WO2002061421A2

WO2002061421A2 - Screening-verfahren zur identifikation von arzneimitteln

Info

Publication number: WO2002061421A2
Application number: PCT/EP2002/001097
Authority: WO
Inventors: Florian Lang; Stefan Huber
Original assignee: Florian Lang; Stefan Huber
Priority date: 2001-02-01
Filing date: 2002-02-01
Publication date: 2002-08-08
Also published as: DE10104825A1; AU2002235892A1; WO2002061421A3

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Screening-Verfahren zur Identifikation von Arzneimitteln zur Behandlung und/oder zur Prophylaxe von Erkrankungen, die durch intrazelluläre Erreger ausgelöst werden, mit den folgenden Schritten: a) Behandlung von nicht-infizierten Zellen mit einem Oxidationsmittel; b) Behandlung mindestens eines Anteils der behandelten Zellen aus Schritt a) mit jeweils mindestens einem potentiellen Arzneimittel, während ein Anteil der behandelten Zellen aus Schritt a) unbehandelt bleibt; c) Quantitative Bestimmung des Hämolyse-Anteils der Anteile an Zellen in isosmotischer Sorbitol-Lösung, die mit mindestens einem potentiellen Arzneimittel in Schritt b) behandelt wurden, im Vergleich zum Hämolyse-Anteil des Anteils an Zellen in isosmotischer Sorbitol-Lösung, der in Schritt b) unbehandelt blieb. Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung einer antioxidativ wirksamen Substanz, insbesondere Diphenyleneiodonium als eines seiner Salze oder eines Salzes seiner Derivate, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder zur Prophylaxe von Erkrankungen, die durch intrazelluläre Erreger ausgelöst werden, insbesondere zur Behandlung und/oder zur Prophylaxe von Malaria.

Description

Screening -Verfahren zur Identifikation von Arzneimitteln zur Behandlung oder zur Prophylaxe von Erkrankungen, die durch mtrazelluläre Erreger ausgelöst werden

Die Erfindung betrifft ein Screening- Verfahren zur Identifikation von Arzneimitteln zur Behandlung und Prophylaxe von Erkrankungen, welche durch intrazelluläre Erreger ausgelöst werden, mit den folgenden Schritten:

a) Behandlung von mcht-infizierten Zellen mit einem Oxidationsmittel; b) Behandlung mindestens eines Anteils der behandelten Zellen aus Schritt a) mit jeweils mindestens einem potentiellen Arzneimittel, während ein Anteil der behandelten Zellen aus Schritt a) unbehandelt bleibt; c) quantitative Bestimmung des Hämolyse-Anteils des Anteils an Zellen in isosmotischer Sorbitol-Losung, die mit mindestens einem potentiellen Arzneimittel in Schritt b) behandelt wurden, im Vergleich zum Hämolyse- Anteil des Anteils an Zellen in isosmotischer Sorbitol-Losung, der in Schritt b) unbehandelt blieb.

Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung von Antioxidantien oder NADPH-Oxidase- Hemmer, wie insbesondere Diphenyleneiodoniumchlorid, einem anderen seiner Salze oder eines seiner Derivate zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und oder zur Prophylaxe von Malaria.

Im Blutstadium seines Lebenszyklus vermehrt sich der Malariaerreger Plasmodium falciparum (P. falciparum) asexuell in humanen Erythrozyten und vergrößert dabei innerhalb von 48h seine Körpermasse vielfach. Das schnelle Wachstum erfordert die Zulieferung von Nähr- und Aufbaustoffen für P. falciparum in den befallenen Erythrocyten, sowie die Entsorgung von Abfallprodukten des Malariaerregers aus der Zelle. Beides wird durch eine infektionsinduzierte Zunahme des Transportes über die Wirtszellmembran erreicht. Tracer- flux-Untersuchungen und isosmotische Hämolyse-Experimente an Erythrozyten zeigen, daß die Infektion mit P. falciparum ein Transportsystem mit breiter Spezifität induziert, den sogenannten new permeability pathway (NPP). Der NPP transportiert eine Vielzahl von anionischen, kationischen und neutralen Substanzen wie etwa Sorbitol (H. Ginsburg, K. Kirk, in Malaria: Parasite biology, pathogenesis, and protection, I.W. Sherman, Ed, (American Society for Microbiology, Washington, DC, 1998), pp. 219-232). Aufgrund der Sorbitol- Durchlässigkeit ihrer Plasmamembran werden infizierte Erythrozyten in Lösungen hämolysiert, in denen NaCl durch Sorbitol ersetzt wurde. Dabei wird die Hämolyse durch Wassereinstrom hervorgerufen, da Sorbitol in die Erythrozyten eindringen kann und osmotisch Wasser mitzieht. Der NPP ist für Cl^" sehr viel besser durchlässig als für K⁺, und er wird durch mehrere Anionenkanal-Blocker gehemmt (K. Kirk, H.A. Horner, B.C. Elford, J.C. Ellory, CL Newbold, J. Biol. Chem. 269, 3339 (1994); W.V. Breuer, S. Kutner, J. Sylphen, H. Ginsburg, Z.I. Cabantchik, J. Cell Physiol. 133, 55 (1987); K. Kirk, H.A. Horner, DJ. Spillett, B.C. Elford, FEBS Lett. 323, 123 (1993); K. Kirk, H.A. Horner, Biochem. J. 311, 761 (1995); S. Kutner, W.V. Breuer, H. Ginsburg, Z.I. Cabantchik, Biochem. Pharmacol. 36,123 (1987)). Jüngste Patch-clamp Experimente zeigten tatsächlich die Existenz eines einwärts- rektifizierenden Anionenkanales in P. falciparum infizierten Erythrozyten (A. S. Desai, S. G. Bezrukov, J. A. Zimmerberg, Nature 406, 1001 (2000)). Bisher war unklar, ob der NPP durch Plasmodium-kodierte Xenoproteine gebildet wird, die der Erreger in die Wirtszellmembran einbaut oder ob der NPP aus endogenen Erythrozytenproteinen besteht, die durch P. falciparum aktiviert werden. Weiterhin stellte sich die Frage, über welchen Mechanismus der NPP in Plasmodium-infizierten Erythrocyten induziert wird.

