JPH02257889A - 新規抗生物質又はこれの酸付加塩の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、カナマイシンＡまたはカナマイシンＢを原料
とする一般式 （式中、Ｒ１およびＲ’ａはメチル基又は水素原子を、
Ｒ′２は水酸基又は水素原子を意味し、またＲ３はアミ
ノ基又は水酸基を意味する。但し、（式中、Ｒ１および
Ｒ’ａはメチル基又は水素原子を、Ｒ’ｔは水酸基又は
水素原子を意味し、またＲ５はアミノ基又は水酸基を意
味する。但し、Ｒ′８が水酸基のときは、Ｒ＋は水素原
子を、Ｒ′２が水素原子のときはＲ’４は水素原子を意
味する。）で示されるアミノグリコシド化合物又はこれ
の酸付加塩の製造法に関する。

上記一般式（１）に包合される化合物のうち３”−Ｎ−
メチルカナマイシンＡ　（Ｒ１＝　Ｈ、Ｒ＃。

＝ＯＨ，Ｒ５−ＯＨ，Ｒ’４−Ｈ）および３”−Ｎ−メ
チルカナマイシンＢ　（Ｒ＋　＝　）Ｉ　、　　Ｒ’ｔ
　＝　ＯＨ、Ｒｓ＝ＮＦｚ　、　　４＝Ｈ）は公知の化
合物であるがこれらの化合物は従来化学的な合成法によ
って製造された。本発明は上記一般式（１）の化合物を
微生物を用いる発酵法によって製造する点に特色がある
。

本発明によって提供される化合物化合物（１）はすぐれ
た抗菌活性を示し、抗菌剤として有望である。また化合
物（１）はこれを原料として各種の誘導体を製造するこ
とが出来る。そのような誘導体としては１位のアミノ基
をＬ（−）−γ−アミノーα−ヒドロキシ酪酸により化
学的合成手段によりアシル化した化合物を挙げることが
できる、又他の有意な抗菌活性を有する誘導体として微
生物変換による方法で製造される種々の化合物を挙げる
ことができる。そのような化合物としては化合物（１）
をミクロモノスポラ属に属するゲンタミシン生産菌株お
よびシソミシン生産菌株又はそれらの変異株と接触させ
ることにより得られるものであって、たとえば １゜ ３゜ ４゜ ５゜ ６゜ ３　’、　４　’−ジデオキシー３”−Ｎ−メチル−４
”−Ｃ−メチル−６′−Ｎ−メチルカナマイシンＢある
いはその４″のエピマー［１−ｎ＋］３　’、　４　’
−ジデオキシー３”−Ｎ−メチル−４”　−Ｃ−メチル
カナマイシンＢあるいはその４″のエピマー［ＩＢ＊］ ３　’、　４　’　−ジデオキシ−３”−Ｎ−メチル−
４”−Ｃ−メチルカナマイシンＡあるいはその４″のエ
ピマー［１−Ａｌ１ ４　’、　５　’　−ジデヒドロ−３’、　４　’−ジ
デオキシー３”−Ｎ−メチル−４”−Ｃ−メチルカナマ
イシンＡあるいはその４″のエピマー［Ｉ　　ＳＫ　　
Ａ＋］ ４　’、　５　’　−ジデヒドロ−３’、　４　’　−
ジデオキシ−３”−Ｎ−メチル−４”−Ｃ−メチルカナ
マイシンＢあるいはその４″のエピマー［ｌ−３Ｋ−Ｂ
、］ ４　’、　５　’　−ジデヒドロ−３’、　４　’　−
ジデオキシ−３”−Ｎ−メチルカナマイシンＢ ［ｒ−３Ｋ−Ｂ、］ をあげることが出来る。これら誘導体は本発明者らの先
願に係る特願昭５３−３１８８および特願昭５３−１４
７３９６に記載されている。

つぎに化合物ＣＩ）の抗菌活性をカナマイシンＡ（以下
ＫＭ−Ａと略記する）およびカナマイシンＢ（以下ＫＭ
−Ｂと略記する）と対比して表示すると次の通りである
。

上表から明らかなように、化合物（Ｉ）は種々のグラム
陽性細菌及びダラム陰性細菌に対し、広範囲でかつ強力
な抗菌活性を有し、医薬品として有用である。

本発明によれば、化合物（１）は、ＫＭ−ＡまたはＫＭ
−Ｂをミクロモノスポラ属に属するゲンタミシン生産菌
株またはその変異株と接触させることによって製造され
る。

この製造法で使用される菌株はＫＭ−ＡおよびＫＭ−Ｂ
の３′位、４′位のデオキシ化と４′位のＣ−メチル化
と６′位のＮ−メチル化のそれぞれを場合によっては行
い、３１位をＮ−メチル化しうるちのであれば特に制限
はない、そのような菌株としてはたとえばミクロモノス
ポラ　ニスキツスボラＮＲＲＬ・２９８５　（Ｉ　Ｆ　
０−１３１４９）　、ミクロモノスポラ　プルプレアＮ
ＲＲＬ・２９５３（ＩＦＯ−１３１５０）など公知の菌
株のほか、ミクロモノスポラ属の新菌株であるミクロモ
ノスポラｓｐ、　Ｋ−６９９３株をあげることが出来る
。このミクロモノスポラｓｐ、　Ｋ−６９９３株は、本
発明者らが沖縄県石垣島の土壌よりあらたに分離した菌
株で、ゲンタミシンを生産することが確認されている。

