Ｄに感作されたＲｈ陰性供給者からの血漿である。血漿
搬出法を通して得られた個々の寄進血液は、なるべくな
ら、凍結し、分別法にかける前に、０から４゜Ｃで、注
意深く解凍し、貯蔵する。血漿プールは、１ml当たり抗
Ｄ−ＩｇＧ１０μg 以上好ましくは、１ml当たり３０μ
g 以上の抗Ｄ−ＩｇＧを含むようにすべきである。陽イ
オン交換クロマトグラフィーに使用される血漿分画は、
いかなる既知の方法でも予備的に精製する事ができ、例
えば、寒性グロブリンの分離やエタノールの方法による
分別沈殿（Cohn, E. J. 等 J. Am. Chem. Soc. 68,45
9, 1946; Kistlerと Nitschmenn, H. Vox sang. 7,
414,1962) 、あるいは、他の沈殿法、例えば、硫安、硫
酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、カプリル酸、
リバノールによる免疫グロブリンの沈殿、あるいは、ク
ロマトグラフィー法、あるいは、そういった方法の組み
合わせなどである。
血漿から直接得ることができる。出発物質は、Ｒｈ因子
Ｄに感作されたＲｈ陰性供給者からの血漿である。血漿
搬出法を通して得られた個々の寄進血液は、なるべくな
ら、凍結し、分別法にかける前に、０から４゜Ｃで、注
意深く解凍し、貯蔵する。血漿プールは、１ml当たり抗
Ｄ−ＩｇＧ１０μg 以上好ましくは、１ml当たり３０μ
g 以上の抗Ｄ−ＩｇＧを含むようにすべきである。陽イ
オン交換クロマトグラフィーに使用される血漿分画は、
いかなる既知の方法でも予備的に精製する事ができ、例
えば、寒性グロブリンの分離やエタノールの方法による
分別沈殿（Cohn, E. J. 等 J. Am. Chem. Soc. 68,45
9, 1946; Kistlerと Nitschmenn, H. Vox sang. 7,
414,1962) 、あるいは、他の沈殿法、例えば、硫安、硫
酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、カプリル酸、
リバノールによる免疫グロブリンの沈殿、あるいは、ク
ロマトグラフィー法、あるいは、そういった方法の組み
合わせなどである。
【００１７】本発明に従って、陽イオン交換クロマトグ
ラフィーを行うに先立ち、寒性グロブリンの無い血漿、
または、平衡緩衝液で溶解された免疫グロブリンを含む
血漿分画を、選択的に濾過し、潜在しているヴィールス
を不活化する為、Horowitz(「血栓症と止血」 65,1163,
1991) により記載された方法に基づき、生物適合的
な、有機溶媒、例えば、トリ（ｎ−ブチル）燐酸、と洗
剤０−[ ４−（１、１、３、３、−テトラメチル−ブチ
ル）−フェニル] −デカ（オキシエチレン）（トリトン
ＲＸ−１００）で処理する。血漿、溶媒、洗剤の混合物
を、次に３７゜Ｃでインキュベートする。それにより、
相分離が起こる。明らかに低い相方のを分離し、希釈、
濾過陽イオン交換クロマトグラフィーの平衡条件に調
節、次のステップの温度を、通例、１０゜Ｃ以上、好ま
しくは、２０〜２５゜Ｃにする。最初の主な精製ステッ
プで、官能基として、好ましくは、カルボキシメチル
（ＣＭ）を有する、弱酸性イオン交換ゲルに、前処理生
成物からの抗Ｄ−ＩｇＧが結合する。それにより、異種
蛋白の９８％以上は洗い流される。ヴィールス不活化の
ために使用された溶媒と洗剤は、同様に、この段階で、
除去される。この過程のステップで特異的に濃縮された
ＩｇＧサブクラス１と３の抗Ｄ−ＩｇＧは、電導度を好
ましくは、１０mS／cm以上に上げることにより、イオン
交換ゲルで溶出する。溶出液は、純粋なＩｇＧ分画であ
る。すなわち、それは、全ＩｇＧ分画の１５％以下を含
み、ＩｇＧサブクラスのスペクトルも変化している。つ
まり、ＩｇＧ１とＩｇＧ３は、非常に濃縮され、ＩｇＧ
２とＩｇＧ４は、極めて減少している。
ラフィーを行うに先立ち、寒性グロブリンの無い血漿、
または、平衡緩衝液で溶解された免疫グロブリンを含む
血漿分画を、選択的に濾過し、潜在しているヴィールス
を不活化する為、Horowitz(「血栓症と止血」 65,1163,
1991) により記載された方法に基づき、生物適合的
な、有機溶媒、例えば、トリ（ｎ−ブチル）燐酸、と洗
剤０−[ ４−（１、１、３、３、−テトラメチル−ブチ
ル）−フェニル] −デカ（オキシエチレン）（トリトン
ＲＸ−１００）で処理する。血漿、溶媒、洗剤の混合物
を、次に３７゜Ｃでインキュベートする。それにより、
相分離が起こる。明らかに低い相方のを分離し、希釈、
濾過陽イオン交換クロマトグラフィーの平衡条件に調
節、次のステップの温度を、通例、１０゜Ｃ以上、好ま
しくは、２０〜２５゜Ｃにする。最初の主な精製ステッ
プで、官能基として、好ましくは、カルボキシメチル
（ＣＭ）を有する、弱酸性イオン交換ゲルに、前処理生
成物からの抗Ｄ−ＩｇＧが結合する。それにより、異種
蛋白の９８％以上は洗い流される。ヴィールス不活化の
ために使用された溶媒と洗剤は、同様に、この段階で、
除去される。この過程のステップで特異的に濃縮された
ＩｇＧサブクラス１と３の抗Ｄ−ＩｇＧは、電導度を好
