JPS6141519B2

JPS6141519B2 -

Info

Publication number: JPS6141519B2
Application number: JP54015998A
Authority: JP
Inventors: Takeo Ideushi; Akio Iwasaki; Kazuhiro Kamya; Masato Nakayama; Isamu Watanabe; Hisakatsu Ito; Toshito Mori; Takeshi Oda
Original assignee: Kowa Co Ltd
Current assignee: Kowa Co Ltd
Priority date: 1979-02-16
Filing date: 1979-02-16
Publication date: 1986-09-16
Also published as: JPS55111497A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、新規抗生物質及びその製法に関す
る。本発明者らは先に、土壌から分離されたKC―
6606株がグラム陽性菌、グラム陰性菌及び抗酸菌
に対して抗菌力を示す新規抗生物質を生産するこ
とを見い出し、その培養液より抗生物質KA―
6606，KA―6606，KA―6606及びKA―
6606を単離した（特公昭57―8116号及び同58―
19679号各公報参照）。本発明者らは更に研究を続けた結果、上記KC
―6606株の培養液中に、上記４種の抗生物質の
ほかに更に２種の抗生物質の存在することを見い
出し、これらの物質を単離することに成功した。本発明の抗生物質はその物理化学的性質及び生
物学的性質が既知物質のそれと異なることから新
規物質であることが認められ、それぞれKA―
6606物質及びKA―6606物質と命名された。 KA―6606物質は、末端にグリシル基を有し、
分子式C₁₇H₃₅O₅N₅で示されるアミノ配糖体（KA
―6606物質）、分子式C₁₅H₃₂O₄N₄で示される
KA―6606物質の脱グリシル体（KA―6606
物質）、末端にカルバモイルグリシル基を有し、
分子式C₁₈H₃₆O₆N₆で示されるアミノ配糖体（KA
―6606物質）及び末端にホルミルグリシル基を
有し、分子式C₁₈H₃₅O₆N₅で示されるアミノ配糖
体（KA―6606物質）のほかに、KA―6606
物質と同一の分子式C₁₅H₃₂O₄N₄を有する異性体
KA―6606物質及びKA―6606物質からなる
混合物として生産されることを見い出した。本発明に使用される菌は、KC―6606株（微工
研菌寄第3912号）ならびにその変異株で、その菌
学的性質は先の出願である特公昭57―8116号公報
に詳記されている。KC―606株は該明細書で説明
したように、炭素源の資化性においてはサツカロ
ポリスポラ・ヒルスタと相違するが、形態学的性
質、各種培地上の性質、生理的性質等の基本性状
がよく一致したことから、サツカロポリスポラ・
ヒルスタの自然変異株と考えられ、サツカロポリ
スポラ・ヒルスタ・KC―6606株と命名された。本発明で用いるサツカロポリスポラ・ヒルスタ
に属する菌株は、その性状が変化しやすく、例え
ば紫外線、エツクス線、薬品などを用いる人工変
異手段で容易に変異し得るものであり、このよう
な変異株であつても抗生物質KA―6606の生産能
を有するものはすべて本発明に使用することがで
きる。なおサツカロポリスポラ・ヒルスタに属す
る菌株が抗生物質を生産することは文献に報告さ
れていない。本菌株の培養には通常の放線菌の培養方法が用
いられる。培養基の炭素源としては種々のものが
用いられるが、殿粉、ぶどう糖、グリセリン、マ
ルトース、デキストリン、蔗糖、果糖、糖蜜など
を単独で又は組み合わせて用いることが好まし
い。さらに菌の資化性によつては炭化水素、有機
酸、植物油なども用いられる。窒素源としては大
豆粉、酵母エキス、乾燥酵母、ペプトン、肉エキ
ス、コーンステイープリカー、カザミノ酸、デイ
ステイラーズソリユブル、塩化アンモニウム、硫
酸アンモニウム、尿素、硝酸ナトリウムなどが単
独で又は組み合わせて用いられる。その他必要に応じ、食塩、燐酸カリウム、硫酸
マグネシウム、塩化カルシウム、炭酸カルシウ
ム、水酸化カルシウム、塩化コバルト、硫酸亜
鉛、塩化鉄、硫酸鉄などの無機塩、並びに微量の
重金属を添加することができる。更に菌の発育を
助け、KA―6606物質の生産を促進する有機及び
無機物質を適宜に添加することができる。通気培
養法を用いる場合には、更に脂肪油、シリコーン
油、パラフインなどの消泡剤が用いられる。培養方法としては、固体培地上での培養も可能
であるが、一般抗生物質生産の方法と同様に液体
培養法、特に深部培養法を用いることが好まし
