JPS58131996A - 抗生物質及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な抗生物質及びその製造法に関する。

本発明者らは先に、土壌から分離されたＫＣ−６６０６
株がダラム賜性菌、ダラム陰性菌及び抗酸菌に対して優
れた抗菌力を示−し、抗生物質として有用な新規化合物
を生産することを見出し、その培養物から各化合物ＫＡ
−６６０６１〜Ｘ■をそれぞれ単離した（特開昭５３−
１２７４０１号、同５４−６６０３号、同５５−１１１
４９７号、特願昭５５−９５６０２号、同５５−１８５
０８７号及び同５６−１２７５５５号各明細書参照）。

本発明者らは更に研究を続けた結果、ＫＣ−６６０６株
の培養液中に、前記の１７種の化合物のほかに更に２種
の新規な化合物が存在することを見出し、これらを単離
することに成功した。

本発明は、一般式 （式中Ｒ４及びＲ２は一方が水素原子、他方がメチル基
を示す）で表わされる抗生物質ＫＡ−６６０６ＸＶＩ又
はＫＡ−６６０６ＸＩＫである。

さらに本発明は、サツカロポリスボラ属に属するＫＡ−
６６０６物質生産菌を培養し、培養液からＫＡ−６６０
６物質を採取し、これからＫＡ−６６０６Ｘ■及び／又
はＫＡ−６６０６ＸＷを単離することを特徴とする、前
記の抗生物質の製造法である。

本発明の化合物はその物理化学的性質及び生物学的性質
が、先に培養物から単離された前記のＫＡ−６６０６１
−Ｘ■と異なることから、ＫＡ−６６０６物質群の新成
分であることが認められ、それぞれＫＡ−６６０６Ｘ■
及びＫＡ−６６０６ＸＩＫと命名された。これらの化合
物は、後記の種々の測定データから下記の構造を有する
ものと考えられる。

ＫＡ−６６０６”ＫＶ＠ Ｈ３ Ｈ２ ＫＡ−６６０６ＸＩＫ 本発明の新規化合物を製造するために使用される菌は、
ｘｃ−６６０６株ならびにその変異株で、その菌学的性
質は特開昭５５−１２７４０１号公報に詳記遅れている
。ＫＣ−６６０６株は炭素源の資化性においてはサツカ
ロポリスポラ・ヒルスタと相違するが、形態学的性質、
各種培地上の性質、生理的性質等の基本性状がよく一致
したことから、サツカロポリスポラ・ヒルスタの自然変
異株と考えられ、サツカロポリスポラ・ヒルスタＫＣ−
６６０６株と命名され、微工研菌寄第６９１２号として
、工業技術院微生物工業研究所に寄託されている。

本発明で用いるサツカロポリスポラ・ヒルスタに属する
菌株は、その性状が変化しやすく、例えば紫外線、エッ
クス線、薬品などを用いる人工変異手段で容易に変異し
得るものであり、このような変異株であっても抗生物質
ＫＡ−６６０６の生産能を有するものはすべて本発明に
使用することができる。

本菌株の培養には通常の放線菌の培養方法が用いられる
。培養基の炭素源としては種々のものが用いられるが、
殿粉、ぶどう糖、グリセリン、マルトース、デキストリ
／、蔗糖、果糖、糖蜜などを単独で又は組み合わせて用
いることが好ましい。さらに菌の資化性によっては炭化
水素、有機酸、植物油なども用いられる。窒素源として
は大豆粉、酵母エキス、乾燥酵母、ペプトン、肉エキス
、コーンステイープリカー、カザミノ酸、デイステイラ
ーズソリュプル、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム
、尿素、硝酸ナトリウムなどが単独で又は組み合わせて
用いられる。

その他必要に応じ、食塩、燐酸カリウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、水酸化カルシ
ウム、塩化コバルト、硫酸亜鉛、塩化鉄、硫酸鉄などの
無機塩、並びに微量の重金属を添加することができる。