ましくは、１０mS／cm以上に上げることにより、イオン
交換ゲルで溶出する。溶出液は、純粋なＩｇＧ分画であ
る。すなわち、それは、全ＩｇＧ分画の１５％以下を含
み、ＩｇＧサブクラスのスペクトルも変化している。つ
まり、ＩｇＧ１とＩｇＧ３は、非常に濃縮され、ＩｇＧ
２とＩｇＧ４は、極めて減少している。
【００１８】次に、この抗Ｄ−ＩｇＧ分画は、官能基と
して、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）をできれば有
する、第２の弱アルカリイオン交換ゲルで、処理するこ
とにより、更に精製される、というのは、抗Ｄ−ＩｇＧ
は、選択された条件下では、イオン交換体に結合しない
からである。濃度を上げる為、精製された抗Ｄ−ＩｇＧ
分画を、つぎには、ＣＭイオン交換ゲルに選択的に結合
させ、適当な条件にすると、可能な限り、濃縮されて、
溶出し、最終生成物に作り上げられる。本発明に従った
条件を達成する為に、抗Ｄ−ＩｇＧ分画をイオン濃度を
上昇する事により、溶出させるか、ｐＨ変更、緩衝液組
成の変化を行う事により溶出させるかは、重要でない。
更に不要な成分例えば、蛋白分解酵素のような成分の濃
度を減少させるため、免疫グロブリン溶液を更に、水酸
化アルミニウムゲルのような吸着剤を用いて、本方法の
いずれの段階においても、処理することができる。溶媒
−洗剤処理は、いかなる既知のヴィールス不活化／除去
工程、例えば、パスツール法のような熱処理、または、
ナノフィルトレーション（ｎａｎｏｆｉｌｔｒａｔｉｏ
ｎ）によって、取り替えることも、補足したりすること
もできる。
して、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）をできれば有
する、第２の弱アルカリイオン交換ゲルで、処理するこ
とにより、更に精製される、というのは、抗Ｄ−ＩｇＧ
は、選択された条件下では、イオン交換体に結合しない
からである。濃度を上げる為、精製された抗Ｄ−ＩｇＧ
分画を、つぎには、ＣＭイオン交換ゲルに選択的に結合
させ、適当な条件にすると、可能な限り、濃縮されて、
溶出し、最終生成物に作り上げられる。本発明に従った
条件を達成する為に、抗Ｄ−ＩｇＧ分画をイオン濃度を
上昇する事により、溶出させるか、ｐＨ変更、緩衝液組
成の変化を行う事により溶出させるかは、重要でない。
更に不要な成分例えば、蛋白分解酵素のような成分の濃
度を減少させるため、免疫グロブリン溶液を更に、水酸
化アルミニウムゲルのような吸着剤を用いて、本方法の
いずれの段階においても、処理することができる。溶媒
−洗剤処理は、いかなる既知のヴィールス不活化／除去
工程、例えば、パスツール法のような熱処理、または、
ナノフィルトレーション（ｎａｎｏｆｉｌｔｒａｔｉｏ
ｎ）によって、取り替えることも、補足したりすること
もできる。
【００１９】本発明に従って産生された抗Ｄ−ＩｇＧ
は、液性安定である。更に、静脈内に充分耐容性があ
り、ＩｇＡ量は、５μg ／ml未満、ＩｇＧ量は、１〜１
０mg／mlである。ｐＨは、ほぼ５．２である。調剤は、
好ましくは、最大２５ｍＭ燐酸塩、最大２００ｍＭ塩化
ナトリウム、と最大１００mg／mlヒトアルブミン、代わ
って２５０〜３００ｍＭのグリシンのようなアミノ酸、
また、最大１００mg／mlのスクロースのような二糖類、
あるいは、マンニトルのような単糖類５０mg／mlを含有
する。また、本研究に従って産生された抗Ｄ−ＩｇＧ
は、ｐＨが、ほぼ６．６で二糖類を付加することによ
り、例えば、抗Ｄ−ＩｇＧ２００μg 量に対し、１００
mg／mlのスクロースを添加することにより、凍結乾燥で
きる。
は、液性安定である。更に、静脈内に充分耐容性があ
り、ＩｇＡ量は、５μg ／ml未満、ＩｇＧ量は、１〜１
０mg／mlである。ｐＨは、ほぼ５．２である。調剤は、
好ましくは、最大２５ｍＭ燐酸塩、最大２００ｍＭ塩化
ナトリウム、と最大１００mg／mlヒトアルブミン、代わ
って２５０〜３００ｍＭのグリシンのようなアミノ酸、
また、最大１００mg／mlのスクロースのような二糖類、
あるいは、マンニトルのような単糖類５０mg／mlを含有
する。また、本研究に従って産生された抗Ｄ−ＩｇＧ
は、ｐＨが、ほぼ６．６で二糖類を付加することによ
り、例えば、抗Ｄ−ＩｇＧ２００μg 量に対し、１００
mg／mlのスクロースを添加することにより、凍結乾燥で
きる。
【００２０】
【実施例】添付された図は、いかなる制限もそれにより
意図されずに、本発明を例示するのに役立っている。図
１は、実施例１に従った、第１の陽イオン交換グラフィ
ーの典型的クロマトグラムを示す。本発明に従った方法
は、以下の実施例を使って、より詳細に説明されるだろ
う。
意図されずに、本発明を例示するのに役立っている。図
１は、実施例１に従った、第１の陽イオン交換グラフィ
ーの典型的クロマトグラムを示す。本発明に従った方法
は、以下の実施例を使って、より詳細に説明されるだろ
う。
【００２１】実施例１ 出発物質は、注意して選択された赤血球で、Ｒｈ因子Ｄ
に感作されたＲｈ陰性の女性、又は、男性の血漿であ
る。どの寄付血液もＨＢｓ抗原の有無、ＨＩＶ抗体、Ｃ