い。培養は好気的条件下で行なわれ、培養温度は
20〜35℃で、27℃付近が好ましい。 KA―6606物質の生産は、振盪倍養又はタンク
培養のいずれの場合も２〜６日間培養を行なう
と、活性物質が培養液中に生産蓄積される。培養
液中の生産量が最大に達した時点で培養を停止
し、培養液中より目的の抗生物質を単離精製す
る。培養液から本物質を単離精製するには、KA
―6606物質が水に可溶で一般の有機溶媒に難溶の
水溶性塩基性物質であるため、通常の水溶性塩基
性抗生物質の単離、精製法を利用することができ
る。イオン交換樹脂、活性炭、セルロース、シリ
カゲル、アルミナ等による吸脱着法、補助剤とし
て高級脂肪酸を加えブタノール、アミルアルコー
ル等で抽出する方法などを適宜に組み合わせて用
いることができる。培養液を弱酸性陽イオン交換樹脂の層に通す
と、KA―6606物質が吸着される。これを0.1〜
3.0規定のアルカリ、酸又は各種塩の溶液で溶出
し、活性成分を凍結乾燥すると、KA―6606物質
の粗粉末が得られる。このとき用いられる弱酸性
陽イオン交換樹脂としては、アンバーライトIRC
―50，IRC―84又はCG―50（ローム・アンド・
ハース社製）、ダイヤイオンWK―10又はWK―20
（三菱化成社製）などがあげられる。またアルカ
リとしてはアンモニア水、水酸化ナトリウム水溶
液などが、酸としては蟻酸、塩酸、硫酸などが、
塩溶液としては炭酸アンモニウム、蟻酸アンモニ
ウム溶液などがあげられる。培養液をPH７〜９に調整し、目的物質を活性
炭に吸着させ、酸性の水又は塩酸―メタノールで
溶出させる方法も利用できる。こうして得られる粗粉末は、弱酸性陽イオン交
換樹脂、CM―セフアデツクス、CM―セルロー
スなどに吸着させ、アルカリ性水溶液、例えばア
ンモニア水、炭酸アンモニウム、蟻酸アンモニウ
ムの水溶液などを用い、濃度勾配法又は濃度段階
法で溶出することにより、数種の微量成分が溶出
されたのちに、遊離塩基としてKA―6606物
質、次いで同物質が溶出され、更に溶出を続け
ると、同物質、同物質及び同物質が順次溶
出され、最後に同物質が溶出されて各成分に分
離することができる。こうして得られる各成分は、それぞれセルロー
ス、シリカゲルなどのクロマトグラフイー、セフ
アデツクス例えばLH20を用いるクロマトグラフ
イーなどを適宜に組合わせて精製することができ
る。例えばシリカゲルカラムクロマトグラフイー
を用い、クロロホルム―メタノール―17％アンモ
ニア水（１：８：３）で展開することにより精製
できる。こうして得られる遊離塩基（及び）は更に
強塩基性陰イオン交換樹脂、例えばダウエツクス
1X2（ダウケミカル社製）のカラムに付し、次い
で例えば水で溶出し、活性区分を集めて凍結乾燥
することにより、それぞれ純品の遊離塩基（及
び）を得ることができる。これらの遊離塩基はそれぞれ無機酸、例えば塩
酸、硫酸、臭化水素酸又は有機酸、例えば酢酸、
修酸、炭酸などを加え、常法により対応する酸付
加塩に導くことができる。 KA―6606物質及び同物質はいずれも塩基
性水溶性の白色物質で、主としてグラム陽性菌及
び陰性菌に対して抗菌性を示す有用な新規抗生物
質である。本物質の物理化学的及び生物学的性状
は下記のとおりである。 KA―6606物質の遊離塩基； (1) 外観白色粉末 (2) 分子式 C₁₅H₃₂O₄N₄ (3) 元素分析値ＣＨＮ実測値（％） 54.01 9.44 16.52 計算値（％） 54.19 9.70 16.85 (4) 分子量 332（マススペクトル） (5) 比旋光度〔α〕^２５ _Ｄ＋103゜（ｃ＝１、H₂O） (6) 紫外線吸収スペクトル 220〜360nmで特異的な吸収を示さず、末端吸
収のみ示す。 (7) 赤外線吸収スペクトル臭化カリウム中にペレツトした赤外線吸収スペ
クトルは第１図に示すとおりである。 (8) 溶剤に対する溶解性水に極めて溶けやすい。メタノールに易溶、エ
タノール、アセトンにやや溶けにくい。クロロホ
ルム、酢酸エチル、エーテル、ヘキサン、石油エ
ーテルに不溶。 (9) 呈色反応ニンヒドリン反応、ライドン・スミス氏反応に
陽性。坂口反応、マルトール反応、塩化第二鉄反応、
フエーリング反応に陰性。 (10) 安定性 PH2.0〜8.0で安定。 (11) 核磁気共鳴スペクトル δ_D2O（ppm）： 1.54（3H，ｄ，Ｃ―ＣH₃ ） 2.86（3H，ｓ，Ｎ―ＣH₃ ） 3.87（3H，ｓ，Ｏ―ＣH₃ ） 5.69（1H，ｄ，アノメリツクＨ） (12) マススペクトルｍ／ｅ：32（M⁺），219，191，173，143 (13) ペーパークロマトグラフイー Rf値：0.91 紙；ワツトマンNo.１溶媒；クロロホルム―メタノール―17％アンモ
ニア水（２：１：１）の下層 (14) 薄層クロマトグラフイー

