Oblast techniky

Tento vynález se týká způsobu výroby prostředku anti-D imunoglobulinu G a farmaceutického prostředku obsahujícího anti-D IgG.

Dosavadní stav techniky

Morbus haemolyticus neonatarum je obecné označení hemolytické anemie plodů a novorozenců způsobené protilátkami matky. Tyto protilátky jsou směrovány proti antigenům na povrchu plodových erythrocytů. Jsou tedy zasaženy buď Rh-antigeny, ABO, nebo systémy jiných krevních skupin.

Nejdůležitějšími antigeny krevních skupin opic jsou D, zřetelně méně imunogenní antitetické antigeny C, c a E, e stejně jako D“. Dále je známo před dalších 40 opičích antigenů. Klinickou důležitost opičí nesnášenlivosti má především opičí antigen D (RhD, Rh₀), membránový protein eiythrocytů, který byl nedávno klonován a jehož primární struktura byla nedávno popsána (Van Kim a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci, USA 89, 10925 (1992)). D-antigen lze nalézt u přibližně 85 % Kavkazanů v Evropě. Jedinci, kteří mají D-antigen, se nazývají Rh-positivní. Jednotlivci, kterým D-antigen chybí, se nazývají Rh-negativní. Protilátky specifičnosti anti-D jsou nejobvyklejšími nepravidelnými opičími protilátkami a vznikají během Rh-inkompatibilního těhotenství a následující transfusí Rh-inkompatibilní krve. Anti-D protilátky náležejí převážně k IgG podtřídám 1 a 3 (IgGl a IgG3).

Až dosud není známo žádné spolehlivé účinné příčinné léčení na Rh-citlivých těhotných žen. Jelikož desenzibilizace není pravděpodobně možná, pro Rh-negativní ženy, v době porodu, je zásadně důležitá profylaxe Rh-senzibilizace imunoglobulinovým anti-D.

Bez léčení až 17% poprvé těhotných žen s Rh-konstelací (matka Rh-negativní, dítě Rhpositivní) bude během těhotenství nebo během porodu citlivých na opičí antigen.

Anti-D prostředky se úspěšně používají po dobu 30 let pro prevenci Rh-negativních nebo respektive D^u-positivních, žen na opičí faktor D, nebo respektive D“, a tím pro předcházení s anti-D souvisejících onemocnění novorozenců, konkrétně Rh erythroblastosy ve všech jejích formách.

Riziko Rh-citlivosti se zvyšuje s množstvím přicházejících plodových Rh-positivních erythrocytů. Léčení dávkou doporučenou WHO 200 pg anti-D IgG jako postpartum profylaxe postačuje ke zneutralizování až 10 ml plodových erythrocytů (což odpovídá přibližně 20 ml krve plodu) a chrání tak proti Rh-citlivosti v přibližně 90 % případů, dokonce i s větším množstvím přiváděných erythrocytů. Díky tomu je citlivost na Rh-antigen stále ještě očekávána, ale už jen u pouze 1 až 2 % všech prvorodiček s konstelací Rh. Další rutinní Rh profylaxí během těhotenství (antepartum prophylaxis) se zbývající riziko citlivosti může snížit dále na 0,1 až 0,2 % všech prvorodiček s Rh konstelací.

Anti-D se dále také používá po chybné transfuzi Rh-positivní krve Rh-negativním pacientům. Dávkování se přizpůsobí množství přiváděných Rh-positivních erythrocytů.

Několik let se diskutuje také o použití anti-D imunoglobulinu pro léčení idiopatické thrombocytopenické purpury (ITP).

- 1 CZ 286271 B6

Farmakokinetiky intramuskulámě a intravenózně injektovaného IgG do organismu jasně ukazují, že intravenózní aplikace je ve všech případech výhodná. U intramuskulámí injekce se musí očekávat zpoždění maximální aktivity a ztráta účinnosti díky pomalé absorpci z místa svalu a lokální proteolyse. Maximální IgG koncentrace v plazmě se u zdravých testovaných subjektů nedosáhne dříve než 4 dny po injekci, u ležících testovaných subjektů ne dříve než 6 dnů po injekci. Navíc, maximální koncentrace IgG v plazmě u zdravých testovaných subjektů je pouze 30 % injektované dávky, u ležících pouze 20 %.

