TW311884B - - Google Patents

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311884 A7 B7 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五、發明説明 (1 ) 1 1 本 發 明 係 關 於 一 種製 造 抗 -D (抗- Rh )免疫球蛋白G (抗-D 1 1 1 I g G ) 之 新 穎 m 縮 液 的製 法 及 一 種 包 含 此 濃 縮 液作為 其 有 1 1 效 成 份 的 路 藥 製 劑 〇 /·—». 請 1 I 先 1 新 生 兒 溶 血 症 (M 〇 r b u S ha e m ο 1 y t 1 C U S η e 〇 n a t 〇 r u η) 是 閱 讀 1 母 親 抗 體 所 引 起 的 胎兒 及 新 生 兒 的 溶 血 性 貧 血的一 般 稱 背 1 I 之 1 呼 〇 這 些 抗 體 是 對 抗位 在 胎 兒 紅 血 球 表 面 的 抗原。 因 此 意 1 事 1 相 關 的 抗 原 可 Μ 是 任何 Rh 9 ΑΒ0 或 其 他 血 型 系铳的 抗 原° 項 再 1 在 Rh 血 型 中 最 重 要的 抗 原 有 D • 具 有 明 顯 較微弱 致 免 填 窝 本 k 疫 性 的 a η t i t h e t i C a 1抗 原 C t C 與 E 9 e 9 以及D1* 此 頁 '— 1 I 外 * 更 — 步 的 超 過 40種 的 Rh抗 原 已 為 人 所 知 。凌駕 於 所 1 1 有 抗 原 之 上 t 對 於 Rh的 不 相 合 性 (r h e S U S in c 〇 祖 f> a t i b i 1 i t y ) 1 1 最 具 有 臨 床 重 要 性 的是 Rh抗 原 D (RhD ; Rh 0 ),其為- 1 訂 種 紅 血 球 的 膜 蛋 白 ,近 來 已 被 選 殖 且 初 级 结 構已被 描 述 1 (L e Va η κ i m等， PN AS USA, 89 , 1 0925 1 1 992卜此D 1 | 抗 原 可 在 歐 洲 大 約 85¾ 的 高 加 索 人 中 發 現 * 這些具 有 D 1 1 抗 原 的 個 體 被 稱 為 Rh陽 性 〇 缺 乏 D- 抗 原 的 個 體稱為 Rh陰 1 » 性 〇 在 Rh不 相 合 的 妊娠 期 間 及 在 Rh - 不相合血液的輸 線 I 血 後 * 特 殊 的 抗 -D抗體 是 最 常 見 的 異 常 Rh抗 體，超 乎 其 1 1 他 抗 體 而 產 生 0 抗 -D抗 體 顯 著 地 是 靨 於 IgG 的次群 1 1 (S u b cl as S ) 1 及 3 (IgG 1 及 I g G 3) 〇 I 直 到 現 在 t 對 於 Rh敏 感 型 的 懷 孕 婦 女 * 並 沒有萬無一失、 1 有 效 的 常 態 治 療 方法 〇 由 於 去 敏 感 性 (d e s e n s i t i z a t i ο η ) 1 | U 乎 不 可 能 » 對 於 適孕 年 龄 的 Rh陰 性 型 婦 女 而言， 抗 1 | -D免 疫 球 蛋 白 進 行 Rh敏 感 性 的澦 防 是 具 有 決 定性的 重 要。 1 1 1 -3 - 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 311884 A7 B7 五、發明説明（2 ) 在沒有治療的情況下，高達17S：具有Rh母體排斥 (rhesus constellation)(母親為障性丨，小孩.為R h陽性） 的初孕婦，會在懷孕過程或分娩期間，對Rh抗原變得敏 感。 抗-D製劑已被成功地使用超過30年，以用來預防R h陰性或 個別地Dtt-陽性婦女，對於Rh因子D ,或個別的D“因子 的Rh敏感性，因此能預防在新生兒與抗-D抗體有閫的疾 病，M Rh-母紅血球症（rhesus-erythroblastose)的稱 呼涵蓋所有型式的此類病症。

Rh敏感性的危瞼随著胎兒的Rh陽性紅血球的流入量而 增加。由WHO所建議的200微克的抗- DIgG的治療劑量 ,Μ作為分娩後預防治療，便足K中和高達10奄升的胎 兒紅血球（相當於大約20毫升的胎兒血液 >,且因此，甚 至在較大血液流入量下，能預防大約90S：病例的Rh敏感 性。後壤地對於Rh抗原的敏感性的發生只有占所有Rh母 體排斥的初孕婦中的1-2¾。透過在妊娠期間，另外的常 態Rh預防處理（分娩前預防），所剩餘的敏感性危險可Μ 再度減少到占所有Rh母體排斥現象的初孕婦的0.1-0.2¾。 此外，抗-D可用於將Rh陽性血液誤輸人Rh陰性的受血 者的情況；故而該劑量可依Rh陽性紅血球的輸入量而非 調整。 使用抗-D免疫球蛋白於原發性血小板減少症（ITP)的 治療已歷經數年的討論。

