JPH0342078B2 - - Google Patents

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JPH0342078B2
JPH0342078B2 JP29311989A JP29311989A JPH0342078B2 JP H0342078 B2 JPH0342078 B2 JP H0342078B2 JP 29311989 A JP29311989 A JP 29311989A JP 29311989 A JP29311989 A JP 29311989A JP H0342078 B2 JPH0342078 B2 JP H0342078B2
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  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
本発明は、カナマイシンＡまたはカナマイシン
Ｂを原料とする一般式 （式中、R1およびR′4はメチル基又は水素原子
を、R′2は水酸基又は水素原子を意味し、またR3
はアミノ基又は水酸基を意味する。但し、R′2が
水酸基のときは、R1は水素原子を、 R′2が水素原子のときはR′4は水素原子を意味す
る。） で示されるアミノグリコシド化合物又はこれの酸
付加塩の製造法に関する。 上記一般式〔〕に包合される化合物のうち
3″−Ｎ−メチルカナマイシンＡ（R1＝Ｈ，R′2＝
OH，R3＝OH，R4＝Ｈ）および3″−Ｎ−メチル
カナマイシンＢ（R1＝Ｈ，R′2＝OH，R3＝NH2，
‖4＝Ｈ）は公知の化合物であるがこれらの化合
物は従来化学的な合成法によつて製造された。本
発明は上記一般式〔〕の化合物を微生物を用い
る発酵法によつて製造する点に特色がある。 本発明によつて提供される化合物化合物〔〕
はすぐれた抗菌活性を示し、抗菌剤として有望で
ある。また化合物〔〕はこれを原料として各種
の誘導体を製造することが出来る。そのような誘
導体としては１位のアミノ基をＬ（−）−γ−アミ
ノ−α−ヒドロキシ酪酸により化学的合成手段に
よりアシル化した化合物を挙げることができる。
又他の有意な抗菌活性を有する誘導体として微生
物変換による方法で製造される種々の化合物を挙
げることができる。そのような化合物としては化
合物〔〕をミクロモノスポラ属に属するゲンタ
ミシン生産菌株およびシソミシン生産菌株又はそ
れらの変異株と接触させることにより得られるも
のであつて、たとえば １ 3′，4′−ジデオキシ−3″−Ｎ−メチル−4″−
Ｃ−メチル−6′−Ｎ−メチルカナマイシンＢ
あるいはその4″のエピマー〔−B1〕 ２ 3′，4′−ジデオキシ−3″−Ｎ−メチル−4″−
Ｃ−メチルカナマイシンＢあるいはその4″の
エピマー〔−B2〕 ３ 3′，4′−ジデオキシ−3″−Ｎ−メチル−4″−
Ｃ−メチルカナマイシンＡあるいはその4″の
エピマー〔−A2〕 ４ 4′，5′−ジデヒドロ−3′，4′−ジデオキシ−
3″−Ｎ−メチル−4″−Ｃ−メチルカナマイシ
ンＡあるいはその4″のエピマー〔−SK−
A1〕 ５ 4′，5′−ジデヒドロ−3′，4′−ジデオキシ−
3″−Ｎ−メチル−4″−Ｃ−メチルカナマイシ
ンＢあるいはその4″のエピマー〔−SK−
B1〕 ６ 4′，5′−ジデヒドロ−3′，4′−ジデオキシ−
3″−Ｎ−メチルカナマイシンＢ〔−SK−
B2〕 をあげることが出来る。これら誘導体は本発明者
らの先願に係る特開昭54−98741号公報および特
開昭55−115896号公報に記載されている。 つぎに化合物〔〕の抗菌活性をカナマイシン
Ａ（以下KM−Ａと略記する）およびカナマイシ
ンＢ（以下KM−Ｂと略記する）と対比して表示
すると次の通りである。
【表】 上表から明らかなように、化合物〔〕は種々
のグラム陽性細菌及びグラム陰性細菌に対し、広
範囲でかつ強力な抗菌活性を有し、医薬品として
有用である。 本発明によれば、化合物〔〕は、KM−Ａま
たはKM−Ｂを、ミクロモノスポラ属に属し、
KM−ＡまたはKM−Ｂを一般式〔〕で示され
るアミノグリコシド化合物又はこれらの酸付加塩
に変換する能力を有する微生物（以下、アミノグ
リコシド化合物生産菌株という）と接触させるこ
とによつて製造される。 この製造法で使用される菌株はKM−Ａおよび
KM−Ｂの3′位、4′位のデオキシ化と4″位のＣ−
メチル化と6′位のＮ−メチル化のそれぞれを場合
によつては行い、3″位をＮ−メチル化しうるもの
であれば特に制限はない。そのような菌株として
