JPH11507946A

JPH11507946A - アテローム性動脈硬化症予防用薬剤の製造におけるｎａｄｐｈオキシダーゼ阻害剤の使用

Info

Publication number: JPH11507946A
Application number: JP9520684A
Authority: JP
Inventors: エイ．ホランドジェイムス; ケイ．ジョンソンデイビッド
Original assignee: ザリサーチファウンデーションオブステートユニバーシティオブニューヨーク
Priority date: 1995-11-27
Filing date: 1996-11-27
Publication date: 1999-07-13
Also published as: ES2144792T3; EP0914821A3; DE69606882T2; CA2238098C; DE69606882D1; ATE189957T1; AU1085997A; EP0861070B1; CA2238098A1; EP0861070A2; WO1997019679A3; US5763496A; US5902831A; GR3033067T3; JP2003176224A; WO1997019679A2; EP0914821A2

Abstract

(57)【要約】哺乳動物におけるアテローム性動脈硬化症およびその関連疾患の予防および治療のための方法であって、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤が投与される方法が提供される。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤は内皮細胞をアテローム原性のＬＤＬレベルに曝したときに反応性の酸素種が生産されるのを防止し、こうしてエンドサイトーシスおよび血管高透過性の減少をもたらす。好ましいＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤は式（Ｉ）のものである。さらに、ヒト患者がアテローム性動脈硬化症−関連疾患に罹患する危険性を予想するための診断法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】アテローム性動脈硬化症予防用薬剤の製造におけるＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤の使用連邦政府に援助された研究の権利に関する陳述本発明は、ベテランズ・アフェヤズ（メリットレビュー０００２）デパートメントからおよびナショナル・インスティチュート・オブ・ヘルス（グラントＮｏ．５Ｒ０１ＨＬ４９５７３）からの支援を得て行われた。合衆国政府は本発明の権利を保持することができる。発明の分野本発明はアテローム性動脈硬化症および内皮の高透過性から生ずる疾病の予防および処置のための治療法に関する。より具体的には、本発明はＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤の投与によるこれらの病気の予防および治療に関する。発明の背景その後遺症である心臓発作、発作および末梢血管病を持つアテローム性動脈硬化症はアメリカ合衆国における死亡原因の筆頭であり、毎年８００，０００人を越える死亡を出している。事故、自殺および殺人を除けば、アテローム性動脈硬化症関連の疾病は総死亡者のほとんど５０％の原因である。疫学的研究によれば、患者の大部分は低比重リポタンパク（ＬＤＬ）の血中レベルの上昇を示すことが明らかである。ＬＤＬは肝臓から体組織へコレステロールを運ぶ。コレステロールレベルの上昇（高コレステロール血症）は通常ＬＤＬレベルの上昇と関連している。血中コレステロール、とりわけＬＤＬ−コレステロールの高レベルは冠状心臓疾患（ＣＨＤ）の危険性を増加させるが、一方総コレステロールおよびＬＤＬコレステロールレベルを低下させるとＣＨＤのリスクが減少する。異常に高い血中ＬＤＬレベルを制御したりあるいはコレステロールレベルを低下させたりすることによりアテローム性動脈硬化症およびその合併症を治療しまたは予防するため多くの薬学的製剤が開発されてきた。これらの中で最も広く知られている薬剤としては、ニコチン酸、クロフィブレート、デキストロチロキシンナトリウム、ネオマイシン、ベータ−シトステロール、プロブコール、コレステリルアミン、およびロバスタチンやシムバスタチンなどのＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤が挙げられる。しかしながら、これらの薬剤の有用性は急性副作用の多発出現により制限される。このような副作用には強い皮膚の紅潮、かゆみ、胃腸の刺激、肝毒性、不整脈、吐き気、体重増加、脱毛症、インポテンス、腹痛、下痢、好酸球増加症、皮膚発疹、筋骨格痛、霞視覚、穏和な貧血症、白血球減少症、胆石の増加、便秘、および宿便が含まれる。さらに、血清コレステロールの低下とアテローム性動脈硬化症の軽減との間には一部の相関があるだけである。アテローム性動脈硬化症を持つ患者のすべてが高コレステロールを持つ訳ではなく、そして高コレステロールを持つ患者のすべてがアテローム性動脈硬化症を持つ訳ではない。アテローム性動脈硬化症の病理生物学は血管内皮の関与の主要な役割を示している。内皮細胞の明白な死滅や喪失なしに内皮が変化して様々な血中物質に対する内皮の透過性に混乱を生じることはアテローム性動脈硬化症病変の発生における重要な特徴である。血液中に含まれる物質はそれに続いてこの内皮組織を通過しそして動脈壁の最も内部に蓄積する。内皮透過性の中度の増加（高透過性）でさえもアテローム性動脈硬化症事象の出現の顕著な増加を伴う。血管の高透過性が健常な内皮の存在下において起こるメカニズムの一つは内皮の混乱による内皮のエンドサイトーシスの増加である。内皮は血流中の低比重リポタンパク（ＬＤＬ）の高レベルや高血圧で生ずるような剪断的ストレスなどの種々の条件により混乱することができる。糖尿病や喫煙も内皮の混乱を生ずる。本発明者は今回ヒト血管内皮細胞（ＥＣ）が長期間高ＬＤＬ濃度（３３０ｍｇ／ｄｌのコレステロールまで）に曝された状態の研究を行った。その結果、例えば、細胞計測値の安定性により示されるように、ＬＤＬによるアテローム性動脈硬化症プラーク形成の増大の間にヒトではＥＣの死滅や喪失は起こらないことを明らかにしている。最初に、内皮の混乱が起こり、エンドサイトーシスの増加および内皮下層の空間におけるＬＤＬの蓄積がその結果として起こる。このようにして、高ＬＤＬレベルへの曝露はＥＣエンドサイトーシスの過度の増強を誘発する。疫学的研究からアテローム発生を起こすと考えられる濃度範囲（例えば、１４０ｍｇ／ｄｌのＬＤＬコレステロールより大きな濃度に曝された内皮細胞）でＬＤＬに曝すことがエンドサイトーシスの過度の増強に必要であることが研究により明らかにされている。別の重要な発見はエンドサイトーシスの過度の増強がいったん起こってしまうとそれは持続するということである。ＥＣの機能的状態におけるこのような持続性の変化は内皮の混乱、あるいは血管の高透過性という概念と矛盾しない。エンドサイトーシスは基本的な、一見普遍的な細胞事象である。エンドサイトーシスの間に、血漿膜の断片が内部に巻いて（interiorized）小嚢を形成し、それは細胞質の中へ移行する。この小嚢はトランスサイトーシスを介して経細胞輸送に関与することができる。エンドサイトーシスの調節機構は良く理解されていないが、本発明者の研究は、Ｈ₂Ｏ₂やＯ₂ ^-などの反応性酸素種が過度に増強されたＥＣエンドサイトーシスを調節することを今回証明した。細胞は正常な細胞代謝の副産物として反応性酸素種（ＲＯＳ）を発生させる。混乱した内皮細胞はニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド・リン酸塩（ＮＡＤＰＨ）オキシダーゼの活性化を介して反応性酸素種の生産を増加させる。ＮＡＤＰＨオキシダーゼは白血球中でよく特性が決定されてきた酵素であるが、白血球型のＮＡＤＰＨオキシダーゼはこれまで内皮細胞中では同定されてこなかった。本発明者はそれが内皮細胞中に生ずることをここに証明した。ＮＡＤＰＨオキシダーゼの活性化によりＮＡＤＰＨから酸素への電子伝達が起こり、その結果Ｏ₂ ^-やＨ₂Ｏ₂などの反応性酸素種（ＲＯＳ）の発生が起こる。このオキシダーゼの活性型は複数の膜結合タンパクから組立てられた複合体であり、それはチトクロームｂ₅₅₈（ｇｐ９１_[phox]およびｐ２２_[phox] より構成される）と細胞質ゾル成分を含み、後者の中の３個は特性が決定されており、ｐ４７_(phox)、ｐ６７_(phox)および低分子量のＧＴＰ−結合タンパクである。チトクロームｂ₅₅₈はグリコシル化された９１ｋＤポリペプチドに固く結合している２２ｋＤポリペプチドから成っている。グリコシル化された９１ｋＤポリペプチドは２２ｋＤポリペプチドを固定するのに役立つ内在性膜タンパクである。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ酵素複合体の遺伝的異常が慢性肉芽腫性疾患（ＣＧＤ）、白血球が微生物に反応して反応性酸素種を発生させることができない先天的疾患を惹起することが知られている。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性が不十分または欠如しているＣＧＤに関する研究により、ＮＡＤＰＨオキシダーゼの遺伝的変異型が存在することが明らかにされた。にもかかわらず、反応性酸素種の過剰量を生産するＮＡＤＰＨオキシダーゼ遺伝的変異型を同定するための研究は見られない。もしこのような変異型が存在しわれわれの集団において一般的であるならば、そのときはこれらの遺伝的変異型を遺伝している人々は心臓発作、発作、および末梢血管病の危険性がより高いということができる。