Při srovnání přináší intravenózní aplikace značné výhody. Pouze v tomto případě aplikace je účinná plná podaná dávka bez ohledu na fyzickou aktivitu. Hladina IgG v plazmě klesá během 5 dnů, prakticky nezávisle na fyzické aktivitě na asi 35 až 40 % podané dávky. Teprve pátý den tedy dosahuje maximální koncentrace v plazmě, které se dosáhne intramuskulámí injekcí (Morell A. a spol.: Vox Sang. 38, 272 (1980).).

Pro výroby imunoglobulinových prostředků v průmyslovém měřítku se dnes používají různé frakcionační postupy:

Způsoby srážení studeným ethanolem, například podle Cohna, nebo modifikovaným způsobem podle Cohna, jsou vhodné především pro zpracování plazmy v množství přes 500 1 za týden. Po specielním zpracování, například s pepsinem při pH 4, imunoglobuliny izolované tímto způsobem mohou být intravenosně dobře snášeny. Jiné způsoby srážení jsou založeny na specifickém srážení imunoglobulinu síranem amonným, síranem sodným, polyethylenglykolem, kyselinou kaprylovou nebo rivanolem (pro souhrn viz například Curling J. M.: Separation of Plasma Proteins, J. M. Curlin, Red., Pharmacia, Uppsala, Švédsko, 1983.).

Způsob izolace imunoglobulinu dávkovou absorpcí na iontoměničích byl poprvé popsán již v roce 1964 (Baumstark J.S. a spol.: Arch Biochem. Biophys. 108. 514 (1964).). V následujících letech byly vyvinuty četné postupy na kolonách (švýcarský patentový spis 572745, USA patent 3 869 436, evropská patentová přihláška 0 085 747) a použity, mimo jiné, pro fřakcionaci anti-D imunoglobulinů (Friesen A.D. a spol.: J. Appl. Biochem. 3, 164 (1981).).

Všemi popsanými postupy se dosáhne vysokého výtěžku celkového IgG s vysokým stupněm čistoty a nezměněnou distribucí IgG podtřídy, ale žádná specifická koncentrace jistých IgG podtříd specifických IgG molekul, jako je například anti-D IgG.

Většina anti-D hyperimunoglobulinových prostředků je vhodná pouze pro intramuskulámí aplikaci. Na světovém trhu je rozšířeno jenom několik intravenózně dobře tolerovaných prostředků. Jedním takovým prostředkem je anti-D SRK podle autora tohoto vynálezu, který se vyrábí fřakcionaci podle Kistlera a Nitschmanna (Kistler P. a Nitschmann H.: Vox Sng. 7, 414 (1962).) a který se vyrábí jako intravenózně dobře tolerovaný způsob mírného zpracování s pepsinem při pH 4. Jelikož výtěžek specifických anti-D protilátek je u tohoto způsobu fřakcionace velmi nízký a současně anti-D hyper-imunní plazma je vzácná, existuje potřeba nového způsobu, který na rozdíl od popsaných způsobů, by vedl také u plazmy s nízkým titrem anti-D, k čistému IgG prostředku, který má vysoký výtěžek a vysokou specifickou anti-D aktivitu.

Předmětem tohoto vynálezu je tedy získat způsob výroby čistého anti-D koncentrátu, v němž jsou specificky zkoncentrovány anti-D imunoglobuliny IgG podtřídy A a 3. Bylo objeveno, že to lze udělat překvapivě jednoduchým způsobem, za současného odstranění více než 85 % nespecifického IgG a téměř veškerých dalších nežádoucích složek v plazmě tak, že se krevní plazma nebo frakce obsahující imunoglobulin získané z plazmy specielně vybraných a specielně imunizovaných dárců krve, které mají titr s výhodou vyšší než 30 pg/ml anti-D IgG, podrobí

-2CZ 286271 B6 chromatografii na katexu za podmínek podle tohoto vynálezu. Anti-D koncentrát získaný ve vysokém výtěžku má dále zvýšenou aktivitu (gram anti-D IgG na gram celkového IgG) a lze ho dále čistit dalším působením jiných iontoměničů nebo gelu hydroxidu hlinitého jednotlivě nebo ve vhodné kombinaci.