はたとえばミクロモノスポラ エスキノスポラ
NRRL・2985（IFO−13149）、ミクロモノスポラ
プルプレアNRRL・2953（IFO−13150）など公
知の菌株のほか、ミクロモノスポラ属の新菌株で
あるミクロモノスポラsp.K−6993株をあげるこ
とが出来る。このミクロモノスポラsp.K−6993
株は、本発明者らが沖縄県石垣島の土壌よりあら
たに分離した菌株で、ゲンタミシンを生産するこ
とが確認されている。 また、変異株はミクロモノスポラ属に属するア
ミノグリコシド化合物生産菌株を、たとえば紫外
線照射、コバルト60照射、Ｘ線照射のほか、ニト
ロソ化合物、アクリジン色素化合物、核酸塩基類
似物質等の変異誘発剤を用いる通常の人工変異手
段で得られるものである。好適な変異株として
は、ゲンタミシン生産能が無いかもしくは極端に
生産能が低下して、かつ、さきにのべたKM−Ａ
およびKM−Ｂをデオキシ化、メチル化出来る性
質をもつものである。それら変異株の代表例は本
発明者らがあらたに取得した、ミクロモノスポラ
sp.K−6993−Ｙ−41株およびミクロモノスポラ
エキノスポラNRRL・2985−Ｎ−６株をあげ
ることができる。 つぎに、ミクロモノスポラsp.K−6993（以下Ｋ
−6993と略記する）とその変異株であるミクロモ
ノスポラsp.K−6993−Ｙ−41（以下Ｙ−41と略記
する）およびミクロモノスポラ エキノスポラ
NRRL・2985−Ｎ−６株（以下Ｎ−６と略記す
る）の３株についてその菌学的性状を記載する。 なお、これらの菌株は、夫々微工研菌寄第4304
号、同4305号および同4303号としていずれも工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。
又これらの菌株はアメリカンタイプカルチユアコ
レクシヨンにそれぞれATCC第31348号、第31349
号および第31350号として寄託されている。 形態的性質 上記３株の形態的特徴は比較的似ている。３
株共、真性気中菌糸は作らないが、直径0.5〜
1.0μで分枝した基生菌糸を形成する。 胞子は基生菌糸から分枝した胞子柄の先端に
１ケのみ着生する。胞子の形は長円型か卵型で
ある。 ３株共、ツアペツク寒天、酵母エキス・麦芽
エキス寒天培地でよく発育し、卵アルブミン寒
天上では紫系の色を示す。Ｋ−6993及びＮ−６
株はミクロモノスポラ エキノスポラ
NRRL・2985（IFO−13149）と同様の形態的特
徴を示した。 Ｙ−41株は前記２株とくらべ、胞子の着生が
よくなく、発育の色調は全体的にやや薄い。 各種培地上での生育状態
【表】
【表】 炭素源の資化性 プリドハム・ゴツトリープ（Pridham−
Gottlieb）の培地を基礎培地として、各々の炭
素源を1.0％加えたもので、資化性を検し、そ
の結果を第２表に示す。
【表】 生理学的性質
【表】
【表】 第３表中ミルク、繊維素については、37℃で
１ケ月培養したのちの結果を示し、ゼラチンの
液化、硝酸還元、チロシナーゼの生成について
は29℃、２週間後の結果を示した。 Ｋ−6993株は真性気中菌糸を形成せず、基生菌
糸に単一の胞子を着生することから、ミクロモノ
スポラ属に属する菌株である。 すでに報告されている、ミクロモノスポラ属で
ゲンタミシンを生産する菌株としてはつぎのもの
がある。ミクロモノスポラ プレプレア
NRRL2953（Micromonospora purpurea）、ミク
ロモノスポラ エキノスポラ バリエタス エキ
ノスポラNRRL・2985（Micromonospora
echinospora var.echinospora）、ミクロモノスポ
ラ エキノスポラ バリエタス フエルギニア
NRRL 2995（Micromonospora echinospora
var.ferruginea）、ミクロモノスポラ エキノス
ポラ バリエタス パリダNRRL 2996
（Micromonospora echinospora var.pallida）
〔以上、アンチミクロビアル・エージエント・ア
ンド・ケモテラピー1963年116頁〜124頁
（Antimicrobial Agents and Chemotheraphy）
及び特公昭44−21934に記載〕ミクロモノスポラ
サガミエンシスMK−65（Micromonospora
sagamiensis）、ミクロモノスポラ サガミエン
シス バリエタス ノンレデユカンスMK−62
（Micromonospora sagamiensis var.
