【発明の詳細な説明】発明の名称
：
修飾抗-ICAM-1抗体および炎症の処置におけるそれらの使用発明の分野
：
本発明は、細胞間接着分子−１(“ICAM-1”)に特異的に結合する修飾抗体、お
よび炎症処置におけるそのような分子の使用に関する。より詳細には、本発明は
そのような修飾の結果、向上した治療特性を示す修飾した非−ヒト抗−ICAM-1抗
体に関する。発明の背景
：
Ｉ．細胞接着分子
感染および組織損傷に応答するために、白血球は循環系から炎症中の部位へと
運ばれなければならない。そのような移動は、白血球が内皮細胞に接着する接着
現象により行われる。そのような細胞接着は、正常な特異的免疫系の応答の経過
中に起こる白血球の抗原−提示細胞への付着の原因でもある。また細胞接着は、
白血球が適切な標的細胞に付着することも可能とし、これによりウイルスに感染
した、または腫瘍細胞の溶解を起こすことができる。
細胞接着は、インテグリンファミリーの内皮細胞表面レセプターとスーパー免
疫グロブリンファミリーの白血球結合リガンドとの結合相互作用により媒介され
ることが見いだされた(Springer,T.A.,Nature 346:425-434(1990);Smith.C.W.,C anad,J.Physiol.Pharmacl.71
:76-87(1993))。
Ａ．インテグリンファミリーの細胞接着分子
細胞接着に関与するインテグリンファミリーのレセプター分子は、“C
D11/CD18ファミリーのレセプター分子”と命名された。これらの分子は初めにハ
イブリドーマ技法を使用して同定された(Davignon,D.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.U SA 78
:4535-4539(1981);Springer,T.ら、Eur.J.Immunol.9:301-306(1979);Sprin
ger,T.ら、Fed.Proc.44:2660-2663(1985))。
このCD11/CD18ファミリーのレセプター分子は、αサブユニット(CD11)および
βサブユニット(CD18)を含むヘテロダイマーである(Sanchez-Madrid,Fら、J.Exp er.Med.158
:1785-1803(1983);Keizer,G.D.ら、Eur.J.Immunol.15:1142-1147(198
5))。３分子のβ鎖は同一である。ヘテロダイマーのα鎖は異なるが、精密な分
析で、それらの間に実質的な類似性があることが明らかとなった。LFA-1関連糖
タンパク質のαサブユニット間の類似性に関する総説は、Sanchez-Madrid,Fら、
(J.Exper.Med,158:586-602(1983);J.Exper.Med,158:1785-1803(1983))により提
供されている。
３つの異なるαサブユニットは以下のように命名された：CD11a(同等にLFA-1
αサブユニットと呼ばれる)、CD11b(同等にMac-1 αサブユニットと呼ばれる)、
およびCD11c(同等にp150,95 αサブユニットと呼ばれる)(Ruoslahti,E.ら、Scie nce 238
:491(1987);Anderson.D.C.ら、Ann.Rev.Med.38:175(1987))。
CD18分子は95kdの分子量を有するが、α鎖の分子量は150kdから180kdに変動す
ることが判明した(Springer.T.,Fed.Proc.44:2660-2663(1985))。
CD11a/CD18ヘテロダイマーは、ほとんどのリンパ球で見いだされる(Springer,
T.A.ら、Immunol.Rev.68:111-135(1982):Ruoslahti,E.ら、Science 238:491(198
7);Anderson,D.Cら、Ann.Rev.Med.38:175(1987))。C
D11b/CD18およびCD11c/CD18ヘテロダイマーは、マクロファージ、顆粒球および
大型顆粒リンパ球で見いだされる(Ruoslahti,E.ら、Science 238:491(1987)；An
derson D.Cら、Ann.Rev.Med.38:175(1987))。これら３つの分子は、細胞接着の
役割を果たしている(Keizer,G.ら、Eur.J.Immunol.15:1142-1147(1985)。
宿主防御におけるCD11a/CD18複合体、およびその細胞リガンドの重要性は、感
染した個体が正常なCD18分子を合成できない、再発性の重篤な細菌感染を特徴と
する常染色体劣性形質(白血球接着欠損症候群に関する“LAD”症候群と命名され
ている)の同定により解明された(Ruoslahti,E.ら、Science 238:491(1987);Ande
rson,D.C.ら、Ann.Rev.Med.38:175(1987)；Anderson,D.C.ら、Fed.Proc.44:2671
-2677(1985)；Anderson.D.C.ら、J.Infect.Dis.152:668-689(1985)。LAD患者か
ら得た白血球は、そのLFA-1ファミリーの分子が抗体に拮抗された正常な対に類
似するインビトロ欠損を現す。さらにこれらの個体は、彼らの細胞が細胞物質に
接着できないことから、正常な免疫応答を行うことができない(Anderson,D.C.ら
、Fed.Proc.44:2671-2677(1985)；Anderson,D.C.ら、J.Infect.Dis.152:668-689
(1985)。ＬＡＤの特徴は、機能的LFA-1接着分子の不在がＬＡＤ白血球を正常な