Jiným předmětem tohoto vynálezu je získat anti-D prostředek, který obsahuje IgA pouze ve stopách, který je dobře snášen a který po přidání vhodných stabilizátorů, nebo také lyofílizován nebo s výhodou v roztoku, lze skladovat několik měsíců beze ztráty aktivity. Bylo zjištěno, že čistý anti-D koncentrát získaný způsoby podle vynálezu splňuje tyto požadavky, tj. že má, mimo jiné, specifickou aktivitu, které nikdy před tím nebylo dosaženo, je intravenózně dobře snášen a má mimořádně nízký obsah IgA. Navíc, anti-D koncentrát má abnormální distribuci IgG podtříd vtom, že způsoby podle vynálezu jsou velice obohaceny IgG podtřídy 1 a 3 a velice zredukovány podtřídy 2 a 4.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je tedy způsob výroby prostředku anti-D imunoglobulinu G s specifickou aktivitou vyšší než 1 % hmotn. anti D IgG na gram celkového IgG z lidské plazmy, vyznačující se tím, že plazma z Rh-negativní krve dárců senzibilizovaných opičím faktorem D nebo frakce plazmy obsahují anti—D IgG:

A) s pH 3,5 až 6,5 a vodivostí od 2 do 4 mS/cm se chromatografuje na iontoměničovém adsorbentu, který má jako funkční skupiny karboxymethylové skupiny, anti-D IgG se naváže na adsorbent,

B) adsorbent s navázaným anti-D IgG se nejprve promyje roztokem s pH 5 až 8 a vodivostí 2 až 4 mS/cm, anti-D IgG se eluuje a potom se

C) eluovaný anti-D IgG s pH 6 až 8 a vodivostí 2 až 4 mS/cm nechá zreagovat s alkalickým adsorbentem s iontoměničovými vlastnostmi, aby se navázaly nežádoucí složky, a nakonec se anti-D IgG zahustí.

Způsobem podle tohoto vynálezu se imunoglobulin může získat přímo z lidské plazmy. Výchozím materiálem je plazma z Rh-negativních dárců senzibilizovaných na opičí faktor D. Jednotlivé darované dávky získané plazmaferezou se před frakcionací a spojováním s výhodou zmrazí a pečlivě se roztají při 0 až 4 C. Spojená plazma by měla obsahovat více než 10 pg anti-D IgG na ml, s výhodou více než 30 pg anti-D IgG na ml. Frakce plazmy se před použitím chromatografie na katexu může předem vyčistit jakýmkoli známým způsobem, jako je například oddělením kryoglobulinů nebo frakčním srážením ethanolem (Cohn E.J. a spol.: J. Amer. Chem. Soc. 68, 459 (1946), Kistler a Nitschmann H.: Vox Sang. 7, 414 (1962).) nebo jinými způsoby srážení, jako je srážení imunoglobulinů síranem amonným, síranem sodným, polyethylenglykolem, kyselinou kaprylovou nebo rivanolem, nebo chromatografickými způsoby nebo kombinací těchto způsobů. Před chromatografii na katexu podle vynálezu se plazma bez kryoglobulinu nebo frakce plazmy obsahující imunoglobulin rozpuštěná v ekvilibračním pufru s výhodou zfiltruje a pro deaktivaci skrytých virů se nechá zreagovat s biokompatibilním organickým rozpouštědlem, jako je například tributylfosfát, a detergentním činidlem, jako je například O-[4-(l,l,3,3-tetramethylbutyl)-fenyl]-dekaoxyethylen) (Triton^ X-1000) podle způsobu popsaného Horowitzem (Thrombosis and Haemostasis 65, 1163 (1991).). Směs plazmy, rozpouštědla a detergentního činidla se pak inkubuje při 37 °C. Potom se fáze oddělí. Čirá dolní fáze se oddělí, zředí, zfiltruje a upraví se na ekvilibrační podmínky chromatografie na katexu, teplota pro následující stupně je, zpravidla, nad 10 °C a s výhodou 20 až 25 °C. V prvním hlavním stupni čištění se anti-D IgG z předem zpracovaného produktu naváže na slabě kyselý