nonreducans）、ミクロモノスポラ サガミエン
シス バリエタス フラバMm−628
（Micromonospora sagamiensis var.flava）〔以
上、特公昭50−39155及び特公昭51−6755に記載〕
これら７株についての分類学上の特徴をＫ−6993
株と比較して、その相違点を第４表に掲載する。 この結果ミクロモノスポラ エキノスポラに近
い新菌株と考えられる。
【表】 つぎに、KM−Ａ及びKM−Ｂを化合物〔〕
に変換するには、KM−Ａ及びKM−Ｂを含む培
地中で、通常上記菌株を用いて培養すればよい。
本発明の培養においては通常の抗生物質生産のた
めの培養法が用いられる。培養のための栄養源と
してはいろいろなものが用いられる。炭素源とし
ては、ブドウ糖、澱粉、可溶性澱粉、デキストリ
ン、シヨ糖、糖蜜などが単独或いは組合せて用い
られるし、菌の資化性にもよるが、炭化水素、ア
ルコール類、有機酸、動植物油なども用いうる。
窒素源としては無機塩、例えば、塩化アンモニウ
ム、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウ
ム、硝酸ナトリウム等が、天然物窒素源として
は、大豆粉、脱脂大豆粉、綿実粕、グルテンミー
ル、コーンミール、ペプトン、肉エキス、酵母エ
キス、乾燥酵母、コーン・スチープ・リカー等が
単独或いは組合せて用いられる。その他に必要に
応じて、アミノ酸類、核酸類、ビタミン類、塩化
ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸塩、硫酸マ
グネシウム、塩化コバルトなどの無機塩類も加え
ることができる。 培養方法としては、液体培養法とくに深部撹拌
方式による方法が適している。培養温度は25℃か
ら45℃、好ましくは、28℃から32℃で、PHは中性
附近がよい。又、培地の液性、添加物の量、温
度、撹拌数、通気量などの培養条件は用いる菌株
などに応じて適宜選択されなければならないこと
はいうまでもない。化合物〔〕を得るため、原
料のKM−Ａ及びKM−Ｂの添加時期は培養開始
時でもよいし、また、培養開始後菌が発育した後
でもよいが培養開始後72時間頃までに行うのが望
ましい。添加量は0.1g〜10g／程度で一度に加
えてもよいが分割して加えてもよい。また、KM
−ＡおよびKM−Ｂはそのままの形でもよいが、
塩例えば硫酸塩でもよい。KM−ＡまたはKM−
Ｂとの接触時間は原料添加後、化合物〔〕が最
も多く蓄積される時間が選択される。 これは、たとえば大腸菌Ｋ−12 ML−1629を
試験菌として、培養液中の化合物の量をペーパー
デイスク法を用いることによつて追跡できるが、
通常原料添加後３〜７日である。 化合物〔〕の採取法は、その培養液からの単
離、精製も含めて、通常アミノグリコシド抗生物
質の採取に利用される方法が用いられる。すなわ
ち、カチオンおよびアニオン交換樹脂による吸脱
着法、活性炭による吸脱着法、セルロースのカラ
ムクロマトグラフイーによる吸脱着法、シリカゲ
ルカラムクロマトグラフイーなどの方法を適当に
組合せて用いることができる。具体的には、例え
ば培養液のPHを２ないし３に調整したのち、濾過
して菌体を除き、PHを６〜７に中和しこの構造を
有する物質の吸着、溶離に適切なカルボン酸、ス
ルホン酸等の基を有する樹脂たとえばカチオン交
換樹脂であるアンバーライトIRC−50（商品名）
（NH4 +型）、ダウエツクス50W（商品名）（NH4 +
型）に吸着させ、１規定のアンモニア水で溶出す
る。この溶出液を減圧濃縮して、アンバーライト
CG−50（商品名）（NH4 +型）でアンモニア水を
用いた濃度勾配によるイオン交換クロマトグラフ
イーを行う。これら化合物〔〕をさらに分離精
製するには、たとえば、シリカゲルカラムクロマ
トグラフイーを用い、また必要があればアンバー
ライトCG−50（NH4 +型）およびダウエツクス１
×２（商品名）（OH-型）等によるカラムクロマ
トグラフイーをくり返して行う事も出来る。 上記の方法で得られた化合物〔〕の代表的な
ものをあげると次の通りである。 4″−Ｃ−メチル−3″−Ｎ−メチルカナマイシン
Ａあるいはその4″のエピマー〔−A3〕 3″−Ｎ−メチル−カナマイシンＡ〔−A4〕3′，
4′−ジデオキシ−3″−Ｎ−メチル−6′−Ｎ−メチ
ルカナマイシンＢ〔−B3〕 3′，4′−ジデオキシ−3″−Ｎ−メチル−カナマ
イシンＢ〔−B4〕 3″−Ｎ−メチル−カナマイシンＢ〔−B4〕 塩基性である本化合物〔〕は無機酸又は有機