型肝炎抗体、ＡＬＡＴ活性の上昇の有無をテストする。
血漿搬出法を通して得られた、血漿は、個々に凍結さ
れ、分別法に先立って０〜４゜Ｃで注意深く解凍し、貯
蔵される。抗Ｄ量２５μg ／mlの氷の無い血漿プール
を、２〜４゜Ｃ下、連続遠心機(Cepa,Lahr, ドイツ )で
遠心分離する（１１／分、１２０００回転／分）。上清
を１．２μm のフィルターで濾過する。（OpticapR, Mi
llipore,Bedford MA,ＵＳＡ )。次にヴィールス不活性
かを、Horowitzらに基づき( 「血栓症と止血」、６５、
１１６３、１９９１）１％トリトンＲＸ−１００（Rohm
とHaas, フランクフルト、ドイツ）と１％トリ（ｎ−ブ
チル）燐酸（メルク、Darmstadt 、ドイツ）で４〜４．
５時間、３０゜Ｃ下溶媒−洗剤処理する方法で行う。ヴ
ィールス不活性化溶液は、１０〜１８時間、３７゜Ｃ
で、そのままに保つ。明らかに、より低い相を分離し、
０．２μm のフィルターで（Sealkleen NFP 7002, Pal
l, Dreieich, ドイツ）濾過する。溶媒と洗剤で処理さ
れた濾過血漿２５l を１０m Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液
で、平衡緩衝液（５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ
５．５、３．２mS／cm）の伝導度に希釈する、ｐＨは、
５．５に調整され１．２μm のフィルター（OpticapR,
Millipore, Bedford MA,ＵＳＡ）で濾過し、面積７０６
cm2 、ベッドの高さ７．５ｃｍカラム内、流速率は、１
５０cm／ｈにしてMascroPrepR ５０ＣＭに（ BioRad,He
rcules CA;ＵＳＡ）結合させる、ゲルは、予め５０ｍＭ
燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５. ５で平衡にしておく。
温度は、２０〜２５゜Ｃに保つ。カラムは、引き続き、
カラム体積の４０倍の２５ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液ｐ
Ｈ７．０で洗う。抗Ｄを含むＩｇＧ分画は、２５ｍＭ燐
酸ナトリウム緩衝液＋０．２Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ
７．５で溶出される。典型的なクロマトグラムは、この
処理で得られるが、１枚の添付図で示されている。図で
は、光学的濃度（ＯＤ）を２８０ｎｍの波長で時間経過
（ｔ）を追って記録している。
に感作されたＲｈ陰性の女性、又は、男性の血漿であ
る。どの寄付血液もＨＢｓ抗原の有無、ＨＩＶ抗体、Ｃ
型肝炎抗体、ＡＬＡＴ活性の上昇の有無をテストする。
血漿搬出法を通して得られた、血漿は、個々に凍結さ
れ、分別法に先立って０〜４゜Ｃで注意深く解凍し、貯
蔵される。抗Ｄ量２５μg ／mlの氷の無い血漿プール
を、２〜４゜Ｃ下、連続遠心機(Cepa,Lahr, ドイツ )で
遠心分離する（１１／分、１２０００回転／分）。上清
を１．２μm のフィルターで濾過する。（OpticapR, Mi
llipore,Bedford MA,ＵＳＡ )。次にヴィールス不活性
かを、Horowitzらに基づき( 「血栓症と止血」、６５、
１１６３、１９９１）１％トリトンＲＸ−１００（Rohm
とHaas, フランクフルト、ドイツ）と１％トリ（ｎ−ブ
チル）燐酸（メルク、Darmstadt 、ドイツ）で４〜４．
５時間、３０゜Ｃ下溶媒−洗剤処理する方法で行う。ヴ
ィールス不活性化溶液は、１０〜１８時間、３７゜Ｃ
で、そのままに保つ。明らかに、より低い相を分離し、
０．２μm のフィルターで（Sealkleen NFP 7002, Pal
l, Dreieich, ドイツ）濾過する。溶媒と洗剤で処理さ
れた濾過血漿２５l を１０m Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液
で、平衡緩衝液（５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ
５．５、３．２mS／cm）の伝導度に希釈する、ｐＨは、
５．５に調整され１．２μm のフィルター（OpticapR,
Millipore, Bedford MA,ＵＳＡ）で濾過し、面積７０６
cm2 、ベッドの高さ７．５ｃｍカラム内、流速率は、１
５０cm／ｈにしてMascroPrepR ５０ＣＭに（ BioRad,He
rcules CA;ＵＳＡ）結合させる、ゲルは、予め５０ｍＭ
燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５. ５で平衡にしておく。
温度は、２０〜２５゜Ｃに保つ。カラムは、引き続き、
カラム体積の４０倍の２５ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液ｐ
Ｈ７．０で洗う。抗Ｄを含むＩｇＧ分画は、２５ｍＭ燐
酸ナトリウム緩衝液＋０．２Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ
７．５で溶出される。典型的なクロマトグラムは、この
処理で得られるが、１枚の添付図で示されている。図で
は、光学的濃度（ＯＤ）を２８０ｎｍの波長で時間経過
（ｔ）を追って記録している。
【００２２】この図１から、カラムにかけ（負荷）洗浄
する際、不要生成物の大半は、分離され、溶出の際に
は、ＩｇＧ分画に非常に濃縮された目的の抗Ｄ−ＩｇＧ
を含む、大きな、鋭いピークが現れる事がわかる。その
特異活性は、全ＩｇＧ１ｇ当たり２％以上の抗Ｄ−Ｉｇ
Ｇに相当する。溶出液は、水で伝導度３．３mS／cm（溶
出液１に対して体積約５倍の水）に希釈、ｐＨは、０．
２Ｍ水酸化ナトリウムで７．５に調整、バッチ法によ
り、２．５時間、１００ｇDEAE-SephadexR A50dry（フ
ァルマシア、 Uppsala, スウェーデン）で吸着させる。
DEAEゲルは、予め２５ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液ｐＨ
７．５平衡にしておく。非結合の抗Ｄ−ＩｇＧ分画は、
ポリエチレンメッシュを通して濾過し、ｐＨは、５．５
に調整する。濃度を上げるため、ＤＥＡＥ濾液は、２回
目に、面積７１cm2 、ベッドの高さ１２．５cm、流速率
２３０cm／h のカラムで、MacroPrep Ｒ５０ＣＭ（BioR
ad, Hercules CA,ＵＳＡ）に結合させる、ゲルは、予
め、５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５で平衡に
しておく。抗Ｄを含むＩｇＧ分画は、２５ｍＭ燐酸ナト
リウム緩衝液＋０．２Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ５．５で
溶出される。ＣＭゲルは、１Ｎ水酸化ナトリウムで再生
され、洗浄し発熱物質を除き、少なくとも２０回は、使
用可能である。ＤＥＡＥゲルは、１回使用後捨てる。
する際、不要生成物の大半は、分離され、溶出の際に
は、ＩｇＧ分画に非常に濃縮された目的の抗Ｄ−ＩｇＧ
を含む、大きな、鋭いピークが現れる事がわかる。その
特異活性は、全ＩｇＧ１ｇ当たり２％以上の抗Ｄ−Ｉｇ
Ｇに相当する。溶出液は、水で伝導度３．３mS／cm（溶
出液１に対して体積約５倍の水）に希釈、ｐＨは、０．
２Ｍ水酸化ナトリウムで７．５に調整、バッチ法によ
り、２．５時間、１００ｇDEAE-SephadexR A50dry（フ
ァルマシア、 Uppsala, スウェーデン）で吸着させる。
DEAEゲルは、予め２５ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液ｐＨ
７．５平衡にしておく。非結合の抗Ｄ−ＩｇＧ分画は、
ポリエチレンメッシュを通して濾過し、ｐＨは、５．５
に調整する。濃度を上げるため、ＤＥＡＥ濾液は、２回
目に、面積７１cm2 、ベッドの高さ１２．５cm、流速率
２３０cm／h のカラムで、MacroPrep Ｒ５０ＣＭ（BioR
ad, Hercules CA,ＵＳＡ）に結合させる、ゲルは、予
め、５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５で平衡に
しておく。抗Ｄを含むＩｇＧ分画は、２５ｍＭ燐酸ナト
リウム緩衝液＋０．２Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ５．５で
溶出される。ＣＭゲルは、１Ｎ水酸化ナトリウムで再生
され、洗浄し発熱物質を除き、少なくとも２０回は、使
用可能である。ＤＥＡＥゲルは、１回使用後捨てる。
【００２３】実施例２ 出発物質は、注意深く選択された赤血球で感作されたＲ
ｈ陰性の女性または、Ｒｈ陰性の男性の血漿である。寄
付された血液は、どれもＨＢｓ抗原、ＨＩＶ抗体、Ｃ型
肝炎の抗体の有無、ＡＬＡＴ活性の上昇をテストする。
血漿搬出法を通して得られた、血漿は、個々に凍結し、
分別法に先立ち、０〜４゜Ｃで、注意深く解凍し、貯蔵
する。氷の無い血漿プールは、連続遠心機（Cepa, Lah
r, ドイツ）で遠心分離する。（１１／分、１２０００
Ｕ／分）上清を１．２μm フィルター（OpticapR, Mill
ipore, Bedford MA,ＵＳＡ）で濾過する。
ｈ陰性の女性または、Ｒｈ陰性の男性の血漿である。寄
付された血液は、どれもＨＢｓ抗原、ＨＩＶ抗体、Ｃ型
肝炎の抗体の有無、ＡＬＡＴ活性の上昇をテストする。
血漿搬出法を通して得られた、血漿は、個々に凍結し、
分別法に先立ち、０〜４゜Ｃで、注意深く解凍し、貯蔵
する。氷の無い血漿プールは、連続遠心機（Cepa, Lah
r, ドイツ）で遠心分離する。（１１／分、１２０００
Ｕ／分）上清を１．２μm フィルター（OpticapR, Mill
ipore, Bedford MA,ＵＳＡ）で濾過する。
【００２４】次にヴィールス不活性化をHorowotzらに基
づき、（血栓症と止血６５、１１６３、１９９１）１％
トリトンＲＸ−１００（RohmとHaas、ドイツ）１％トリ
（ｎーブチル）燐酸（Merck,Darmstadt,ドイツ）で４〜
４．５時間３０゜Ｃ溶媒−洗剤処理を行う。ヴィールス