更に菌の発育を助け、ＫＡ−６６０６物質（ＫＡ−６６
０６１〜ＸＩＸの総称）の生産を促進する有機及び無機
物質を適宜に添加することができる・。通気培養法を用
いる場合には、更に脂肪油、シリコーン油、パラフィン
などの消泡剤が用いられる。

培養方法としては、固体培地上での培養も可能であるが
、一般抗生物質生産の方法と同様に液体培養法、特に深
部培養法を用いることが好ましい。培養は好気的条件下
で行なわれ、培養温度は２０〜６８℃で、６０℃付近が
特に好ましい。

ＫＡ−６６０６物質の生産は、振盪培養又はタンク培養
のいずれの場合も２〜９日間培養を行なうと、活性物質
が培養液中に生産蓄積される。培養液中の生産量が最大
に達した時点で培養を停止し、培養液中より目的の抗生
物質な単離精製する。

培養Ｐ液から本物質な単離精製するには、ＫＡ−６６０
６物質が水に可溶で一般の有機溶媒に難溶性 の水溶性塩へ物質であるため、通常の水溶性塩基性抗生
物質の単離、精製法を利用することができる。イオン交
換樹脂、活性炭、セルロース、シリカゲル、アルミナ等
による吸脱着法、補助剤として高級脂肪酸を加えてブタ
ノール、アミルアルコール等で抽出する方法などを適宜
組み合わせて用いることができる。

培養ｒ液を弱酸性陽イオン交換樹脂の層に通すと、ＫＡ
−６６０６物質が吸着される。これを０．１〜３，０規
定のアルカリ、酸又は各種塩の溶液で溶出し、活性成分
を凍結乾燥すると、ＫＡ−６６０６−物質の粗粉末が得
られる。このとき用いられる弱酸性陽イオン交換樹脂と
しては、アンバーライトＩＲＣ−５０又はｃｏ−５ｏ　
（ローム・アンド・ハース社製）、ダイヤイオ／ＷＫ−
１０又はＷＫ−２０（三菱化成社製）などがあげられる
。またアルカリとしてはアンモニア水、水酸化ナトリウ
ム水溶液などが、酸としては義酸、塩酸、硫酸などが、
塩溶液としては炭酸アンモニウム、義酸アンモニウム溶
液などがあげられる。

培養ｒ液をｐＨ７〜９に調整し、目的物質を活性炭に吸
着させ、酸性の水又は塩酸−メタノールで溶出させる方
法も利用できる。

こうして得られる粗粉末は、弱酸性陽イオン交換１１ｔ
　脂、　ＣＭ−セファデックス、ＣＭ−セルロースなど
に吸着させ、アルカリ性水溶液、例えばアンモニア水、
炭酸アンモニウム、義酸アンモニウムの水溶液などを用
い、濃度勾配法又は濃度段階法で溶出することにより、
遊離塩基としてＫＡ　−６６０６１−Ｘ！にの各成分に
分離することができる。

例えばＫＡ−６６０６物質の粗粉末を陽イオン交換樹脂
、例えばアンバーライ）　ＣＧ−５０に吸着させ、例え
ばアンモニア水を用いる濃度勾配法によって溶出すると
下記の順序で各成分が分離されて溶出してくる。先ず最
初にＫＡ−６６０６Ｘｌｌ　、次いでＫＡ−６６０６Ｔ
Ｖ、■及びＩの混合物が溶出する。

引き続いてＫＡ−６６０６■が溶出した後に、ＫＡ−６
６０６■及びＫＡ−６６０６ＸＩ〜Ｘ■の混合物が溶出
する。その後、ＫＡ−６６０６ＶＷ及び■の混合物、Ｋ
Ａ−６６０６Ｍ　。