在生物體内，肌肉注射的IgG與血管注射的IgG之S -4- 本紙張X度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公嫠） ---------------IT------i (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 311884 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明 ( 3 ) 1 1 m 動 力 學 清 楚 地 顯 示 在 所 有 的 方 式 中 * 經 血 管 腌 用 是 較 J 1 佳 的 Ο 在 肌 肉 注 射 的 情 況 下 » 基 於 肌 肉 積 存 的 緩 慢 吸 收 1 1 及 局 部 的 蛋 白 質 分 解 • 最 大 活 性 的 延 遲 及 有 效 性 的 損 失 ^—S 請 1 先 1 是 可 預 期 的 0 IgG 血 漿 濃 度 的 最 大 值 » 在 身 體 健 康 的 測 閲 讀 1 I 試 主 體 中 » 在 注 射 後 四 天 才 能 達 到 t 對 於 臥 床 的 測 試 主 背 1 I 之 1 體 則 需 在 注 射 後 天 才 能 達 到 0 此 外 f 在 健 康 的 測 試 注 意 1 事 1 主 體 中 IgG 血 漿 濃 度 的 最 大 值 僅 有 注 射 量 的 大 約 30¾ 項 再 1 • 對 於 臥 床 的 測 試 主 體 9 只 有 20¾ 〇 填 寫 本 k 相 較 之 下 » 從 血 管 施 用 具 有 相 當 之 優 點 〇 只 有 這 種 施 頁 1 I 用 方 式 9 所 有 的 施 用 m 劑 量 均 可 發 生 效 用 而 無 視 於 生 理 1 1 活 動 的 狀 況 IgG 的 血 漿 值 實 際 上 與 身 體 活 動 無 關 ，在經 1 1 過 5 天 後 會 下 降 t 降 至 施 蕖 劑 量 的 35 40¾ * 且 只 有 在 1 訂 第 五 天 的 值 降 到 相 當 於 肌 肉 注 射 後 所 達 到 的 血 漿 最 大 濃 1 度 (M or el 1 , A 等人， V 0 X S an g . 38 , 272 > 1 9 80 )( 1 | 為 了 要 工 業 生 產 免 疫 球 蛋 白 製 劑 * 今 B 已 採 用 不 同 的 1 1 化 學 分 離 過 程 * 1 1 例 如 根 據 Co hn 提 出 的 冷 乙 醇 沈 m 法 或 是 基 於 Co h η 的 線 1 修 正 過 程 » 對 於 處 理 每 週 超 過 500 公 升 的 血 漿 量 是 最 適 1 1 合 的 〇 透 過 特 殊 的 處 理 9 例 如 在 pH4 下 Μ 胃 蛋 白 酶 處 理 1 1 1 經 此 方 式 分 離 的 免 疫 球 蛋 白 9 是 相 當 有 血 管 施 用 的 附 I 受 性 的 0 其 他 的 沈 m 方 法 係 基 於 Μ 硫 酸 銨 9 硫 酸 納 聚 1 1 乙 二 醇 * 辛 酸 或 乳 酸 -6 ,9 -二胺基- 2- 乙 氧 基 吖 啶 ( 利 凡 1 I 諾 ) ( 對 於 其 概 論 9 可 見 Cu r 1 in g > J .Μ 血漿蛋白的 1 | 分 離 9 J. Μ . C U Γ 1 i n g » e d * · 1 983 , P h a r m a c i a > Up P s ala, 1 1 1 -5 - 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 311884 A7 B7 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 五、發明説明 (4 ) 1 I S w e c e η ), 來對免疫球蛋白進行特殊沈澱。 1 1 一 種 藉 著 離 子 交 換 器的 批 式 吸 附 方 式 來分 離 免 疫 球 蛋 1 1 白 的 方 法 〇 早 在 1964年便 已 首 度 被 描 述 (B a υ ms t a r k » J . s. y-s. 請 1 先 1 等 » Ar c h • B i 0 C h e 也♦ Bio p h y s ♦ t 1 08 • 514, 1 964 ) 〇 在 閲 讀 1 1 後 鑛 1 2年 9 數 種 管 柱 處理 過 程 也 被 發 展 (CH- A- 572745 ； 背 1 I 之 I US -A -3 ,869 ,436 ； EP -A-0 085 747 ). 且在其他事物使 注 意 1 | 用 中 • 其 被 用 在 抗 -D免疫 球 蛋 白 的 化 學 分離 上 (F r 1 e s e η , 事 項 再 1 1 A . D . 等 t J . A P P 1 . Biochem* 3 9 164, 1981) 0 填 寫 本 A Μ 所 有 已 描 述 的 方 法所 製 造 高 產 量 的 完整 IgG » 其 具 頁 '—✓ 1 I 有 高 純 度 及 無 改 變 的 IgG 次 群 分 佈 但 是並 沒 有 特 定 的 1 1 Ig G 次 群 或 特 殊 的 IgG分 子 • 像 是 例 如 抗-D Ig G « 特 刖 1 1 的 濃 縮 現 象 0 訂 大 多 數 抗 -D超 免 疫 球蛋 白 的 製 劑 僅 適 用於 經 由 肌 肉 施 1 用 0 全 世 界 市 面 上 只 有一 些 經 血 管 施 用 且具 良 好 人 體 耐 1 I 受 性 的 製 劑 0 一 種 此 類製 劑 是 本 申 請 者 所提 出 的 免 疫 球 1 I 蛋 白 抗 -DSRK 9 其 係 根據 K i s t 1 e r及N it s c h m an η (K i s t 1 e r , 1 1 P . 及 N i t S c h m a η η » Η . Vox S an g > 7 * 41 4, 1962) 的 化 學 線 I 分 離 方 法 所 產 生 且 藉著 在 pH4 . 