【表】プレートはTLCアルミニウムシート・シリカ
ゲル60F₂₅₄0.2mm（メルク社製）を用いた。KA―
606物質の遊離塩基： (1) 外観白色粉末 (2) 分子式 C₁₅H₃₂O₄N₄ (3) 元素分析値ＣＨＮ実測値（％） 52.21 9.56 16.17 計算値（％） 52.76 9.74 16.41 （C₁₅H₃₂O₄N₄・1/2H₂Oとして） (4) 分子量 332（マススペクトル） (5) 比旋光度〔α〕^２５ _Ｄ＋54゜（ｃ＝１，H₂O） (6) 紫外線吸収スペクトル 220〜360nmで特異的な吸収を示さず、未端吸
収のみを示す。 (7) 赤外線吸収スペクトル臭化カリウム中にペレツトした赤外線吸収スペ
クトルは第２図に示すとおりである。 (8) 溶剤に対する溶解性水に極めて溶けやすい。メタノールに易溶、エ
タノール、アセトンに溶けにくい。クロロホル
ム、酢酸エチル、エーテル、ヘキサン、石油エー
テルに不溶。 (9) 呈色反応ニンヒドリン反応、ライドン・スミス氏反応に
陽性。坂口反応、マルトール反応、塩化第二鉄反応、
フエーリング反応に陰性。 (10) 安定性 PH2.0〜8.0で安定 (11) 核磁気共鳴スペクトル δ_D2O（ppm）： 1.53（3H，ｄ，Ｃ―ＣH₃ ） 2.83（3H，ｓ，Ｎ―ＣH₃ ） 3.87（3H，ｓ，Ｏ―ＣH₃ ） 5.56（1H，ｄ，アノメリツクＨ） (12) マススペクトルｍ／ｅ：333（M⁺＋１）、32（M⁺）219，191，
173，143 (13) ペーパークロマトグラフイー Rf値：0.94 紙；ワツトマンNo.１溶媒；クロロホルム―メタノール―17％アンモ
ニア水（２：１：１）の下層 (15) 薄層クロマトグラフイー