また、変異株はミクロモノスポラ属に属するゲンタミシ
ン生産菌株を、たとえば紫外線照射、コバルト６０照射
、Ｘ線照射のほか、ニトロソ化合物、アクリジン色素化
合物、核酸塩基類似物質等の変異誘発剤を用いる通常の
人工変異手段で得られるものである。好適な変異株とし
ては、ゲンタミシン生産能が無いかもしくは極端に生産
能が低下して、かつ、さきにのべたＫＭ−ＡおよびＫＭ
−Ｂをデオキシ化、メチル化出来る性質をもつものであ
る。それら変異株の代表例は本発明者らがあらたに取得
した、ミクロモノスポラｓｐ、　Ｋ　−６９９３−Ｙ−
４１株およびミクロモノスポラ　エキノスポラＮＲＲＬ
・２９８５−　Ｎ−６株をあげることができる。

つぎに、ミクロモノスポラｓｐ、Ｋ　−６９９３（以下
に−６９９３と略記する）とその変異株であるミクロモ
ノスポラｓｐ、Ｋ　−６９９３−Ｙ　−４１（以下Ｙ−
４１と略記する）およびミクロモノスポラ　エキノスポ
ラＮＲＲＬ・２９８５−　Ｎ−６株（以下Ｎ−６と略記
する）の３株についてその菌学的性状を記載する。

なお、これらの菌株は、夫々微工研寄託受理番号４３０
４号、同４３０５号および同４３０３号としていずれも
工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。又
これらの菌株はアメリカンタイプ力ルチュアコレクショ
ンにそれぞれＡＴＣＣ第３１３４８号、第３１３４９号
および第３１３５０号として寄託されている。

１、形態的性質 上記３株の形態的特徴は比較的似ている。３株共、真性
気中菌糸は作らないが、直径０．５〜１．０μで分校し
た基生菌糸を形成する。

胞子は基生菌糸から分校した胞子柄の先端に１ケのみ着
生する。胞子の形は長円型か卵型である。

３株共、ツアペック寒天、酵母エキス・麦芽エキス寒天
培地でよく発育し、卵アルブミン寒天上では紫系の色を
示す、　Ｋ−６９９３及びＮ−６株はミクロモノスポラ
　エキノスポラＮＲＲＬ・２９８５（Ｉ　Ｆ　０−１３
１４９）と同様の形態的特徴を示した。

Ｙ−４１株は前記２株とくらべ、胞子の着生がよくなく
、発育の色調は全体的にやや薄い。

■、炭素源の資化性 プリドハム・ゴツトリープ（Ｐｒｉｄｈａｓ−Ｇｏｔｔ
ｌｉｅｂ）の培地を基礎培地として、各々の炭素源を１
．０％加えたもので、資化性を検し、その結果を第２表
に示す。

第２表　炭素源の資化性 ■。

生理学的性質 第 表 第３表中ミルク、繊維素については、３７℃で１ケ月培
養したのちの結果を示し、ゼラチンの液化、硝酸還元、
チロシナーゼの生成については２９°Ｃ１２週間後の結
果を示した。

Ｋ−６９９３株は真性気中菌糸を形成せず、基体菌糸に
単一の胞子を着生することから、ミクロモノスポラ属に
属する菌株である。

すでに報告されている、ミクロモノスポラ属でゲンタミ
シンを生産する菌株としてはつぎのものがある。ミクロ
モノスポラ　プレブレアＮＲＲＬ２９５３（Ｍｉｃｒｏ
ｍｏｎｏｓｐｏｒａ　ｐｕｒｐｕｒｅａ）　、ミクロモ
ノスポラ　エキノスポラ　バリエタス　エキノスポラＮ
　ＲＲＬ　・２９８５（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ
　ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａｖａｒ、ｅｃｈｉｎｏｓｐｏ
ｒａ）　、ミクロモノスポラ　エキノスポラ　バリエタ
ス　フエルギニアＮ　ＲＲＬ　　２９９５（Ｍｉｃｒｏ
ｍｏｎｏｓｐｏｒａ　ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ　ｖａｒ
、　ｆｅｒｒｕｇｉｎｅａ）、ミクロモノスポラ　エキ
ノスポラ　バリエタスバリダＮ　ＲＲＬ　　２９９６（
Ｍｉｃｒｏｗｏｎｏｓｐｏｒａ　ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒ
ａｖａｒ、　ｐａｌｌｉｄａ）　［以上、アンチミクロ
ビアル・エージェント・アンド・ケモテラピー１９６３
年１１６頁〜１２４頁（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　
Ａｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｒａｏｔｈ−ｅｒａｐｈ
ｙ）及び特公昭４４−２１９３４に記載１　ミクロモノ
スポラ　サガミエンシスＭ　Ｋ　−６５（Ｍｉｃｒｏｍ
ｏｎｏｓｐｏｒａｓａｇａｓ＋１ｅｎｓｉｓ）、ミクロ
モノスポラ　サガミエンシス　バリエタス　ノンレデエ
カンスＭＫ−６２（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ　　
ｓａｇａｍｉｅｎｓｉｓ　　ｖａｒ、ｎｏｎｒｅｄｕｃ
ａｎｓ）、ミクロモノスポラ　サガミエンシス　バリエ
タスフラバＭｍ−６２８（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒ
ａ　ｓａｇａｍｉｅｎｓｉｓｖａｒ、ｆｌａｖａ）　［
以上、特公昭５０−３９１５５及び特公昭５１６７５５
に記ｉｌｌ　これら７株についての分類学上の特徴をに
一６９９３株と比較して、その相違点を第４表に掲載す
る。