0 下 Μ 溫和 的 胃 蛋 白 酶 1 1 1 處 理 的 方 式 * 成 為 相 當有 血 管 施 用 的 附 受性 〇 由 於 在 Μ 1 1 此 種 化 學 分 離 之 類 的 方法 製 造 時 特 殊 的抗 -D抗 體 的 產 I 量 很 低 9 且 同 時 由 於 抗-D 超 -免疫血漿很稀少， 所Μ需要一 1 1 種 新 的 方 法 争 其 與 上述 的 方 法 不 同 * 能在 低 滴 定 量 的 1 I 抗 -D血 漿 池 (a n t i - D plasma P 0 0 1 s )中， 產生具有高產 1 I 量 及 高 度 的 特 殊 抗 -D活性 的 純 IgG 製 劑 Ο 1 1 1 -6 - 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐） 311884 A7 B7 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五、發明説明 ( 5 ) 1 1 所 Μ 本 發 明 的 巨 的 係 在 提 供 一 種 生 產 純 抗 -D m 縮 液 的 1 1 方 法 » 在 該 方 法 中 抗 -D免 疫 球 蛋 白 的 I g G 次 群 1 及 3 是 1 1 特 別 被 濃 縮 〇 此 濃 縮 現 象 已 經 揭 示 能 >λ 一 種 相 當 簡 單 的 /«—V 請 1 先 1 方 式 來 達 成 » 且 同 時 去 除 超 過 85¾ 的 不 專 · 的 IgG 及 幾 閲 讀 1 1 乎 所 有 不 要 的 其 他 血 漿 成 份 〇 在 經 特 別 選 擇 且 特 殊 免 疫 背 1 I 之 1 的 捐 血 者 的 血 漿 中 t 或 來 自 該 血 漿 * 包 含 免 疫 球 蛋 白 的 注 意 1 I 部 分 ， 該 血 漿 或 部 分 血 漿 具 有 滴 定 量 最 好 超 過 30微 克 / 事 項 再 1 1 毫 升 的 抗 -D I g G » 在 根 據 本 發 明 的 製 造 狀 態 下 t 該 血 漿 % 寫 本 1 或 其 含 免 疫 球 蛋 白 的 部 分 > 要 接 受 陽 離 子 交 換 的 層 析 處 頁 '— 1 1 理 〇 此 高 產 量 獲 得 的 抗 -dm 縮 液 具 有 增 加 的 比 活 性 ( 每 1 1 克 想 I g G 中 抗 -D Ig G 的 克 數 ) 且 可 >λ 進 一 步 地 透 過 個 1 I 別 Μ 其 他 離 子 交 換 器 或 氫 氣 化 鋁 凝 膠 或 者 Μ 適 當 的 組 合 1 訂 方 式 等 額 外 處 理 來 純 化 〇 1 本 發 明 的 另 一 百 的 係 在 提 供 一 種 抗 -D製 劑 9 其 包 含 微 1 I 量 的 IgG t 相 當 具 有 血 管 施 用 的 耐 受 性 9 且 在 加 人 適 當 1 I m 定 劑 的 情 況 下 t 另 一 選 擇 係 Μ 冷 凍 乾 燦 * 最 好 是 溶 液 1 f 型 式 » 可 Μ 貯 存 數 月 且 不 喪 失 活 性 0 藉 著 根 據 本 發 明 所 線 I 建 議 的 方 法 所 獲 得 的 純 抗 -D 濃 縮 液 可 滿 足 這 些 需 求 * 亦 1 1 即 » 已 發 現 在 其 他 事 物 之 間 9 其 具 有 Μ 前 從 未 達 到 的 比 1 活 性 相 當 具 有 血 管 施 用 的 耐 受 性 9 及 相 當 低 的 IgG 含 I 量 〇 此 外 > 該 抗 -D 濃 縮 液 具 有 一 不 尋 常 的 IgG 次 群 分 佈 1 1 t 在 此 分 佈 中 藉 著 處 理 方 法 • IgG 的 次 群 1 及 3 大 量 1 | 地 富 化 • 然 而 次 群 2 及 4 大 量 地 減 少 0 1 1 本 發 明 的 主 體 是 一 種 製 造 抗 -D免 疫 球 蛋 白 G 製 劑 的 方 1 1 1 -7 - 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 311884 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明 ( 6 ) 1 1 法 • 該 製 劑 在 每 克 來 白 人 類 血 漿 的 德 IgG 中 • 具 有 超 過 1 1 IX的 抗 -D I g G 的 比 活 性 * 該 血 漿 是 來 白 對 Rh 因 子 D 敏 感 1 1 的 Rh陰 性 的 提 血 者 的 血 液 » 或 包 含 抗 -D I ε G 的 血 漿 部 分0 請 1 先 1 A) 其 具 有 pH 值 在 PH3 . 5到6 .5的 範 圍 且 導 電 值 在 2 到 閱 讀 1 I 4 毫 西 門 / 公 分 (m S / c m) 的 範 圍 接 受 Μ 羧 甲 基 群 為 功 背 面 1 I 之 1 能 基 的 吸 附 劑 的 離 子 交 換 層 析 處 理 9 將 抗 -D IgG 结 合 到 注 意 1 事 1 該 吸 附 劑 上 〇 項 再 1 B) 具 有 鐽 结 抗 -D I δ G 的 吸 附 劑 * 在 一 pH值 從 5 到 8 的 填 寫 本 1 範 圍 内 > 且 導 電 值 在 2 到 4 毫 西 門 / 公 分 的 範 圍 内 的 情 頁 1 I 況 下 9 首 先 > Μ 一 沖 洗 溶 液 洗 灌 攀 且 抗 -D I g G 而 後 將 洗 1 1 出 且 進 而 1 1 C) 在 pH值 6 到 8 的 範 圍 及 導 電 值 2 到 4 毫 西 門 / 公 分 1 訂 的 範 圍 下 « 洗 出 的 抗 -D I g G 9 Μ 具 有 離 子 交 換 特 性 的 鹼 1 性 吸 附 劑 來 處 理 * Μ 结 合 欲 成 份 且 最 後 將 抗 -D I g G m 縮。 