不活性化溶液は、３７゜Ｃ下１０〜１８時間そのまま保
存する。明らかに、より低い相を分離し、０．２μm の
フィルターで濾過する（Sealkleen NFP 7002, Pall, Dr
eieich, ドイツ）。溶媒と洗剤で処理された濾過血漿２
５l は、１０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液で、平衡緩衝液
の（５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５、３．
２m ｓ／cm）の伝導度に、希釈し、ｐＨを５．５に調整
し、１．２μm フィルター（OpticapR, Millipore,Bedf
ord MA,ＵＳＡ）で濾過する。更に、面積７０６cm2 、
ベッドの高さ７．５cm、流速率１５０cm／ｈのカラム
で、MacroPrepR 50CM( BioRad, Hercules, CA;ＵＳＡ )
に結合させる、ゲルは、予め、５０ｍＭ燐酸ナトリウム
緩衝液、ｐＨ５. ５で平衡に保たれている。温度は、２
０〜２５゜Ｃに保つ。カラムは、引き続きカラム体積の
４０倍の２５ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０で
洗うと、抗Ｄを含むＩｇＧ分画は、２５ｍＭ燐酸ナトリ
ウム緩衝液＋０．２Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５で溶
出する。ｐＨ６．６で、抗Ｄ−ＩｇＧ２００μg を１単
位として、１００mg／mlのスクロースを添加し、溶出液
を０．２μm のフィルターで濾過する（MillidiskR, MC
GL-10, Millipore, Bedford, MA,ＵＳＡ )、引き続き凍
結乾燥する。
づき、（血栓症と止血６５、１１６３、１９９１）１％
トリトンＲＸ−１００（RohmとHaas、ドイツ）１％トリ
（ｎーブチル）燐酸（Merck,Darmstadt,ドイツ）で４〜
４．５時間３０゜Ｃ溶媒−洗剤処理を行う。ヴィールス
不活性化溶液は、３７゜Ｃ下１０〜１８時間そのまま保
存する。明らかに、より低い相を分離し、０．２μm の
フィルターで濾過する（Sealkleen NFP 7002, Pall, Dr
eieich, ドイツ）。溶媒と洗剤で処理された濾過血漿２
５l は、１０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液で、平衡緩衝液
の（５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５、３．
２m ｓ／cm）の伝導度に、希釈し、ｐＨを５．５に調整
し、１．２μm フィルター（OpticapR, Millipore,Bedf
ord MA,ＵＳＡ）で濾過する。更に、面積７０６cm2 、
ベッドの高さ７．５cm、流速率１５０cm／ｈのカラム
で、MacroPrepR 50CM( BioRad, Hercules, CA;ＵＳＡ )
に結合させる、ゲルは、予め、５０ｍＭ燐酸ナトリウム
緩衝液、ｐＨ５. ５で平衡に保たれている。温度は、２
０〜２５゜Ｃに保つ。カラムは、引き続きカラム体積の
４０倍の２５ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０で
洗うと、抗Ｄを含むＩｇＧ分画は、２５ｍＭ燐酸ナトリ
ウム緩衝液＋０．２Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５で溶
出する。ｐＨ６．６で、抗Ｄ−ＩｇＧ２００μg を１単
位として、１００mg／mlのスクロースを添加し、溶出液
を０．２μm のフィルターで濾過する（MillidiskR, MC
GL-10, Millipore, Bedford, MA,ＵＳＡ )、引き続き凍
結乾燥する。
【００２５】実施例３ 溶媒と洗剤で処理された血漿５mlを、平衡緩衝液の
（３．３mS／cm）の伝導度に希釈し、DEAD-SephadexR A
50(Pharmacia, Uppsala,スウェーデン）を使用して、面
積２cm2 、ベッドの高さ５cm、流速率３０cm／ｈのカラ
ムでのクロマトグラフをとる。ゲルは、予め２５ｍＭ燐
酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５で平衡に保たれてい
る。温度は約２０〜２５゜Ｃに維持する。更に精製する
ために、結合していないＩｇＧ分画を０．２Ｍ塩酸でｐ
Ｈ５．５と伝導度３．２mS／cmに調節し、面積０．８cm
2 、ベッドの高さ６．５cm、流速率２３０cm／ｈのカラ
ムで、MacroPrepR, 50CM ( BioRad,Hercules, CA, ＵＳ
Ａ) に結合させる、ゲルは、予め５０ｍＭ燐酸緩衝液、
ｐＨ５．５で、平衡に保っておく。抗Ｄを含むＩｇＧ分
画は、２５ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液＋０．２Ｍ塩化ナ
トリウムで溶出し、最終生成物に加工される。DEAE Sep
hadexR A50ゲルは、１回使用で捨てられるが、MacroPre