-3CZ 286271 B6 gel iontoměniče s výhodou s karboxymethylovou (CM) skupinou jako funkční skupinou. Vymyje se tak nad 98 % hmot, cizích proteinů; oddělí se zde pravděpodobně rozpouštědla a detergentní činidla použitá pro deaktivaci viru. Anti-D IgG IgG podtříd 1 a 3 specificky zkoncentrovaných tímto způsobem se eluují gelem iontoměniče zvyšující se vodivostí nad lOmS/cm. Eluátem je čistá IgG frakce. Obsahuje méně než 15 % hmot, z celkové IgG frakce a má změněné spektrum IgG podtříd: IgGl a IgG3 jsou silně zkoncentrovány, IgG2 a IgG4 jsou značně sníženy. Tato anti-D IgG frakce se pak vyčistí dalším zpracováním s druhým, slabě alkalickým gelem iontoměniče, s výhodou s diethylaminoethylovou (DEAE) skupinou jako funkční skupinou, anti-D IgG se za zvolených podmínek neváže na iontoměniče. Pro zvýšení koncentrace se vyčištěná anti-D IgG frakce s výhodou naváže podruhé na gel CM ionexu a eluuje se co nejkoncentrovanější za vhodných podmínek. Pak se z ní vyrobí konečný produkt. Pro dosažení podmínek podle vynálezu není významné, jestli anti-D IgG frakce se eluuje zvyšováním koncentrace iontů, posunem pH nebo změnou pufru v prostředku. Pro snížení koncentrace dalších nežádoucích složek, jako jsou například proteázy, se roztok imunoglobulinu může dále nechat zreagovat s adsorbentem, jako je například gel hydroxidu hlinitého, během kteréhokoliv stupně tohoto procesu. Zpracování s rozpouštědlem a detergentním činidlem lze nahradit nebo doplnit jakýmkoliv známým stupněm inaktivace/odstraňování virů, například působením tepla, jako je pasterizace, nebo nanofiltrace.

Anti-D IgG vyrobený podle vynálezu je částečně stabilní. Je dobře snášen při intravenózním podávání, obsah IgA má nižší než 5 pg/ml a obsah IgG 1 až 10 mg/ml. pH je přibližně 5,2. Tento prostředek obsahuje s výhodou až 25 mM fosfátu, až 200 mM NaCl a až 100 mg/ml lidského albuminu, a také 250 až 300 mM aminokyseliny, jako je například glycin, nebo až 100 mg/ml disacharidu, jako je například sacharóza, nebo 50 mg/ml monosacharidu, jako je například manitol.

Anti-D IgG vyrobený podle tohoto vynálezu lze také lyofilizovat při pH přibližně 6,6 při přidání disacharidu, jako je například 100 mg/ml sacharózy, v dávce 2000 pg anti-D IgG.

Připojený výkres slouží jako ilustrace tohoto vynálezu bez tohoto, aby znamenal jakékoliv omezení. Ukazuje typický chromatogram první chromatografíe na katexu v příkladu 1.