Es ist anzunehmen, daß außer dem Malaria-Erreger auch andere intrazelluläre Krankheitserreger, so insbesondere die Erreger der Tuberkulose, der Hühnerpest, der Legionellose oder der Gonorrhoe, von der Versorgung und Entsorgung durch Kanäle in der Zellmembran abhängen, wobei die Aktivität dieser Kanäle wahrscheinlich durch einen Infektions- vermittelten Mechanismus beeinflußt wird. Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Screening- Verfahren zur Identifikation von Arzneimitteln bereitzustellen, das auf neuen Erkenntnissen über die Identität der zum NPP beitragenden Kanäle, sowie über den Induktionsmechanismus des NPP in Plasmodium falciparum-infizierten Erythrocyten basiert.

Es ist weiterhin Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die oben genannten Erkennisse über den Induktionsmechanismus des NPP in Plasmodium-infizierten Erythrocyten bei Malaria auf bisher unbekannte Induktionsmechanismen bei ähnlichen Erkrankungen, die wie Malaria durch intrazelluläre Erreger verursacht werden, zu übertragen, so insbesondere auf die Erkrankungen Tuberkulose, Hühnerpest, Legionellose und Gonorrhoe. Dadurch könnte ein Screening- Verfahren zur Identifikation von Arzneimitteln zur Behandlung und zur Prophylaxe von Erkrankungen bereitgestellt werden, die durch intrazelluläre Erreger verursacht werden. Weiterhin sollte ein solches erfmdungsgemäßes Screening-Verfahren so einfache Einzelschritte umfassen, daß es auch in großem Maßstab, d.h. zum Screenen komplexer Substanz-Bibliotheken, praktikabel ist.

Darüberhinaus ist es Aufgabe der Erfindung durch Einsatz des Screening- Verfahrens neue Substanzen oder auch neue Verwendungen von Substanzen zu ermitteln, die zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder zur Prophylaxe von Erkrankungen, die durch intrazelluläre Erreger ausgelöst werden, geeignet sind, insbesondere zur Behandlung und/oder zur Prophylaxe von Malaria.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte gezeigt werden, daß als Folge der Infektion der Erythrocyten mit dem Malaria-Erreger Plasmodium falciparum die zum NPP beitragenden Kanäle in der Erythrocytenmembran oxidiert werden. Durch diese Oxidation werden die zum NPP beitragenden Kanäle aktiviert und können daraufhin zur Versorgung des intrazellulären Erregers, in diesem Fall des Malaria-Erregers Plasmodium falciparum;, mit Nährstoffen und zur Entsorgung von Abfallprodukten des Erregers beitragen.

Es ist weiterhin anzunehmen, daß dieser erfindungsgemäße Mechanismus zur Aktivierung endogener Zellkanäle durch Oxidation infolge der Infektion der Zelle mit intrazellulären Krankheitserregern nicht auf den Malaria-Erreger Plasmodium falciparum beschränkt ist. Es ist vielmehr zu erwarten, daß auch bei weiteren Krankheiten, die ähnlich wie Malaria durch die Infektion von humanen Zellen mit intrazellulären Erregern ausgelöst werden, die zum NPP beitragenden Kanäle oder auch andere Bestandteile, insbesondere andere Kanäle, in der Membran als Folge der Infektion der Zelle oxidiert werden. Durch eine solche Infektions- abhängige Oxidation können diese Kanäle aktiviert werden, um so letztlich zur Versorgung des intrazellulären Krankheitserregers mit Nährstoffen, sowie zur Entsorgung seiner Abfallprodukte aus der infizierten Zelle beizutragen.

Die erfindungsgemäße Aufgabe konnte so gelöst werden, daß ein Screening- Verfahren zur Identifikation von Arzneimitteln zur Behandlung und Prophylaxe von Erkrankungen, welche durch intrazelluläre Erreger ausgelöst werden, mit den folgenden Einzelschritten bereitgestellt wurde: a) Behandlung von nicht-infizierten Zellen mit einem Oxidationsmittel; b) Behandlung mindestens eines Anteils der behandelten Zellen aus Schritt a) mit jeweils mindestens einem potentiellen Arzneimittel, während ein Anteil der behandelten Zellen aus Schritt a) unbehandelt bleibt; c) quantitative Bestimmung des Hämolyse-Anteils der Anteile an Zellen in isosmotischer Sorbitol-Losung, die mit mindestens einem potentiellen Arzneimittel in Schritt b) behandelt wurden, im Vergleich zum Hämolyse- Anteil des Anteils an Zellen in isosmotischer Sorbitol-Losung, der in Schritt b) unbehandelt blieb.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden die Eigenschaften des NPP durch Ganzzell-

Patch-clamp und Hämolyse-Experimente analysiert. Insbesondere konnte der Mechanismus aufgeklärt werden, über den bei Plasmodium-infizierten Erythrozyten der NPP induziert wird.

So konnte gezeigt werden, daß Parasiten-infizierte, nicht aber nicht infizierte Erythrozyten die Aktivität einwärts- rektifizierender und auswärts- rektifizierender Anionenkanäle mit unterschiedlichen Hemmstoff- und Anionenselektivitäten aufweisen. Diese beobachteten Leitfähigkeiten wurden durch Cι^"-Kanal-Blocker wie 5-Nitto-2-(3-phenylpropylamino)- benzoesäure (NPPB), 4,4'-Diisothiocyano-stilben-2,2'-disulfonsäure DIDS, zum Teil auch durch Glibenclamid, und Furosemid gehemmt. Eine solche Abhängigkeit der Kanalaktivität in Erythrocyten von der Infektion mit Plasmodium falciparum wäre auch von Kanälen zu erwarten, die zum NPP beitragen. Es ist daher anzunehmen, daß diese durch Parasiten- Infektion induzierbaren Aktivitäten eines einwärts- und eines auswärts- rektifizierenden Anionenkanals zum NPP beitragen (siehe Beispiel 1 und Fig. 1 und 2).