pR 50CM ゲルは、１Ｎ水酸化ナトリウムで再生され、発
熱物質のない状態へ、洗浄され、少なくとも、２０回
は、使用可能である。
（３．３mS／cm）の伝導度に希釈し、DEAD-SephadexR A
50(Pharmacia, Uppsala,スウェーデン）を使用して、面
積２cm2 、ベッドの高さ５cm、流速率３０cm／ｈのカラ
ムでのクロマトグラフをとる。ゲルは、予め２５ｍＭ燐
酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５で平衡に保たれてい
る。温度は約２０〜２５゜Ｃに維持する。更に精製する
ために、結合していないＩｇＧ分画を０．２Ｍ塩酸でｐ
Ｈ５．５と伝導度３．２mS／cmに調節し、面積０．８cm
2 、ベッドの高さ６．５cm、流速率２３０cm／ｈのカラ
ムで、MacroPrepR, 50CM ( BioRad,Hercules, CA, ＵＳ
Ａ) に結合させる、ゲルは、予め５０ｍＭ燐酸緩衝液、
ｐＨ５．５で、平衡に保っておく。抗Ｄを含むＩｇＧ分
画は、２５ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液＋０．２Ｍ塩化ナ
トリウムで溶出し、最終生成物に加工される。DEAE Sep
hadexR A50ゲルは、１回使用で捨てられるが、MacroPre
pR 50CM ゲルは、１Ｎ水酸化ナトリウムで再生され、発
熱物質のない状態へ、洗浄され、少なくとも、２０回
は、使用可能である。
【００２６】実施例４ 実施例１から３に従った方法を、繰り返し行う。しか
し、出発物質として、血漿の代わりに、最初の血漿に相
応する量の血漿から製造され、免疫グロブリンを含む血
漿分画も使用される。その場合、Cohn ( Cohn, E.J. 等
J. Am. Chem. Soc. 68, 459, 1949) に依れば、分画
(a)＋(b)＋(c)、または、分画(b)＋(c)、あるいは、Kis
tler と Nitschmamm に依ると ( Kistler, P.とNitschm
ann, H. Vox Sang, 7, 414, 1962 ) 沈殿物Ａまたは、
ガンマーグロブリン沈殿物が、得られ、平衡緩衝液で蛋
白量３０μｇ／l に溶解すると、同様の結果が得られ
る。
し、出発物質として、血漿の代わりに、最初の血漿に相
応する量の血漿から製造され、免疫グロブリンを含む血
漿分画も使用される。その場合、Cohn ( Cohn, E.J. 等
J. Am. Chem. Soc. 68, 459, 1949) に依れば、分画
(a)＋(b)＋(c)、または、分画(b)＋(c)、あるいは、Kis
tler と Nitschmamm に依ると ( Kistler, P.とNitschm
ann, H. Vox Sang, 7, 414, 1962 ) 沈殿物Ａまたは、
ガンマーグロブリン沈殿物が、得られ、平衡緩衝液で蛋
白量３０μｇ／l に溶解すると、同様の結果が得られ
る。
【００２７】実施例５ 実施例１から４に従った方法を、繰り返し行う、それに
より、抗Ｄを含むＩｇＧ分画が、MacrePrepR 50CM ゲル
（BioRad, Hercules, CA, ＵＳＡ）から溶出され、代わ
って、２５ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液＋０．２Ｍ塩化ナ
トリウム、ｐＨ７．５でなく０．１Ｍグリシン＋０．５
Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ９、あるいは、一般的には、ｐ
Ｈ変更かつ、または、イオン強度の変化、かつ、また
は、緩衝液組成の他の変化を行うと、同様の結果が得ら
れる。
より、抗Ｄを含むＩｇＧ分画が、MacrePrepR 50CM ゲル
（BioRad, Hercules, CA, ＵＳＡ）から溶出され、代わ
って、２５ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液＋０．２Ｍ塩化ナ
トリウム、ｐＨ７．５でなく０．１Ｍグリシン＋０．５
Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ９、あるいは、一般的には、ｐ
Ｈ変更かつ、または、イオン強度の変化、かつ、また
は、緩衝液組成の他の変化を行うと、同様の結果が得ら
れる。
【００２８】実施例６ 実施例１と実施例２に従った方法を繰り返し行う、それ
によりMacroPrepR 50CM ゲル (BioRad, Hercules, CA,
ＵＳＡ )を２５ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．
０、の代わりに、１０ｍＭグリシン、ｐＨ９で洗浄する
と、同様の結果が得られる。
によりMacroPrepR 50CM ゲル (BioRad, Hercules, CA,
ＵＳＡ )を２５ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．
０、の代わりに、１０ｍＭグリシン、ｐＨ９で洗浄する
と、同様の結果が得られる。