この結果ミクロモノスポラ　エキノスポラに近い新菌株
と考えられる。

表 つぎに、ＫＭ−Ａ及びＫＭ−Ｂを化合物（１）に変換す
るには、ＫＭ−Ａ及びＫＭ−Ｂを含む培地中で、通常上
記菌株を用いて培養すればよい。

本発明の培養においては通常の抗生物質生産のための培
養法が用いられる。培養のための栄養源としてはいろい
ろなものが用いられる。炭素源としては、ブドウ糖、澱
粉、可溶性澱粉、デキストリン、シｇ糖、糖蜜などが単
独或いは組合せて用いられるし、菌の資化性にもよるが
、炭化水素、アルコール類、有機酸、動植物油なども用
いうる。

窒素源としては無機塩、例えば、塩化アンモニウム、硫
酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリ
ウム等が、天然物窒素源としては、大豆粉、脱脂大豆粉
、綿実粕、グルテンミール、コーンミール、ペプトン、
肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーン・スチープ・
リカー等が単独或いは組合せて用いられる。その他に必
要に応じて、アミノ酸類、核酸類、ビタミン類、塩化ナ
トリウム、炭酸カルシウム、リン酸塩、硫酸マグネシウ
ム、塩化コバルトなどの無機塩類も加えることができる
。

培養方法としては、液体培養法とくに深部攪拌方式によ
る方法が適している。培養温度は２５°Ｃから４５℃、
好ましくは、２８℃から３２°Ｃで、ｐＨは中性附近が
よい、又、培地の液性、添加物の量、温度、攪拌数、通
気量などの培養条件は用いる菌株などに応じて適宜選択
されなければならないことはいうまでもない、化合物（
１）を得るため、原料のＫＭ−Ａ及びＫＭ−Ｂの添加時
期は培養開始時でもよいし、また、培養開始後面が発育
した後でもよいが培養開始後７２時間頃までに行うのが
望ましい、添加量は０．１ｇ〜１０ｇ／　ｊ！程度で一
度に加えてもよいが分割して加えてもよい、また、ＫＭ
−ＡおよびＫＭ−Ｂはそのままの形でもよいが、塩例え
ば硫酸塩でもよい、ＫＭ−ＡまたはＫＭ−Ｂとの接触時
間は原料添加後、化合物（１）が最も多く蓄積される時
間が選択される。

これは、たとえば大腸菌に−１２ＭＬ−１６２９を試験
菌として、培養液中の化合物の量をペーパーディスク法
を用いることによって追跡できるが、通常原料添加後３
〜７日である。

化合物（１）の採取法は、その培養液からの単離、精製
も含めて、通常アミノグリコシド抗生物質の採取に利用
される方法が用いられる。すなわち、カチオンおよびア
ニオン交換樹脂による吸脱着法、活性炭による吸脱着法
、セルロースのカラムクロマトグラフィーによる吸脱着
法、シリカゲルカラムクロマトグラフィーなどの方法を
適当に組合せて用いることができる。具体的には、例え
ば培養液のｐＨを２ないし３に調整したのち、濾過して
菌体を除き、ｐＨを６〜７に中和しこの構造を有する物
質の吸着、溶離に適切なカルボン酸、スルホン酸等の基
を有する樹脂たとえばカチオン交換樹脂であるアンバー
ライトＩ　ＲＣ−５０（商品名）（ＮＨ４”型）、ダウ
エックス５０Ｗ（商品名）　（ＮＨ４”型）に吸着させ
、１規定のアンモニア水で溶出する。この溶出液を減圧
濃縮して、アンバーライトＣＧ−５０（商品名）（ＮＨ
４”型）でアンモニア水を用いた濃度勾配によるイオン
交換クロマトグラフィーを行う。これら化合物（１）を
さらに分離精製するには、たとえば、シリカゲルカラム
クロマトグラフィーを用い、また必要があればアンバー
ライトＣＧ−５０（ＮＨ，。型）およびダウエックス１
×２（商品名）（０１１−型）等によるカラムクロマト
グラフィーをくり返して行う事も出来る。

上記の方法で得られた化合物（１）の代表的なものをあ
げると次の通りである。

４”−Ｃ−メチル−３”−Ｎ−メチルカナマイシンＡあ
るいはその４″のエピマー［１−Ａ！］３”−Ｎ−メチ
ル−カナマイシンＡ［１−Ａ４］３　’、　４　’−ジ
デオキシー３　”　−Ｎ−メチル−６′−Ｎ−メチルカ
ナマイシンＢ［Ｉ−Ｂ、］３　’、　４　’　−ジデオ
キシ−３”−Ｎ−メチル−カナマイシンＢ［Ｉ−Ｂ、］ ３”−Ｎ−メチル−カナマイシンＢ［ｌ−８４］塩基性
である本化合物（１）は無機酸又は有機酸例えば塩酸、
硫酸、リン酸、酢酸、ステアリン酸、プロピオン酸、酒
石酸、マレイン酸等と無毒の塩を容易に形成する。

つぎに実施例により本発明の製造法をさらに説明する。

実施例１ ミクロモノスポラｓｐ、　Ｋ　−６９９３−Ｙ−４１株
による目的化合物−−Ａ！］の製造 デキストリン５％、脱脂大豆粉ニスサンミート特級（商
品名）３．５％、炭酸カルシウム０．７％を含む液体培
地（ｐＨ７，５）１００ｍを５００Ｗ１のフラスコに分
注し、滅菌する。そのフラスコにベネット斜面寒天培地
に３０℃で２週間培養して良く生育させたミクロモノス
ポラｓｐ、　Ｋ　−６９９３−Ｙ　−４１株を一白金耳
接種し２９°Ｃで４８〜７２時間振盪して種母培養液を
得た。