1 | 藉 著 根 據 本 發 明 的 方 法 • 免 疫 球 蛋 白 可 直 接 從 人 體 1 I 血 漿 獲 得 〇 初 始 原 料 是 來 白 於 對 Rh 因 子 D 敏 感 的 Rh陰 性 1 » 捐 血 者 的 血 漿 〇 透 過 血 漿 減 除 術 所 得 到 的 個 別 捐 輸 物 最 線 I 好 被 冰 凍 « 在 化 學 分 離 前 在 0- 4 〇下小心解凍， 且被積 1 1 存 在 一 起 0 該 血 漿 池 應 包 含 每 毫 升 超 過 10微 克 的 抗 -D 1 1 IgG 9 最 好 是 每 毫 升 超 過 30微 克 的 抗 -D I ε G 〇 用 於 陽 離 I 子 交 換 層 析 的 血 漿 部 分 可 Μ 初 步 地 使 用 已 知 的 方 法 * 像 1 1 是 例 如 藉 冷 凝 球 蛋 白 的 分 離 或 藉 乙 酵 來 化 學 分 雄 沈 m 1 | (C oh η , E .J .等人， J * Am • Ch e m • So C · 68 , 459 » 1946 1 | 5 κ i s t 1 e r及N it S C h m an η , Η . Vo X Sa n g * 7 , 41 4, 1962 ) 1 1 1 _ 8 - 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29*7公釐） 311884 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明 (7 ) 1 1 〇 其 他 的 沈 m 方 法 像 是 K 硫 酸 銨 • 碕 酸 納 9 聚 乙 二 酵 * 1 1 辛 酸 或 乳 酸 -6 .9 -二胺基- 2- 乙 氧 基 吖 啶 (利凡諾） • 來 沈 1 1 m 免 疫 球 蛋 白 • 或 是 藉 層 析 的 方 法 或 是 這 些 方 法 的 組 合 -N 請 1 先 1 來 纯 化 〇 根 據 本 發 明 » 在 進 行 陽 離 子 交 換 層 析 之 前 9 不 閲 讀 1 1 含 冷 凝 球 蛋 白 的 血 漿 或 是 包 含 溶 在 均 衡 鑀 街 液 中 的 免 疫 背 面 1 I 之 1 球 蛋 e 的 血 漿 部 分 » 最 好 先 過 濾 9 且 為 了 要 將 m 藏 的 病 意 1 事 1 毒 去 活 性 9 其 被 —- 生 物 可 容 忍 的 有 機 溶 劑 • 像 是 例 如 三 項 再 1 (正丁基） 磷 酸 酯 1 及 — 洗 條 劑 » 像 是 例 如 基 於 Ho Γ 0 w i t Z 填 寫 本 1 A 所 描 逑 的 方 法 (Thr 〇 m bo si S Η a e m 〇 s t as is 65 , 1 163 , 頁 S^ 1 I 1991 )， 中 使 用 0- [4 -( 1 , 1 , 3 , 3- 四 甲 基 丁 基 )- 苯 基 ]- 十 ( 1 1 氣 化 乙 烯 )(Tr it on ⑨ X- 100) 0 而 後 血 漿 t 溶 劑 及 洗 滌 劑 1 1 的 混 合 物 置 放 在 37 TC 下 〇 因 此 進 行 相 分 離 0 澄 清 的 下 層 1 訂 液 被 分 離 t 稀 釋 * 過 濾 » 及 調 整 為 陽 離 子 交 換 層 析 的 均 I 衡 吠 態 » 至 於 後 績 步 驟 的 溫 度 是 可 作 為 準 則 地 t 在 10 V 1 | Μ 上 9 最 好 是 2 0到 25 V 〇 在 一 初 步 的 主 要 純 化 步 驟 中 * 1 1 來 白 預 處 理 產 物 的 抗 -D I g G 是 结 合 到 一 最 好 羧 甲 基 1 ! (CM) 為 功 能 基 的 弱 酸 性 離 子 交 換 凝 膠 〇 超 過 98¾ 的 異 蛋 線 I 白 故 而 被 洗 去 將 病 毒 去 活 化 的 溶 劑 及 洗 滌 劑 同 樣 地 在 1 1 此 被 移 除 〇 藉 此 ;處理過程特別澹縮之抗- D I g G 的I g G 1 1 次 群 1 及 3 Μ 離 子 交 換 凝 膠 藉 著 將 導 電 度 增 加 到 最 好 I 超 過 10 毫 西 門 / 公 分 % 來 洗 去 0 洗 出 物 是 純 IgG 部 分 » 1 1 其 包 含 低 於 15¾ 的 總 I g G 部 分 且 具 有 變 更 的 IgG 次 群 1 I 的 圖 譜 Ig G 1及I g G 3強 烈 地 濃 縮 9 I g G 2及I g G 4大 量 1 | 地 減 少 〇 此 抗 -D I g G 部 分 而 後 藉 著 Μ 次 級 弱 鹼 性 的 離 子 1 1 1 -9 - 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 311884 A7 B7 五、發明説明（8 ) 交換凝膠，該凝膠最好Μ二乙胺基（DEAE)為功能基的 處理來進一步地純化，在選擇的情況下，抗-DIgG不會 结合到離子交換器上。為了要提高濃度，純化的抗-D IgG部分最好再次地结合到一 CM離子交換凝膠且在適合 的狀況下Μ儘可能濃縮的方式被洗出，且被製成最终產 物。對於要達到根據本發明所述的狀態，不論該抗-D IgG部分是藉增加離子濃度，或藉pH偏移，或藉緩衝液 成份改變來被洗出是不重要的。為了要進一步減少不欲 成份的濃度，像是例如蛋白酶，該免疫球蛋白溶液可K 另外Μ —吸附劑，像是例如氫氧化鋁凝膠，在製造過程 的任何階段中來處理。此溶劑-洗條劑的處理，可Μ用 任何已知的病毒去活化/移除步驟，例如加熱處理，像 是例如巴斯特法，或是毫微過漶（nanofiltration),來 取代或補充。 根據本發明所製造的抗- DIgG的流動是很穩定的。它 具有血管施用的附受性，有少於5微克/毫升的IgA.含 量及1-10毫克/毫升的IgG含量。pH值是大約5.2 。此 製劑包含最好高達25毫莫耳的磷酸盥，高達200毫莫耳 的氛化納及高達100毫克/毫升的人類清蛋白，及下列 二者選一地，250-300毫莫耳的胺基酸，像是例如甘胺 酸，或是高達100毫克/毫升的雙醣，像是例如蔗糖· 或50毫克/毫升的單釀，像是例如甘露酵。 