Způsob podle vynálezu bude podrobněji vysvětlen v následujících příkladech.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Výchozím materiálem je plazma Rh-negativní ženy nebo Rh-negativního muž, kteří byly senzibilizováni na Rh faktor D pečlivě vybranými erythrocyty. Každá darovaná krev je testována na přítomnost HBs-antigenů, HIV protilátek a protilátek hepatitidy C a na zvýšenou ALAT aktivitu. Plazma, která se získá plazmoforesou, se jednotlivě zmrazí a před frakcionací a spojením se pečlivě roztaje při 0 až 4 °C. Spojená plazma bez ledu s obsahem anti-D 25 pg/ml se odstřeďuje (1 1/min, 12 000 otáček za minutu) v kontinuální odstředivce (Cepa, Lahr, Německo) při 2 až 4 °C. Supematant se zfiltruje 1,2 pm filtrem (Opticap^, Millipore, Bedford, Ma., USA). Potom se deaktivuje virus podle Horowitze a spol. (Thrombosis and Haemostasis 65, 1163 (1991).) působením detergentního činidla s 1 % Tritonu^ X-100 (Rohm a Haas, Frankfurt, Německo) a 1 % tributylfosfátu (Měrek, Darmstadt, Německo) 4 až 4,5 h při 30 °C. Roztok s deaktivovaným virem se nechá stát 10 až 18 h při 37 °C. Čirá dolní fáze se oddělí a zfiltruje se 0,2 pm filtrem (Sealkleen NFP 7002, Pall, Dreieich, Německo). 25 1 zfiltrované plazmy, která byla zpracována s rozpouštědlem a detergentním činidlem, se zředí 1 OmM pufřem fosforečnanu

-4CZ 286271 B6 sodného na vodivost ekvilibračního pufru (50mM pufr fosforečnanu sodného, pH 5,5, 3,2 mS/cm), pH se upraví na 5,5, zfiltruje 1,2 pm filtrem (Opticap^(R>, Millipore, Bedford, Ma., USA) a naváže se na MacroPrep^(R) 50 CM (BioRad, Hercules, Ka., USA) na koloně s plochou 706 cm², výškou vrstvy 7,5 cm a průtokem 150 cm/h. Gel se předem ekvilibruje pufrem 50mM fosforečnanu sodného, pH 5,5. Teplota se udržuje na 20 až 25 °C. Kolona se následně promyje 40 objemy kolony pufru 25mM fosforečnanu sodného, pH 7,0. IgG frakce obsahující anti-D se eluuje pufrem 25mM fosforečnanu sodného + 0,2M chloridu sodného, pH 7,2. Typický chromatogram, který se takto získá, je uveden na přiloženém obrázku 1. Na diagramu je znázorněn průběh optické hustoty (OD) při 280 nm s časem (t). Z obrázku je vidět, že během napájení a promývání se většina nežádoucích produktů oddělí, zatímco během eluce se získá hlavní úzké maximum, které obsahuje žádaný anti-D IgG silně zkoncentrovaný v IgG podfrakci. Specifická aktivita je tedy vyšší než 2 % hmotn. anti-D IgG na g celkového IgG. Tento eluát se zředí vodou na vodivost 3,3 mS/cm (1 objem eluátu + přibližně 5 objemů vody), pH se upraví 0,2M NaOH na 7,5 a adsorbuje se dávkovým způsobem 2,5 h na 100 g nosiče DEAESephadex^(R) A50 dry (Pharmacia, Uppsala, Švédsko). DEAE gel se předem ekvilibruje pufrem 25mM fosforečnanu sodného, pH 7,5. Nenavázaná anti-D IgG frakce se zfiltruje polypropylenovou sítí a pH se upraví na 5,5. Pro zvýšení koncentrace se DEAE filtrát naváže podruhé na MacroPrep^(R) 50 CM (BioRad, Hercules, Ka., USA) na koloně s plochou 71 cm², výškou vrstvy 12,5 cm a průtokem 230 cm/h. Gel se předem ekvilibruje pufrem 50mM fosforečnanu sodného, pH 5,5. IgG frakce obsahující anti-D se eluuje pufrem 25mM fosforečnanu sodného + 0,2M chloridu sodného, pH 5,5. CM gely se regenerují 1N NaOH, promyjí se tak aby byly nepyrogenní. Takto se mohou opět použít alespoň dvacetkrát. DEAE gel se po každém použití odstraní.