酸例えば塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、ステアリン
酸、プロピオン酸、酒石酸、マレイン酸等と無毒
の塩を容易に形成する。 つぎに実施例により本発明の製造法をさらに説
明する。 実施例 １ ミクロモノスポラsp.K−6993−Ｙ−41株によ
る目的化合物〔−A3〕の製造 デキストリン５％、脱脂大豆粉エスサンミート
特級（商品名）3.5％、炭酸カルシウム0.7％を含
む液体培地（PH7.5）100mlを500mlのフラスコに
分注し、滅菌する。そのフラスコにベネツト斜面
寒天培地に30℃で２週間培養して良く生育させた
ミクロモノスポラsp.K−6993−Ｙ−41株を一白
金耳接種し29℃で48〜72時間振盪して種母培養液
を得た。 別に500mlフラスコに100mlの本培養培地を調製
し、それに上記種母培養液１mlを植菌する。この
本培養培地の組成は、デキストリン５％、脱脂大
豆粉エスサンミート特級3.5％、炭酸カルシウム
0.7％、塩化コバルト0.000025％（PH7.5）であり、
オートクレーブで120℃20分間滅菌して使用する。
植菌後24時間目に別に除菌したKM−Ａを培地１
ml当り、1000mcg（力価）添加した。添加後120時
間29℃で振盪培養を行つて得られたフラスコ600
本分の培養液60を４規定の塩酸でPH2.0に調整
したのちに菌体を濾別した。濾液を４規定の水酸
化ナトリウムでPH7.0に再調整し、アンバーライ
トIRC−50（NH4 +型）４を充填したカラムを通
過させ目的化合物〔−A3〕を吸着させた。樹
脂を充分に水洗して１規定のアンモニア水12で
溶出し、溶出液を減圧濃縮後乾燥して粗溶出物を
得た。この粗溶出物をアンバーライトCG−50
（NH4 +型）1.6を充填したカラムに吸着させ、
樹脂を水洗したのち、水７と0.7規定のアンモ
ニア水７を用いた濃度勾配溶出操作を行い、各
フラクシヨン（各15ml）を大腸菌Ｋ−12を試験菌
としたペーパーデイスク法及びシリカゲル薄層ク
ロマトグラフイー（メルク社製、キーゼルゲル
Kieselgel 60F254（商品名）厚さ0.25mm、展開溶媒
（第５表のＡ）で２時間展開後ニンヒドリン発色
Rf値0.11）により検出する。目的化合物〔−
A3〕区分は添加したKM−Ａと共に化合物〔
−A4〕に先行して溶出されてくる。この溶出液
を濃縮乾固して得た〔−A3〕の粗区分をシリ
カゲルカラム〔ワコーゲルＣ−200（商品名）〕20
mm×1200mmに付し、展開溶媒（第５表のＡ）で溶
出分画し、上記と同様にシリカゲル薄層クロマト
グラフイーで検出し、〔−A3〕の含まれる区分
を集め、濃縮乾固して〔−A3〕の粗区分の2g
を得た。この粗区分にはまだKM−Ａも含まれて
いるのでこれを除くために再びシリカゲルカラム
（ワコーゲルＣ−200）20mm×1000mmに付し、上記
シリカゲルカラムクロマトグラフイーと同様の展
開溶媒で溶出分画して、上記シリカゲル薄層クロ
マトグラフイーで検出する。溶出してきた〔−
A3〕区分を集め減圧濃縮後乾燥して〔−A3〕
の白色粗粉末を462mg得た。この粗粉末をアンバ
ーライトCG−50（NH4 +型）20mm×500mmカラム
に吸着させ水１と0.7規定アンモニア水１と
で濃度勾配溶出操作を行い、各フラクシヨン（各
15ml）を上記薄層クロマトグラフイーにより検出
した。この〔−A3〕溶出区分を濃縮乾固して
388mgの粗粉末を得た。さらに精製するためこの
粗粉末300mgをダウエツクス１×２（OH-型）８
mm×300mmのカラムにチヤージし水で溶出する。
溶出されてきた〔−A3〕区分を上記シリカゲ
ル薄層クロマトグラフイーで検出して集め、これ
を凍結乾燥して249mgの純粋な目的化合物〔−
A3〕の白色粉末を得た。 この〔−A3〕遊離塩基（凍結乾燥品）はつ
ぎの理化学的性質を示す。 塩基性の白色粉末（80℃18時間真空乾燥） 溶解性：水に極めて良く溶ける。メタノール
とエタノールには溶けにくく、アセ
トン、クロロホルム、ベンゼン、酢
酸エチル、酢酸ブチル、エーテル、
ｎ−ヘキサンなどの有機溶媒には不
溶である。 元素分析値（C20H40N4O11・H2Oとして） Ｃ Ｈ Ｎ 理論値（％） 45.28 7.98 10.56 実験値（％） 45.33 7.93 10.39 融点 ：168〜170℃ 施光度：〔α〕25 D＋163.6゜（Ｃ＝0.5％、in H2O
