DE10104825A1 - Screening von Antimalariamitteln - Google Patents

Screening von Antimalariamitteln

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Screening-Verfahren zur Identifikation von Arzneimitteln zur Behandlung und/oder zur Prophylaxe von Erkrankungen, die durch intrazelluläre Erreger ausgelöst werden, mit den folgenden Schritten: DOLLAR A a) Behandlung von nicht-infizierten Zellen mit einem Oxidationsmittel; DOLLAR A b) Behandlung mindestens eines Anteils der behandelten Zellen aus Schritt a) mit jeweils mindestens einem potentiellen Arzneimittel, während ein Anteil der behandelten Zellen aus Schritt a) unbehandelt bleibt; DOLLAR A c) quantitative Bestimmung des Hämolyse-Anteils der Anteile an Zellen in isosmotischer Sorbitol-Lösung, die mit mindestens einem potentiellen Arzneimittel in Schritt b) behandelt wurden, im Vergleich zum Hämolyse-Anteil des Anteils an Zellen in isosmotischer Sorbitol-Lösung, der in Schritt b) unbehandelt blieb. DOLLAR A Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung einer antioxidativ wirksamen Substanz, insbesondere Diphenyleneiodonium als eines seiner Salze oder eines Salzes seiner Derivate, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder zur Prophylaxe von Erkrankungen, die durch intrazelluläre Erreger ausgelöst werden, insbesondere zur Behandlung und/oder zur Prophylaxe von Malaria.

Description

Die Erfindung betrifft ein Screening-Verfahren zur Bestimmung von Antimalariamitteln und die Behandlung und Prophylaxe von Malaria mit solchen Mitteln.
Im Blutstadium seines Lebenszyklus vermehrt sich der Malariaerreger Plasmodium falciparum (P. falciparum) asexuell in humanen Erythrozyten und vergrößert dabei innerhalb von 48 h seine Körpermasse vielfach. Das schnelle Wachstum erfordert die Zulieferung von Nähr- und Aufbaustoffen sowie die Entsorgung von Abfallprodukten. Beides wird durch eine infektionsinduzierte Zunahme des Transportes über die Wirtszellmembran erreicht. Tracer­ flux-Untersuchungen und isosmotische Hämolyse-Experimente an Erythrozyten zeigen, daß die Infektion mit P. falciparum ein Transportsystem mit breiter Spezifität induziert, den sogenannten new permeability pathway (NPP). Der NPP transportiert eine Vielzahl von anionischen, kationischen und neutralen Substanzen wie etwa Sorbitol (H. Ginsburg, K. Kirk, in Malaria: Parasite biology, pathogenesis, and protection, LW. Sherman, Ed, (American Society for Microbiology, Washington, DC, 1998), pp. 219-232). Aufgrund der Sorbitol- Durchlässigkeit ihrer Plasmamembran werden infizierte Erythrozyten in Lösungen hämolysiert, in denen NaCl durch Sorbitol ersetzt wurde. Dabei wird die Hämolyse durch Wassereinstrom hervorgerufen, da Sorbitol in die Erythrozyten eindringen kann und osmotisch Wasser mitzieht. Der NPP ist für Cl- sehr viel besser durchlässig als für K+, und er wird durch mehrere Anionenkanal-Blocker gehemmt (K. Kirk, H. A. Hor, B. C. Elford, J. C. Ellory, C. I. Newbold, J. Biol. Chem. 269, 3339 (1994); W. V. Breuer, S. Kutner, J. Sylphen, H. Ginsburg, Z. I. Cabantchik, J. Cell Physiol. 133, 55 (1987); K. Kirk, H. A. Homer, D. J. Spillett, B. C. Elford, FEBS Lett. 323, 123 (1993); K. Kirk, H. A. Homer, Biochem. J. 311, 761 (1995); 5. Kutner, W. V. Breuer, H. Ginsburg, Z. I. Cabantchik, Biochem. Pharmacol. 36,123 (1987)). Jüngste Patch-clamp Experimente (siehe Definition vor den Beispielen) zeigten tatsächlich die Existenz eines einwärts-rektifizierenden Anionenkanales in P. falciparum infizierten Erythrozyten (A. S. Desai, S. G. Bezrukov, J. A. Zimmerberg, Nature 406, 1001 (2000)). Bisher war unklar, ob der NPP durch Plasmodium-kodierte Xenoproteine gebildet wird, die der Erreger in die Wirtszellmembran einbaut oder ob der NPP aus endogenen Erythrozytenproteinen besteht, die durch P. falciparum aktiviert werden.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Screening-Verfahren zur Bestimmung von Antimalariamitteln aufzufinden, das einfach anzuwenden ist und das Erkenntnisse des NPP nutzt. Darüber hinaus soll im Einsatz des Screening-Verfahrens eine neue Substanz ermittelt werden, die zur Behandlung von Malaria und/oder zur Prophylaxe geeignet ist.