【表】プレートはTLCアルミニウムシート・シリカ
ゲル60F₂₅₄0.2mm（メルク社製）を用いた。抗菌作用： KA―6606及び同物質のデイスクプレート
法による各種微生物に対する抗菌スペクトラムを
KA―6606物質と比較して第１表に示す。

【表】なお薬剤は30mcgずつ直径８mmのペーパーデイ
スクに浸透させて用いた。以上のように既知の右旋性水溶性塩基性抗生物
質のうちで、カナマイシン―Ａ，Ｂ及びＣ、トブ
ラマイシン、パロモマイシン、ネオマイシン―
Ａ，Ｂ及びＣ、ブチロシン―Ａ及びＢ、リビドマ
イシン―Ａ及びＢ、リボスタマイシン、キシロス
タチン、ゲンタミシン―Ａ及びＢ、アプラマイシ
ン、ソルビスチン、抗生物質No.460等は、理化学
的性状において本物質と大きな相違点が認めら
れ、更に第２表に示すようにペーパークロマトグ
ラフイーのRf値も本物質と相違することが認め
られる。また、ゲンタミシン―Ｃグループ、サガ
ミシン及びホーテイミシンはいずれもペーパーク
ロマトグラフイー及び薄層クロマトグラフイーの
Rf値が第２表及び第３表に示すようにKA―6606
物質と相違することが認められる。従つてKA―
6606物質及び同物質は、既知抗生物質とは諸
性状が異なる新規物質と認められる。