膜結合酵素であるＮＡＤＰＨオキシダーゼは静態細胞では不活性型で存在する。細胞の混乱が生ずると、酵素複合体が組立てられそして活性型に転換して反応性酸素種の強い発生を惹起する（酸化的爆発）。ＮＡＤＰＨオキシダーゼの活性化機構を明らかにしようと試みる研究は、不飽和脂肪酸が、最も強力なのはアラキドン酸が直接ＮＡＤＰＨオキシダーゼを活性化することを示している。アラキドン酸が内皮細胞で見出されるＮＡＤＰＨオキシダーゼを活性化するか否かを確認するため、濃度を増加させたアラキドン酸に細胞を直接接触させそして反応性酸素種生産を測定する研究が行われた。これらの研究では、ＥＣを１〜２５μＭのアラキドン酸と共にインキュベートし、Ｈ₂Ｏ₂の生産を測定した。アラキドン酸はＥＣのＨ₂Ｏ₂生成を誘発しそしてＥＣの高められたエンドサイトーシスを促進することが示された。上の情報に基づく高ＬＤＬとアテローム性動脈硬化症の間の相関関係に対する一つの説明は高レベルのＬＤＬとの接触がホスホリパーゼＡ₂の活性化を促進するというものである。細胞内の閾値レベルでは、細胞質ゾルの遊離のアラキドン酸はＮＡＤＰＨオキシダーゼを休眠状態から活性状態に転換する。本発明者の実験で得られた証拠は反応性の酸素種がアテローム性動脈硬化症の特徴である、高められたエンドサイトーシスを調節すること、そしてＮＡＤＰＨオキシダーゼが主要な細胞内資源であることを示している。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤は炎症状態を治療するのに有効であると主張されているが、その初期相が高められたエンドサイトーシスおよび高血管透過性により特徴付けられるアテローム性動脈硬化症などの疾病を治療するのにこれらの阻害剤が示唆されたことはこれまでなかったことである。例えば、ヨーロッパ特許出願第５５１６６２号は気道、関節、および血管の急性および慢性炎症のコントロールにＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤の使用を開示する。このような血管の炎症には炎症の起源であるこれらのアテローム性動脈硬化症が含まれるが、このＥＰ出願はアテローム性動脈硬化症が代謝状態により開始され炎症により開始されるものでないという理由でアテローム性動脈硬化症を想定していない。４−ヒドロキシ−３−メトキシアセトフェノン（慣用名、アポシニン）のＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤としての使用が知られている。そしてそれは炎症疾患を治療するのに有用であると示唆されてきた。アポシニンはヒマラヤ山中で成長する植物、ピクロリザ・クロア(Picrorhiza kurroa)の根から単離された天然フェノールである。ピクロリザ・クロアの抽出物は南東アジアで、炎症と関連した疾病の治療に、そして肝臓疾患や肺臓疾患、熱病、皮膚外傷、虫感染、リューマチ性疾患、尿障害、心不全、および蛇やサソリに噛まれたときを含む多様な状態の治療に伝統薬として使用されてきた。より最近の文献（エンジェルスら FEBS Lett., 305，254-56（1992）では、アポシニンが血栓症の予防ににも有用であることが示唆されている。しかしながら、アポシニンも他のＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤もこれらがアテローム性動脈硬化症すなわちＥＣの高められたエンドサイトーシスおよび高ＬＤＬ濃度に帰することができる高血管透過性を予防することは示されていない。アテローム性動脈硬化症およびその関連疾患を予防および治療する、すなわち多くの患者に有効な方法、そして患者を思い止まらせる副作用を回避する方法はこの国の主要な死亡原因を無くす方向への実質的前進をもたらすことになろう。既にヒトに使用されてきた容易に入手可能な医薬を用いる方法はアテローム性動脈硬化症および関連疾患の予防および治療にさらなる重要な利点を提供するであろう。さらに、個体がアテローム性動脈硬化症を発症する潜在的危険性を予防しそして治療するための診断法も強く望まれている。発明の概要本発明は哺乳類のアテローム性動脈硬化症を治療しそして予防するのに有効な方法および組成物についての驚くべき発見に関する。本発明はアテローム性動脈硬化症などの内皮の高透過性から生ずる状態を治療および予防するための、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤、好ましくはアポシニンの治療的使用法を提供する。内皮細胞内におけるＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性化を阻害すると血管の高透過性が減少する。血管の高透過性と関連する他の状態もアポシニンなどのＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤を投与することにより治療または予防することができる。一つの側面では、本発明は内皮の高透過性により生ずる状態を予防または治療するための方法に関連する。この方法は内皮の高透過性から生ずる状態を患う哺乳類に、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤またはＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤の代謝前駆体を治療上有効量投与することを含んで成る。本発明の方法から生ずるＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤は重なっているが異なる幾つかの特徴により区別することができる。すなわち、（１）ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤または前駆体の投与量が１０％を越えるまでにより低い血清ＬＤＬには不十分であること、（２）ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤または前駆体がヒトＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼに対するよりもヒトＮＡＤＰＨオキシダーゼに対してより低いＩＣ₅₀を持つこと、または（３）ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤または前駆体がメバロン酸塩の存在下または非存在下に統計学的に等価な阻害をヒトＮＡＤＰＨオキシダーゼに及ぼすこと、である。別の側面では、本発明は内皮の高−透過性から生ずる状態を治療または予防する方法であって、ｇｐ９１_[phox]およびｐ２２_[phox]膜結合ＮＡＤＰＨオキシダーゼ成分へのｐ４７_[phox]の輸送を阻害する物質を治療上有効量哺乳類に投与することを含んで成る方法に関する。本発明の好ましい側面では、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤は次の式の化合物である。上式中、Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³は、水素原子、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換アルキル、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、置換アルケニルおよび置換アルキニルより成る群から独立に選択されるものである。本発明の別の好ましい側面では、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤は下記の式を持つものまたはそれらの互変異性体である。上式中、Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³は、水素原子、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換アルキル、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、置換アルケニルおよび置換アルキニルより成る群から独立に選択されるものである。本発明のより好ましい側面では、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤は、Ｒ¹およびＲ²がそれぞれメチルであり、かつ、Ｒ³が水素原子である式Ｉ、IIまたはIII を持つものである。式Ｉの化合物は市場で広く入手可能である。市場で入手できない化合物は適当なフェノールまたは保護されたフェノールのフリーデルクラフツアシル化により、保護されたフェノールの適当なカルボン酸へのアリールリチウム付加または酸クロリドへのアリールカドミウム付加の後脱保護することにより、あるいはケトンを形成する他の良く知られた方法のいずれかにより、便利に調製することができる。第II属の他の化合物は適当なフェノールの酸化的二量体化により同様にして合成することができる。これらの化合物はすべて過酸化水素などの便利な酸化剤のいずれかを使用して酸化することにより容易にそして可逆的にキノン構造に酸化される。血管の高透過性から生ずる状態には、アテローム性動脈硬化症およびアテローム性動脈硬化症に関連する疾患、例えば、心臓発作、発作、および末梢血管病が含まれる。式Ｉ、IIまたはIIIの化合物はアテローム性動脈硬化症を治療しそして予防するのに特によく適している。「予防する」および「治療する」という用語により本出願人はこの病気または状態が完全に終わってしまわなければならないことを意図するものではなく、何らかの改善があること、すなわち予期された症候についての改善が臨床的に観察され得るようにその病気の通常のコースが実質的に減少することのみを意図する。