【００２９】実施例７ 実施例１に従って得られた、抗Ｄ溶出液を、次の条件に
調整する：
調整する：
【００３０】
【表１】
【００３１】そして０．２μｍフィルター(MillipakRー
20,Millipore,BedfordMA, ＵＳＡ) で濾過後、無菌状態
下、抗Ｄ溶出液を、Hypac の即使用できるシリンジ（Ve
tter,Ravensburg, ドイツ）に満たす。
20,Millipore,BedfordMA, ＵＳＡ) で濾過後、無菌状態
下、抗Ｄ溶出液を、Hypac の即使用できるシリンジ（Ve
tter,Ravensburg, ドイツ）に満たす。
【００３２】実施例８ 実施例１に基づいたＤＥＡＥ濾液（ｐＨは、ほぼ５．
５）を、蛋白量１ｇ当たり０．２ｇの水酸化アルミニウ
ムゲルを用いて、２０〜２５゜Ｃにて、３０分処理し、
更に、実施例１に従って、操作した。
５）を、蛋白量１ｇ当たり０．２ｇの水酸化アルミニウ
ムゲルを用いて、２０〜２５゜Ｃにて、３０分処理し、
更に、実施例１に従って、操作した。
【００３３】実施例９ 実施例１から６に従った方法を、繰り返し行う。その場
合、MacroPrepR 50CMの代わりに、同じ官能基を有す
る、ゲル：CM-SpherodexR(BioSepra, Villeneuvela Gar
enne,フランス ), CM-TrisacrylR (BioSepra, Villeneu
ve la Garenne,フランス), CM-SepharoseR FF ( Pharma
cia, Uppsala, スウェーデン),または、FracrogelR TSK
CM-650 ( Merck, Darmstadt,ドイツ) を使用すると、
同様の結果が得られる。
合、MacroPrepR 50CMの代わりに、同じ官能基を有す
る、ゲル：CM-SpherodexR(BioSepra, Villeneuvela Gar
enne,フランス ), CM-TrisacrylR (BioSepra, Villeneu
ve la Garenne,フランス), CM-SepharoseR FF ( Pharma
cia, Uppsala, スウェーデン),または、FracrogelR TSK
CM-650 ( Merck, Darmstadt,ドイツ) を使用すると、
同様の結果が得られる。
【００３４】実施例１０ 実施例３から６に従う方法と同様に、実施例１に従う方
法を繰り返す。その場合、DEAE-SephadexR A50の代わり
に, MacrePrepRDEAE ( Biorad, Hercules CA, ＵＳＡ)
を使用すると、同様の結果が得られる。前述の実施例１
から６での、クロマトグラフィーにかけるステップは、
代わりに、バッチカラムや、膜クロマトグラフィーとし
ても行うことができ、やはり同様の結果が得られる。
法を繰り返す。その場合、DEAE-SephadexR A50の代わり
に, MacrePrepRDEAE ( Biorad, Hercules CA, ＵＳＡ)
を使用すると、同様の結果が得られる。前述の実施例１
から６での、クロマトグラフィーにかけるステップは、
代わりに、バッチカラムや、膜クロマトグラフィーとし
ても行うことができ、やはり同様の結果が得られる。
【００３５】
【発明の効果】本発明において、ＩｇＧサブクラス１と
３の抗Ｄ免疫グロブリンが特異的に濃縮される、純粋な
抗Ｄ濃縮物を極めて簡単な方法で製造することができ
る。更に、静脈内に充分耐容性があり、しかも、適当な
安定剤の添加により、あるいは凍結乾燥又は好ましくは
溶液で、活性の損失なく、数カ月貯蔵する事ができる、
ＩｇＡを痕跡程度のみ含む抗Ｄ調剤を得ることができ
る。
３の抗Ｄ免疫グロブリンが特異的に濃縮される、純粋な
抗Ｄ濃縮物を極めて簡単な方法で製造することができ
る。更に、静脈内に充分耐容性があり、しかも、適当な
安定剤の添加により、あるいは凍結乾燥又は好ましくは
溶液で、活性の損失なく、数カ月貯蔵する事ができる、
ＩｇＡを痕跡程度のみ含む抗Ｄ調剤を得ることができ
る。
【図１】実施例１に従った、第１の陽イオン交換グラフ
ィーの典型的クロマトグラムを示す図である。
ィーの典型的クロマトグラムを示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ペーター・レルヒ スイス国 ベルン、ローゼンヴェーク 20 (72)発明者 マルティン・シュタッキ スイス国 ラウペン、ヴァゼルマットヴ ェーク ７ (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) A61K 39/395 ＢＩＯＴＥＣＨＡＢＳ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (14)
- 【請求項１】 ＲｈＤ因子に感作されたドナーのＲｈ陰
性血、および抗Ｄ−ＩｇＧ含有血漿分画を、 A) 官能基としてカルボキシメチル基をもち、抗Ｄ−Ｉ
ｇＧが結合する吸着剤を用いて、ｐＨ３．５〜６．５、
電導度２〜４ mS ／cmにて、イオン交換クロマトグラフ
ィにかけ、 B) 抗Ｄ−ＩｇＧの結合した吸着剤を、まずｐＨ５〜８