Příklad 2

Výchozím materiálem je plazma Rh-negativní ženy nebo Rh-negativního muže, kteří byly senzibilizováni na Rh faktor D pečlivě vybranými erythrocyty. Každá darovaná krev je testována na přítomnost HBs-antigenů, HIV protilátek a protilátek hepatitidy C a na zvýšenou ALAT aktivitu. Plazma, která se získá plazmaferezou, se jednotlivě zmrazí a před frakcionací a spojením se pečlivě roztaje při 0 až 4 °C. Spojená plazma bez ledu se odstřeďuje (1 1/min, 12 000 otáček za minutu) v kontinuální odstředivce (Cepa, Lahr, Německo). Supematant se zfiltruje 1,2 pm filtrem (Opticap^(R), Millipore, Bedford, Ma., USA). Potom se deaktivuje virus podle Horowitze a spol. (Thrombosis and Haemostasis 65, 1163 (1991)) působením detergentního činidla s 1 % Tritonem^ X-100 (Rohm a Haas, Frankfurt, Německo) a 1 % tributylfosfátu (Měrek, Darmstadt, Německo) 4 až 4,5 h při 30 °C. Roztok s deaktivovaným virem se nechá stát 10 až 18 h při 37 °C. Čirá dolní fáze se oddělí a zfiltruje se 0,2 pm filtrem (Sealkleen NFP 7002, Pall, Dreieich, Německo). 25 1 zfiltrované plazmy, která byla zpracována s rozpouštědlem a detergentním činidlem, se zředí lOmM pufrem fosforečnanu sodného na vodivost ekvilibračního pufru (50mM pufr fosforečnanu sodného, pH 5,5, 3,2 mS/cm), pH se upraví na 5,5, zfiltruje 1,2 pm filtrem (Opticap^(R), Millipore, Bedford, Ma., USA) a naváže se na MacroPrep^(R) 50 CM (BioRad, Hercules, Ka., USA) na koloně s plochou 706 cm², výškou vrstvy 7,5 cm a průtokem 150 cm/h. Gel se předem ekvilibruje pufrem 50mM fosforečnanu sodného, pH 5,5. Teplota se udržuje na 20 až 25 °C. Kolona se následně promyje 40 objemy kolony pufru 25mM fosforečnanu sodného, pH 7,0. IgG frakce obsahující anti-D se eluuje pufrem 25mM fosforečnanu sodného + 0,2M chloridu sodného, pH 7,5. Při pH 6,6 po přidání 100 mg/ml sacharózy na dávku 200 pg anti-D IgG se eluát zfiltruje 0,2pm filtrem (Millidisk^(R) MCGL-10, Millipore, Bedford, Ma., USA) a následně se lyofilizuje.

-5CZ 286271 B6

Příklad 3 ml plazmy, která byla zpracována s rozpouštědlem a detergentním činidlem a zředěna na vodivost ekvilibračního pufru (3,3 mS/cm), se chromatografuje na koloně s plochou 2 cm² a výškou vrstvy 5 cm při průtoku 30 cm/h s nosičem DEAE-Sephadex^(R) A50 (Pharmacia, Uppsala, Švédsko). Předtím se gel ekvilibruje pufrem 25mM fosforečnanu sodného, pH 7,5. Teplota se udržuje na přibližně 20 až 25 °C. Pro další čištění se pH nenavázané IgG frakce upraví 0,2M HC1 na 5,5 a vodivost na 3,2 mS/cm a naváže se na MacroPrep^w 50 CM (BioRad, Hercules, Ka., USA) na koloně s plochou 0,8 cm², výškou vrstvy 6,5 cm a průtokem 230 cm/h. Gel se předem ekvilibruje pufrem 50mM fosforečnanu sodného, pH 5,5. IgG frakce obsahující anti-D se eluuje pufrem 25mM fosforečnanu sodného + 0,2M chloridu sodného, pH 5,5. DEAE Sephadex^fR)A50 gel se po každém použití odstraní, MacroPrep^ 50 CM gel se regeneruje 1N NaOH, promyje se tak, aby byl nepyrogenní. Takto se může opět použít alespoň dvacetkrát.