Lösung dieser Aufgabe ist dann das Screening-Verfahren zur Bestimmung von Antimalariamitteln, bei dem die Oxidations-induzierte Hämolyse von nicht infizierten humanen Erythrozyten in Sorbitol verwendet wird.
Mit Ganzzell-Patch-clamp und Hämolyse-Experimenten wurden die Eigenschaften des NPP analysiert. Parasiten-infizierte, nicht aber normale Erythrozyten exprimierten einwärts­ rektifizierende und auswärts-rektifizierende Anionenkanäle, die unterschiedliche Hemmstoff- und Anionenselektivitäten aufweisen. Beide Kanäle wurden durch reduzierende Substanzen gehemmt. Umgekehrt konnten ähnliche Kanäle in nicht infizierten Erythrozyten durch Oxidation erzeugt werden. Möglicherweise liegt dies daran, daß P. falciparum endogene Erythrozytenkanäle durch Oxidation der Zellmembran aktiviert.
Es wurden mit der Patch-clamp-Technik die Eigenschaften des NPP definiert und der Mechanismus aufgedeckt, über den bei Malaria-infizierten Erythrozyten der NPP induziert wird. Darüber hinaus wurde überraschend gefunden, daß die Kanäle durch oxidativen Streß geöffnet werden und durch Hemmung der Oxidation verschlossen werden können.
In der anliegenden Zeichnung ist dargestellt
Fig. 1 Ganzzell-Patch-clamp Ableitungen (A: lichtmikroskopische Aufnahme, B: Originalstromspuren, C: Strom-/Spannungs-Beziehung)
Fig. 2 Ganzzell-Ströme (A bis C: Originalstromspuren, D, F: gemittelte Strom-/ Spannungs-Beziehungen, E, G: Leitfähigkeiten)
Fig. 3 Ganzzell-Ströme (A, C, E, G: Originalstromspuren, B, D, F, H: Strom-/ Spannungs-Beziehungen, I, J: Bestimmungen)
Fig. 4 Ganzzell-Ströme
Fig. 5 Fluorimeterbestimmungen
Die nachfolgenden Ausführungen, durch welche die Erfindung näher erläutert wird, beziehen sich auf die Beispiele 1 bis 5, zu denen die entsprechenden Fig. 1 bis 5 gehören.
Kontrollerythrozyten (22 aus 27 Zellen; Fig. 1A) zeigten Ganzzellströme von weniger als 100 pS (70 ± 11 pS (Datenanalyse und Statistik: Die Daten sind Mittelwerte ±SE; n = Zahl der Zellen/Experimente. Unterschiede zwischen Mittelwerten wurden mittels ungepaarten t-Test (zweiseitig) abgeschätzt.); Fig. 1B-C, links). Im Gegensatz dazu zeigten Ganzzellströme von P. falciparum infizierten Erythrozyten (Fig. 1A) durchweg Ströme im Bereich von 10 nS. Zwei verschiedene Typen von Leitfähigkeiten konnten unterschieden werden: Sieben von 42 Zellen zeigten ausschließlich einwärts rektifizierende Ströme (Fig. 1B, mitte) mit einer mittleren Leitfähigkeit Geinwärts von 7 ± 1 nS (Fig. 1C, mitte). Diese Ströme wurden durch den Cl--Kanalblocker 5-Nitro-2-(3-phenylpropylamino)-benzoesäure NPPB (100 µM; Fig. 2A) fast völlig, durch 4,4'-Diisothiocyano-stilben-2,2'-disulfonsäure DIDS (100 µM; Fig. 2B) nur wenig gehemmt. Ähnliche Befunde hatte zuvor Desai et al erhoben.