根據本發明所產生的抗-DIgG ,另一選擇惠，可在pH 值大約6.6的情況下，於200微克抗-DIgG的劑量中， -10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -----------批衣------，訂------# (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 :1884 311884 b7_ 五、發明説明（9 ) 加入雙_，像是例如100奄克/奄升的蔗糖*來冷凍乾 燥0 •-、'二\ 所附的用來說明：本發明，然而不意味對本發明 有任何限制示根據實|例1的初次隈離子交換層析 法的典型層析崮'、，: '、-Ά 根據本發明的方^蔣使用後鑛實例來解釋得更仔细。 声例1 初始的原料是Rh陰性的女性或Rh陽性男性的血漿，該 女性或男性經小心篩選的紅血球，對於Rh因子D是敏感 型的。每一份血液捐輸物要測試其HBS -抗原、HIV抗體 及旰炎C抗體的存在及升高的ALAT活性。透過血液減除 術所得到的血漿個別地被冰凍，且在化學分雄前在0-4TC 下小心地解凍且積存。具有抗-D含量25微克/毫升，不 含冰的血漿池，在2-4P下Μ連缜離心機（Cepa, Lahr, Germany)離心（1公升/分鐘；12000rpn)。上 清液以 —1.2 微米的過滅膜（Opticap®, Millipore, Bedford MA, USA)來過漶。而後將病毒去活性係MHorowitz等人 (T h r 〇 b b 〇 s ί s a n d H a e m 〇 s t a s i s 6 5，1 1 6 3 · 1 9 9 1)所提 出，H # lXTriton® X-lOOiRohn and Haas, Frankfurt ,Germany)及 1¾ 三（正 丁基）鱗酸酷（Merck, Darmstadt, Germany),在30TC下進行4-4.5小時的溶劑-洗滌劑來處 理。經病毒去活化的溶液在37¾下置放10-18個小時。 澄清的下層液（lower phase)被分離出且Κ0.2微米的漶 K (Sealkleen NFP 7002, Pall, Dreieich, Germany) -11- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I I I I I I I I 裝— —訂 I I I I 線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 511884 B7 五、發明説明（1〇 ) 來過滤。25升已經溶劑及洗滌劑處理的過滤血漿M10毫 莫耳的磷酸納緩衝液稀釋成均衡緩街液（50毫萁耳磷酸 納緩衝液，PH5.5, 3.2毫西門/公分）的導電性，pH值 被調至5.5,以一1.2撤米的漶膜（(^1;1〇3口<&,»<丨11丨？〇以 ,Bedford MA, USA)來過滅，且 WMacroPrep®50CM來 结合，該凝膠係位在面積706平方公分，柱床高（bed height) 7.5公分且流速150公分/小時的管柱内，凝 膠已事先用50毫莫耳pH值5.5的磷酸納緩衝液來平衡。 溫度維持在20-25t!。管柱然後M40倍管柱體積的25毫 萁耳，PH7.0的磷酸納緩衡液清洗，以25毫奠耳的磷酸 緩衝液+ 0.2莫耳的氛化納，PH7.5,將包含抗- DIgG洗 出。經本發明所獲得典型的層析圖，顯示於唯一的附圖 中。在此圖式中，光密度（0D)值在280毫微米下随時間 變化（t)而記錄。從此可見在裝載和清洗的過程間，大 多數不需要的產物被分離，而在流析期間，一主要且狹 窄的峰出現，其包含所欲的抗-DIgG ,且強烈地濃縮於

IgG的次部分内。比活性因此在每克總IgG中有高於2% 的抗-DIgG 。析出液Μ水稀釋成導電度3.3毫西門/公 分（1體積的析出液+大約5體積的水），Μ0..2萁耳的 (DEAE)

NaOH將pH值調成7.5 ,且MIOOg二乙胺基乙酵^Sephadex® A50 乾燥物（Pharmacia, Uppsala, Sweden .)，以批式方 法處理2.5小時來吸附。二乙胺基乙醇（DEAE)凝膠事先 已用25毫莫耳，PH7.5的磷酸納緩衝液來平衡。未鍵结 的抗-DIgG部分透過一聚丙二酵篩孔來過滤且pH調整到 -1 2- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ------------1------，訂------# (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

mmA 311884 a? B7 五、發明説明（ 5.5 。為了增加濃度，將DEAE過漶液再次地结合到位在 面積71平方公分及柱床高12.5公分且流速230公分/小 時的管柱内的 MacroPrep® 50CH凝勝（BioRad，： Hercules CA, USA),該凝膠已事先用pH5.5, 50毫萁耳的磷酸納 緩衝液來平衡。包含抗-D的IgG部分K25牽莫耳磷酸納 + 0.2莫耳氛化納，PH5.5來洗出。CM凝膠可藉INNaOH 再更新，沖洗至不含熱精（pyrogen-free),且可再次使 用至少二十次。DEAE凝膠只使用一次即丟棄。 奮例2 初始的原料是Rh陰性的女性或Rh陽性男性的血漿，該 女性或男性經小心篩選的紅血球，對於Rh因子D是敏感 反應的。每一份血液措輪物要測試其HBs -抗原、HIV抗 體及肝炎C抗體的出現及升高的ALAT活性。