別に５００Ｊｄフラスコに１００ｄの本培養培地を調製
し、それに上記種母培養液ＩＷ＆を植菌する。この本培
養培地の組成は、デキストリン５％、脱脂大豆粉ニスサ
ンミート特級３．５％、炭酸カルシウム０．７％、塩化
コバルト０．００００２５％（ｐＨ７，５）であり、オ
ートクレーブで１２０″Ｃ２０分間滅菌して使用する。

植菌後２４時間目に別に除菌したＫＭ−Ａを培地１ｄ当
り、１０００１００Ｏ力価）添加した。添加後１２０時
間２９℃で振盪培養を行って得られたフラスコ６００本
分の培養液６０！を４規定の塩酸でｐＨ２，０に調整し
たのちに菌体を濾別した。濾液を４規定の水酸化ナトリ
ウムでｐＨ７，０に再調整し、アンバーライトＩ　ＲＣ
−５０（ＮＨ４”型）４２を充填したカラムを通過させ
目的化合物［１−Ａ５１を吸着させた。樹脂を充分に水
洗して１規定のアンモニア水１２ｆで溶出し、溶出液を
減圧濃縮後乾燥して粗溶出物を得た。この粗溶出物をア
ンバーライトＣＧ−５０（ＮＯ，。型）１．６１！、を
充填したカラムに吸着させ、樹脂を水洗したのち、水１
と０．７規定のアンモニア水７２を用いた濃度勾配溶出
操作を行い、各フラクション（各１５ｄ）を大腸菌に−
１２を試験菌としたペーパーディスク法及びシリカゲル
薄層クロマトグラフィー（メルク社製、キーゼルゲルＫ
ｉｅｓｅ１ｇｅｌ　６０Ｆｚｓ４（商品名）厚さ０．２
５ｍｍ。

展開溶媒（第５表のＡ）で２時間展開後ニンヒドリン発
色Ｒｆ値０．１１）により検出する。目的化合物［１−
Ａ３１区分は添加したＫＭ−Ａと共に化合物［１−Ａ、
］に先行して溶出されてくる。この溶出液を濃縮乾固し
て得た［ｌ−Ａ３１の粗区分をシリカゲルカラム［ワコ
ーゲルＣ−２００（商品名）］２２０ｍｍＸ　１２００
ｍｍに付し、展開溶媒（第５表のＡ）で溶出分画し、上
記と同様にシリカゲル薄層クロマトグラフィーで検出し
、　［Ｉ　　Ａ３］の含まれる区分を集め、濃縮乾固し
て［１−Ａ２１の粗区分の２ｇを得た。この粗区分には
まだＫＭ−Ａも含まれているのでこれを除（ために再び
シリカゲルカラム（ワコーゲルＣ２００）２ｈｍＸ１０
００ｍｍに付し、上記シリカゲルカラムクロマトグラフ
ィーと同様の展開溶媒で溶出分画して、上記シリカゲル
薄層クロマトグラフィーで検出する。溶出してきた［■
−Ａ、１区分を集め減圧濃縮後乾燥して［Ｉ　　Ａｓ］
の白色粗粉末を４６２■得た。この粗粉末をアンバーラ
イトＣＧ　　５０　（ＮＨａ”型）　２０ｍ−Ｘ　５０
０ｓｎカラムに吸着させ水ｌｌと０．７規定アンモニア
水ｌＩ！。

とで濃度勾配溶出操作を行い、各フラクション（各１５
ｍ）を上記薄層クロマトグラフィーにより検出した。こ
の［ｘ−Ａｓｌ溶出区分を濃縮乾固して３８にの粗粉末
を得た。さらに精製するためこの粗粉末３００ｍｇをダ
ウエックスｌ　Ｘ　２　（ＯＨ−型）８ｓａＸ３００ｓ
＋ｍのカラムにチャージし水で溶出する。

溶出されてきたローＡｓ１区分を上記シリカゲル薄層ク
ロマトグラフィーで検出して集め、これを凍結乾燥して
２４９■の純粋な目的化合物［Ｉ　　Ａｓ］の白色粉末
を得た。

この［Ｉ−ＡＳ］遊離塩基（凍結乾燥品）はつぎの理化
学的性質を示す。

■　塩基性の白色粉末（８０°Ｃ１８時間真空乾燥）■
　溶解性：水に極めて良く溶ける。メタノールとエタノ
ールには溶けに＜（、アセ トン、クロロホルム、ベンゼン、酢 酸エチル、酢酸ブチル、エーテル、 ｎ−ヘキサンなどの有機溶媒には不溶 である。

■　元素分析値（Ｃｚ。Ｈ４゜Ｎ、Ｏ□・Ｈ，０として
）ＨＮ 理論値（％”）　　４５．２Ｂ　　？、９８　１０．５
６実験値（％”）　　４５．３３　７．９３　１０．３
９■　融点　：１６′８〜１７０°Ｃ ■　旋光度：　（ｃｒ３Ｆ＋１６３．６°（Ｃ＝０．５
％、ｉｎ　ＨＩ３）■　紫外線吸収スペクトル二末端吸
収 ■　赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）　：第１図吸収極
大（ｃａｒ−’） １０４５．１１４５．１３６０．１４５０．１５９５．
１６３５．２９１０．３３７５ ■　ＮＭＲスペクトル（重水中）：特徴的ピーク１．３
８ｐｐｍ・・・−・−・３級４＃−Ｃ−メチル、２．７
２ｐｐｍ・・・−・・−３１−Ｎ−メチル、５、１３ｐ
ｐｍ−・−・−１＃−アノメリックプロトン、５．２８
ｐｐｍ　−−−−−−−４”−アノメリックプロトン ■　マススペクトル：主なイオンピーク（ｍ／ｅ）１１
０．１２５．１２６．１２Ｂ　、１３０．１４５．１４
６．１６２．１６３．１７４．１８９．１９０．１９１
．１９２．２０５．２３３．２４５．２４６．２６４．
２７５．３０６．３３４．３５２．３６２．３８８．４
４６．５１３（Ｍ　＋　１　） ［相］　薄層クロマトグラフィーによるＲｆ値：第５表
（末尾） 以上の理化学的性質特にマススペクトルに於ける典型的
なフラグメントイオンビークおよびＮＭＲの結果ならび
にＫＭ−Ａから誘導されることに基いて次式で示される
４＃−Ｃ−メチル−３１−Ｎ−メチルカナマイシンＡあ
るいはその４′のエピマーであると認められる。