【表】

【表】 TLCアルミニウムシート・シリカゲル
60F₂₅₄0.2mm（メルク社製）以上の諸性状より、本物質は次の構造を有する
ものと推定される。 KA―6606：R₁＝Ｈ、 R₂＝NHCH₃ KA―6606：R₁＝NHCH₃，R₂＝Ｈ本物質は前述のように広範囲の優れた抗菌スペ
クトラムを有することから、抗菌性物質として医
薬、動物薬などとして有用である。また本物質は
種々の誘導体を合成するための出発物質としても
有用である。実施例殿粉３％，大豆粉1.5％，コーンステイープリ
カー0.5％，酵母エキス0.2％，硫酸マグネシウム
0.05％，食塩0.3％，炭酸カルシウム0.3％及び塩
化第二コバルト六水塩0.001％の組成を有し、PH
7.0に調整し滅菌した培地にKC―6606株を接種
し、27℃で約50時間前培養したものを第一種菌と
する。200容のタンク３基に種菌培地と同じ培
地に綿実油１％を添加した培地各100を仕込
み、第一種菌200mlを接種し、27℃で通気撹拌方
式（225rpm、通気量50／分）により４日間培
養する。培養終了後、培養液に硫酸を添加してPH2.0に
調整したのち、過助剤としてダイカライト（ダ
イカライト・オリエン社製）を加えて菌体を別
する。液に希水酸化ナトリウム水溶液を加えて
PHを8.0に調整し、陽イオン交換樹脂アンバーラ
イトIRC―50（NH₄ ⁺型）のカラムに通し（流出
液は捨てる）、水洗後、１規定アンモニア水で吸
着された活性物質を溶出する。バチルス・ズブチ
リスの寒天平板を用いてペーパーデイスク法によ
り溶出液の活性を測定し、活性を有する区分を合
わせ、減圧下で約50mlまで濃縮する。この濃縮液
を凍結乾燥すると、KA―6606物質の粗粉末26ｇ
が得られた。この粗粉末20ｇを蒸溜水50mlに溶解し、PHを
7.0に調整し、陽イオン交換樹脂アンバーライト
CG―501型（NH₄ ⁺）のカラム（３×150cm）に通
し、水洗したのち0.01規定のアンモニア水５と
１規定のアンモニア水５の間で濃度勾配法を用
いて150ml／時の流速で溶出し、25mlごとに分画
する。各画分をペーパーデイスク法により活性を
検定し、KA―6606に該当する成分の含まれる
画分及びKA―6606に該当する成分の含まれる
画分をそれぞれ集め、凍結乾燥すると、KA―
6606を含む粗粉末25mg及びKA―6606を含む
粗粉末48mgが得られる。 KA―6606を含む粗粉末25mgを蒸留水50mlに
溶解し、PHを7.0に調整したのち陽イオン交換樹
脂CM―セフアデツクスＣ―25（NH₄ ⁺型）のカラ
ム（1.5×60cm）に付す。水洗したのち0.2規定の
アンモニア水１と0.8規定のアンモニア水１
の間で濃度勾配法により150ml／時の流速で溶出
し、15mlずつ分画する。各画分をペーパーデイス
ク法により活性を検定し、KA―6606を含む画
分を集めて凍結乾燥すると、KA―6606の白色
粉末15mgが得られる。 KA―6606を含む粗粉末48mgをあらかじめク
ロロホルム―メタノール―17％アンモニア水
（２：１：１）の下層に懸濁させたセルロースを
充填したカラム（1.5×80cm）に付し、同じ溶媒
で展開してKA―6606を含む画分を減圧下に濃
縮したのち凍結乾燥すると、KA―6606の白色
粉末28mgが得られる。これらの凍結乾燥品をそれぞれ水に溶解し、PH
を7.0に調整したのち、陰イオン交換樹脂ダウエ
ツクス１×２（OH^-型）のカラム（１×150cm）
に付し、水で溶出する。活性画分を集めて凍結乾
燥すると、それぞれKA―6606の遊離塩基の精
製標品10mg及びKA―6606の遊離塩基の精製標
品10mgが得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図は抗生物質KA―6606の赤外線吸収ス
ペクトルを示すグラフ、第２図は抗生物質KA―
6606の赤外線吸収スペクトルを示すグラフであ
る。

Claims

【特許請求の範囲】１一般式で表わされ、式中R₁及びR²は相異なつて水素原
子又はメチルアミノ基を示し、R₁が水素原子の
場合（KA―6606）は比旋光度が〔α〕^２５ _Ｄ＋103
゜（ｃ＝１、H₂O）であり、R₂が水素原子の場合
（KA―6606）は比旋光度が〔α〕^２５ _Ｄ＋54゜（ｃ
＝１、H₂O）である化合物及びその酸付加塩。２式中のR₁が水素原子、R₂がメチルアミノ基
である特許請求の範囲第１項に記載の化合物
（KA―6606）及びその酸付加塩。３式中のR₁がメチルアミノ基、R₂が水素原子
である特許請求の範囲第１項に記載の化合物
（KA―6606）及びその酸付加塩。４サツカロポリスポラ属に属するKA―6606物
質生産菌を培養し、培養液よりKA―6606物質を
採取し、これからKA―6606及び／又はKA―
6606を単離することを特徴とする、一般式で表わされ、式中R₁及びR₂は相異なつて水素原
子又はメチルアミノ基を示し、R₁が水素原子の
場合（KA―6606）は比旋光度が〔α〕^２５ _Ｄ＋103
゜（ｃ＝１、H₂O）であり、R₂が水素原子の場合
（KA―6606）は比旋光度が〔α〕^２５ _Ｄ＋54゜（ｃ
＝１、H₂O）である化合物及びその酸付加塩の製
法。