Ｖ、ＸＶＩ及びｘｕノ混合物、更にＫＡ−６６０６Ｘ及
びＫＡ−６６０６ＸＩが順次溶出する。

ＫＡ−６６０６Ｉｔ　、　Ｖ　、　ＸＶＩ及び魚の混合
物より各成分を分離するには、例えば粗粉末を陽イオン
交換樹脂、例えばＣＭ−セファデックスＣ−２５を充填
したカラムに吸着させ、例えばアンモニア水を用いる濃
度勾配法により展開すると、ＫＡ−６６０６Ｘ■、ＸＩ
Ｋ、■及び■の順序に溶出してくるので各成分を単離す
ることができる。

こうして得られるＫＡ−６６０６ＸＶＩ及び豆は、それ
ぞれセルロース、シリカゲル、セファデックスなどを用
いるクロマトグラフィーな適宜に組み合せて精製するこ
とができる。

ＫＡ−６６０６ＸＶＩ及びＸＵの遊離塩基はそれぞれ常
法により酸付加塩に導くことができる。酸としては、無
機酸例えば硫酸、塩酸、臭化水素酸、沃化水素酸、燐酸
、炭酸、硝酸等−ならびに有機酸例えば酢酸、フマル酸
、りんご酸、くえん酸、マンデル酸、こはく酸等が用い
られる。

ＫＡ−６６０６Ｘ■及び同ｘｖはいずれも塩基性水溶性
の白色物質で、主としてダラム陽性菌及び陰性菌に対し
て抗菌性を示す有用な新規抗生物質である。本物質の物
理化学的及び生物学的性状は下記のとおりであり、先、
に％示した構造式を支持した。従って本発明化合物は、
既知抗生物質とは異なる構造を有する新規抗生物質と認
められた。

１、物理化学的性状 ＫＡ−６６０６Ｘｌｌの遊離塩基 （１）外観：白色粉末 （２）分子量：３１８ 高分解能マススペクトル （６）分子式：　Ｃ１４Ｈ３Ｏ０４Ｎ４（４）比旋光度
：〔α）２２＋１４６°（ｃｌ、Ｈ２Ｏ）（５）紫外線
吸収スペクトル： ２２０〜３６０ｎｍで特異的な吸収を示さない。

（６）赤外線吸収スペクトル： 臭化カリウム中にペレットした赤外線吸収スペクトルは
第１図に示すとおりである。

（７）溶剤に対する溶解性： 水に極めて溶けやすい。メタノールに易溶、エタノール
、アセトンに溶けにくい。

クロロホルム、酢酸エチル、エーテル。

ヘキサン、石油エーテルに不溶。

（８）呈色反応： ニンヒドリン反応、ライドン、スミス氏反応に陽性。

坂口反応、マルトール反応、塩化第二鉄反応、フェーリ
ング反応に陰性。

（９）安定性：ｐＨ２，０〜８．０テ安定（１の核磁気
共鳴スペクトル：δＤ２０　（ｐｐｍ）ｔ５６　（３Ｈ
，Ｓ、　Ｃ−ＣＨＬ） ３．９２　（３Ｈ，Ｓ、０−ＣＲ２） ５．４１（ＩＨ，ｄ、アノメリックＨ）（１１）マスス
ペクトル： Ｍｕｇ　　＝３１９（Ｍ＋＋１）、２０５．１７７．１
５９．１４３ （１２）ペーパークロマトグラフィー：Ｒｆ値：０．６
６ ｒ紙二ワットマン＆１ 溶媒：クロロホルム−メタノール− １７％アンモニア水（２：１：１） の下層 （１３）薄層クロマトグラフィー プレートはＴＬＣアルミニウムシート・シリカゲル６０
　Ｆ２５４０．２　ｍｍ　（メルク社製）を用いた。

ＫＡ−６６０６ＸＩＫの遊離塩基 （１）外観：白色粉末 （２）分子量：３１８ 高分解能マススペクトル （６）分子式：Ｃ０４Ｈ３０ｏ４Ｎ４ （４）比旋光度：　ｃα’Ｆ＋　１５６°（ｃＯ，５、
Ｈ２Ｏ）（５）紫外線吸収スペクトル： ２２０〜３６０ｎｍで特異的な吸収を示さない。