Die meisten infizierten Zellen (35 aus 42 Zellen) exprimierten hingegen eine auswärts rektifizierende Leitfähigkeit (Fig. 1B, rechts). Diese Leitfähigkeit (Gauswärts = 18 ± 1 nS, Fig. 1C; rechts) wurde irreversibel durch den Cl--Kanalblocker DIDS und reversibel durch NPPB, Glibenclamid, und Furosemid (jeweils 100 µM) gehemmt (Fig. 2B-E).
Ersatz von Cl- in der Badflüssigkeit durch Glukonat minderte den Auswärtsstrom und verschob das Umkehrpotential der auswärts rektifizierenden Leitfähigkeit parallel zur Änderung des Gleichgewichtspotentiales für Cl- (ECl), ein Hinweis auf eine Anionenselektivität des Kanales (Fig. 2F). Die aus dem Umkehrpotential unter bionischen Bedingungen errechnete Permselecktivität des auswärts-rektifizierenden Stromes war I- (= Br- = Cl-) < SCH- < Lactat < Glukonat (Fig. 2G).
Um zu überprüfen, ob die beobachteten Leitfähigkeiten auf eine Oxidation der Erythrozytenmembran durch den Erreger zurückzuführen sind, wurde die reduzierende Substanz Dithioerythrol (DTE, 100 µM) im Bad zugesetzt und hemmte binnen 5 min irreversibel die einwärts- und auswärts-rektifizierenden Ströme (Fig. 3A-D). Darüber hinaus wurden die Ströme durch reduziertes Glutathion (GSH; 10 mM) in der Pipettenlösung gehemmt, nicht aber durch oxidiertes Glutathion (GSSG; 10 mM) (Fig. 3E-H).
Hämolyse infizierter Erythrozyten in isosmotischer Sorbitol-Lösung wurde durch die Anionenkanalblocker NPPB, Furosemid und Glybenclamid als auch durch das Reduktionsmittel DTE (jeweils 100 µM) gehemmt (Fig. 3I-J). Dies ist ein Hinweis, daß beide Infektionsinduzierten Ströme das elektrophysiologische Korrelat des NPP sind und möglicherweise durch Oxidation verursacht werden.
Um weiter zu untersuchen, ob Oxidation der Erythrozyten-Zellmembran für die Induktion des NPP eine Rolle spielt, wurden nicht-infizierte Zellen mit t-Butylhydroxyperoxid vorbehandelt und dann in isosmotisches Sorbitol eingebracht. Fast 40% der Erythrozyten wurden binnen 2 h in isosomotischer Sorbitol-Lösung, nicht aber in isosmotischer Kochsalz-Lösung hämolysiert. Die Hämolyse wurde durch NPPB, Furosemid, oder Glybenclamid (jeweils 100 µM) abgeschwächt oder gänzlich unterdrückt (Fig. 4A-B). Darüber hinaus wurden die einwärts und auswärts rektifizierenden Ströme in einigen nicht infizierten Erythrozyten und den meisten t-Butyhydroxyperoxid-behandelten Erythrozyten beobachtet (Fig. 4C-E). Die durch oxidativen Streß hervorgerufenen Leitfähigkeiten waren somit den, durch Infektion mit P. falciparum ausgelösten Leitfähigkeiten ähnlich.
Hinweise für die Existenz von Cl--Kanälen in nicht infizierten humanen Erythrozyten wurden bereits zuvor berichtet (J. C. Freedman, C. Miller, Ann. NY Acad. Sci. 435, 541 (1984); W. Schwarz, R. Grygorczyk, D. Hof, Methods Enzymol. 173, 112 (1989); J. C. Freedman, T. S. Novak, J. D. Bisognano, P. R. Pratap, J. Gen. Physiol. 104, 961 (1994); J. C. Freedman, T. S. Novak, J. Gen. Physiol. 109, 201 (1997); S. M. Huber, N. Gamper, F. Lang, Pflügers Arch., im Druck. Die vorgelegten Befunde zeigen, daß diese Kanäle praktisch identisch zu den durch P. falciparum induzierten Kanälen sind. In der Abwesenheit von oxidativem Streß ist die Ganzzell-Leitfähigkeit im Bereich von wenigen pS (J. F. Hoffman, in Progress in Cell Research. The Band 3 proteins: anion transporters, binding proteins, and senescent antigens, E. Bamberg, H. Passow, eds. (Elsevier, Amsterdam, New York, 1992) vol. 2, pp. 173-178). Die durch Oxidation bzw. Malaria aktivierten Kanäle sind also normalerweise inaktiv und ihre Leitfähigkeit entsprechend gering. Daher ist auch die Sorbitol-induzierte Hämolyse in unbehandelten Erythrozyten minimal.