Weiterhin konnte gezeigt werden, daß beide Kanäle durch reduzierende Substanzen gehemmt werden. Umgekehrt konnten ähnliche Kanal-Aktivitäten auch in mcht-infizierten Erythrozyten durch Oxidation erzeugt werden (siehe Beispiel 2 und Fig. 3 und 4). Diese Beobachtung spricht deutlich dafür, daß es sich bei diesen für den NPP verantwortlichen Kanälen um endogene Erythrocyten-Kanäle und nicht um Plasmodium falciparum-kodierte Proteine handelt. Die Aktivität dieser endogenen Erythrocyten-Kanäle wird mit großer Wahrscheinlichkeit lediglich durch die Oxidation der Erytlirocyten-Membran bzw. insbesondere durch die Oxidation der zum NPP beitragenden Kanäle induziert. Weiterhin läßt sich aus den erfindungsgemäßen Daten schließen, daß das eigentliche aktivitäts-induzierende Ereignis für die zum NPP beitragenden Kanäle in der Oxidation von Zellmembrankomponenten liegt. So werden vermutlich die zum NPP beitragenden endogenen Erythrocytenkanäle durch oxidativen Streß, der eine Folge der Infektion mit Plasmodium falciparum ist, geöffnet und durch Hemmung der Oxidation geschlossen.

Weiterhin konnte im Rahmen der vorliegenden Erfindung gezeigt werden, daß die Aktivität der endogenen, zum NPP beitragenden Erythrocyten-Kanäle mit dem zu beobachtenden Ausmaß an Hämolyse der Erythrocyten in isosmotischer Sorbitol-Losung direkt korreliert. Sind die endogenen, zum NPP beitragenden Erythrocyten-Kanäle aktiv, so wird das Sorbitol aus dem extrazellulären Raum in die Erythrocyten transportiert. Da Sorbitol eine osmotisch aktive Substanz ist, führt der Transport von Sorbitol in die Zelle zusätzlich zur Aufnahme von Wasser durch Osmose, wodurch der Erythrocyt letztlich hämolysiert wird. Die Aktivität der zum NPP beitragenden Kanäle in der Erythrocytenmembran sollte hierbei linear abhängig von der zu beobachtenden Hämolyse der Erythrocyten in isosmotischer Sorbitol-Losung sein. Diese Erkenntnis konnte im Rahmen der vorliegenden Erfindung dazu verwendet werden, einen einfachen, quantitativ auswertbaren Zell-Hämolyse-Assay zu entwickeln, der die Aktivität der zum NPP beitragenden Kanäle quantitativ wiederspiegelt und sich daher zum Einsatz in high-throughput-screening- Verfahren eignet.

Diese erfindungsgemäßen Erkenntnisse über die Identität der zum NPP beitragenden Kanäle, und deren mfektions-vermittelte Induktion durch Oxidation führten letzlich zur Entwicklung des oben genannten Screening-Verfahrens zur Identifikation von Arzneimitteln zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, die von intrazellulären Erregern ausgelöst werden, mit den Schritten a) bis c).

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens betrifft ein Screemng-Verfahren zur Identifikation von Antimalariamitteln, bei dem in den Verfahrensschritten a) bis c) nicht infizierte Erythrocyten, vorzugsweise humane nicht infizierte Erythrocyten, verwendet werden.

Eine alternative, ebenfalls bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens betrifft ein Screemng-Verfahren zur Identifikation von Arzneimitteln zur Behandlung und Prophylaxe von Erkrankungen ausgewählt aus der Gruppe Tuberkulose, Hühnerpest, Legionellose und Gonorrhoe. Bei dieser alternativen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Screening-Verfahrens werden statt nicht infizierter Erythrocyten in der Regel andere Zellen, insbesondere solche Zellen, die bei der betreffenden Erkrankung von dem jeweiligen Erreger infiziert werden, in den Verfahrensschritten a) bis c) eingesetzt. Auch die Verwendung von geeigneten Zellinien im Screening- Verfahren ist hierbei generell möglich.

Die einzelnen Schritte des Screening-Verfahrens a) bis c) werden in den folgenden Ausführungen am Beispiel eines Screening-Verfahrens zur Identifikation von Antimalariamitteln zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Malaria näher erläutert, ohne jedoch auf diese Ausführungen beschränkt zu sein. Bei DurcMuhrung der alternativen Ausführungsform des Screening-Verfahrens zur Identifikation von Arzneimitteln zur Behandlung und/oder zur Prophylaxe von Erkrankungen aus der Gruppe Tuberkulose, Hühnerpest, Legionellose und Gonorrhoe werden die einzelnen Schritte an den betreffenden Krankheits-relevanten Zellen analog den folgenden Ausführungen durchgeführt.

In Schritt a) werden nicht infizierte, bevorzugt humane Erythrocyten, mit einem Oxidationsmittel behandelt.

Die hierbei eingesetzten Erythrocyten werden gegebenenfalls durch Zentrifugations- und Resuspensionsschritte gewaschen und in einer Natriumchlorid-haltigen Lösung resuspendiert. Die Natriumchlorid-haltige Lösung ist vorzugsweise eine Lösung enthaltend 140 mM NaCl; 10 mM HEPES/NaOH pH 7,4; 5 mM KC1; 2,5 mM CaCl₂; ImM MgCl₂ und wird vorzugsweise in einem solchen Volumen zugegeben, daß sich eine Zellsuspension mit einem Hämatokrit 1 % bis 20 %, vorzugsweise von 4% bis 10 %, insbesondere von 5% ergibt Die so erhaltene Zellsuspension kann gegebenenfalls bei 8°C für 1 bis 7 Tage gelagert werden.

Als Oxidationsmittel kann generell jede bekannte oxidativ wirkende Substanz eingesetzt werden. Bevorzugt wird Wasserstoffperoxid, stärker bevorzugt die Substanz t- Butylhydroxyperoxid als Oxidationsmittel eingesetzt. Hierbei wird t-Butylhydroxyperoxid in einer Endkonzentration von 100 μM bis 3 mM, insbesondere in einer Endkonzentration von 1 mM zu der Erythrocyten-Suspension zugegeben. Die Inkubationszeit des Oxidationsmittels beträgt je nach Konzentration 5 min bis 0,5 Stunden, bevorzugt 10 min bis 20 min, stärker bevorzugt 15 Minuten und wird gegebenenfalls durch Zentrifugation und anschließende Entfernung des Überstands abgestoppt. In Schritt b) wird mindestens ein Anteil der mit einem Oxidationsmittel behandelten Erythrocyten aus Schritt a) mit jeweils mindestens einem potentiellen Arznei- bzw. Antimalariamittel behandelt, während ein Anteil der mit einem Oxidationsmittel behandelten Erythrocyten aus Schritt a) unbehandelt bleibt, d.h. nicht mit einem potentiellen Antimalariamittel behandelt wird und somit als Referenz dient.