透過血液減 除術所得到的血漿個別地被冰凍，且在化學分離前在〇-4C下小心地解凍且積存。不含冰的血漿池，以連續離 心機（Cepa, Lahr, Germany)離心（1公升/分鐘； 12000轉/分鐘）。上 清液以一 1.2微米的過漶膜 (Opticap®, Mill ipore, Bedford MA，USA)來過滅。 而後將病毒去活性係M Horowitz等人（Thrombosis and Haemostasis 65, 1163, 1991)所提出，藉著 lXTriton® X-100 (Rohm and Haas, Frankfurt, Germany)及 II 三 (正 丁基）鱗酸酷（Merck, Darmstadt, Germany),在 30 C下進行4-4. 5小時的溶劑-洗滌劑來處理。經病毒去活 化的溶液在371C下置放10-18個小時。澄清的下層液 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -----------參------1T--------il (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 311884 A7 B7 經濟部中央榡準局員工消費合作社印製 五、發明説明 (12 ) 1 1 (1 0 w e r P h a s e )被分離出且Μ 0 . 2微 米的 濾 膜 (Sea 1 k 1 e e η 1 1 I NFP 7002 * Pa 11 ,D r e i e i c h , G e Γ Β any) 來 過 25升經 1 1 溶 劑 及 洗 滌 劑 處 理的過 m 血漿， 以 10毫 莫 耳 的磷 酸納緩 /--N 請 1 I 先 1 衝 液 稀 釋 成 均 衡 鑀衝液 (50毫莫耳磷酸納緩衝液， ρΗ5 . 5 閱 讀 1 背 1 3 . 2毫西門/公分）的 導 電性， pH值調 至 5 . 5 ,以一 1 . 2 I 之 1 I 微 米 的 m 膜 (0 P t icap® M i 1 1 i p 0 Γ e , B e d f 〇 rd MA, USA) 注 意 1 I 事 1 來 過 m » 且 结 合 到位在 面 積706 平 方公 分 * 柱床 高（bed 項 再 1 he i g h t) 7 . 5 公 分且流 速 150公 分 /小 時 的 管柱 内的 填 寫 本 i 1 M a C Γ oP re p ® 50CM 凝膠（BioRad,· Her c u 1 e s CA 5 美國 )上， 頁 '-- 1 I 該 凝 膠 已 事 先 用 50毫莫 耳 pH值 5 . 5 的磷 酸 納 緩街 液來平 1 1 衡 〇 溫 度 維 持 在 20-25 "C ( 管柱然後K 40倍管柱體積的 1 1 25 奄 莫 耳 • PH7 . 0的磷 酸 納鍰衝 液 沖洗 % Μ 25毫 莫耳的 1 訂 磷 酸 緩 衝 液 + 0 . 2莫耳的氛化納， P H7 . 5 » 將 包含 抗-DIgG部分 1 洗 出 0 在 PH6 . 6 時，將 100毫克 / 毫升 的 蔗 糖加 到200 1 1 微 克 的 抗 -D I g G 的劑量 内 ，析出 液 透過 一 0 . 2微 米的漶 1 | 膜 (M ί 1 1 i d i s k <E> MCGL-1 0 , M ill i P ο re, Be df 〇 r d HA , USA) 1 1 來 過 m 9 且 狀 後 冷凍乾 燥 Ο 線 | S. 例 3 1 1 5 毫 升 經 溶 劑 及洗滌 劑 處理的 血 漿， 稀 釋 成均 衡緩衝 1 1 液 的 導 電 度 (3 .3 毫西門/公分） f 且在 管 柱 内層 析，該 I 管 柱 具 有 面 積 2 平方公 分 ,柱床 高 5公 分 9 流速 30公分 1 1 / 小 時 » 且 使 用 DEAE-S e p hadex⑧ A50(Pha r mac i a * 1 1 Up P s a 1 a , 瑞_ ) 的凝膠 〇 先前， 此 凝膠 已 Μ 25毫 其耳， 1 1 pH7 . 5 的 磷 酸 納 來平衡 〇 溫度維 持 在大 約 20 -2 5 10。為 1 1 1 -14- 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X2ST7公釐） 311884 A7 B7 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五、發明説明 (13 ) 1 1 了 進一 步 的 純化 ,未 结 合 的 IgG部分 係 Μ 0 . 2 莫 耳 的 HC 1 1 1 I 調 整成 pH5 . 5， 調至 導 電 度 3 . 2毫西 門 / 公 分 且 结 合 I 1 到 M a c r oP re P® 50CM的凝膠上， 該凝膠係在具有面積0 .8 /^N 請 1 1 先 1 平 方公 分 » 柱床 高6 . 5 公 分 且 流速230 公 分 / 小 時 的 管 閲 讀 1 1 柱 内， 且 事 先用 50毫 莫 耳 PH5 . 5磷酸 納 鑀 衝 液 來 平 衡 〇 背 面 1 1 之 1 1 包 含抗 -D的 IgG 部分 以 25 毫 莫 耳瞵酸 納 緩 衝 液 + 0 .2 萁 耳 1 1 事 1 氛 化納 9 PH5 . 5 來流出 t 且 處 理成终 產 物 〇 DEAE 一 項 再 1 Se P h a d ex <ε> A50凝膠在使用- -次後丟棄； Μ a c Γ 0 Pr e p <© 50 填 寫 本 έ CM凝膠 以 1 Ν的 Na 0Η更 新 » 且 沖 洗至不 含 熱 精 参 且 可 使 用 頁 '--- 1 I 至 少二 十 次 Ο 1 1 宵 例4 1 1 根據 範 例 1到 3 , 將 其 方 法 重覆， 但 Μ 包 含 免 疫 球 蛋 1 訂 白 的血 漿 部 分， 替代 血 漿 作 為 初始原 料 來 被 使 用 9 該 血 1 漿 部分 係 產 自一 相對 量 的 初 始 血漿， 其 中 可 得 到 根 據 Cohn 1 1 (C 〇 h η， E .J .