もう一つの側面では、本発明は内皮の高透過性から生ずるアテローム性動脈硬化症などの疾患に罹患するヒト患者の危険性を予想する方法に関する。この方法は高められたＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を有する患者の同定を含んでいる。高められたＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性とは、本発明の目的では、対にされた対照で見出される範囲を１０％よりも多く越えている場合と定義される。このような同定は患者の白血球（多形核の白血球）中のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を測定することにより行うことが好ましい。多形白血球（ＰＭＮ）ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性は流動細胞測光法を用い、２，７−ジクロロフルオレセイン・ジアセテートを指示薬として使用して測定することができる。このような患者を同定した後は、アテローム性動脈硬化症やその関連疾患を予防しあるいは治療するためにアポシニンなどのＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤の投与が推奨され得る。本発明の各側面において、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤の投与は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤である化合物、並びにその代謝的前駆体である化合物（すなわち、プロドラッグ、前駆薬剤）の投与を包含することを意味する。機能的な特徴はこの問題の化合物の投与の結果としてのＮＡＤＰＨオキシダーゼの阻害である。定義本明細書を通して次の用語は示された意味を有する。「アルキル」とは、直鎖状の、分岐した、または環状の炭化水素構造およびそれらの組み合わせを含むことを意味する。「低級アルキル」とは１〜８個の炭素原子のアルキル基を意味する。低級アルキル基の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓ−およびｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、シクロプロピルエチル、ボルニルおよび同種のものが挙げられる。好ましいアルキル基はＣ₂₀またはそれ以下のアルキル基である。「シクロアルキル」とはアルキルのサブセットであり、３〜８個の炭素原子の環状炭化水素基を含む。低級シクロアルキル基の例にはｃ−プロピル、ｃ−ブチル、ｃ−ペンチル、ノルボルニルおよび同種のものが含まれる。「ヘテロシクロアルキル」とは、メチレン（ＣＨ₂）基の一つから二つがＮＲ（ここでＲは水素原子またはアルキルである）、Ｓまたは同種のものなどのヘテロ原子により置換されているシクロアルキルを意味する。ヘテロシクロアルキルの例としてはテトラヒドロフラニル、ピペリジン、ジオキサニルおよび同種のものが挙げられる。「アルケニル」には直鎖状の、分岐した、または環状の（Ｃ_5-6）構造の不飽和炭化水素およびそれらの組み合わせが含まれる。アルケニル基の例としては、ビニル、アリル、イソプロペニル、ペンテニル、ヘキセニル、ｃ−ヘキセニル、１−プロペニル、２−ブテニル、２−メチル−２−ブテニルおよび同種のものが挙げられる。「アルキニル」には直鎖状または分岐の構造を有する少なくとも一つの炭素− 炭素三重結合を含むＣ_2-8の炭化水素およびそれらの組み合わせが含まれる。アルキニル基の例としては、エチン、プロピン、ブチン、ペンチン、３−メチル− １−ブチン、３，３−ジメチル−１−ブチンおよび同種のものが挙げられる。「アリール」および「ヘテロアリール」にはＯ、ＮおよびＳから選択される０〜３個のヘテロ原子を含む５員または６員の芳香環または複素芳香環、Ｏ、ＮおよびＳから選択される０〜３個のヘテロ原子を含む二環系の９員または１０員の芳香環または複素芳香環系、またはＯ、ＮおよびＳから選択される０〜３個のヘテロ原子を含む三環系の１３または１４員の芳香環または複素芳香環系が含まれ、これらの環のそれぞれは低級アルキル、置換されたアルキル、置換されたアルキニル、＝Ｏ、ニトロ、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、−ＯＣＨ（ＣＯＯＨ）₂、シアノ、−ＮＲ⁴Ｒ⁴（ここでＲ⁴はそれぞれ独立に水素原子、低級アルキルまたはシクロアルキルであり、そして−Ｒ⁴Ｒ⁴が融合してＮと共に環を形成することができる）、アシルアミノ、フェニル、ベンジル、フェノキシ、ベンジルオキシ、ヘテロアリール、またはヘテロアリールオキシの１〜３個で必要に応じ置換されており、該フェニル、ベンジル、フェノキシ、ベンジルオキシ、ヘテロアリールおよびヘテロアリールオキシは低級アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、シアノ、フェニル、ベンジル、ベンジルオキシ、カルボキサミド、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、−ＮＯ₂および−ＮＲ⁴Ｒ⁴から選択される置換基１〜３個で必要に応じ置換されている。芳香族の６員〜１４員の炭素環には、例えば、ベンゼン、ナフタレン、インダン、テトラリンおよびフルオレンが含まれ、そして５員〜１０員の芳香族複素環には、例えば、イミダゾール、ピリジン、インドール、チオフェン、ベンゾピラノン、チアゾール、フラン、ベンズイミダゾール、キノリン、イソキノリン、キノクサリン、ピリミジン、ピラジン、テトラゾールおよびピラゾールが含まれる。「アルコキシ」とは直鎖状の、分岐した、または環状の構造を持つ炭素原子１〜８個の基およびそれらの組み合わせを指す。例としてはメトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、シクロプロピルオキシ、シクロヘキシルオキシおよび同種のものが挙げられる。「アシルアミノ」とは直鎖状の、分岐した、または環状の構造を持つ炭素原子１〜８個の基およびそれらの組み合わせを指す。例としてはアセチルアミノ、ブチルアミノ、シクロヘキシルアミノおよび同種のものが挙げられる。「ハロゲン」にはＦ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩが含まれる。「アリールアルキル」とは、アリール環に結合しているアルキル残基を指す。例としては、例えば、ベンジル、フェネチルおよび同種のものが挙げられる。「ヘテロアリールアルキル」とはヘテロアリール環に結合しているアルキル残基を指す。例としては、例えば、ピリジニルメチル、ピリミジニルエチルおよび同種のものが挙げられる。「置換された」アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルケニルまたはアルキニルとは、その中の各炭素原子上の水素原子３個までがハロゲン、ヒドロキシ、低級アルコキシ、カルボキシ、カルボアルコキシ、カルボキサミド、シアノ、カルボニル、−ＮＯ₂、ＮＲ⁵Ｒ⁵（ここでＲ⁵は水素原子、アルキルまたはアリールアルキルである）、アルキルチオ、スルホキシド、スルホン、アシルアミノ、アミジノ、フェニル、ベンジル、ヘテロアリール、フェノキシ、ベンジルオキシ、ヘテロアリールオキシおよび置換されたフェニル、ベンジル、ヘテロアリール、フェノキシ、ベンジルオキシまたはヘテロアリールオキシで置換されているアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルケニルまたはアルキニルを指す。図面の簡単な説明本発明のこれらの及び他の目的、特徴および長所は以下に述べる詳細な説明から下記の添付の図面を参照して読むとき明らかとなる。図１は内皮細胞の４テストグループに対する細胞当たりの「ＩＬＩＧＶ」として測定された蛍光分光法からの光学密度のグラフであって、高−ＬＤＬに誘導された内皮細胞の過酸化物生産に対するアポシニンの影響を示す。図２は内皮細胞の４テストグルーブに対する１０⁵細胞当たりの蛍光のグラフであって、高−ＬＤＬに誘導された内皮細胞のエンドサイトーシスに対するアポシニンの影響を示す。図３は内皮細胞の４テストグループに対する細胞当たりの「ＩＬＩＧＶ」として測定された蛍光分光法からの光学密度のグラフであって、アラキドン酸に誘導された内皮細胞の過酸化物生産に対するアポシニンの影響を示す。図４は高コレステロール食餌を与えられたウサギの腹部大動脈の切片の顕微鏡写真の印刷物である。図５は高コレステロール食餌と本発明のアポシニンも与えられたウサギの腹部大動脈の切片の顕微鏡写真の印刷物である。図６はアテローム性動脈硬化症を持つ患者２２名のそれぞれに対する過酸化水素生産の、対にされた対照と比較した場合の増加パーセント（すなわち、オキシダーゼ活性の増加）を示す棒グラフである。図７は、対照内皮細胞、ＰＭＡ曝露内皮細胞およびアポシニン１００μｇ／ｍｌで処理されたＰＭＡ曝露内皮細胞からの細胞質ゾル画分および膜画分のウエスタンブロットの印刷物であって、アポシニン処理細胞では膜画分にｐ４７_[phox] が存在しないことを示す。図８はアポシニンおよび精製アポシニンダイマーの存在下および非存在下にアラキドン酸に反応して全細胞内皮細胞音波処理物が発生するＯ₂ ^-を示すグラフである。発明の詳細な説明本発明は内皮の透過性の増大と関連する状態であるアテローム性動脈硬化症およびそれよ関連する疾患を予防および治療する方法を提供する。本発明によれば、アポシニンなどのＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤の投与が内皮細胞のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性化を阻害する。