Als potentielles Arznei- bzw. Antimalariamittel kann hier jede chemische Verbindung bzw. jede Mischung chemischer Verbindungen, vorzugsweise chemische Verbindungen mit oxidationsinhibierender bzw. reduzierender Wirkung oder mit der Wirkung eines Amonenkanalblockers eingesetzt werden. Besonders bevorzugt werden als potentielle Antimalariamittel die Einzelkomponenten einer Substanz-Bibliothek im high-throughput- screening eingesetzt, d.h. in dieser besonders bevorzugten Ausführungsform des Screening-Verfahrens werden gleich große Anteile an Erythrocyten aus Schritt a) in zahlreiche einzelne Reaktionsansätze aufgeteilt, die jeweils mit einer einzelnen oder mit mehreren Komponenten der Substanz-Bibliothek behandelt werden.

Unter "Behandlung" im Sinne des Schritts b) ist lediglich die Zugabe des potentiellen Arznei- bzw. Antimalariamittels in geeigneten Mengen zu den nach Schritt a) behandelten Erythrocyten zu verstehen. Das potentielle Antimalariamittel kann hierbei nach einer bestimmten Inkubationszeit vor Schritt c) wieder entfernt oder inaktiviert werden oder auch in der Suspension verbleiben.

In Schritt c) wird in isosmotischer Sorbitol-Losung der Hämolyse-Anteil der Anteile an Erythrocyten, die jeweils mit mindestens einem potentiellen Arznei- bzw. Antimalariamittel nach Schritt b) behandelt wurden, im Vergleich zum Hämolyse-Anteil der Erythrocyten in isosmotischer Sorbitol-Losung, die in Schritt b) unbehandelt blieben, bestimmt.

Hierbei werden zunächst die gegebenenfalls durch Zentrifugation pelletierten Zellen aus Schritt b) in isosmotischer Sorbitol-Losung suspendiert. Besonders bevorzugt werden die Zellen aus Schritt b) in einer isosmotischen Sorbitol-Losung enthaltend 290 mM Sorbitol; 5 mM HEPES/NaOH pH 7,4 suspendiert. Die Inkubationszeit und -bedingungen für die Hämolyse betragen bei 37 °C zwischen 30 min und 4 Stunden, vorzugsweise zwischen 60 min bis zu 3 Stunden, insbesondere zwischen 2 Stunden und 2,5 Stunden. Dabei sind die langen Inkubationszeiten notwendig für die langsame Induktion/Aktivierung der Ionenkanäle. Sind die Ionenkanäle einmal aktiviert, erfolgt der Transport des osmotisch aktiven Sorbitols in die Erythrocyten und die anschließende Hämolyse mit einer Zeitkonstante von t < 5 min. Anschließend wird die Hämolyse vorzugsweise durch Zentrifugation abgebrochen und die Hämoglobin-Konzentrationen in den Überständen der einzelnen Reaktionsansätze werden bestimmt. Je mehr Erythrocyten in einem Reaktionsansatz hämolysiert wurden, desto mehr Hämoglobin sollte sich im jeweiligen Überstand - also außerhalb der Erythrocyten -befinden. Die Hämoglobin-Konzentration im Überstand kann entweder qualitativ durch Aufnahme der Farbmuster (rot = Hämolyse; farblos = keine Hämolyse; "image scanning") oder quantitativ photometrisch durch die Absorption bei 546 nm nach Oxidation zu Cyanomet-Härnoglobin bestimmt werden. Bei dieser Bestimmung der Hämoglobin-Konzentration im Überstand kann der Reaktionsansatz, der in Schritt b) unbehandelt geblieben ist, als Referenz dienen. Die Verwendung weiterer geeigneter Reaktionsansätze als Referenzen ist gegebenenfalls möglich.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein antioxidativ wirkenden Mittel enthaltend Diphenyleneiodonium als eines seiner Salze oder als Salz eines seiner Derivate zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder zur Prophylaxe von Erkrankungen, die durch intrazelluläre Erreger ausgelöst werden, insbesondere zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Malaria.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung einer antioxidativ wirksamen Substanz, insbesondere die Verwendung von Diphenyleneiodonium als eines seiner Salze oder als Salz eines seiner Derivate, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder zur Prophylaxe von Erkrankungen, die von intrazellulären Erregern ausgelöst werden, insbesondere zur Behandlung und/oder zur Prophylaxe von Malaria. Die Verwendung eines NADPH-Oxidase-Hemmers als antioxidativ wirksame Substanz ist hierbei ebenfalls bevorzugt.

Zu den Derivaten des Diphenyleneiodoniumchlorids zählen solche Verbindungen der allgemeinen Grundformel des Diphenyleneiodonium-Ions ((l,l-Biphenyl)-2,2'- diyliodonium),

die an einem oder an beiden Phenylringen mindestens eine oder mehrere gleiche oder verschiedene funktionelle Gruppen besitzen, so beispielsweise 4-Acetylamino- diphenyleneiodonium etc.. Auch Inhibitoren der zum NPP beitragenden Kanäle eignen sich nach den erfindungsgemäßen Erkenntnissen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder zur Prophylaxe von Erkrankungen, die durch intrazelluläre Erreger ausgelöst werden. Ihre Verwendung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder zur Prophylaxe solcher Erkrankungen, insbesondere zur Behandlung und/oder zur Prophylaxe von Malaria ist daher ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung von Zellen, die zuvor mit einem Oxidationsmittel behandelt wurden, zur Identifizierung von Arzneimitteln zur Behandlung und/oder zur Prophylaxe von Erkrankungen, die durch intrazelluläre Erreger ausgelöst werden. Bevorzugt ist hierbei die Verwendung von Erythrocyten, die zuvor mit einem Oxidationsmittel behandelt wurden, zur Identifizierung von Arzneimitteln zur Behandlung und/oder zur Prophylaxe von Malaria.