） 紫外線吸収スペクトル：末端吸収 赤外線吸収スペクトル（KBr）：第１図 吸収極大（cm-1） 1045，1145，1360，1450，1595，
1635，2910，3375 NMRスペクトル（重水中）：特徴的ピーク 1.38ppm……３級4″−Ｃ−メチル、
2.72ppm……3″−Ｎ−メチル、 5.13ppm……1″−アノメリツクプロ
トン、5.28ppm……1′−アノメリツ
クプロトン マススペクトル：主なイオンピーク（ｍ／
ｅ） 110，125，126，128，130，145，
146，162，163，174，189，190，
191，192，205，233，245，246，
264，275，306，334，352，362，
388，446，513（Ｍ＋１） 薄層クロマトグラフイーによるRf値：第５
表（末尾） 以上の理化学的性質特にマススペクトルに於け
る典型的なフラグメントイオンピークおよび
NMRの結果ならびにKM−Ａから誘導されるこ
とに基いて次式で示される4″−Ｃ−メチル−3″−
Ｎ−メチルカナマイシンＡあるいはその4″のエピ
マーであると認められる。 実施例 ２ ミクロモノスポラsp.K−6993−Ｙ−41株によ
る目的化合物〔−A4〕の製造 実施例１に示した第１回目のアンバーライト
CG−50（NH4 +型）1.6を充填したカラムを用い
たアンモニア水の濃度勾配溶出において〔−
A3〕とKM−Ａに続いて溶出されてきた目的化
合物〔−A4〕（シリカゲル薄層クロマトグラフ
イー、展開溶媒は第５表のＡ，Rf値0.07で検出）
を含む溶出区分を濃縮して約10gの〔−A4〕の
粗区分を得た。この粗区分を再びアンバーライト
CG−50（NH4 +型）25mm×1000mmのカラムに吸着
させ、0.1規定のアンモニア水500mlで洗浄した
後、0.1規定アンモニア水２と0.8規定アンモニ
ア水２とで濃度勾配溶出を行い、各フラクシヨ
ン（各15ml）をシリカゲル薄層クロマトグラフイ
ー（展開溶媒は第５表のＢ，Rf値0.23）で検出し
て〔−A4〕区分を集め、これを濃縮乾固して
5.04gの〔−A4〕粗粉末を得た。この粗粉末の
3gをシリカゲルカラム（ワコーゲルＣ−200）20
mm×500mmに付し展開溶媒（第５表のＡ）で溶出
分画し、その各フラクシヨンをシリカゲル薄層ク
ロマトグラフイー（展開溶媒は第５表のＢ）で検
出して〔−A4〕区分を集め濃縮乾固して、
2.74gの粗粉末を得た。この粗粉末を更にアンバ
ーライトCG−50（NH4 +型）10mm×500mmカラム
に吸着させ、水１と0.8規定アンモニア水１
とで濃度勾配溶出操作を行い、各フラクシヨン
（各15ml）をシリカゲルクロマトグラフイー（展
開溶媒は第５表のＢ）で検出し、〔−A4〕区分
を集め約２mlまで濃縮した。この濃縮液をダウエ
ツクス１×２（OH-型）10mm×500mmのカラムに
チヤージし、水で溶出した。溶出されてきた〔
−A4〕区分をシリカゲル薄層クロマトグラフイ
ー（展開溶媒は第５表のＢ）で検出して集め、凍
結乾燥して887mgの純粋な〔−A4〕の白色粉末
を得た。 この〔−A4〕遊離塩基（凍結乾燥品）はつ
ぎの理化学的性質を示す。 塩基性の白色粉末（80℃18時間真空乾燥） 溶解性：水に極めて良く溶ける。メタノール
とエタノールには溶けにくく、アセ
トン、クロロホルム、ベンゼン、酢
酸エチル、酢酸ブチル、エーテル、
ｎ−ヘキサンなどの有機溶媒には不
溶である。 元素分析値（C19H38N4O11・0.5H2Oとして） Ｃ Ｈ Ｎ 理論値（％） 44.96 7.74 11.04 実験値（％） 44.81 7.85 10.70 紫外線吸収スペクトル：末端吸収 赤外線吸収スペクトル（KBr）：第２図 吸収極大（cm-1） 1035，1145，1360，1455，1475，
1595，2910，3350 NMRスペクトル（重水中）：特徴的ピーク 2.49ppm……3″−Ｎ−メチル、
5.05ppm……1″−アノメリツクプロ
トン、5.37ppm……1′−アノメリツ
クプロトン マススペクトルによる質量数：499（Ｍ＋１） 薄層クロマトグラフイーによるRf値：第５
表 以上の理化学的性質特にマススペクトルおよび
NMRの結果ならびにKM−Ａから誘導されるこ
とに基いて既知の物質である次式で示される3″−
Ｎ−メチルカナマイシンＡであると認められる。 実施例 ３ ミクロモノスポラsp.K−6993−Ｙ−41株によ
る目的化合物〔−B3〕の製造 デキストリン５％、脱脂大豆粉エスサンミート
特級3.5％、炭酸カルシウム0.7％を含む液体培地
（PH7.5）100mlを500mlフラスコに分注し、滅菌す