ＮＡＤＰＨオキシダーゼの活性化は酸化的爆発（反応性酸素種の発生の増大）の主要な細胞起源であり、これはアテローム発生原として知られる血清ＬＤＬレベルと関連する。この酸化的爆発は高められたエンドサイトーシスおよび内皮の高透過性を調節する。本発明はさらにＮＡＤＰＨオキシダーゼの活性を測定することによりアテローム性動脈硬化症−関連疾患の危険性を予想するための診断法を提供する。アテローム性動脈硬化症−関連疾患の記録された臨床歴を持つ個体あるいはその強い家族歴を持つ個体は、この病気の病歴または家族歴を何ら持たない人々よりも高いＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を持っている。本発明の方法の好ましいＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤はアポシニンである。アポシニンはオルトメトキシ置換されたカテコールであり、これはｐ４７_[phox] 細胞質ゾルのオキシダーゼサブユニットの膜画分への輸送を阻害することによりＮＡＤＰＨオキシダーゼ複合体の組立てを阻止するように作用する。１００μｇ／ｍｌのアポシニンの存在下および非存在下に１０ｎＭのＰＭＡとＥＣを１５分間接触させる研究を行った。続いて、ＥＣの細胞質ゾル画分および膜画分を単離した。ｐ４７_[phox]に対するモノクローン抗体を用いてこれらの画分のウエスタン・ブロット分析を行った。図７はアポシニンで処理されたＥＣの膜画分には細胞質ゾルのサブユニットｐ４７_[phox]が存在しないことを示す。本発明の好ましいＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤はアポシニンであるが、本発明の方法はアポシニンに限定されず、当分野で熟練した者には明らかであるように、内皮細胞のＮＡＤＰＨオキシダーゼを阻害することが知られている他の多様な化学物質を使用することもできる。アポシニンの場合には、完全な分子（オルト−メトキシフェノール）が阻害剤として有効であるように見え、さらに、代謝的酸化から生ずるダイマーも極めて有効であり、実際に活性種でありうる。このようにして、ダイマーの電子分布に類似の電子分布を持つ化合物はＮＡＤＰＨオキシダーゼの有効な阻害剤であり、本発明の中に包含される。有用な他のタイプのＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤の例としては、ロバスタチンやコンパクチン（米国特許第５，２２４，９１６号を参照）、ベンゾフラニルアルカンやベンゾテニルチオアルカンのカルボキシレート（ＥＰ出願第５５１，６６２号参照）、およびチトクロームｂ₅₅₈断片およびそれらのアナログ（ＰＣＴ出願ＷＯ９１／１７７６３号参照）などのイソプレニレーション阻害剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。既知のＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤の多くは活性複合体の組立てを妨害することにより作用すると信じられているが、本明細書で用いるときＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤という用語は機構に関して制限する意図は全くない。ＮＡＤＰＨオキシダーゼにより触媒される反応性酸素種の発生を阻害する物質はすべて「ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤」という用語により包含される。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤によりアテローム性動脈硬化症を治療するための請求された方法は、たまたまＮＡＤＰＨ阻害剤でもある化合物を用いる既知のアテローム性動脈硬化症治療法（その機構はこれまで知られていないが）とは区別することができる。請求された方法は、ＬＤＬ−コレステロールを減少させるには治療上無効である、すなわち血清ＬＤＬ−コレステロールの低下を１０％未満しか行えない既知の阻害剤（例えば、ロバスタチン）の投与を採用することができる。また、請求された方法はそれらがヒトＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼに対するよりもヒトＮＡＤＰＨオキシダーゼに対するＩＣ₅₀がより低いためＮＡＤＰＨオキシダーゼ複合体に標的化される阻害剤を採用する。本発明の目的では、ＩＣ₅₀は標準的実務に従い問題の酵素を５０％まで阻害するのに必要な阻害剤の濃度と定義される。ヒトＮＡＤＰＨオキシダーゼに対するＩＣ₅₀は米国特許第５，２４４，９１６号カラム１１〜１２に記載されているように測定し、ヒトＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼに対するＩＣ₅₀はエドワーズら〔J．Lipid Res．20，40-46(1979 )］により記載されたように測定する。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ測定の簡単な記述は次のようなものである。ヒト肝臓の断片を２５ｍｌの緩衝液Ａ（０．１Ｍスクロース、０．０５ＭのＫＣｌ、０．０４Ｍのリン酸カリウムおよび０．０３ＭのＥＤＴＡカリウム塩、ｐＨ７．２）中、４℃でホモゲナイズし、そしてエドワーズおよびゴールド［J．B iol．Chem. 247，1520-1524(1972)］により記述されたようにミクロソームを調製する。このミクロソームを約８２ｍｇタンパク／ｍｌの濃度になるように緩衝液Ａに再懸濁し、固体のＤＴＴを最終濃度１０ｍＭになるように添加しそしてミクロソームをホモゲナイズする。このミクロソーム懸濁液の３ｍｌ部分を、ヘラーおよびゴールド〔Biochem．Biophys．Res．Comm. 50, 859-865(1973)]により記述されたように、ガラス管の中で６〜８℃／分の速度で凍結し、そして２ヶ月までの間−２０℃に貯蔵する。レダクターゼの最適溶解のために、凍結したミクロソームを室温で融解させた後、３７℃に予め加温した緩衝液Ｂ（緩衝液Ａプラス１０ｍＭのＤＴＴ）中の５０％グリセロール等量を添加する。この懸濁液を再びホモゲナイズし、ついで３７℃で６０分間インキュベートする。この懸濁液を予め３７℃に加温した緩衝液Ｂで３倍希釈し、最終グリセロール濃度を８．３％とし、再ホモゲナイズしそして２５℃で１００，０００ｇで６０分間遠心分離する。可溶化されたＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを含むその上清を採り、直ちに使用する。可溶化されたＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの活性は、分光光度計を用い総量０．５ｍｌで３７℃で測定する。セル光路長は１．０ｃｍである。ＮＡＤＰＨの酸化速度は初めＨＭＧ−ＣｏＡの非存在下で測定しそしてこのブランク値を、それがあるなら、両基質で得られた速度から差し引く。最大活性は緩衝液Ｃ（０．２ＭのＫＣｌ、０．１６Ｍのリン酸カリウム、０．００４ＭのＥＤＴＡ、および０．０１ＭのＤＴＴ、ｐＨ６．８）中で、０．２ｍＭのＮＡＤＰＨおよび０．１ｍＭのＲＳ−ＨＭＧ−ＣｏＡと共に酵素を検定することにより得られる。酵素活性の１ユニットは１分間に２ナノモルのＮＡＤＰＨを酸化するのに必要な量として定義される。従って、１ユニットは１分間当たり１ナノモルのメバロン酸塩の合成と等価である。阻害は緩衝液Ｃの中で測定する。結果はテスト基質に対し５０％阻害濃度（ＩＣ₅₀）として表す。約１／２ｌｏｇで隔てられた６〜１０種のテスト基質濃度について２連でテストする。インキュベーションに添加するためテスト基質を緩衝液Ｃに溶解する。ＩＣ₅₀は直線補間により計算する。ＮＡＤＰＨオキシダーゼを阻害するがイソプレニレーションを阻害しない１クラスの阻害剤は、これらがメバロン酸塩の存在下および非存在下でヒトＮＡＤＰＨオキシダーゼに対し統計的に等価の阻害を及ぼすという事実により識別することができる（米国特許第５，２４４，９１６号、カラム１４第６０行〜カラム１５第３０行を参照）。イン・ビトロアポシニン実験高ＬＤＬの内皮細胞組織培養系を用いてイン・ビトロで実験を行った。内皮細胞はヒト臍帯静脈から単離しそしてＬＤＬ培地を添加した実験穴の中に入れた。組織培養の成分および化学薬品は市販されており、シグマ、ワーシングトン、およびギブコから入手した。ＬＤＬはヒト血液の血漿から単離した。アポシニンはカール・ロートGMhH（ドイツ）から入手可能である。アポシニンを用いてＮＡＤＰＨオキシダーゼの活性化を阻害し、それにより高められたエンドサイトーシスを防止する研究を行った。アポシニンは機能的なＮＡＤＰＨオキシダーゼ酵素複合体の組立てを妨害する。アポシニン研究では、１００μｇ／ｍｌのアポシニンの存在下および非存在下でＥＣを２４０ｍｇ／ｄｌのＬＤＬコレステロールと共にインキュベートした。図１および図２に示すように、アポシニンは（１）Ｈ₂Ｏ₂の生産の誘導および（２）高濃度のＬＤＬと関連するエンドサイトーシスの改変を効果的に阻害する。上述のように、アラキドン酸はＥＣのＨ₂Ｏ₂発生を誘導することによりＥＣのＮＡＤＰＨオキシダーゼを直接活性化し、アラキドン酸への曝露は高められたＥＣのエンドサイトーシスを促進する。アラキドン酸−誘導酸化的爆発がＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性化から生ずるというさらなる支持がアポシニンを用いてＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性化を阻止した次のテストの結果から得られる。ＥＣを１００μｇ／ｍｌのアポシニンの存在下および非存在下で１０μＭのアラキドン酸とインキュベートした。