Gegenstand der Erfindung ist außerdem die Verwendung eines Hämolyse-Assays bei Zellen in isosmotischer Sorbitol-Losung zur Bestimmung und/oder Quantifizierung der Aktivität von Kanälen in der Membran dieser Zellen, insbesondere zur Bestimmung und/oder Quantifizierung der Aktivität der zum NPP beitragenden Kanäle.

In der anliegenden Zeichnung sind in den einzelnen Figuren die folgenden Sachverhalte, die sich im wesentlichen auf die Beispiele beziehen, im Detail dargestellt.

Fig. 1 zeigt Ganzzell-Patch-clamp Ableitungen von P. falciparum infizierten Erythrozyten.

Fig 1A zeigt die lichtmikroskopische Aufnahme eines Trophozoit-infizierten Erythrozyten während Ganzzell- Ableitung. Für die Infektionen wurde der Laborstamm P. falciparum BINH (V.Q. Binh, A.J. Luty, P.G. Kremsner, Am. J. Trop. Med. Hyg. 57, 594 (1997)) verwendet. Die Kultivierung der Parasiten, die Synchronisation des Parasitenentwicklungsstadiums und die Anreicherung von infizierten Erythrozyten erfolgte wie beschrieben in Cranmer, C. Magowan, J. Liang, R.L. Coppel, B.M. Cooke, Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 91, 363 (1997); W. Trager, J.B. Jensen, Science 193, 673 (1976) und in C. Lambros, J.P. Vanderberg, J. Parasitology 65, 418 (1979); J.B. Jensen, Am. J. Tro.p Med. Hyg. 27, 1274 (1978).

Fig. 1B zeigt die Original Stromspuren aufgenommen in nicht-infizierten humanen Erythrozyten (control; links) und in zwei Trophozoit-infizierten Zellen, die einwärts- (Mitte) bzw. auswärts rektifizierende Ströme zeigen (rechts). Die Ganzzeil-Ströme wurden evoziert durch aufeinanderfolgende Spannungspulse vom -30 mV Haltepotential auf Potentiale zwischen -100 mV and +100 mV. In den OriginalstiOmspuren sind die individuellen Spannungspulse übereinandergelagert abgebildet.

Fig. IC stellt die Strom/Spannungs- (I/V)- Beziehung dar aufgenommen wie in Fig. 1B von nicht-infizierten (n=22; links) and Trophozoit-infizierten Zellen mit einwärts- (n=7; Mitte) und auswärts rektifizierenden Strömen (n=35; rechts).

Fig.2 zeigt, daß die Ganzzell-Ströme von infizierten Erythrocyten anionenselektiv sind.

Fig. 2A und 2C zeigen die Originalstromspuren von jeweils einer infizierten Zelle mit einwärts- (Fig. 2A) und auswärts rektifizierenden Strömen (Fig. 2C) vor (control), während (NPPB), und nach (wash-out) Applikation von NPPB ( 100 μM) im Bad.

Fig. 2B zeigt die Originalstromspuren einer infizierten Zelle, die beide Phänotypen zeigte (auswärts- und einwärts-rektifizierende Ströme), aufgenommen vor (control; links) und nach Zugabe von DIDS (100 μM) zur Badlösung (DIDS; Mitte). Die DIDS-sensitive Stromfraktion ist auswärts rektifizierend, während die DIDS-insensitive Fraktion einwärts rektifiziert. Diese DIDS-insensitive Fraktion zeigt die I/V-Kurve (rechts).

Fig. 2D stellt die gemittelten I/V-Kurven der DIDS- (100 μM; Dreiecke; n=7) und NPPB- (100 μM; Kreise; n=6) sensitiven Fraktionen des auswärts rektifizierenden Stroms dar.

Fig. 2E zeigt den Prozentsatz der Auswärts-Leitfähigkeit, der durch NPPB, DIDS, Furosemid oder Glibenclamid (jeweils 100 μM; n=3-5) in infizierten Erythrozyten mit auswärts rektifizierenden Strömen gehemmt wurde. Fig. 2F stellt die gemittelten I/V-Beziehungen von auswärts rektifizierenden Strömen dar, die in gepaarten Experimenten in NaCl-haltiger Lösung (Kreise) bzw. in Na-Glukonat- haltiger Lösung (Dreiecke; n=6) aufgenommen wurden.

Fig. 2G demonstriert die mittlere Verschiebung des Umkehrpotentials dieser Ströme verursacht durch Substitution von Cl^" im Bad durch die angegebenen Anionen (n=4-9; p = 0.05).

Aus Fig. 3 ist ersichtlich, daß Reduktion die Infektions-induzierten Ströme in Erythrocyten und die Hämolyse der Erythrocyten in isosmostischer Sorbitol-Losung hemmt.

Fig. 3A-D zeigt die Originalspuren von einwärts- (Fig. 3A) und auswärts rektifizierenden Strömen (Fig. 3C) vor (links) und nach Inkubation mit der reduzierenden Substanz Dithioerythrol (DTE) (100 μM; rechts). In Fig. 3B und 3D sind die entsprechenden DTE- sensitiven Stromfraktionen (n=l bzw. n=6) gegen die Spannung aufgetragen.

Fig. 3E-H stellt den "Run-down" von Infektion-induzierten Strömen in Erythrocyten durch reduziertes Glutathion (GSH; 10 mM) zugegeben zur Pipettenlösung dar. Hierbei zeigen die Fig. 3 E und 3G die Originalspuren von einwärts- (Fig. 3E) und auswärts rektifizierenden Strömen (Fig. 3G), während kontinuierlicher Ganzzell-Ableitung. Die Inkubationszeiten sind jeweils angegeben. In Fig.3F (n=l) und in Fig. 3H (Dreiecke; n=5) sind die I/V-Kurven der entsprechenden GSH-sensitiven Stromfraktionen dargestellt. Zusätzlich zeigt der N-Plot in Fig. 3H, daß die Zugabe der oxidierten Form von Glutathion (GSSG; 10 mM) zur Pipettenlösung in ungepaarten Kontrollexperimenten die auswärts rektifizierenden Ströme nicht inhibiert (schwarze Kreise; n=4).