Příklad 4

Zopakují se způsoby podle příkladů 1 až 3, ale místo plazmy se jako výchozí materiál použije frakce plazmy obsahující imunoglobulin, která se vyrobí zodpovídajícího množství výchozí plazmy tak, že se získají frakce I+II+III nebo frakce II+III podle Cohna (Cohn E.J. a spo.: J. Amer. Chem. Soc. 68, 459 (1949) nebo precipitát A nebo precipitát gamaglobulinu podle Kistlera a Nitschmanna (Kistler P. a Nitschmann H.: Vox Sang 7, 414 (1962).) a rozpustí se v ekvilibračním pufru na koncentraci 30 g proteinu na 1. Získají se analogické výsledky.

Příklad 5

Zopakují se způsoby podle příkladů 1 až 4, při čemž se IgG frakce obsahující anti-D eluuje z MacroPrep^ 50CM gelu (BioRad, Hercules, Ka., USA) eluuje buď 0,lM glycinym + 0,5M chloridem sodným, pH 9, nebo obecně změnou pH a/nebo změnou iontové síly a/nebo jiným změnami ve složení pufru, místo pufrem 25 mM fosforečnanu sodného + 0,2M chloridu sodného, pH 7,5. Získají se analogické výsledky.

Příklad 6

Zopakují se způsoby podle příkladů 1 a 2, při čemž se MacroPrep^ 50CM gel (BioRad, Hercules, Ka., USA) promývá lOmM glycinem místo pufrem 25 mM fosforečnanu sodného, pH 7,0. Získají se analogické výsledky.

Příklad 7

Anti-D eluát získaný podle příkladu 1 se upraví na následující kapalné prostředky:

	kapalný prostředek I	kapalný prostředek II	kapalný prostředek ΙΠ	kapalný prostředek IV
anti-D	100 pg/ml	100 pg/ml	100 pg/ml	100 pg/ml
glycin	20,6 mg/ml	20,6 mg/ml	20,6 mg/ml	20,6 mg/ml
albumin	-	10 mg/ml	50 mg/ml	100 mg/ml
pH	5,20	5,20	5,20	5,20
dávka	2 ml	2 ml	2 ml	2 ml

-6CZ 286271 B6

	kapalný prostředek V	kapalný prostředek VI	kapalný prostředek VII	kapalný prostředek vni
anti-D	100 pg/ml	100 pg/ml	100 pg/ml	100 pg/ml
glycin	50 mg/ml	50 mg/ml	50 mg/ml	50 mg/ml
albumin	-	10 mg/ml	50 mg/ml	100 mg/ml
pH	5,20	5,20	5,20	5,20
dávka	2 ml	2 ml	2 ml	2 ml

a po zfíltrování 0,2 pm filtrem (Millipak^(R)-20, Millipore, Bedford, Ma., USA) se za sterilních podmínek naplní do injekčních stříkaček Hypac pro okamžité použití (Vetter, Ravensburg, Německo).

Příklad 8

DEAE filtrát podle příkladu 1 při pH přibližně 5,5 se nechá reagovat s 0,2 g hydroxidu hlinitého na g proteinu 30 minut při 20 až 25 °C. Potom se postupuje dále podle příkladu 1.

Příklad 9

Zopakují se způsoby podle příkladů 1 až 6, při čemž se místo MacroPrep^<R) 50CM použije jeden z následujících gelů se stejnými funkčními skupinami: CM-Spherodex^(R) (Biosepra, Villeneuve la Garenne, Francie), CM-Trisacryl^(R) (Biosepra, Villeneuve la Garenne, Francie), CMSepharose^(R>FF (Pharmacia, Uppsala, Švédsko) nebo Fractogel^(R)TSK CN-650 (Měrek, Darmstadt, Německo). Získají se analogické výsledky.

Příklad 10

Zopakují se způsoby podle příkladu 1 a 3 až 6, při čemž se místo DEAE-Sephadexu^(R) A50 použije MacroPrep^(R> DEAE (BioRad, Hercules, Ka., USA). Získají se analogické výsledky.

Chromatografické stupně se ve shora uvedených příkladech 1 až 6 provádějí jako dávkové, kolonové nebo membránové chromatografie. Získají se analogické výsledky.

PATENTOVÉ NÁROKY