る。そのフラスコにベネツト斜面寒天培地に30℃
で２週間培養して良く生育させたミクロモノスポ
ラsp.K−6993−Ｙ−41株を一白金耳接種し、29
℃で48〜72時間振盪して種母培養液を得た。 別に500mlフラスコに100mlの本培養培地を調製
し、それに上記種母培養液１mlを植菌する。本培
養培地の組成は、デキストリン５％、脱脂大豆粉
エスサンミート特級3.5％、炭酸カルシウム0.7
％、塩化コバルト0.000025％（PH7.5）であり、
120℃20分間滅菌して使用する。植菌後24時間目
に別に除菌したKM−Ｂを培地１ml当り300mcg
（力価）添加した。添加後120時間29℃で振盪培養
を行つて110の培養液を得た。この培養液を４
規定塩酸でPH2.0に調整し菌体を濾別したのちそ
の濾液を４規定水酸化ナトリウムでPH7.0に戻し
アンバーライトIRC−50（NH4 +型）７のカラム
に通し、水洗後１規定のアンモニア水21で溶出
し減圧濃縮してアメ状の粗溶出物を得た。この粗
溶出物を４等分してアンバーライトCG−50
（NH4 +型）900mlを充填したカラム４本にそれぞ
れ吸着させ、樹脂をよく水洗した後、各カラムに
ついて水3.5と0.8規定アンモニア水3.5とを用
いた濃度勾配分画溶出操作を行い、各フラクシヨ
ン（各15ml）を実施例１と同様にシリカゲル薄層
クロマトグラフイー（Rf値0.26）で検出して、そ
れそれのカラム〔−B4〕に先行して溶出され
てくる〔−B3〕区分を集め濃縮乾固して520mg
の〔−B3〕の粗粉末を得た。この粗粉末を13
mlのメタノールに溶解し不溶物を濾別した後に約
３mlまで濃縮した。この濃縮液に0.1規定の硫酸
のメタノール溶液を徐々に加えPH4.0に調整する
と白色沈澱を生じた。更に確実に沈澱させるため
にアセトンを加えた後にこの白色の沈澱を濾取し
真空乾燥して749mgの〔−B3〕の硫酸塩を得
た。この硫酸塩をダウエツクス１×２（OH-型）
10mm×500mmカラムにチヤージし水で溶出する。
溶出されてきた〔−B3〕区分を上記と同様に
シリカゲル薄層クロマトグラフイーで確認し、こ
の溶出区分を集め濃縮乾固して〔−B3〕の白
色粉末を284mg得た。さらに純粋にするためにこ
の白色粉末をアンバーライトCG−50（NH4 +型）
13mm×250mmカラムに吸着させ、水200mlと0.8規
定アンモニア水200mlとで濃度勾配溶出操作を行
い、各フラクシヨン（各３ml）を上記シリカゲル
薄層クロマトグラフイーで確認し〔−B3〕区
分を集め凍結乾燥して純粋な〔−B3〕の白色
粉末を98mg得た。 この〔−B3〕遊離塩基（凍結乾燥品）はつ
ぎの理化学的性質を示す。 塩基性の白色粉末（80℃18時間真空乾燥） 溶解性：水に極めて良く溶け、メタノールに
も溶ける。 エタノールとアセトンにはやや溶け
にくく、クロロホルム、ベンゼン、
酢酸エチル、酢酸ブチル、エーテ
ル、ｎ−ヘキサンなどの有機溶剤に
は不溶である。 元素分析値（C20H41N5O8・0.5H2Oとして） Ｃ Ｈ Ｎ 理論値（％） 49.17 8.66 14.33 実験値（％） 48.95 8.59 14.35 融点 ：112〜116℃ 施光度：〔α〕25 D＋134.8゜（Ｃ＝１％、in H2O） 紫外線吸収スペクトル：末端吸収 赤外線吸収スペクトル（KBr）：第３図 吸収極大（cm-1） 1035，1110，1140，1335，1375，
1475，1565，1630，2920，3400 NMRスペクトル（重水中）：特徴的ピーク 2.51ppm……3″−Ｎ−メチル、
2.60ppm……6″−Ｎ−メチル、
5.07ppm……1″−アノメリツクプロ
トン、5.38ppm……1′−アノメリツ
クプロトン マススペクトル：主なイオンピーク（ｍ／
ｅ） 110，112，114，125，126，130，
134，142，143，144，145，158，
163，176，191，272，305，320，
338，366，449，479，480（Ｍ＋１） 薄層クロマトグラフイーによるRf値：第５
表 以上の理化学的性質特にマススペクトルに於け
る典型的なフラグメントイオンピークおよび
NMRの結果ならびにKM−Ｂから誘導されるこ
とに基いて次式で示される3′，4′−ジデオキシ−
3″−Ｎ−メチル−6′−Ｎ−メチルカナマイシンＢ
であると認められる。 実施例 ４ ミクロモノスポラsp.K−6993−Ｙ−41株によ
る目的化合物〔−B4〕の製造 実施例３の第１回目のアンバーライトCG−50