（６）赤外線吸収スペクトル： 臭化カリウム中にペレットした赤外線吸収スペクトルは
第２図に示すとおりである。

（７）溶剤に対する溶解性： 水に極めて溶けやすい。メタノールニ易１溶。エタノー
ル、アセトンに溶けにくい。

クロロホルム、　酢酸エチル、ヘキサン。

石油エーテルに不溶。

（８）呈色反応： ニンヒドリン反応、ライドン・スミス氏反応に陽性。

坂口反応、マルトール反応、塩化第二鉄反応、フェーリ
ング反応に陰性。

（９）安定性：ｐＩ−Ｌ２．０〜８．０で安定。

（１の核磁気共鳴スペクトル：δＤ２０（ｐｐｍ）２．
８１（３Ｈ，ｄ％Ｎ−ＣＨ，） ６．８６　（３Ｈ，Ｓ、　０−ＣＨ８）５．５６（ＩＨ
，ｄ、アノメリック旦工）（１１）マススペクトル： Ｍ／Ｚ　：　３．１９　（Ｍ＋＋１　）、２１９．１９
１．１７３．１２９ （１２）ペーパークロマトグラフィー：Ｒｆ値：０．６
２ Ｐ紙二ワットマン應１ 溶媒：クロロホルム−メタノール− １７％アンモニア水（２：１：１） の下層 （１３）薄層クロマトグラフィー： プレートはＴＬＣアルミニウムシート・シリカゲル６０
　Ｆ２５４０．２　ｍｍ　（メルク社製）を用いた。

■、生物学的性状 抗菌作用 ＫＡ−６６０６Ｘ１１及び同意のディスクプレート法に
による各種微生物に対する抗菌スペクトラムをＫＡ−６
６０６１［物質と比較して第１表に示す０薬剤は６０　
ｍｃｇずつ直径ａ　Ｗｔのペーパーディスクに浸透させ
て用いた。

第　　１　　表 このようにＫＡ−６６０６Ｘ■及びＸｖは広範囲の優れ
た抗菌スペクトラムを有することから、抗菌性物質とし
て医薬、動物薬などとして有用である。その際ＫＡ−６
６０６Ｘ■及びＸｖは単独で又はこれらを組合せて、あ
るいは１種以上のＫＡ−６６０６Ｘ■とＸＩＫと１種以
上のＫＡ−６６０６Ｉ−Ｘ■１との混合物として使用で
きる。さらに本物質は糧々の誘導体を合成するための出
発物質としても有用である。

実施例 殿粉４％、大豆粉１．８％、酵母エキス０．１％、コー
ンステイープリカー０．４％、食塩０．３％、硫酸マグ
ネシウム・上水塩０．０５％、塩化カルシウム０．０６
％、塩化コバルト−力水塩０．００５％の組成を有し、
ｐＨ７，２に調整し滅菌した培地にＫＣ−６６０６株を
接種し、３０℃で２日間培養したものを第一種菌とする
。２０！容のジャーファーメンタ−に第一種菌培地と同
じ培地に綿実油２．０％を添加した培地１０１を仕込み
、第一種菌２００　ｔｎｌを接種し、３０℃で２日間通
気攪拌方式（２４０ｒｐｍ、通気量１０看／分）によっ
て培養して第二種菌とする。５０００／？容のファーメ
ンタ−に第二種菌培地と同じ組成の培地２５００４を仕
込み、第二種菌１０！を接種し、６０℃で７日間通気攪
拌力式（１２０ｒｐｍ　、通気量２５００４／分−）に
より培養する。

培養終了後、培養液に硫酸を添加してｐＨ２，０に調整
したのち、沢過助剤としてセライト（ジョーン・マンビ
ル社製）を加えて菌体なｒ別する。ｆ液に４８％水酸化
ナトリウム水溶液を加えてｐＨ７，０に調整し、陽イオ
ン交換樹脂アンバーライトＩＲＣ５０（ＮＨ４型）のカ
ラム（２０×１５０ｃＩｒＬ）に通し、活性物質を吸着
させ、水洗したのち１規定アンモニア水で溶出する。活
性部分を集め、減圧下で濃縮したのち凍結乾燥すると、
ＫＡ−６６０６物質の粗粉末２００ｇが得られる。