図３はアポシニンがＥＣのアラキドン酸−誘導Ｈ₂Ｏ₂発生を顕著に減少させた。アポシニンがＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を阻害するように作用するまでに約２分間のラグタイム（遅れの時間）のあることが示された。この遅延はアポシニンがＲＯＳおよびペルオキシダーゼの関与する化学反応で活性生産物まで代謝されるために必要な時間から生ずる。事実上この遅延の後に、細胞のＲＯＳ生産がほぼ完全に阻害される。アポシニンの活性代謝物は代謝的酸化から生ずるキノン様構造を持つダイマーと同定された。精製したアポシニンダイマーの存在下および非存在下にアラキドン酸に反応して生ずる全細胞ＥＣ音波処理物によるＲＯＳの発生を検討するための研究を行った。図８に示すように、精製したアポシニンダイマーの存在下では、ＲＯＳ発生のほぼ完全な阻害に対するラグタイムは存在しなかった。アポシニンの二量体化アポシニンダイマーの合成および単離Ｉ．合成１０ｍｇのアポシニンを５００ｍｌの蒸留水に容積測定により溶解してアポシニンの０．０２ｍｇ／ｍｌ水溶液を調製する。この溶液の最終モル濃度は１．２ ×１０^-4Ｍである。３０％Ｈ₂Ｏ₂（ｍ／ｍ，９．８Ｍ）の１ｍｌを蒸留水で１０ｍｌに容積測定により希釈して、３％Ｈ₂Ｏ₂（ｍ／ｍ）溶液を調製する。この溶液の最終モル濃度は０．９８Ｍである。固体のホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）５ｍｇを蒸留水５０ｍｌに容積測定により溶解してＨＲＰの０．１ｍｇ／ｍｌ溶液を調製する。洗浄し乾燥した２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中で、０．０２ｍｇ／ｍｌアポシニン溶液１００ｍｌを、０．１ｍｇ／ｍｌのＨＲＰ溶液１００μｌ（ミクロピペットにより添加）と混ぜる。マグネチックスターラーのバーを添加し穏和にこの溶液を攪拌する。反応は３％Ｈ₂Ｏ₂溶液２４μｌ（ミクロピペットにより添加）の添加により開始する。１０秒後に、０．１ＭのＮａ₂Ｓ₂Ｏ₃の１．５ｍｌを添加して反応混合物を停止させる。ついでこの溶液を２分間激しく攪拌した後、３Ｍ硫酸５滴を添加して溶液のｐＨを３から４に下げる。ついで、停止した反応混合物を二つの５０ｍｌずつに分ける。それぞれをジエチルエーテルで２回抽出（２×１５ｍｌ）し、そしてエーテル層を合わせる。合わせたエーテル抽出液を最小量の無水硫酸マグネシウム上で１０分間乾燥し、ついで重力ろ過する。このエーテルをロータリ・エバポレーターで除去し、得られる生産物、主としてアポシニンとアポシニンダイマーの混合物をＣＤＣｌ₃に溶解し¹Ｈ−ＮＭＲスペクトロスコピーで分析する。 II．単離 ¹Ｈ−ＮＭＲによる分析の後、ロータリ・エバポレーターでＣＤＣｌ₃を除去し、粗生産物混合物を最小量のＨＰＬＣグレードのメタノール中（＜１ｍｌ）に溶解する。懸濁する粒子が存在するときは、ＨＰＬＣカラムに注入する前にナイロン膜シリンジフィルターを用いてこの溶液をろ過する。ダイマーを単離するため、ＵＶ検出器を備えた調製用の逆相（Ｃ１８）ＨＰＬＣを用いる。移動相は５０：５０のメタノール：アセテート緩衝液（ｐＨ＝４）、そして検出には２６０ｎｍ波長を使用する。ロータリ・エバポレーター（約１時間）でダイマーを含む調製用の集めた溶液（１０〜２０ｍｌ）からメタノールを除去する。次いで、固相抽出フィルターカートリッジ（アルテックＣ18 500mg - 3ml）を、１０ｍｌＨＰＬＣグレードメタノールを引き、その後フィルターを通して１０ｍｌの蒸留水を引くことにより調製する。溶媒を除いた調製用溶液をフィルターに通し、ついで４ｍｌの蒸留水で濯ぐ。約１０分間このフィルターを乾燥し、ついでＨＰＬＣグレードのメタノールでカラムから押し出して集める（５×５ｍｌ）。このメタノールをロータリ・エバポレーターで除去し、単離されたダイマーを３ｍｌのＣＤＣｌ₃中に溶解する。ついでダイマーを¹Ｈ−ＮＭＲスペクトロスコピーで分析する。アポシニンダイマーの酸化還元反応出願人は仮説によって限定されることを望まないが、アポシニンはＮＡＤＰＨオキシダーゼを積極的に阻害するものの代謝滴前駆体であるように思われる。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性化の機構にさらなる洞察を得るために追加的な研究を行った。細胞の酵素であるホスホリパーゼＡ₂（ＰＬＡ₂）は膜のリン脂質を加水分解して細胞内にアラキドン酸を放出する。そのアンタゴニストであるｐ− ブロモフェナシルブロミド（ＢＰＢ）によるＰＬＡ₂の阻害は細胞質ゾルの遊離のアラキドン酸の上昇を抑制しそしてＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性化のこの二次的メッセンジャーを制限する。このようにして、ＰＬＡ₂の阻害はＬＤＬ−ＥＣ・ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性化を阻止する。これらの研究では、ＥＣは１０ μＭのＢＰＢの存在下および非存在下において２４０ｍｇ／ｄｌのＬＤＬ−コレステロールに曝された。ＢＰＢはＬＤＬ−ＥＣの反応性酸素種生産を顕著に減少させた。ＰＬＡ₂はＣａ²⁺−依存性の酵素である。同様に、Ｃａ²⁺は完全細胞においてＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性化のために必要とされる。ＰＬＡ₂−媒介アラキドン酸放出は細胞外Ｃａ²⁺濃度と平行する。ＬＤＬ−ＥＣが細胞のＣａ²⁺流入を増加させるか否かを決定するための研究を行った。これらの研究では、ＥＣを次第に増加するＬＤＬレベル（３０〜２４０ｍｇ／ｄｌコレステロール）と共にインキュベートし、そして細胞のＣａ²⁺流入をルイスら〔J．Clin．Invst., 82, 204 5-2055(1988)]により記述されたように⁴⁵Ｃａ²⁺の取り込み試験を用いることにより測定された。ＬＤＬ−ＥＣは細胞のＣａ²⁺流入の用量−依存的な上昇を促進することが見出された。ＬＤＬはＥＣをＨ₂Ｏ₂に曝すことによりＣａ²⁺の流入を誘導することができる。これは細胞のＣａ²⁺に対する透過性を惹起しそして細胞内のカルシウム上昇を生ずるのである。上のイン・ビトロの研究は、アテローム原性のＬＤＬレベルが高められたＥＣエンドサイトーシスを誘導しそしてＮＡＤＰＨオキシダーゼにより大量に作られる反応性酸素種が高められたＥＣエンドサイトーシスを調節することを明らかにした。再述すると、如何なる特定の理論に固執するつもりもないが、イン・ビトロでの上記の研究によれば、活性化されたＥＣ・ＮＡＤＰＨオキシダーゼにより発生させられる反応性酸素種は高コレステロール血症に誘導される、高められたＥＣエンドサイトーシスを介する血管の高透過性を調節するという仮説を立てることができる。高ＬＤＬとの接触は最初リン脂質からアラキドン酸を放出するホスホリパーゼＡ₂の活性を活性化する。細胞質の遊離のアラキドン酸は、閾値レベルでＮＡＤＰＨオキシダーゼの不活性な遺伝的変異型をその活性型に転換する。ＮＡＤＰＨオキシダーゼのこの遺伝的変異型は細胞膜を混乱させそしてＰＬＡ₂の活性化を増強する反応性酸素種の発生量を増加させる。ＰＬＡ₂活性化はさらに反応性酸素種により媒介される細胞のＣａ²⁺流入により増強される。膜のリン脂質から放出されるアラキドン酸はＮＡＤＰＨオキシダーゼ酵素複合体の補充および組立てを顕著に拡大する。この多重の、膜に結合した、組立てられた酵素複合体は過剰な量の反応性酸素種、Ｏ_2- ^-およびＨ₂Ｏ₂を発生させる。これらの反応性酸素種は膜の流動性を増加しそしてエンドサイトーシスのための活性化エネルギーを減少させる。これらのＬＤＬ−に誘導される細胞事象の組み合わせにより高められたＥＣエンドサイトーシス、血管の高透過性、およびトランスサイトーシスを介する細胞間輸送の増強を生ずる。このようにして、例えば、アポシニンを用いてＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性化を阻害すれば、高められたＥＣエンドサイトーシスを予防しそして血管の高透過性を減少させることになる。特定の理論に限定することを望む訳ではないが、アポシニンダイマーによるＮＡＤＰＨオキシダーゼの阻害はＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性化プロセスの中の電子伝達鎖の破壊を伴うという可能性がある。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性化はユビキノン（補酵素Ｑ）とチトクロームｂの間の電子伝達機能の共役を必要とする。ユビキノンよりもより低い還元電位を有する酸化型のダイマーはそのときその電子伝達鎖を妨害するであろう。イン・ビボにおけるアポシニン実験上記の仮説をテストするため、高コレステロール血症ウサギモデルを用いて、血管の高透過性に対するＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害の影響に焦点をおいた研究をイン・ビボで行った。ニュージーランド雄白ウサギをその飲み水に２００μｇ／ｍｌのアポシニンを添加し（ｎ＝５）および添加せず（ｎ＝５）、１％コレステロール食餌で飼育した。食餌の開始から１月後に、犠牲にする１分前に動物に透過性の指標としてホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を注入した。大動脈を切り取り、開き、そして解剖トレーにピンで止めた。巨視的観察では、アポシニン無添加の１％コレステロール食餌ウサギの大動脈は典型的な拡散した初期アテローム性動脈硬化症病巣を有していることが明らかであった。対照的に、アポシニンで処理された高コレステロール血症ウサギの大動脈には病巣が存在しないことが注目された。