（NH4 +型）カラムを用いたアンモニア水の濃度
勾配溶出において〔−B3〕に続いて溶出され
てきた〔−B4〕区分（シリカゲル薄層クロマ
トグラフイー、展開溶媒第５表のＡ，Rf値0.19で
検出）を集め、濃縮して85mgの〔−B4〕の粗
粉末を得た。この粗粉末を0.5mlの水に溶解して
シリカゲルプレート（メルク社製、キーゼルゲル
Kieselgel60PF254（商品名）厚さ0.3mm、20cm×20
cm、150℃活性化）３枚に帯状にチヤージして展
開溶媒（第５表のＡ）で展開した。展開後ニンヒ
ドリン発色で目的化合物の位置を確認してから、
その位置をシリカゲルごとかき取り、同じ展開溶
媒でシリカゲルから溶出した。この溶出液を減圧
濃縮乾固して56mgの粗粉末を得た。この粗粉末を
更に精製するために２mlのメタノールに溶解し
0.1規定硫酸のメタノール溶液でPH4.0に調整し、
アセトンを加えて生じた白色沈澱を濾取し真空乾
燥して95mgの〔−B4〕の硫酸塩を得た。この
硫酸塩をダウエツクス１×２（OH-型）８mm×
300mmカラムにチヤージし水で溶出して、溶出さ
れてきた〔−B4〕区分を上記シリカゲル薄層
クロマトグラフイーで確認して集め濃縮した。こ
の濃縮液をアンバーライトCG−50（NH4 +型）８
mm×180mmカラムに吸着させ水200mlと0.8規定ア
ンモニア水200mlとで濃度勾配溶出操作を行い、
各フラクシヨン（各2.5ml）を上記シリカゲル薄
層クロマトグラフイーで確認して〔−B4〕区
分を集め凍結乾燥して純粋な〔−B4〕の白色
粉末を52mg得た。 この〔−B4〕遊離塩基（凍結乾燥品）はつ
ぎの理化学的性質を示す。 塩基性の白色粉末（80℃18時間真空乾燥） 溶解性：水に極めて良く溶け、メタノールに
も溶ける。エタノールとアセトンに
はやや溶けにくく、クロロホルム、
ベンゼン、酢酸エチル、酢酸ブチ
ル、エーテル、ｎ−ヘキサンなどの
有機溶剤には不溶である。 元素分析値（C19H30N5O8・0.5H2Oとして） Ｃ Ｈ Ｎ 理論値（％） 48.09 8.50 14.76 実験値（％） 48.10 8.49 14.37 融点 ：204〜208℃（褐変） 旋光度：〔α〕25 D＋131.1゜（Ｃ＝１％、in H2O） 紫外線吸収スペクトル：末端吸収 赤外線吸収スペクトル（KBr）：第４図 吸収極大（cm-1） 1035，1110，1140，1335，1380，
1480，1565，1630，2920，3400 NMRスペクトル（重水中）： 2.48ppm……3″−Ｎ−メチル、
5.06ppm……1″−アノメリツクプロ
トン、5.25ppm……1′−アノメリツ
クプロトン マススペクトル：主なイオンピーク（ｍ／
ｅ） 112，126，130，145，158，163，
176，191，242，246，258，273，
302，305，320，338，366，429，
438，465，466（Ｍ＋１） 薄層クロマトグラフイーによるRf値：第５
表 以上の理化学的性質特にマススペクトルに於け
る典型的なフラグメントイオンピークおよび
NMRの結果ならびにKM−Ｂから誘導されるこ
とに基いて次式で示される。3′，4′−ジデオキシ
−3″−Ｎ−メチルカナマイシンＢであると認めら
れる。 実施例 ５ ミクロモノスポラsp.K−6993−Ｙ−41株によ
る目的化合物〔−B5〕の製造 培養方法、培地、KM−Ｂの添加方法等は実施
例３と同様に行つて38の培養液を得た。この得
られた培養液を４規定塩酸でPH2.0に調整し、菌
体を濾別したのち、その濾液を４規定水酸化ナト
リウムでPH7.0に戻しアンバーライトIRC−50
（NH4 +型）2.4のカラムに通し、水洗後１規定
のアンモニア水7.5で溶出し減圧濃縮乾固して
17.4gの粗溶出物を得た。この溶出物の9.3gをア
ンバーライトCG−50（NH4 +型）800mlを充填し
たカラムに吸着させ樹脂をよく水洗した後、水４
と0.7規定のアンモニア水４とで濃度勾配溶
出操作を行い各フラクシヨン（各15ml）を実施例
１と同様にシリカゲルクロマトグラフイー（Rf
値0.06）で検出して、溶出されてくる〔−B5〕
区分を集め濃縮乾固して649mgの〔−B5〕の粗
粉末を得た。この粗粉末を再びアンバーライト
CG−50（NH4 +型）10mm×500mmカラムに吸着さ
せ水300mlと0.5規定アンモニア水300mlとで濃度
勾配溶出操作を行い、上記と同様にシリカゲル薄
層クロマトグラフイーで検出して〔−B5〕区