及び電導度２〜４mS／cmの洗浄液でリンスし、続いて抗
Ｄ−ＩｇＧを溶出し、次いで C) ｐＨ６〜８及び電導度２〜４mS／cmで溶出した抗Ｄ
−ＩｇＧを、不要の成分を結合させるためのイオン交換
特性を有するアルカリ性吸着剤で処理し、抗Ｄ−ＩｇＧ
を濃縮させる、 ことを特徴とするヒト血漿から、全ＩｇＧ１ｇ当たり１
％以上の抗Ｄ−ＩｇＧ特異活性をもつ抗Ｄ免疫グロブリ
ンＧ調剤を製造する方法。 - 【請求項２】 ＡとＢの段階を少なくとも一回繰り返し
て、段階Ｃにて抗Ｄ−ＩｇＧを濃縮させる請求項１に記
載の方法。 - 【請求項３】 不要成分を結合させるためのイオン交換
特性を有する塩基性吸着剤で前処理した血漿を出発物質
として使用する請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】 血漿または血漿分画中の蛋白分解酵素
が、アルミニウム水酸化物ゲルのような吸着剤を用いた
インキュベーションにより減少される請求項１または２
に記載の方法。 - 【請求項５】 イオン交換クロマトグラフィーの全ステ
ップ、及び更に必要ならば吸着ステップは、バッチクロ
マトグラフィー、カラムクトマトグラフィー、膜クロマ
トグラフィーで代用される請求項１から４のいずれか１
項に記載の方法。 - 【請求項６】 段階Ｃでのアルカリ性吸着剤が、官能基
としてジエチルアミノエチル基を持つ請求項１から５の
いずれか１項に記載の方法。 - 【請求項７】 段階Ｂでの溶出が、ｐＨ変化及び／又は
緩衝液組成の変化により行われる、請求項１から６のい
ずれか１項に記載の方法。 - 【請求項８】 該ｐＨ変化及び緩衝液組成の変化が、そ
れぞれイオン濃度及び組成物の電導度の変化により行わ
れる請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 少なくとも１つのヴィールス不活性化段
階を含む請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１０】 ヴィールス不活性化段階は、血漿又は
抗Ｄ−ＩｇＧを含む分画を、洗剤とトリ（ｎ−ブチル）
燐酸で処理する事から成り、溶媒と洗剤を含む混合液の
相を分離し、明確に低い相を使用する、請求項９に記載
の方法。 - 【請求項１１】 ヴィールス不活性化ステップは、熱処
理、除去又はナノフィルトレーションである請求項９に
記載の方法 - 【請求項１２】 最初の血漿又は、最初の血漿分画を、
段階Ａ）でのイオン交換クロマトグラフィーの段階に先
立ち、次のステップのすくなくとも１つにかける、請求
項１から１１のいずれか１項に記載の方法。 a)血漿を凍結し、寒冷沈殿物を、溶解後かつ更なる使用
の前に、濾過及び／又は遠心分離により分離する。 b)溶媒−洗浄混合物での処理、ほぼ３７°Ｃでのインキ
ュベート及び相分離する。 - 【請求項１３】 製薬的に受け入れられるキャリヤー及
び付加剤を含有する、請求項１から１２までのいずれか
１項に記載の方法に従って製造された製薬的調剤。 - 【請求項１４】 ２０〜２００μｇ／mlの抗Ｄ−Ｉｇ
Ｇ、５μｇ／ml未満のＩｇＡ量、及び製薬的調剤中の１
０％以下の全蛋白量を含有し、ｐＨ値が５．０〜７．５
の範囲である、請求項１３に記載の製薬的調剤。
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| DE19923027C2 (de) * | 1999-05-19 | 2002-09-19 | Aventis Behring Gmbh | Verfahren zur Inaktivierung von Viren |
| US6475749B1 (en) * | 1999-08-11 | 2002-11-05 | The Regents Of The University Of California | Rh hybrid antibody |
| SE0001128D0 (sv) * | 2000-03-30 | 2000-03-30 | Amersham Pharm Biotech Ab | A method of producing IgG |
| ES2184594B1 (es) * | 2001-01-17 | 2004-01-01 | Probitas Pharma Sa | Procedimiento para la produccion de gammaglobulina g humana inactivada de virus. |
| EP1532983A1 (en) * | 2003-11-18 | 2005-05-25 | ZLB Bioplasma AG | Immunoglobulin preparations having increased stability |
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| TWI391399B (zh) | 2005-05-25 | 2013-04-01 | Hoffmann La Roche | 測定溶離多肽之鹽濃度之方法 |
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