実施例２ ミクロモノスポラｓｐ、　Ｋ　−６９９３−Ｙ　−４１
株による目的化合物［１−Ａ、］の製造 実施例１に示した第１回目のアンバーライトＣＧ５０（
ＮＨ４゜型）１．６２を充填したカラムを用いたアンモ
ニア水の濃度勾配溶出においてＨ−ＡＳ］とＫＭ−Ａに
続いて溶出されてきた目的化合物［１−Ａ、］（シリカ
ゲル薄層クロマトグラフィ、展開溶媒は第５表のＡ、Ｒ
ｆ値０．０７で検出）を含む溶出区分を濃縮して約１０
ｇの［１−Ａ４］の粗区分を得た。この粗区分を再びア
ンバーライトＣ（１，−５０（ＮＨ４”型）　　２５ｍ
ｍＸ１０００ｍのカラムに吸着させ、０．１規定のアン
モニア水５００ｄで洗浄した後、０．１規定アンモニア
水２１と０．８規定アンモニア水２１とで濃度勾配溶出
を行い、各フラクション（各１５ｄ）をシリカゲル薄層
クロマトグラフィー（展開溶媒は第５表のＢ、Ｒｆ値０
．２３）で検出して　［１−Ａ４１区分を集め、これを
濃縮乾固して５．０４ｇの［１−Ａ４］粗粉末を得た。

この粗粉末の３ｇをシリカゲルカラム（ワコーゲルＣ−
２００）　２０　ｍ＊Ｘ５００　ｍに付し展開溶媒（第
５表のＡ）で溶出分画し、その各フラクションをシリカ
ゲル薄層クロマトグラフィー（展開溶媒は第５表のＢ）
で検出して［ｔ−Ａ４１区分を集め濃縮乾固して、２．
７４　ｇの粗粉末を得た。この粗粉末を更にアンバーラ
イトＣＧ−５０（ＮＨ４”型）１０閤Ｘ５００ａｌカラ
ムに吸着させ、水１２と０．８規定アンモニア水１１と
で濃度勾配溶出操作を行い、各フラクション（各１５ｄ
）をシリカゲルクロマトグラフィー（展開溶媒は第５表
のＢ）で検出し、［１−Ａａ］区分を集め約２ｄまで濃
縮した。この濃縮液をダウエックスＩ　Ｘ　２　（ＯＨ
−型）１０ｍｍＸ５００１ＩＩｌＯカラムにチャージし
、水で溶出した。溶出されてきた［１−Ａ４１区分をシ
リカゲル薄層クロマトグラフィー（展開溶媒は第５表の
Ｂ）で検出して集め、凍結乾燥して８８７■の純粋な［
Ｉ−・Ａｎ］の白色粉末を得た。

この［Ｉ　　Ａ４］遊離塩基（凍結乾燥品）はつぎの理
化学的性質を示す。

■　塩基性の白色粉末（８０℃１８時間真空乾燥）■　
溶解性：水に極めて良く溶ける。メタノールとエタノー
ルには溶けに＜＜、アセ トン、クロロホルム、ベンゼン、酢 酸エチル、酢酸ブチル、エーテル、 ｎ−ヘキサンなどの有機溶媒には不溶 である。

■　元素分析値（Ｃｒ　＊　Ｈ３ｓ　Ｎ　４０゜・０．
５Ｈ，０として） ＣＨＮ 理論値（％”）　　４４．９６　７．７４　１１．０４
実験値（％）　　４４．８１　　？、８５　１０．７０
■　紫外線吸収スペクトル：末端吸収 ■　赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：第２図吸収極大
（ｃｍ−’） １０３５．１１４５．１３６０．１４５５．１４７５．
１５９５．２９１０．３３５０ ■　ＮＭＲスペクトル（重水中）：特徴的ピーク２．４
９ｐｐ園−３’−Ｎ−メチル、５．０５９Ｉ）１１−’
１　’−アノメリックプロトン、５、３７９ｐ腸−１′
−アノメリンクプロトン ■　マススペクトルによる質量数：　４９９（Ｍ　＋　
１　）■　薄層クロマトグラフィーによるＲｆ値：第５
表以上の理化学的性質特にマススペクトルおよびＮＭＲ
の結果ならびにＫＭ−Ａから誘導されることに基いて既
知の物質である次式で示される３′−Ｎ−メチルカナマ
イシンＡであると認められる。

実施例３ ミクロモノスポラｓｐ、　Ｋ　−６９９３−Ｙ　−４１
株による目的化合物［ｌ−Ｂｓ１の製造 デキストリン５％、脱脂大豆粉ニスサンミート特級３．
５％、炭酸カルシウム０．７％を含む液体培地（ｐＨ７
，５）　１００ｄを５００ｊｄフラスコに分注し、滅菌
する。そのフラスコにベネット斜面寒天培地に３０°Ｃ
で２週間培養して良く生育させたミクロモノスポラｓｐ
、　Ｋ　−６９９３−Ｙ　−４１株を一白金耳接種し、
２９°Ｃで４８〜７２時間振盪して種母培養液を得た。