Nach der elektrophysiologischen Charakterisierung des NPP wurde die Auswirkung eines Oxidationsinhibitors sowie die verwendeten NPP-Inhibitoren auf das Wachstum von P. falciparum untersucht. Das intraerythrozytäre Wachstum der Malaria-Erreger konnte durch den Flavinproteininhibitor Diphenyleniodonium (DPI) (Fig. 5) im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle bei einer Konzentration von 10 µM moderat sowie ab einer Konzentration von 50 µM komplett inhibiert werden. Darüber hinaus hemmen hohe extrazelluläre Laktatkonzentrationen ebenfalls das Parasitenwachstum. Der Erreger ist daher ganz offensichtlich auf die durch Oxidation geöffneten Leitfähigkeiten angewiesen, um z. B. das von ihm generierte Laktat entsorgen zu können.
Außerdem wurden die bekannten Anioneninhibitoren auf ihre Wirksamkeit im in-vitro System getestet (Fig. 5). Dabei bestätigten sich frühere Daten von Cabantchik (Z. I. Cabantchik, S. Kutner, M. Krugliak, H. Ginsburg, Mol. Pharmacol. 23, 92 (1983)) und verifizieren damit das eingesetzte Sorbitol-Hämolysesystem zum Screening für mögliche Inhibitoren von P. falciparum als Grundlage für die Entwicklung neuer Chemotherapie gegen die Malaria.
Patch-clamp Ableitungen
Die Erythrozyten wurden in der Spannungsklemme im Ganzzell-Modus während konstanter Superfusion bei Raumtemperatur abgeleitet wie früher beschrieben (S. M. Huber, N. Gamper, F. Lang, Pflügers Arch., in Druck). Abgeleitet wurden Trophozoitstadium­ infizierte und nichtinfizierte Erythrozyten (Fig. 1) mit einer Badlösung bestehend aus (in mM:) 115 NaCl, 20 HEPES/NaOH pH 7.4, 5 CaCl2, 10 MgCl2. Die Pipettenlösung war (in mM): 115 NaCl, 0.5 EGTA, 10 MgCl2, and 20 HEPES/NaOH pH 7.4. Die Ganzzell- Ströme wurden charakterisiert durch Austausch der NaCl-Badlösung mit Lösungen bestehend aus 140 mM Na-X, 20 mM HEPES/NaOH pH 7.4 wobei X SCH-, I-, Br-, Laktat, bzw. Glukonat repräsentierte. Die Daten wurden für die "Liquid junction potentials" korrigiert.
Beispiel 1 Ganzzell-Patch clamp Ableitungen von P. falciparum infizierten Erytbrozyten
Aus Fig. 1 geht hervor: Der Laborstamm P. falciparum BINH (V. Q. Binh, A. J. Luty, P. G. Kremsner, Am. J. Trop. Med. Hyg. 57, 594 (1997)) wurde verwendet. Parasitenkultur, Synchronisation des Parasitenentwicklungsstadiums und Anreicherung von infizierten Erythrozyten erfolgte wie beschrieben (Cranmer, C. Magowan, J. Liang, R. L. Coppel, B. M. Cooke, Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 91, 363 (1997); W. Trager, J. B. Jensen, Science 193, 673 (1976); C. Lambros, J. P. Vanderberg, J. Parasitology 65, 418 (1979); J. B. Jensen, Am. J. Trop Med. Hyg. 27, 1274 (1978)). A: Lichtmikroskopische Aufnahme eines Trophozoit­ infizierten Erythrozyten während Ganzzell-Ableitung. B: Original Stromspuren aufgenommen in nicht infizierten humanen Erythrozyten (control; links) und zwei Trophozoit-infizierten Zellen, die einwärts-(Mitte) bzw. auswärts rektifizierende Ströme exprimierten (rechts). Die Ganzzell-Ströme wurden evoziert durch aufeinanderfolgende Spannungspulse vom -30 mV Haltepotential auf Potentiale zwischen -100 mV and +100 mV. In den Originalstromspuren sind die individuellen Spannungspulse übereinandergelagert abgebildet. C: Strom/Spannungs-(I/V)-Beziehung aufgenommen wie in B von nicht infizierten (n = 22; links) and Trophozoit-infizierten Zellen mit einwärts- (n = 7; Mitte) und auswärts rektifizierenden Strömen (n = 35; rechts).