この粗粉末２００ｇを蒸留水２０２に溶解し、希硫酸で
ｐＨをＺＯに調整し、陽イオン交換樹脂アンバーライト
Ｃ’Ｇ−５０（’ＮＨ＋型）のカラム（１ｏｘ４ｏｏｃ
ＩｒＬ）に通し、水洗したのち０．０１規定のアンモニ
ア水２５０！と１規定のアンモニア水２５０沼の間で濃
度勾配法を用いてろ２７時の流速で溶出し、１０彫ずつ
分画する。

各両分をペーパーディスク法による活性の検定及びペー
パークロマトグラフィーにより検討し、ＫＡ−６６０６
ＩＩに該当する成分の含まれる両分を集め、凍結乾燥す
ると、粗粉末３０．！９が得られる。

この粗粉末１０ｇを弱酸性陽イオン交換樹脂ＣＭ−セフ
ァデックスＣ−２５（ＮＨ４型）のカラム（３ｘ１５０
ｃｒｒＬ）に付し、水洗したのち０．１規定のアンモニ
ア水５！と０．６規定のアンモニア水５−ｅの間で濃度
勾配法により１５０１ｒＬｌ／時で溶出して１００　ｍ
ｌずつ分画する。各画分をペーパーディスク法及び薄層
クロマトグラフィーにより検討し、ＫＡ−６６０６１の
前に溶出されるＫＡ−６６０６Ｘ■及び同ＸｒＬを含む
両分を集め、凍結乾燥すると粗粉末２５０１ｎ９が得ら
れる。

この粗粉末２５０〜を再び水に溶解し、ＣＭ−セファデ
ックスｃ−２５（ＮＨ４＋型）のカラム（１ｔ５ｘ５２
ｃｍ）に付し、水洗したのち水５０Ｑ　ｍｌと０，３規
定のアンモニア水５００　ｍｌの間で濃度勾配法により
８０ｒＩＬｌ／時の流速で溶出して１Ｑｍｌずつ分画す
る。画分７６〜８６及び画分８７〜９５を各々合し、凍
結乾燥すると、前者よりＫＡ−６６０６Ｘ■の粗粉末４
０〜が、後者よりＫＡ−６６０６ＸＩＫの粗粉末８０ｍ
ｇが得られる。

この粗粉末を各々シリカゲルのカラムに付し、クロロホ
ルム−メタノール−１７％アンモ＝７水（１：８：２）
で展開溶出して活性区分を集める。これを更に水に溶解
し、ＣＭ−セフアゾそれぞれＫＡ−６６０６Ｘ■の遊離
塩基の精製標品２５■及びｘＡ−６６０６ＸＷの遊離塩
基の精製標品４０■が得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図は抗生物質ＫＡ−６６０６Ｘ■の赤外線吸収スペ
クトルを示すグラフ、第２図は抗生物質ｘＡ−６６０６
ＸＷの赤外線吸収スペクトルを示すグラフである。 出願人興和株式会社 代理人　弁理士　小　林　　正　　雄

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一般式 （式中Ｒ，及びＲ２は一方が水素原子、他方がメチル基
   を示す）で表わされる抗生物質ＫＡ−６６０６）Ｎｌ又
   ハＫＡ−６６０６ＸＩＸ。 λ　サツカロポリスボラ属に属するＫＡ−６６０６物！
   生産菌を培養し、培養液からＫＡ−６６０６物質を採取
   し、これからＫＡ−６６０６ｍ及び／又はＫＡ−６６０
   ６窺を単離することを特徴とする、ＫＡ−６６０６ｘｖ
   Ｍ及び／又はＫＡ−６６０６ＸＩＫの製造法。