別に５００　ｄフラスコに１００　ａｄの本培養培地を
調製し、それ−に上記種母培養液１ｄを植菌する０本培
養培地の組成は、デキストリン５％、脱脂大豆粉ニスサ
ンミート特級３．５％、炭酸カルシウム０．７％、塩化
コバルト０．００００２５％（ｐＨ７，５）であり、１
２０℃２０分間滅菌して使用する。植菌後２４時間目に
別に除菌したＫＭ−Ｂを培地１ｄ当り３００ｍｃｇ　（
力価）添加した。添加後１２０時間２９℃で振盪培養を
行って１１０１の培養液を得た。この培養液を４規定塩
酸でｐＨ２，０に調整し菌体を濾別したのち垂の濾液を
４規定水酸化ナトリウムでｐＨ７，０に戻しアンバーラ
イトＩＲＣ−５０（ＮＨ，“型）７１のカラムに通し、
水洗後１規定のアンモニア水２１ｊ！で溶出し減圧濃縮
してアメ状の粗溶出物を得た。この粗溶出物を４等分し
てアンバーライトＣＧ−５０（Ｎ１１４゜型）　９００
ｗ１を充填したカラム４本にそれぞれ吸着させ、樹脂を
よく水洗した後、各カラムについて水３．５２と０．８
規定アンモニア水３．５２とを用いた濃度勾配分画溶出
操作を行い、各フラクション（各１５ｄ）を実施例１と
同様にシリカゲル薄層クロマトグラフィー（Ｒｆ値０．
２６）で検出して、それぞれのカラム［Ｉ−Ｂ１１に先
行して溶出されてくる　［Ｉ−８２１区分を集め濃縮乾
固して５２０■の［ｌ−Ｂ１１の粗粉末を得た。

この粗粉末を１３ｄのメタノールに溶解し不溶物を濾別
した後にＭ３ｄまで濃縮した。この濃縮液に０．１規定
の硫酸のメタノール溶液を徐々に加えｐＨ４，０に調整
すると白色沈澱を生じた。更に確実に沈澱させるために
アセトンを加えた後にこの白色の沈澱を濾取し真空乾燥
して７４９■の（ｉ−８３］の硫酸塩を得た。この硫酸
塩をダウエックスｌ×２（ＯＨ−型）　　１０ｍＸ５０
０　ｍカラムにチャージし水で溶出する。溶出されてき
た［Ｉ　　Ｂｚ１区分を上記と同様にシリカゲル薄層ク
ロマトグラフィーで確認し、この溶出区分、を集め濃縮
乾固して［ｌ−８３］の白色粉末を２８４■得た。さら
に純粋にするためにこの白色粉末をアンバーライトｃｃ
−ｓ。

（ＮＬ”型）　１３ｍｍｘ２５Ｏｔｒｍカラムに吸着さ
せ、水２００　ＩＩｉと０．８規定アンモニア水２００
１１１とで濃度勾配溶出操作を行い、各フラクション（
各３ｍ）を上記シリカゲル薄層クロマトグラフィーでＦ
ｉｆ１認し［Ｉ　　Ｂｓ１区分を集め凍結乾燥して純粋
な［ＩＢ２］の白色粉末を９８■得た。

この［Ｉ　　Ｂｓｌ遊離塩基（凍結乾燥品）はつぎの理
化学的性質を示す。

■　塩基性の白色粉末（８０°Ｃ１８時間真空乾燥）■
　溶解性：水に極めて良く溶け、メタノールにも溶ける
。

エタノールとアセトンにはやや溶け に＜（、クロロホルム、ベンゼン、 酢酸エチル、酢酸ブチル、エーテル、 ｎ−ヘキサンなどの有機溶剤には不 溶である。

■　元素分析値（Ｃ２゜Ｈ，、Ｎ、Ｏ，・０．５　Ｈｔ
。

として） ＨＮ 理論値（％）　　４９．１７　８．６６　１４．３３実
験値（％）　　４８．９５　８．５９　１４．３５■　
融点　：１１２〜１１６°Ｃ ■　旋光度：　（α）’＋１３４．８　’　（Ｃ＝　１
％、ｉｎ　ＨＩＯ）■　紫外線吸収スペクトル二末端吸
収 ■　赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）　？第３図吸収極
大（ｃｍ−９ １０３５，１１１０，１１４０，１３３５，１３７５，
１４７５，１５６５，１６３０，２９２０，３４００■
　ＮＭＲスペクトル（重水中）：特徴的ピーク２．５１
ｐｐｍ−３’　−Ｎ−メチル、２．６０ｐｐｍ・・−６
’−Ｎ−メチル、５．Ｏ７ｐｐｍ−・−１１−アノメリ
ックプロトン、 ５．３８ｐｐ＋ｗ・−１′−アノメリックプロトン ■　マススペクトル：主なイオンピーク（ｍ／ｅ）１１
０．１１２．１１４．１２５．１２６．１３０．１３４
．１４２．１４３．１４４．１４５．１５Ｂ　、１６３
．１７６．１９１．２７２　、３０５．３２０．３３Ｂ
　、３６６．４４９　、４７９．４８０　　（Ｍ＋１　
）［相］　薄層クロマトグラフィーによるＲｆ値：第５
表以上の理化学的性質特にマススペクトルに於ける典型
的なフラグメントイオンピークおよびＮＭＲの結果なら
びにＫＭ−Ｂから誘導されることに基いて次式で示され
る３　’、　４　’−ジデオキシー３＃−μｍメチル−
６’−Ｎ−メチルカナマイシンＢであると認められる。