Beispiel 2
Aus Fig. 2 geht hervor: Die Ganzzell-Ströme von infizierten Erythrozyten waren anionenselektiv. A-C: Originalstromspuren von jeweils einer infizierten Zelle mit einwärts- (A) und auswärts rektifizierenden Strömen (C) vor (control), während (NPPB), und nach (wash-out) Applikation von NPPB (100 µM) im Bad. (B) Originalstromspuren von einer infizierten Zelle, die beide Phänotypen exprimierte, aufgenommen vor (control; links) und nach Zugabe von DIDS (100 µM) zur Badlösung (DIDS; Mitte). Die DIDS-sensitive Stromfraktion war auswärts rektifizierend während die DIDS-insensitive Fraktion einwärts rektifizierte. Diese DIDS-insensitive Fraktion zeigt die I/V-Kurve (rechts) D: Gemittelte I/V-Kurven der DIDS- (100 µM; Dreiecke; n = 7) and NPPB (100 µM; Kreise; n = 6)- sensitiven Fraktionen des auswärts rektifizierenden Stroms. E: Prozentsatz der Auswärts- Leitfähigkeit, die durch NPPB, DIDS, Furosemid oder Glibenclamid (jeweils 100 µM; n = 3-5) in infizierten Erythrozyten mit auswärts rektifizierenden Strömen gehemmt wurde. F: Gemittelte I/V-Beziehungen von auswärts rektifizierenden Strömen, die in gepaarten Experimentne in NaCl (Kreise) and Na-Glukonat (Dreiecke; n = 6) aufgenommen wurden. G: Mittlere Verschiebung des Umkehrpotentials dieser Ströme verursacht durch Substi­ tution von Cl- im Bad durch die angegebenen Anionen (n = 4-9; *: p = 0.05).
Beispiel 3
Aus Fig. 3 geht hervor: Die Reduktion hemmte die Infektion-induzierten Ströme and die Hämolyse in isosmotischem Sorbitol A-D: Originalspuren von einwärts- (A) und auswärts rektifizierende Strömen (C) vor (links) und nach Inkubation mit DTE (100 µM; rechts). In (B) und (D) sind die entsprechenden DTE-sensitiven Stromfraktionen (n = 1 bzw. n = 6) gegen die Spannung aufgetragen. E-H: "Run-down" von Infektion-induzierten Strömen durch reduziertes Glutathion (GSH; 10 mM) zugegeben zur Pipettenlösung. Originalspuren von einwärts- (E) und auswärts rektifizierenden Strömen (G) während kontinuierlicher Ganzzell-Ableitung. Die Inkubationszeit ist angegeben. In (F; n = 1) und (H, Dreiecke; n = 5) sind die I/VKurven der entsprechenden GSH-sensitiven Stromfraktionen. Zusätzlich zeigt der I/V-Plot in (H), daß Zugabe der oxidierten Form von Glutathion (GSSG; 10 mM) zur Pipettenlösung in ungepaarten Kontrollexperimenten die auswärts rektifizierenden Ströme nicht inhibiert (schwarze Kreise; n = 4). I-J: Angereicherte Trophozoit-infizierte Erythrozyten wurden suspendiert in isosmotischer Sorbitol-Lösung (5%), oder zur Kontrolle in NaCl und für S-10 min bei 37°C in An- bzw. Abwesenheit von DIDS, NPPB, Furosemid, Glibenclamid bzw. DTE (jeweils 100 µM) hämolysiert. Nach Zentrifugation wurde die Hämoglobinkonzentration des Überstands photometrisch bestimmt (gezeigt in (I) in einem Experiment in Duplikaten). In (J) ist die DTE (100 µM) inhibierte Fraktion, ausgedrückt als Prozentsatz der gesamten Hämolyse, die durch NPPB blockiert werden konnte (n = 8-13; **: P = 0.01).