続いて、大動脈をジアミノベンジジンおよびＨ₂ Ｏ₂に接触させ、高ＨＲＰ濃度の部位に褐色の反応沈澱物を発生させた。アポシニン処理なしの高コレステロール血症ウサギの大動脈は顕著な、高ＨＲＰ濃度の拡散領域を有していた。しかしながら、アポシニンで同時に処理された高コレステロール血症動物の大動脈はＨＲＰ−陽性領域をほとんど示さず、標準のウサギ食餌を与えられたウサギで見られたパターンと同様のパターンを示した。高コレステロール血症ウサギの総血清コレステロールレベルはアポシニン添加ウサギと無添加ウサギとで同等であった。その飲み水にアポシニン３０μｇ／ｍｌ（ｎ＝２）、２００μｇ／ｍｌ（ｎ＝２）、４００μｇ／ｍｌ（ｎ＝２）、８００μｇ／ｍｌ（ｎ＝２）の添加、およびアポシニン無添加（ｎ＝２）で、１％コレステロール食餌を与えた１０頭のニュージーランド雄白ウサギを用いた３ヵ月間の研究も行った。３ヵ月後にその動物を犠牲にし、その大動脈を前と同様に検討した。視覚観察により、アポシニン処理なしの１％コレステロール食餌ウサギの大動脈はその表面の６０％の範囲でアテローム性動脈硬化症プラークで覆われた領域を有していた。対照的に、アポシニンで処理された高コレステロール血症ウサギの大動脈では病巣の用量−依存的な減少が注目された。２００μｇ／ｍｌより多くののアポシニンで処理された動物では、プラークで覆われた大動脈の表面は８％未満に減少した。アポシニン処理があっても無くても高コレステロール血症ウサギの総血清コレステロールレベルは同等であり約１０００ｍｇ／ｄｌであった。１ヵ月および３ヵ月ウサギ由来の大動脈の内皮の形態学的検討を行った。無差別の組織試料を高コレステロール血症ウサギおよびアポシニン処理高コレステロール血症ウサギの胸大動脈および腹大動脈から採取した。組織試料を薄い切片とし顕微鏡のために処理した。アポシニン無処理の高コレステロール血症ウサギ由来の試料を電子顕微鏡および光学顕微鏡で検討すると、アテローム性動脈硬化症の特徴である頻度の多い拡散性の血管変化が明らかになった。図４は代表的光学顕微鏡写真である。対照的に、アポシニンで処理された高コレステロール血症ウサギ由来の多種類の組織試料を検討すると、血管変化の証拠がほとんどないことが明らかになった。図５は代表的な光学顕微鏡写真である。冠状大動脈の内皮に対するＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害の影響を同様に検討した。腹部大動脈と同様に、冠状大動脈はアテローム性動脈硬化症の特徴である血管変化を示すことが見出された。そしてこれらの変化はアポシニンで処理することにより減少した。アポシニンが高められたＥＣエンドサイトーシスが生ずるのを予防することにより血管の高透過性を減少させるという実験的証拠を提供するために、ＥＣの管腔側および管腔の反対側（abluminal side）の上のエンドサイトーシス小胞の数をエンドサイトーシス活性の近似的尺度として顕微鏡写真から計算した。アポシニンで処理された高コレステロール血症ウサギおよび処理されなかったものの大動脈から無差別に選ばれた５０の細胞の電子顕微鏡写真を３５，０００×拡大で撮った。エンドサイトーシス小胞を管腔細胞側および管腔の反対側上で計測した。計測された小胞には原形質膜中で形成しつつあるものあるいは膜に明らかに結合しているものが含まれる。アポシニン処理動物におけるエンドサイトーシス小胞の数には有意な減少が観察され、これはアポシニンが作用してエンドサイトーシスの増加を防止することを示唆する。副作用３ヵ月間アポシニンで処理したウサギは病気の明白な徴候を示さなかった。アポシニン処理ウサギの３ヶ月の期間にわたる体重増加はアポシニン処理なしの動物の体重増加と同等であった。白血球はＮＡＤＰＨオキシダーゼを利用してＲＯＳを発生させ細菌類を殺すのであるから、アポシニンが感染に対する感受性を増加するおそれが予想されるかも知れない。しかしながら、ニュージーランド雄白ウサギにおける感染の発生率の増加はみられなかった。アポシニンのもう一つの理論的副作用は細胞増殖の阻害から生ずると考えられた。骨髄細胞および胃腸管細胞などの身体のある組織はより高い細胞増殖速度を有している。細胞成長研究は内皮細胞の増殖および平滑筋細胞の増殖に対するアポシニンの用量−依存性の影響を示した。１００μｇ／ｍｌのアポシニンで、細胞増殖速度は最小であったが、しかしながら、細胞の視覚的検査ではテストされたアポシニン濃度での細胞障害や細胞死の証拠は明らかでなかった。このようにして、ＲＯＳ発生を阻害する濃度では、アポシニンは細胞増殖を抑制するのに極めて有効である。結論イン・ビトロおよびイン・ビボでの上記の研究から、アポシニンなどのＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤の投与により、アテローム性動脈硬化症およびその関連疾患を含む内皮細胞の高透過性と関連する疾患を予防および治療することができる。アテローム性動脈硬化症の予防に加えて、アポシニンなどのＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤は膜透過性およびそれと関連する細胞増殖を減少させることにより下記の状態、すなわち、関節炎、癌、敗血症、発作後およびＭＩ後の組織の腫脹や再灌流障害、成人呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）、成長悪性疾患、移植後血管変化、脈管炎、喘息および糖尿病を予防および治療するのに有用でありうる。アポシニンなどの、ヒトに投与すべきＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤の最適投与量は、治療対象である状態の重篤度および性質、投与経路、患者の年齢、体重、および性により変化する。そしてそれは患者の受けている他の投薬あるいは治療されている患者の併発している重要な医学的状態の存在にも同様に依存して変化する。投与量およびおそらくは投与頻度も個々の患者の反応に応じて変化する。一般に、ここに記載された状態に対するアポシニンの総一日投与量の範囲は約１０ｍｇ／ｋｇ／日から約４５ｍｇ／ｋｇ／日であり、平均的なヒトの場合は１日の総投与量は約５００ｍｇから約３０００ｍｇであり、好ましくは分割投与される。患者を管理するには、治療は低い投与量、おそらく約２００ｍｇから約５００ｍｇで開始すべきであり、そして患者の全体的反応に応じて約１０００ｍｇまで増加すべきである。６５歳を越えた患者および腎機能または肝機能に障害を持つ患者は最初低い投与量を受け、しかも患者は個体の反応（複数）および血液レベル（複数）に基づいて滴定されることがさらに推奨される。当分野の熟練した者には明らかなように、ケースによっては、これらの範囲を越えた投与量を使用することが必要となることがある。さらに、臨床医すなわち治療している医師は、個々の患者の反応と関連して治療を如何にして何時中断し、調整し、または終了すべきかを知っていることに注意すべきである。「治療上有効な量」および状態を「予防するのに十分な量」という用語は、上記の投与量および投与頻度計画により包含される。適当な投与経路はいずれもアポシニンの有効な投与量を患者に投与するために用いることができる。例えば、経口、経直腸、非経口（皮下、筋肉内、静脈内）、経皮、エアロゾル、および同種の投与形態が使用できる。経口投与が好ましい。アテローム性動脈硬化症の危険性の予防に関する研究高められたエンドサイトーシス機構が専らアテローム原性のＬＤＬ型によりも内皮細胞の欠陥に関係するものならば、通常ならアテローム性動脈硬化症と関連する血漿ＬＤＬレベルを持つある人々がアテローム性動脈硬化症−関連疾患を発症していない理由を説明することができるであろう。ＥＣ欠陥という仮説は、アテローム性動脈硬化症の患者がＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の何らかの上昇を通常示すはずであるということも示唆する。この仮説を検証するために、９２名の別人のヒト臍帯から単離した細胞を用いて、イン・ビトロで９２の高ＬＤＬ−ＥＣエンドサイトーシス実験を行った。さらに、異なるヒト起源から毎週単離されたＬＤＬ調製物を２以上のヒト起源由来のＥＣ単離物に対して一般に使用し、このようにしてＬＤＬの影響の分析を行った。同一臍帯由来の内皮細胞はすべて高ＬＤＬレベルに曝すと類似のエンドサイトーシス活性を有していた。対照的に、異なる臍帯起源由来のＥＣは異なった反応を示し、対照の細胞と変化のないものから対照の細胞を越えて２００〜３００％の増加を示したエンドサイトーシス活性まで幅があった。テストしたＥＣ単離物の５２％で、高ＬＤＬとの接触による反応の程度に広い変動、すなわち５％から３００％に及ぶエンドサイトーシスの増加が誘発された。イン・ビトロでのこの観察はアテローム性動脈硬化症関連疾患による死亡率が約５０％で生ずることを示す疫学的研究と相関する。このＥＣ仮説に反して、もしアテローム原性ＬＤＬ型が存在するならば、多種のヒト起源由来のＥＣ単離物が同一のＬＤＬ調製物に曝されるとすべて類似の反応をすると予想されるであろう。テストしたＥＣ単離物は無反応型（０から５％のエンドサイトーシス増加）または反応型（５から３００％のエンドサイトーシス増加）と分類して分析した。結果は実験の僅か５３％ですべてのＥＣ単離物が同一のＬＤＬ調製物に曝されたとき反応したか反応しなかったかのいずれかであった。この発見の重要性はそれが高められたエンドサイトーシス機構は専らＥＣ欠陥に関連しておりアテローム原性ＬＤＬ型に関連するものではないという可能性を示唆することである。このようにして、高レベルのＬＤＬは高められたエンドサイトーシス機構を活性化するようである。この発見は通常アテローム性動脈硬化症と関連する血漿ＬＤＬレベルを持つある人々がアテローム性動脈硬化症−関連疾患を発症しない理由を説明し、そしてアテローム性動脈硬化症の個体の危険性を予想する本発明の方法に導く。高められたＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を持つ患者を同定することにより、アテローム性動脈硬化症の危険が増加していることを予想することができる。次いで、アテローム性動脈硬化症およびその関連疾患を予防するために、これらの同定された患者に対しアポシニンまたは他のＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤の投与を推奨することができる。ＮＡＤＰＨオキシダーゼまたはその活性化に関与する酵素の遺伝的変異型がヒト集団に存在するならば、そしてこれらの変異型の一部が過剰量の反応性酸素種を生成させるならば、これは臨床的アテローム性動脈硬化症と相関性を持つはずである。従って、ヒトについての研究を行った。これらの研究で、臨床的に記録されたアテローム性動脈硬化症−関連疾患の病歴を持つ個人あるいはそれらの強い家族歴を持つ個人における多形核白血球（ＰＭＮ）ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性をこの疾患の病歴または家族歴を持たない個人のそれと比較した。ボランティアからアテローム性動脈硬化症関連疾患の病歴や家族歴および静脈血試料が提供された。ＰＭＮ・ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性は２，７−ジクロロフルオレシンジアセテートを指標とし、蛍光プローブを備えた流動血球計算法により測定した。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性はＰＭＮゲートウインドーから蛍光測定を行うことにより測定した。これらの研究では、アテローム性動脈硬化症−関連疾患の臨床的に記録された病歴か家族歴かを持つ２２名の個人（実験）がこの疾患の臨床的証拠も家族歴も持たない１１名の個人（対照）と比較された。その結果は、図６に示すように、２２名の実験されたヒト個体は彼らと対にされた対照よりも有意に増加したＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を有していた（テストの有意性の確率は、Ｐ＜０．０７）。この発見はＮＡＤＰＨオキシダーゼ（またはその活性化に関与する酵素）の遺伝的変異型が存在すること、そしてこれらの遺伝的変異型を持つ人々がアテローム性動脈硬化症−関連疾患のより高い危険性を有していることを示唆する。本発明は具体的に示されそしてその好ましい態様に言及して記述されたが、本発明の精神および範囲を逸脱することなくその中で形式や詳細における他の変化がなされうることは当分野における熟練した者により理解されることである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９８年２月２３日【補正内容】請求の範囲１．内皮の高透過性から生ずる内皮下層スペースにおけるＬＤＬの蓄積を予防するための薬剤の調製における、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤の使用であって、該阻害剤が下記のものである使用、（ａ）ユビキノンよりも低い酸化還元電位を持つオルトメトキシフェノールの酸化型ダイマー、または（ｂ）その酸化型ダイマーがユビキノンよりも低い酸化還元電位を持つオルトメトキシフェノール、または（ｃ）次の式の化合物、または（ｄ）次の式の化合物、またはそれらの互変異性体上式中、Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³は、水素原子、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換アルキル、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、置換アルケニルおよび置換アルキニルより成る群から独立に選択されるものである。２．内皮の高透過性から生ずる内皮下層スペースにおけるＬＤＬの蓄積を予防するための薬剤の調製における、ｐ４７_[phox]の内皮細胞ｇｐ９１_[phox]およびｐ２２_[phox]膜結合ＮＡＤＰＨオキシダーゼ成分への転置阻害剤の使用。３．該転置阻害剤が次の式の化合物またはそれらの互変異性体である請求項２記載の使用、または上式中、Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³は、水素原子、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換アルキル、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、置換アルケニルおよび置換アルキニルより成る群から独立に選択されるものである。４．Ｒ¹およびＲ²がそれぞれメチルでありそしてＲ³が水素原子である、請求項１または請求項３記載の使用。【手続補正書】【提出日】１９９８年７月２２日【補正内容】請求の範囲１．内皮の高透過性から生ずる状態を治療または予防するための薬剤の調製におけるＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤またはＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤の代謝的前駆体の使用であって、該薬剤が１０％より多く血清ＬＤＬを低下させるには不十分な量の該ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤または該前駆体を含むものである使用。２．内皮の高透過性から生ずる状態を治療または予防するための薬剤の調製におけるＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤またはＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤の代謝的前駆体の使用であって、該ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤または該前駆体がヒトＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼに対するよりもヒトＮＡＤＰＨオキシダーゼに対して、より低いＩＣ₅₀を持つものである使用。３．内皮の高透過性から生ずる状態を治療または予防するための薬剤の調製におけるＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤またはＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤の代謝的前駆体の使用であって、該ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤または該前駆体がメバロン酸の存在下または非存在下にかかわらず統計学的に同等のヒトＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害を及ぼすものである使用。４．内皮の高透過性から生ずる内皮下層スペースにおけるＬＤＬの蓄積を予防するための薬剤の調製における、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤の使用であって、該阻害剤が下記のものである使用、（ａ）ユビキノンよりも低い酸化還元電位を持つオルトメトキシフェノールの酸化型ダイマー、または（ｂ）その酸化型ダイマーがユビキノンよりも低い酸化還元電位を持つオルトメトキシフェノール、または（ｃ）次の式の化合物、または（ｄ）次の式の化合物、またはそれらの互変異性体上式中、Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³は、水素原子、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換アルキル、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、置換アルケニルおよび置換アルキニルより成る群から独立に選択されるものである。５．Ｒ¹およびＲ²がそれぞれメチルでありそしてＲ³が水素原子である、請求項４記載の使用。６．内皮の高透過性から生ずる内皮下層スペースにおけるＬＤＬの蓄積を予防するための薬剤の調製における、Ｐ４７_[phox]の内皮細胞ｇｐ９１_[phox]およびｐ２２_[phox]膜結合ＮＡＤＰＨオキシダーゼ成分への転置阻害剤の使用。７．該転置阻害剤が次の式の化合物またはそれらの互変異性体である請求項６記載の使用、または上式中、Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³は、水素原子、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換アルキル、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、置換アルケニルおよび置換アルキニルより成る群から独立に選択されるものである。８．Ｒ¹およびＲ²がそれぞれメチルでありそしてＲ³が水素原子である、請求項７記載の使用。９．内皮の高透過性から生ずる疾患に罹病するヒト患者のリスクを予想する方法であって、（ａ）該患者から採取した血液のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を測定する工程、（ｂ）同時に行われた対照の活性範囲よりも１０％を越えるＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を示す血液を有する患者を確認する工程、を含んで成る方法。