寛流側４ ミクロモノスポラｓｐ、　Ｋ　−６９９３−Ｙ　−４１
株による目的化合物（ｒ−Ｂａｊの製造 実施例３の第１回目のアンバーライトＣＧ−５０（ＮＨ
４”型）カラムを用いたアンモニア水の濃度勾配溶出に
おいて［１−Ｂ１１に続いて溶出されてきた［１−Ｂ、
］区分（シリカゲル薄層クロマトグライー、展開溶媒第
５表のＡ、Ｒｆ値０．１９で検出）を集め、濃縮して８
５■の［ｌ−８４］の粗粉末を得た。この粗粉末を０．
５　ｄの水に溶解してシリカゲルプレート（メルク社製
、キーゼルゲルＫｉｅｓｅ１ｇｅ１６０ＰＦ□４　（商
品名）厚さ０．３　ｅｒｔａ、２０ｃｍＸ２０ｃｔａ、
　１５０°Ｃ活性化）３枚に帯状にチャージして展開溶
媒（第５表のＡ）で展開した。展開後ニンヒドリン発色
で目的化合物の位置を確認してから、その位置をシリカ
ゲルごとかき取り、同じ展開溶媒でシリカゲルから溶出
した。この溶出液を減圧濃縮乾固して５６■の粗粉末を
得た。この粗粉末を更に精製するために２ｄのメタノー
ルに溶解し０、１規定の硫酸のメタノール溶液でｐＨ４
，０に調整し、アセトンを加えて生じた白色沈澱を濾取
し真空乾燥して９５■の［Ｉ−Ｂ、］の硫酸塩を得た。

この硫酸塩をダウエックス１　ｘ　２　（ＯＲ−型）８
ｍｍＸ　３００■カラムにチャージし水で溶出して、溶
出されてきた［１−Ｂ、］区分を上記シリカゲル薄層ク
ロマトグラフィーで確認して集め濃縮した。この濃縮液
をアンバーライトＣＧ−５０（ＮＨ４”型）８ｆｆｉｌ
Ｘ１８０ｍカラムに吸着させ水２００　ａｄと０．８規
定アンモニア水２００　ｄとで濃度勾配溶出操作を行い
、各フラクション（各２．５ｄ）を上記シリカゲル薄層
クロマトグラフィーで確認して［Ｉ−Ｂ４］区分を集め
凍結乾燥して純粋な［１−８４］の白色粉末を５２■得
た。

この［１−８４］遊離塩基（凍結乾燥品）はつぎの理化
学的性質を示す。

■　塩基性の白色粉末（８０°Ｃ１８時間真空乾燥）■
　熔解性：水に極めて良く溶け、メタノールにも溶ける
。エタノールとアセトンに はやや溶けにくく、クロロホルム、 ベンゼン、酢酸エチル、酢酸ブチル、 エーテル、ｎ−ヘキサンなどの有機 溶剤には不溶である。

■　元素分析値（ＣＩｌＨ３゜Ｎ、０．・０．５　Ｈ２
Ｏとして） ＨＮ 理論値（％’）　　４８．０９　８．５０　１４．７６
実験値（％）　　４８．１０　８．４９　１４．３７■
　融点　：２０４〜２０８°Ｃ（褐変）■　旋光度：〔
α〕ｒ＋ｒ３ｘ、１°（Ｃ＝１％、ｉｎ　ＨｚＯ）■　
紫外線吸収スペクトル：末端吸収 ■　赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）　：第４図吸収極
大（ｃｍ−’） １０３５．１１１０．１１４０．１３３５．１３８０．
１４８０、１５６５．１６３０　２９２０．３４００■
　ＮＭＲスペクトル（重水中）： ２．４８ｐｐｍ−３５−Ｎ−メチル、５，０６ｐＩ）Ｉ
ｆ　−’　１　’−アノメリックプロトン、５．２５ｐ
ｐ■・・−１′〜アノメリツクプロトン ■　マススペクトル：主なイオンピーク（ｍ／ｅ）１１
２．１２６．１３０．１４５．１５８．１６３．１７６
．１９１．２４２．２４６．２５Ｂ　、２７３．３０２
．３０５．３２０．３３Ｂ　、３６６．４２９　、４３
８．４６５．４６６　　（Ｍ＋１） ［相］　薄層クロマトグラフィーによるＲｆ値：第５表 以上の理化学的性質特にマススペクトルに於ける典型的
なフラグメントイオンピークおよびＮＭＲの結果ならび
にＫＭ−Ｂから誘導されることに基いて次式で示される
３　’、　４　’−ジデオキシー３＃−Ｎ−メチルカナ
マイシンＢであると認められる。