Fig. 3 I-J zeigt, daß die Reduktion, sowie auch die Behandlung von infizierten Erythrocyten mit Cl^"-Kanal-Blockern die Hämolyse in isosmostischer Sorbitol-Losung hemmt. Angereicherte Trophozoit-infizierte Erythrozyten wurden in isosmotischer Sorbitol-Losung (5 %) oder zur Kontrolle in NaCl-Lösung suspendiert und für 5-10 min bei 37 °C in An- bzw. Abwesenheit von DIDS, NPPB, Furosemid, Glibenclamid bzw. DTE (jeweils 100 μM) hämolysiert. Nach Zentrifugation wurde die Hämoglobinkonzentration des Überstands photometrisch bestimmt (gezeigt in Fig. 31, in einem Experiment in Duplikaten). In Fig. 3J ist die durch 100 μM DTE inhibierte Fraktion als Prozentsatz der gesamten Hämolyse, die durch NPPB blockiert werden konnte, dargestellt (n=8-13; P = 0.01). Die Reduktion hemmt somit die Infektions-induzierten Ströme und die Hämolyse der Erythrocyten in isosmotischer Sorbitol-Losung.

Fig. 4 zeigt das Ergebnis der Oxidations-induzierten Hämolyse nicht infizierter Erythrocyten in isosmotischer Sorbitol-Losung. Kontroll-Erythrozyten wurden hierbei bis zu einem Hämatokrit von 0.05 in NaCl-Ringer (140 mM NaCl, 10 mM HEPES/NaOH pH 7.4, 5 mM KC1, 1 mM MgCl₂; 2,5 mM CaCl₂) resuspendiert und in 500μl- Reaktionsansätzen aliquotiert Zu den Reaktionsansätzen wurde jeweils 1 ml NaCl-Ringer mit bzw. ohne 1.5 mM t-Butylhydroxyperoxid zugegeben, und die Zellen wurden für 10 min inkubiert und dann 5 min bei 1500 rpm herunterzentrifiigiert. Die Zellpellets wurden resuspendiert in 400 μl 5% Sorbitol/5 mM HEPES/NaOH pH 7.4 oder im gleichen Volumen von NaCl-Ringer. Die Zellen wurden bei 37 °C in An- bzw. Abwesenheit von NPPB, Furosemid, bzw. Glibenclamid (alle 100 μM) inkubiert. Nach 120 minütiger Inkubation wurden die Proben 5 min bei 1500 rpm abzentrifugiert und die Hämoglobinkonzentration in 200 μl des Überstands photometrisch bestimmt.

Fig. 4A zeigt das Hämoglobin im Überstand von unbehandelten (obere Reihen) und oxidierten Kontroll-Erythrozyten (Reihen 3 und 4) nach 2stündiger Inkubation in Sorbitol- Losung (oder zur Kontrolle in NaCl-Lösung) in Ab- (control, NaCl) und Anwesenheit von verschiedenen Blockern (gezeigt ist ein individuelles Experiment in Duplikaten).

Fig. 4B stellt die mittlere Oxidations-induzierte Hämolyse in Sorbitol- (schwarze Säulen; n=6-8) und NaCl-Lösung (n=4; weiße Säule) in Ab- (control, NaCl) und Anwesenheit der angegebenen Blocker (alle 100 μM) dar.

Fig. 4C-D zeigt die einwärts rektifizierenden Ströme in nicht-infizierten Erythrozyten, insbesondere die Originalstromspuren (Fig. 4C, links) und die gemittelte I/V-Kurve (Fig. 4D) aufgenommen in unbehandelten (n=l) oder oxidierten Zellen (n=9). Der Kasten in Fig. 4C zeigt Einzelkanalereignisse, die aus den Ganzzeil-Spuren (links) herausvergrößert wurden. Fig. 4E zeigt auswärts rektifizierende Ströme in nicht-infizierten Kontroll-Erythrozyten, insbesondere die Original Stromspuren in NaCl- (links) und in Na-Gukonat- (rechts) Badlösung einer Zelle mit spontanen Strömen.

Fig. 4F zeigt die IAA-Beziehungen von auswärts rektifizierenden Strömen in unbehandelten (n=4) und oxidierten Kontroll-Erythrozyten (n=7) aufgenommen in NaCl- Badlösung.

Fig. 5 demonstriert die Inhibition des intaerythrozytären Parasiten- Wachstums durch die Kanal-Blocker Furosemid, NPPB, Glibenclamid und den Oxidationsinhibitor Diphenyleniodiumchlorid.

Hierbei wurden mit Plasmodium falciparum infizierte Erythrozyten (Laborstamm BINH) bei einem Hämatokrit von 1% und einer Parasitaemie von 1% kultiviert und mit verschiedenen Konzentrationen der angegebenen Blocker inkubiert. Nach 48 h wurden die Kulturen geerntet, mit Ethidiumbromid angefärbt und das Überleben der Parasiten mittels FACS analysiert (Becton Dickinson Fluorometer). Dargestellt ist die Parasitämie (Prozentsatz der infizierten Erythrozyten) in Mittelwerten (± SE; n = 6; c: Kontrolle) von zwei unabhängigen Experimenten, jeweils bestimmt in Triplikaten.

Die folgenden Beispiele, durch die die Erfindung näher erläutert wird, beziehen sich auf die in den Figuren 1 bis 5 dargestellten Ergebnisse, sowie auf die vorangegangenen Figuren- Beschreibungen.

Beispiel 1 : Identifizierung der zum NPP beitragende Kanäle

Die Erythrozyten wurden in der Spannungsklemme im Ganzzeil-Modus während konstanter Superfusion bei Raumtemperatur abgeleitet wie früher beschrieben (S.M. Huber,

N. Gamper, F. Lang, Pflügers Arch., in Druck). Abgeleitet wurden Trophozoitstadium- infizierte und nichtinfizierte Erythrozyten (Fig. 1) mit einer Badlösung bestehend aus 115 mM NaCl, 20 mM HEPES/NaOH pH 7.4, 5 mM CaCl₂, 10 mM MgCl₂. Die Pipettenlösung war 115 mM NaCl, 0.5 mM EGTA, 10 mM MgCl₂, and 20 mM HEPES/NaOH pH 7.4. Die Ganzzell-Ströme wurden charakterisiert durch Austausch der NaCl-Badlösung mit Lösungen bestehend aus 140 mM Na-X, 20 mM HEPES/NaOH pH 7.4, wobei X die Anionen SCN^", I^", Br^", Laktat, bzw. Glukonat repräsentierte. Die Daten wurden für die "Liquid junction potentials" korrigiert.