Beispiel 4 Oxidation-induzierte isosmotische Hämolyse und einwärts/auswärts rektifizierende Ströme in nicht-infizierten Erythrozyten
Aus Fig. 4 geht hervor: Kontroll-Erythrozyten wurden bis zu einem Hämatokrit von 0.05 in NaCl-Ringer (in mM: 140 NaCl, 10 HEPES/NaOH pH 7.4, 5 KCl, MgCl2 1; CaCl2 2.5) resuspendiert und aliquotiert (500 µl). Zu den Aliquoten wurde NaCl-Ringer (1 ml) mit/ohne 1.5 mM t-Butylhydroxyperoxid zugegeben, und die Zellen wurden für 10 min inkubiert und dann herunterzentrifugiert (5 min/1500 rpm). Die Zellpellets wurden resuspendiert in 5% Sorbitol/5 mM HEPES/NaOH pH 7.4 (400 µl) oder im gleichen Volumen von NaCl-Ringer. Die Zellen wurden bei 37°C in An- bzw. Abwesenheit von NPPB, Furosemid, bzw. Glibenclamid (alle 100 µM) inkubiert. Nach 120 minütiger Inkubation wurden die Proben abzentrifuguert (5 min/1500 rpm) und die Hämoglobinkonzentration in 200 µl des Überstands photometrisch bestimmt (200 µl). A: Hämoglobin im Überstand von unbehandelten (oberen Reihen) und oxidierten Kontroll- Erythrozyten (Reihe 3 und 4) nach 2 h Inkubation in Sorbitol (oder zur Kontrolle in NaCl) in Ab- (control, NaCl) und Anwesenheit von verschiedenen Blockern (gezeigt ist ein individuelles Experiment in Duplicaten). B: Mittlere Oxidation-induzierte Hämolyse in Sorbitol- (schwarze Säulen; n = 6-8) und NaCl-Lösung (n = 4; weiße Säule) in Ab- (control, NaCl) und Anwesenheit der angegebenen Blocker (alle 100 µM). C-D: Einwärts rektifizierende Ströme in nicht infizierten Erythrozyten. Originalstromspuren (C, links) und gemittelte I/V-Kurve (D) aufgenommen in unbehandelten (n = 1) oder oxidierten Zellen (n = 9). Der Kasten in (C) zeigt Einzelkanalereignisse, die aus den Ganzzell-Spuren (links) herausvergrößert wurden. E: Auswärts rektifizierende Ströme in nicht infizierten Kontroll- Erythrozyten. Original Stromspuren in NaCl (links) und Na-Gukonat (rechts) Badlösung einer Zelle mit spontanen Strömne. F: I/V-Beziehung von auswärts rektifizierende Strömen in unbehandelten (n = 4) und oxidierten Kontroll-Erythrozyten (n = 7) aufgenommen in NaCl Badlösung.
Beispiel 5 Inhibition des intaerythrozytären Plasmodium-Wachstums durch Furosemid, NPPB, Glibenclamid und Diphenyleneiodium Chloride
Aus Fig. 5 geht hervor: Ring-Stadium infizierte Erythrozyten (Laborstamm BINH) wurden bei einem Hämatokrit von 1% und einer Parasitaemie von 1% kultiviert und mit verschiedenen Konzentrationen der angegebenen Blocker inkubiert. Nach 48 h wurden die Kulturen geerntet, mit Ethidiumbromid angefärbt und das Überleben der Parasiten mittels FACS analysiert (Becton Dickinson Fluorometer). Dargestellt ist die Parasitämie (Prozentsatz der infizierten Erythrozyten) in Mittelwerten (±SE; n = 6; c: Kontrolle) von zwei unabhängigen Experimenten jeweils bestimmt in Triplikaten.

Claims (2)

1. Screening-Verfahren zur Bestimmung von Antimalariamitteln, bei dem die Oxidations-induzierte Hämolyse von nicht infizierten humanen Erythrozyten in Sorbitol verwendet wird.
2. Diphenyleniodonium als antioxidativ wirksame Substanz in der Behandlung und/oder Prophylaxe von Malaria.
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