分を集め凍結乾燥して477mgの〔−B5〕の粗粉
末を得た。この粗粉末の161mgをシリカゲル（ワ
コーゲルＣ−200）10mm×500mmカラムに付し展開
溶媒（第５表のＢ）で溶出分画し各フラクシヨン
（各10ml）をシリカゲル薄層クロマトグラフイー
（展開溶媒は第５表のＢ，Rf値0.26）で検出した。
溶出してきた〔−B5〕区分を濃縮乾固して
〔−B5〕の白色粉末を得た。この粉末をアンバ
ーライトCG−50（NH4 +型）10mm×500mmカラム
に吸着させ水１と0.7規定アンモニア水１と
で濃度勾配溶出操作を行い、シリカゲル薄層クロ
マトグラフイー（展開溶媒は第５表のＢ）で溶出
して、溶出されてきた〔−B5〕区分を集め約
２mlに減圧濃縮した。この濃縮液をダウエツクス
１×２（OH-型）６mm×170mmカラムにチヤージ
し水で溶出し、溶出されてきた〔−B5〕区分
をシリカゲル薄層クロマトグラフイー（展開溶媒
第５表のＢ）で確認し、この溶出区分を集め凍結
乾燥して純粋な〔−B5〕の白色粉末を116mg得
た。 この〔−B5〕遊離塩基（凍結乾燥品）はつ
ぎの理化学的性質を示す。 塩基性の白色粉末（80℃18時間真空乾燥） 溶解性：水に極めて良く溶ける。メタノール
とエタノールには溶けにくく、アセ
トン、クロロホルム、ベンゼン、酢
酸エチル、酢酸ブチル、エーテル、
ｎ−ヘキサンなどの有機溶剤には不
溶である。 元素分析値（C19H39N5O10・H2Oとして） Ｃ Ｈ Ｎ 理論値（％） 44.26 8.02 13.58 実験値（％） 44.52 7.87 13.68 紫外線吸収スペクトル：末端吸収 赤外線吸収スペクトル（KBr）：第５図 吸収極大（cm-1） 1035，1150，1360，1450，1480，
1600，1640，2910，3375 NMRスペクトル（重水中）：特徴的ピーク 2.47ppm……3″−Ｎ−メチル、
5.06ppm……1″−アノメリツクプロ
トン、5.34ppm……1′−アノメリツ
クプロトン マススペクトルによる質量数：498（Ｍ＋１） 薄層クロマトグラフイーによるRf値：第５
表 以上の理化学的性質、特にマススペクトルおよ
びNMRの結果ならびにKM−Ｂから誘導される
ことに基いて次式で示される既知の3″−Ｎ−メチ
ルカナマイシンＢであると認められる。 なお、上記実施例で得られた目的化合物〔−
A3〕，〔−A4〕，〔−B3〕，〔−B4〕および
〔−B5〕の薄層のクロマトグラフイーによるRf
値を既知のアミノグリコシド抗生物質と対比して
示す。
【表】
【表】
【表】 【図面の簡単な説明】
第１図から第５図はそれぞれ本発明の目的化合
物〔−A3〕，〔−A4〕，〔−B3〕，〔−B4〕
および〔−B5〕の赤外線吸収スペクトルを示
す。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ カナマイシンＡ又はカナマイシンＢを、ミク
    ロモノスポラ属に属し、カナマイシンＡ又はカナ
    マイシンＢを下記一般式〔〕で示されるアミノ
    グリコシド化合物又はこれらの酸付加塩に変換す
    る能力を有する微生物と接触させることを特徴と
    する一般式 （式中、R1およびR′4はメチル基又は水素原子
    を、R′2は水酸基又は水素原子を意味し、またR3
    はアミノ基又は水酸基を意味する。但し、R′2が
    水酸基のときは、R1は水素原子を、 R′2が水素原子のときはR′4は水素原子を意味す
    る。） で示されるアミノグリコシド化合物又はこれの酸
    付加塩の製造法。 ２ ミクロモノスポラ属に属し、カナマイシンＡ
    又はカナマイシンＢを変換する能力を有する微生
    物が、ミクロモノスポラsp.K−6993−Ｙ−41株
    及びミクロモノスポラ エキノスポラ
    NRRL.2985−Ｎ−６株である特許請求の範囲第
    １項記載の製造法。
JP29311989A 1979-07-27 1989-11-10 新規抗生物質又はこれの酸付加塩の製造法 Granted JPH02257889A (ja)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007062871A1 (de) 2005-12-03 2007-06-07 Skumtech As Korrosionsschutz für anker im gebirge

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