実施例５ ミクロモノスポラｓｐ、　Ｋ　−６９９３−Ｙ　−４１
株による目的化合物［ｌ−Ｂ１１の製造 培養方法、培地、ＫＭ−Ｂの添加方法等は実施例３と同
様に行って３８Ｉｌの培養液を得た。この得られた培養
液を４規定塩酸でＰＩＪ２．０に調整し、菌体を濾別し
たのち、その濾液を４規定水酸化ナトリウムでｐＨ７，
０に戻しアンバーライトＩＲＣ−５０（ＮＨ，”型）２
．４ｆのカラムに通し、水洗後１規定のアンモニア水７
．５２で溶出し減圧濃縮乾固して１７．４　ｇの粗溶出
物を得た。この溶出物の９．３ｇをアンバーライトＣＧ
−５０（ＮＨ，”型）　８００　ｄを充填したカラムに
吸着させ樹脂をよく水洗した後、水４２と０．７規定の
アンモニア水４１とで濃度勾配溶出操作を行い各フラク
ション（各１５ｄ）を実施例１と同様にシリカゲルクロ
マトグラフィー（Ｒｆ値０．０６）で検出して、溶出さ
れてくる　［１−８５１区分を集め濃縮乾固して６４９
■の［１−ＢＳ］の粗粉末を得た。この粗粉末を再びア
ンバーライトＣＧ−５０（ＮＨ，”型）１０■Ｘ５００
　ｔｍカラムに吸着させ水３００　ｄと０．５規定アン
モニア水３００ｄとで濃度勾配溶出操作を行い、上記と
同様にシリカゲル薄層クロマトグラフィーで検出して［
１−８５１区分を集め凍結乾燥して４７７■の［Ｉ　　
Ｂｓｌの粗粉末を得た。この粗粉末の１６１■をシリカ
ゲル（ワコーゲルＣ−２００）　　１０ｍＸ５００　ｍ
カラムに付し展開溶媒（第５表のＢ）で溶出分画し各フ
ラクション（各１０ｍ）をシリカゲル薄層クロマトグラ
フィー（展開溶媒は第５表のＢ、Ｒｆ値０．２６）で検
出した。溶出してきた［Ｉ　　Ｂｓ１区分を濃縮乾固し
て［１−ＢＳ］の白色粉末を得た。この粉末をアンバー
ライトＣＧ　　５０　　（ＮＨ４゜型）１０ｍｍｘｓｏ
ｏ　ＩＩＩカラムに吸着させ水１１と０．７規定アンモ
ニア水ｌＩｌとで濃度勾配溶出操作を行い、シリカゲル
薄層クロマトグラフィー（展開溶媒は第５表のＢ）で溶
出して、溶出されてきた［ｌ−Ｂｓ１区分を集め約２ｄ
に減圧濃縮した。この濃縮液をダウエックスＩ　Ｘ　２
　（ＯＨ−型）　６ｇｗａＸ１７０　ｍカラムにチャー
ジし水で溶出し、溶出されてきた［１−８５１区分をシ
リカゲル薄層クロマトグラフィー（展開溶媒第５表のＢ
）で確認し、この溶出区分を集め凍結乾燥して純粋な［
１−ＢＳ］の白色粉末を１１６■得た。

この［１−ＢＳ］遊離塩基（凍結乾燥品）はつぎの理化
学的性質を示す。

■　塩基性の白色粉末（８０’Ｃ１Ｂ時間真空乾燥）■
　溶解性：水に極めて良く溶ける。メタノールとエタノ
ールには溶けにくく、アセトン、クロロホルム、ベンゼ
ン、酢酸エチル、酢酸ブチル　エーテル、ｎ−ヘキサン などの有機溶剤には不溶である。

■　元素分析値（ＣＩ　９　Ｈｚ　９　Ｎ　ｓ　Ｏ＋　
ｏ　’　Ｈｔ　Ｏとして）ＨＮ 理論値（％）　　４４．２６　　Ｂ、０２　１３．５Ｂ
実験値（％）　　４４．５２　７．８７　１３．６８■
　紫外線吸収スペクトル：末端吸収 ■　赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）　：第５図吸収極
大（ｃｍ−’） １０３５．１１５０．１３６０．１４５０．１４８０．
１６００．１６４０．２９１０　３３７５■　ＮＭＲス
ペクトル（重水中）：特徴的ピーク２．４７ｐｐｍ−・
−３“−Ｎ−メチル、５．０６ｐｐａａ・・−１１−ア
ノメックプロトン、５．３４ｐｐ＋ｍ−・・１′−アノ
メリックプロトン ■　マススペクトルによる質量数：４９８　　（Ｍ＋１
）■　薄層クロマトグラフィーによるＲｆ値：第５表 以上の理化学的性質、特にマススペクトルおよびＮＭＲ
の結果ならびにＫＭ−Ｂから誘導されることに基いて次
式で示される既知の３″−Ｎ−メチルカナマイシンＢで
あると認められる。

なお、上記実施例で得られた目的化合物［１−Ａ＊］、
　［１−Ａ４］　、　［１−８３］　、　［ｌ−８４］
および［１−ＢＳ］の薄層のクロマトグラフィーによる
Ｒｆ値を既知のアミノグリコシド抗生物質と対比して示
す。

第 表

【図面の簡単な説明】

第１図から第５図はそれぞれ本発明の目的化合物　　［
１−Ａｌ１．　　［１−Ａａｌ　　、　　［１−８３１
。 ［１−Ｂ、］および［Ｉ　　Ｂｓｌの赤外線吸収スペク
トルを示す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）カナマイシンＡ又はカナマイシンＢをミクロモノ
   スポラ属に属するゲンタミシン生産菌株又はその変異株
   と接触させることを特徴とする一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿１およびＲ′＿４はメチル基又は水素原子
   を、Ｒ′＿２は水酸基又は水素原子を意味し、またＲ＿
   ３はアミノ基又は水酸基を意味する。但し、Ｒ′＿２が
   水酸基のときは、Ｒ＿１は水素原子を、Ｒ′＿２が水素
   原子のときはＲ′＿４は水素原子を意味する。） で示されるアミノグリコシド化合物又はこれの酸付加塩
   の製造法。
2. （２）ミクロモノスポラ属に属するゲンタミシン生産菌
   株またはその変異株がミクロモノスポラｓｐ．Ｋ−６９
   ９３−Ｙ−４１株およびミクロモノスポラエキノスポラ
   ＮＲＲＬ．２９８５−Ｎ−６株である特許請求の範囲第
   （１）項記載の製造法。