Kontrollerythrozyten (22 aus 27 Zellen; Fig. 1 A) zeigten Ganzzellströme von weniger als 100 pS (70 ± 11 pS (Datenanalyse und Statistik: Die Daten sind Mittelwerte ± SE; n = Zahl der Zellen/Experimente, die Unterschiede zwischen den Mittelwerten wurden mittels ungepaartem t-Test (zweiseitig) abgeschätzt.); Fig. 1B-C, links). Im Gegensatz dazu zeigten Ganzzellströme von P. falciparum-infizierten Erythrozyten (Fig. 1A) durchwegs Ströme im Bereich von 10 nS. Zwei verschiedene Typen von Leitfähigkeiten konnten unterschieden werden: Sieben von 42 Zellen zeigten ausschließlich einwärts rektifizierende Ströme (Fig IB, Mitte) mit einer mittleren Leitfähigkeit G_ej_nwär_ts von 7 ± 1 nS (Fig. IC, Mitte). Diese Ströme wurden durch den Cl^"-Kanalblocker 5-Nitro-2-(3-phenylpropylamino)-benzoesäure NPPB (100 μM; Fig 2A) fast völlig, durch 4,4^,-Diisothiocyano-stilben-2,2^,-disulfonsäure DIDS (100 μM; Fig 2B) nur wenig gehemmt. Ahnliche Befunde hatten zuvor Desai et al erhoben.

Die meisten infizierten Zellen (35 aus 42 Zellen) exprimierten hingegen eine auswärts rektifizierende Leitfähigkeit (Fig. IB, rechts). Diese Leitfähigkeit (Gau_swärts^lδ ± 1 nS, Fig IC; rechts) wurde irreversibel durch den Cr-Kanalblocker DIDS und reversibel durch NPPB, Glibenclamid, und Furosemid (jeweils 100 μM) gehemmt (Fig. 2B-E).

Der Austausch von Chlorid in der Badflüssigkeit durch Glukonat minderte den Auswärtsstrom und verschob das Umkehrpotential der auswärts rektifizierenden Leitfähigkeit parallel zur Änderung des Gleichgewichtspotentiales für Cl^" (Eci), ein Hinweis auf eine Anionenselektivität des Kanales (Fig. 2F). Die aus dem Umkehrpotential unter bionischen Bedingungen errechnete Permselektivität des auswärts- rektifizierenden Stromes war I^" (= Br^" - Cϊ) > SCN^" > Lactat > Glukonat (Fig. 2G). Beispiel 2: Induktion der zum NPP beitragenden Kanäle durch Oxidation bzw. Hemmung der Induktion durch Reduktion

Um zu überprüfen, ob die beobachteten Leitfähigkeiten auf eine Oxidation der Erythrozytenmembran durch den Erreger zurückzuführen sind, wurde die reduzierende Substanz Dithioerythrol (DTE, 100 μM) im Bad zugesetzt. Diese hemmte binnen 5 min irreversibel die einwärts- und auswärts- rektifizierenden Ströme (Fig. 3A-D). Darüber hinaus wurden die Ströme durch reduziertes Glutathion (GSH; 10 mM) in der Pipettenlösung gehemmt, nicht aber durch oxidiertes Glutathion (GSSG; 10 mM) (Fig. 3E-H).

Die Hämolyse infizierter Erythrozyten in isosmotischer Sorbitol-Losung wurde durch die Anionenkanalblocker NPPB, Furosemid und Glybenclamid, sowie auch durch das Reduktionsmittel DTE (jeweils 100 μM) gehemmt (Fig. 31- J). Dies ist ein Hinweis, daß beide Infektions-induzierten Ströme das elektrophysiologische Korrelat des NPP sind und durch Oxidation verursacht werden.

Um weiter zu untersuchen, ob die Oxidation der Erythrozyten-Zellmembran für die Induktion des NPP eine Rolle spielt, wurden nicht-infizierte Zellen mit t-Butylhydroxyperoxid vorbehandelt und dann in isosmotische Sorbitol-Losung eingebracht. Fast 40 % der Erythrozyten wurden binnen 2 h in isosomotischer Sorbitol-Losung, nicht aber in isosmotischer Kochsalz-Lösung hämolysiert. Die Hämolyse wurde durch NPPB, Furosemid, oder Glybenclamid (jeweils 100 μM) abgeschwächt oder gänzlich unterdrückt (Fig. 4A-B). Darüberhinaus wurden die einwärts und auswärts rektifizierenden Ströme in einigen nicht- infizierten Erythrozyten und in den meisten t-Butylhydroxyperoxid-behandelten Erythrozyten beobachtet (Fig. 4C-E). Die durch oxidativen Streß hervorgerufenen Leitfähigkeiten sind somit den durch Infektion mit P. falciparum ausgelösten Leitfähigkeiten ähnlich.

Hinweise für die Existenz von Cl^"-Kanälen in nicht infizierten humanen Erythrozyten wurden bereits zuvor berichtet (J.C. Freedman, C. Miller, Ann. NY Acad. Sei. 435, 541 (1984); W. Schwarz, R. Grygorczyk, D. Hof, Methods Enzymol.173, 112 (1989); J.C. Freedman, T.S. Novak, J.D. Bisognano, P.R. Pratap, J. Gen. Physiol. 104, 961 (1994); J.C. Freedman, T.S. Novak, J. Gen. Physiol. 109, 201 (1997); S.M. Huber, N. Gamper, F. Lang, Pflügers Arch., im Druck) . Die erfindungsgemäßen Befunde zeigen, daß diese Chlorid-Kanäle praktisch identisch zu den durch P. falciparum induzierten Kanälen sind und daß diese durch Oxidation als Folge der Infektion mit Plasmodium falciparum aktiviert werden. In der Abwesenheit von oxidativem Streß ist die Ganzzell-Leitfähigkeit im Bereich von wenigen pS (J.F. Hoffman, in Progress in Cell Research. The Band 3 proteins: anion transporters, binding proteins, and senescent antigens, E. Bamberg, H. Passow, eds. (Elsevier, Amsterdam, New York, 1992) vol.2, pp. 173-178). Die durch Oxidation bzw. durch Plasmodium aktivierten Kanäle sind also normalerweise inaktiv und ihre Leitfähigkeit entsprechend gering. Daher ist auch Hämolyse von unbehandelten Erythrozyten in isosmotischer Sorbitol-Losung minimal.