等人，J • AN * Ch e ίο . So C . 68 , 459 t 1 949 ) 1 | 的 方法 之 I + I + Μ的 部 分 或 I + Μ的部分， 或根據K is tier 1 1 及 Nits c h m a η η ί K i s t 1 e r t P . 及 N i t s c h m a η η > Η . V OX S a n g , 線 I 7 , 414 t 1962)的方法之沉澱物A或 r — 球 蛋 白 沈 澱 9 且 1 I 溶 解在 均 衡 緩衝 液直 到 濃 度 為 30克/ 升 蛋 白 質 可 得 到 1 1 類 似的 结 果 ο I 富例5 1 1 I 根據 S 例 1到 4 , 將 其 方 法 重覆， 因 此 將 包 含 抗 -D IgG 1 1 部 分， 另 一 選擇 地Μ 0 . 1 莫 耳 甘胺酸 + 0 .5 萁 耳 氯 化 納 » 1 | PH9 , 或 一 般Μ pH偏 移 及 / 或 離子強 度 的 改 變 及 / 或 緩 I 1 1 -1 5- 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 311884 A7B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 五、發明説明（14 ) 衝液成份的其他改變· Μ替代25毫莫耳磷酸納缓衝液 +0.2Μ氛化納，ΡΗ7.5 ,從 MacroPrep®50CM凝膠（BioRad, Hercules CA, USA)中流出可獲得類似的結果。 奮例fi 根據黉例1及2 ,將其方法重覆，因此將MacroPrep® •50CH凝膠（BioRad, Hercules CA, USA),另一壤擇，是以 10奄莫耳的甘胺酸，PH9 ,替代25毫莫耳的磷酸納鍰衝 液，PH7.0來沖洗，可得到類似的结果。 宵例7 根據實例1 ,將得到的抗-D析出液調整成下列狀態： 液體製劑 I 液體製劑 I 液體製劑 n 液體製劑 IV 抗-D 100微克/毫升 100微克/毫升 100微克/¾升 100微克/毫升 甘胺酸 20.6毫克/毫升 20.6毫克/毫升 20.6毫克/毫升 20.6毫克/毫升 清蛋白 — 10毫克/毫升 50毫克/奄升 100牽克/毫升 pH 5.20 5.20 5.20 5.20 劑量 2毫升 2毫升 2毫升 2毫升 16- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ! ^― !| I !!. I I I II ...... Γ----------------象 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁). 311884 A7 B7 五、發明説明（15 ) 液體製劑 V 液體製繭 VI 液體製劑 \Λ 液艟製劑 VI 抗-D 100微克/毫升 100微克/毫升 100微克/毫升 100微克/毫升 D-甘露酵 50毫克/毫升 50牽克/毫升 50毫克/毫升 50毫克/毫升 清蛋白 — 10奄克/毫升 50毫克/奄升 100毫克/毫升 pH 5.20 5.20 5.20 5.20 劑 量 2毫升 2毫升 2毫升 2毫升 -----------裝-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 且用 0.2 微米漶瞑（Millipark^-aO· Millipore， Bedford MA, US A)過滤後，將該抗-D析出液在無菌狀態 下填充到Hypac針筒内随時取用（Vetter， Ravensburg， Germany) ° 8 根據實例1的DEAE過漶液，在pH值大約5.5下，W毎 克蛋白質用〇.2g氫氧化鋁凝膠的狀況下，在20-25C下 處理30分鐘，然後根據實例1作進一步處理。 實例9 根據實例1到6 ，將其方法重覆，因此為了取代

MacroPrep® 50CM;具有相同功能基的下列凝朦之一可 Μ 選擇其一來使用：CM-Spherodex® (Biosepra· -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） *vs 線 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 311884 A7 B7 五、發明説明（认）

Villeneuve la Garenne, France) , CΜ-Trisacry1® (Biosepra, V i 1 I e n e u v e la Garenne, France) , C H-Sepharose® FF (Pharmacia, Uppsala, Sweden)or Fractogel® TSK CH-650 (Merck, Darmstadt, Germany), 可M獲得類似的结果。 宵例1 0 根據食例1及根據實例3到6 ,將其方法重覆，因此 為 了 取代 DEAE-Sephadex® A50，使用 MacroPrep® DEAE (Biorad, Hercules CA, USA),可獲得類似的结果。 在前述的範例1到6之層析步驟，另一選擇可用批式 ，柱狀或薄膜層析來進行，可Μ獲得類似的结果。 裝 訂 .