１０．内皮の高透過性から生ずる該疾患がアテローム性動脈硬化症である、請求項９記載の方法。１１．ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性が該血液から得られる多形核白血球（poly morphonuclear leukocytes）について測定されるものである、請求項９または請求項１０記載の方法。１２．該測定がフローサイトメトりー（flow cytometry）により達成されるものである請求項９〜請求項１１いずれか１項に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．内皮の高透過性から生ずる状態を患う哺乳類に対し、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤またはＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤の代謝的前駆体の治療上有効量を投与することを含む内皮の高透過性から生ずる状態を治療する方法であって、該ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤または該前駆体の該治療上有効量が１０％を越えるところまで血清ＬＤＬを低下させるには不十分である方法。２．内皮の高透過性から生ずる状態を患う哺乳類に対し、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤またはＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤の代謝的前駆体の治療上有効量を投与することを含む内皮の高透過性から生ずる状態を治療する方法であって、該ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤または該前駆体がヒトＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼに対するよりもヒトＮＡＤＰＨオキシダーゼに対してより低いＩＣ₅₀を持つものである方法。３．内皮の高透過性から生ずる状態を患う哺乳類に対し、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤またはＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤の代謝的前駆体の治療上有効量を投与することを含む内皮の高透過性から生ずる状態を治療する方法であって、該ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤または該前駆体がメバロン酸の存在下および非存在下においてヒトＮＡＤＰＨオキシダーゼに対し統計学的に等価の阻害を及ぼすものである方法。４．哺乳類に対しＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤またはＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤の代謝的前駆体の治療上有効量を投与することを含む内皮の高透過性から生ずる状態を治療する方法であって、該ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤または該前駆体の該治療上有効量が１０％を越えるところまで血清ＬＤＬを低下させるには不十分であるが内皮の高透過性から生ずる該状態を予防するには十分なものである方法。５．哺乳類に対し内皮の高透過性から生ずる状態を予防するのに十分な量のＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤またはＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤の代謝的前駆体を投与することを含む内皮の高透過性から生ずる該状態を予防する方法であって、該ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤または該前駆体がヒトＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼに対するよりもヒトＮＡＤＰＨオキシダーゼに対しより低いＩＣ₅₀を持つものである方法。６．哺乳類に対し内皮の高透過性から生ずる状態を予防するのに十分な量のＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤またはＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤の代謝的前駆体を投与することを含む内皮の高透過性から生ずる該状態を予防する方法であって、該ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤または該前駆体がメバロン酸の存在下および非存在下においてヒトＮＡＤＰＨオキシダーゼに対し統計学的に等価の阻害を及ぼすものである方法。７．哺乳類に対しｇｐ９１_[phox]およびｐ２２_[phox]膜結合ＮＡＤＰＨオキシダーゼ成分へのｐ４７_[phox]の転置を阻害する物質の治療上有効量を投与することを含む内皮の高透過性から生ずる状態を治療または予防する方法。８．該ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤または該前駆体が次の式の化合物である請求項１〜請求項６いずれか１項に記載の方法、上式中、Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³は、水素原子、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換アルキル、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、置換アルケニルおよび置換アルキニルより成る群から独立に選択されるものである。９．Ｒ¹およびＲ²がそれぞれメチルでありそしてＲ³が水素原子である、請求項８記載の方法。１０．該ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤または該前駆体が次の式の化合物またはそれらの互変異性体である、請求項１〜請求項６いずれか１項に記載の方法、上式中、Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³は、水素原子、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換アルキル、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、置換アルケニルおよび置換アルキニルより成る群から独立に選択されるものである。１１．Ｒ¹およびＲ²がそれぞれメチルでありそしてＲ³が水素原子である、請求項１０記載の方法。１２．該状態がアテローム性動脈硬化症である、請求項１〜請求項７いずれか１項に記載の方法。１３．該ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤または該前駆体が次の式の化合物である、請求項１２記載の方法、上式中、Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³は、水素原子、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換アルキル、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、置換アルケニルおよび置換アルキニルより成る群から独立に選択されるものである。１４．Ｒ¹およびＲ²がそれぞれメチルでありそしてＲ³が水素原子である、請求項１３記載の方法。１５．該ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤が次の式の化合物またはそれらの互変異性体である、請求項１２記載の方法、上式中、Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³は、水素原子、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換アルキル、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、置換アルケニルおよび置換アルキニルより成る群から独立に選択されるものである。１６．Ｒ¹およびＲ²がそれぞれメチルでありそしてＲ³が水素原子である、請求項１５記載の方法。１７．哺乳類に対しアポシニンの治療上有効量を投与することを含んで成るアテローム性動脈硬化症を治療または予防する方法。１８．内皮の高透過性から生ずる疾病に罹るヒト患者の危険性を予想する方法であって、高められたＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を持つ患者を同定する工程を含み、高められたＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性が比較された対照で見出される範囲を１０％以上越えているものと定義される方法。１９．内皮の高透過性から生ずる該疾病がアテローム性動脈硬化症である、請求項１８記載の方法。２０．該同定工程が該患者の血液から得た多形核白血球のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性のレベルを測定することを含むものである、請求項１８記載の方法。２１．該測定工程が流動血球計算法（flow cytometry）を用いるものである、請求項２０記載の方法。