Beispiel 3: Wirkung eines Oxidationsinhibitors oder bekannter Anioneninhibitoren auf das Parasiten- Wachstum

Nach der elektrophysiologischen Charakterisierung des NPP wurde die Auswirkung eines Oxidationsinhibitors, sowie auch die Auswirkung bekannter Anioneninhibitoren auf das Wachstum von P. falciparum untersucht.

Hierbei wurden mit Plasmodium falciparum infizierte Erythrozyten (Laborstamm BINH) bei einem Hämatokrit von 1% und einer Parasitaemie von 1% kultiviert und mit verschiedenen Konzentrationen der angegebenen Blocker inkubiert. Nach 48 h wurden die Kulturen geerntet, mit Ethidiumbromid angefärbt und das Überleben der Parasiten mittels FACS analysiert (Becton Dickinson Fluorometer).

Das intraerythrozytäre Wachstum der Malaria-Erreger konnte durch den Flavinproteininhibitor Diphenyleneiodonium (DPI), einen Oxidationsinhibitor (Fig. 5) im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle bei einer Konzentration von 10 μM moderat, sowie ab einer Konzentration von 50 μM komplett inhibiert werden.

Fig. 5 zeigt außerdem, daß auch die Anionenkanal-Blocker Furosemid, NPPB und Glibenclamid das Parasitien- Wachstum spezifisch hemmen. Dabei bestätigten sich frühere Daten von Cabantchik (Z.I. Cabantchik, S. Kutner, M. Krugliak, H. Ginsburg, Mol. Pharmacol. 23, 92 (1983)) und verifizieren damit das eingesetzte Sorbitol-Hämolysesystem zum Screening für mögüche Inhibitoren von P. falciparum als Grundlage für die Entwicklung neuer Chemotherapie gegen die Malaria.

Darüberhinaus hemmen hohe extrazelluläre Laktatkonzentrationen ebenfalls das Parasitenwachstum. Der Erreger ist daher ganz offensichtlich auf die Leitfähigkeit der durch Oxidation geöffneten Kanäle angewiesen, um z.B. das von ihm generierte Laktat entsorgen zu können.

Claims

Patentansprüche

1. Screening- erfahren zur Identifikation von Arzneimitteln zur Behandlung und/oder zur Prophylaxe von Erkrankungen, die durch intrazelluläre Erreger ausgelöst werden, mit den folgenden Schritten: a) Behandlung von nicht-infizierten Zellen mit einem Oxidationsmittel; b) Behandlung mindestens eines Anteils der behandelten Zellen aus Schritt a) mit jeweils mindestens einem potentiellen Arzneimittel, während ein Anteil der behandelten Zellen aus Schritt a) unbehandelt bleibt; c) quantitative Bestimmung des Hämolyse-Anteils der Anteile an Zellen in isosmotischer Sorbitol-Losung, die mit mindestens einem potentiellen Arzneimittel in Schritt b) behandelt wurden, im Vergleich zum Hämolyse- Anteil des Anteils an Zellen in isosmotischer Sorbitol-Losung, der in Schritt b) unbehandelt blieb.

2. Screening- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkrankung Malaria ist und als Zellen nicht infizierte Erythrocyten eingesetzt werden.

3. Screening- Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die nicht infizierten Erythrocyten humanen Ursprungs sind.

4. Screening- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkrankung aus der Gruppe Tuberkulose, Hühnerpest, Legionellose und Gonorrhoe ausgewählt ist.

5. Screemng-Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als potentielles Arzneimittel in Schritt b) die jeweiligen Einzelkomponenten einer Substanz-Bibliotliek eingesetzt werden.

6. Screemng-Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt a) als Oxidationsmittel t-Butylhydroxyperoxid eingesetzt wird.

7. Antioxidativ wirksames Mittel zur Behandlung und/oder zur Prophylaxe von Erkrankungen, die durch intrazelluläre Erreger ausgelöst werden, enthaltend Diphenyleneiodonium als eines seiner Salze oder als Salz eines seiner Derivate.

8. Antioxidativ wirksames Mittel nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkrankung, die durch intrazelluläre Erreger ausgelöst wird, Malaria ist.

9. Antioxidativ wirksames Mittel nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkrankung, die durch intrazelluläre Erreger ausgelöst wird, ausgewählt aus der Gruppe Tuberkulose, Hühnerpest, Legionellose und Gonorrhoe ist.

10. Verwendung einer antioxidativ wirksamen Substanz zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder zur Prophylaxe einer Erkrankung, die durch intrazelluläre Erreger ausgelöst wird.

11. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkrankung, die durch intrazelluläre Erreger ausgelöst wird, Malaria ist.

12. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkrankung, die durch intrazelluläre Erreger ausgelöst wird, ausgewählt aus der Gruppe Tuberkulose, Hühnerpest, Legionellose und Gonorrhoe ist.

13. Verwendung nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die antioxidativ wirksame Substanz Diphenyleniodonium, eines seiner Salze oder Derivate ist.

14. Verwendung eines Inhibitors der zum NPP beitragenden Kanäle zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder zur Prophylaxe von Erkrankungen, die von intrazellulären Erregern ausgelöst werden.

15. Verwendung von Zellen, die zuvor mit einem Oxidationsmittel behandelt wurden, zur Identifizierung von Arzneimitteln zur Behandlung und/oder zur Prophylaxe von von Erkrankungen, die von intrazellulären Erregern ausgelöst werden.

16. Verwendung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendeten Zellen Erythrocyten sind.

17. Verwendung eines Hämolyse- Assays in isosmotischer Sorbitol-Losung zur Bestimmung und/oder Quantifizierung der Aktivität von Kanälen in der Zellmembran.

18. Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Kanälen in der Zellmembran um die zum NPP beitragenden Kanäle handelt.