線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 311884 五、發明説明（ A7 B7 實施例11 : 重覆實施例1 50 CM管柱的吸 pH4.5 或 8.5 , 4，5或8 . 0下進 實施例12 : 重覆實施例1 柱的洗脱物，係 門/公分且pH值 DEAE-Sephadex 緩衝液条統（如 西門/公分，或 西門/公分）來 丨補充 的方法，其中血资溶液對Macro Prep 附作用僳另於導電度2毫西門/公分及 或者於導電度4毫西門/公分及pH值 行，可以獲得類似的結果。 的方法，其中來自Macro Prep50 CM管 另稀釋成導電度2毫西門/公分或4毫西 被調成7.0或8.0 ,且以批次方法以 吸附。DEAE-Sephadex膠事先以對應之 PH7.0, 2毫西門/公分或PH8.0, 2毫 PH7.0, 4毫西門/公分或PH8.0, 4毫 平衡。可獲得類似結果。 姑， 訂 Λ&. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

Claims (1)

1. A8 311884 § 六、申請專利範圍 料本 補尤· l_一 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 第84100147號「抗-D免疫球蛋白G濃縮液之製法及包含 此濃縮液的醫藥製劑」專利案 （86年6月修正） 杰申謓專利範圍 1. 一種裂造抗-D免疫球蛋白G (anti-D IgG)製劑的方法 ，該製劑在每克來自人髅血榮之结IgG中，具有高於 1«抗-DIgG (anti-D IgG)的比活性，該方法包含至少 一病毒失活化或去除病籌步驟，其中來自對Rh因子D .敏感的損血者之Rh陰性血液的血漿或是包含抗-(anti-D IgG)的血漿部分： A) 具有pH值在pH3.5到6.5的範圍及導電值在2到4 毫西門/公分US/CB)的範圍，接受以羧甲基群為 功能基的吸附劑的離子交換層析處理，將抗 (anti-D IgG)結合到該吸附剤上， 經濟部中央標準局工消費合作社印装 B) 具有鍵結抗-DIgG (anti-D IgG)的吸附劑，在pH 值從5到9的範画内，且導電值低於4毫西門/公分 的範圍内情況下，首先以一沖洗溶液洗濯，且抗-DIgG (anti-D IgG)而後藉pH禳移，改變離子濃度，改變導 電性或缓衝液成份的其他改變來洗脱，且進而 C) 將被洗出之抗-D IgG(anU-D UG)調至pH值從？ 到8的範圍及導電值2到4毫西門/公分的範圍後， 將此被洗出之抗- DUG (anti-D IsG),以具有離子交 換特性且具有二乙胺基乙基群作官能基之鹼性吸附劑 本紙張尺度逍用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 311884 ?88 D8 ___ 六、申請專利範圍 來處理，以結合不欲之成份且最後將抗-DUG (anti-D IgG)濃縮。 2. 如申謓專利範圍第1項的方法，其中抗-DIgG (ant ίο IgG) 偽在 C) 階段 濃縮， 其階段 A) 及 B) 重 覆至少 一次。 3. 如申請專利範圍第1或2項的方法，其中用來作為初 始原料的是血漿，其已用具有雔子交換特性的基本吸 附劑來預處理以結合不欲之成份。 4.,如申諳專利範圍第1或2項的方法，其中血漿中或部 分血漿的蛋白酶含量，經由與一吸附劑如氳氧化鋁凝 謬培養而被減少。 5. 如申請專利範圍第1或2項的方法，其中所有的離子 交換層析步费[,及若有需要，更進一步的吸附步费（， 另有選擇地可以批式層析，管柱層析或薄膜層析來進 行〇 經濟部中央梯準局貞工消费合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 6. 如申請專利範圍第1或2項的方法，其中病毒去活化 的步驟包括將血漿或包含抗-D I g： G (a n t i - D I g G )的部 分，以一洗滌劑及三（正丁基）磷酸酯來處理，將包含 溶劑及洗滌劑的混合物相分離且取澄清的下層液來使 用。 7. 如申請專利範圍第6項的方法，其中病毒去活化的步 驟包括熱處理。 8·如申請專利範圍第1或2項的方法，包括至少一次病 '2- 本紙張尺度適用中國國家橾率（CNS ) Λ4規满( 210X297公釐） A8 B8 C8 D8 311884 六、申請專利範圍 毒移除的步驟。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 9.如申請專利範圍第7項的方法，其中病毒移除的步驟 包含毫撤過猫（nanofiltration)。 10. 如申請專利範圍第1或2項的方法，其中初始血漿或 初始血漿部分，在嗶段A)的離子交換層析步想前，要 接受至，少一種下列步驟的處理： a) 將血漿冰凍，结晶沈澱物在解凍後及進一步.使用 .前以過濾及/或離心來分離， b) 以溶劑-洗滌劑混合物來處理，在大約37Ό下培養 且進行相分離。 11. 一種用於預防或治療Rh敏感症的翳藥組成物，其為如 申請專利範圍第1或2項的方法所製造，包含20-200 撤克/毫升抗-D IgG (anti-D IgG),低於5微克/毫 升的IgA ，總蛋白質含量最多10 %,且包含醫藥可接 受的載體及添加物。 經濟部中央揉準局貝工消费合作社印氧 12. 如申請專利範函第11項的S藥組成物，其pH值位在 5.0及7.5之間，且些撤的高張滲透性，可藉甘胺酸 或糖及HaCl之組合來調整。 13. 如申請專利範圍第11項的醫藥組成物，其pH值位在 5 . 0及5 . 5之間。 -3- 本紙張尺度逋用中國國家橾率（CNS > A4规格（210X297公釐）