様式で実質的に内皮細胞に接着できなくすることを証明している。ＬＡＤ個体か
ら得た白血球は、白血球が血管の内皮細胞に接着し、そして通過することを誘導
するこのような刺激に対して非応答性である(Smith,C.W.ら、J.Clin.Invest.82:
1746(1988))。
またCD11/CD18複合体は、感染に対する宿主防御が関与する他の細胞−細胞相
互反応にも関与し、それにはIC3b-オプソニン化粒子の結合および食作用、顆粒
球および単球様細胞上のCD11b/CD18の性質、ならびに
Mg2+依存的接着およびＴ細胞およびNK細胞による標的細胞を殺すこと、CD11a/CD
18ヘテロ二重鎖の性質を含む(Ruoslahti,Eら、Science 238:491(1987);Anderson
,D.C.ら、Ann.Rev.Med.38:175(1987))。
Ｂ．スーパー免疫グロブリンファミリーの接着分子
CD11/CD18レセプター分子の天然の結合リガンドは、細胞間接着分子−１であ
る(“ICAM-1”またはCD54)(Rothlein,R.ら、J.Immunol.137:1270(1986))、欧州
特許出願公開第289,949号明細書、Simmons,Dら、Nature 331:624-627(1988);Sta
unton,D.E.ら、Cell 52:925-933(1988)、これら技術文献は引用により本明細書
に編入する）。
ICAM-1は、スーパー免疫グロブリン分子の一員である。このスーパーファミリ
ーの員は、１つ以上のＩｇ相同的領域の存在が特徴であり、各々が２つのシート
中に配置された多数の非−平行β−プリーツ鎖を有するジスルフィド−架橋ルー
プから成る。３種類の相同的領域が定められ、各々が典型的な長さを持ち、そし
てジスルフィド結合のシステイン間に位置するアミノ酸残基にコンセンサス配列
を有する(Williams.A.Fら、Ann.Rev.Immunol.6:381-405(1988)；Hunkapillar,T.
ら、Adv.Immunol.44:1-63(1989))。
ICAM-1は、97-114kdの細胞表面糖タンパク質である。ICAM-1は５つのIg-様ド
メインを有する。その構造は、神経細胞接着分子(NCAM)およびミエリン−結合糖
タンパク質(MAG)の構造に緊密に関連している（Simmons,D,ら、Nature 331:624-
627(1988);Staunton,D.E.ら、Cell 52:925-933(1988);Staunton,D.E.ら、Cell 6 1
243-254(1990)、これら技術文献は引用により本明細言に編入する）。
ICAM-1は、インビボのリンパ球の炎症病変への侵潤に一致した時間枠
で、IL-1、ガンマインターフェロンおよび腫瘍壊死因子のような炎症メディエー
ターにより、インビトロで繊維芽細胞および内皮細胞上に誘導され得る（Dustin
,M.L.ら、J.Immunol 137:245-254(1986);Pober,J.S.ら、J.Immunol 137:1893-18
96(1986)）。ICAM-1は、血管内皮細胞、胸腺上皮細胞、他の上皮細胞および繊維
芽細胞のような非−造血細胞、ならびに組織マクロファージ、マイトジェン−刺
激Ｔリンパ芽のような造血細胞、ならびに扁桃、リンパ節およびパイエル板の胚
中心Ｂ−細胞および樹状細胞で発現される(Dustin,M.L.ら、J.Immunol 137:245-
254(1986))。ICAM-1は、アレルギー性温疹、苔癬、プラナス(planus)、発疹、じ
んま疹および水疱性疾患のような良性の炎症病変中の角質細胞中で発現する。
このように、ICAM-1は炎症部位で優先的に発現し、そして一般的には静止細胞
により発現されない。ICAM-1はリンパ球が結合できる細胞物質として機能するの
で、リンパ機能は感染または炎症部位へ移動できる。
ICAM-1の“可溶性”（すなわち、“非−固定化”）断片は、循環中に検出でき
る(Rothlein,R.ら、J.Immunol 147:3788-3793(1991)。この断片の炎症に反応し
たレベルの上昇は、このレベルが炎症の診断的測定に有用となり得ることを示唆
している(Gearing、A.J.H.ら、Immunol.Today14:506-512(1993);Rothlein,R.ら、J.Immunol 147
:3788-3798(1991);Blann.A.D.ら、Thromb Haemost.72:151-154(19
94);Cush,J.J.ら、Arthritis Rheum.36:1098-1102(1993))。
細胞接着における役割に加えて、ICAM-1はライノウイルス感染を起こすために
、ヒトライノウイルスが結合する細胞性レセプターであることも判明した(Greve
,J.M.ら、Cell 56:839-847(1989):Staunton.D.E.ら
、Cell 56:849-853(1989):Ohlin,A.ら、Antimicrob.Agents Chemother.38:1413-
1415(1994):Cassanovas,J.M.ら、J.Virol.68:5882-5889(1994))。
ICAM-2は第２のLFA-1リガンドであり、ICAM-1とは明らかに異なる(Rothlein,R
.ら、J.Immunol 137:1270-1274(1986);Makgoba,M.W.ら、Eur.J.Immunol.18:637-
640(1988);Dustin,M.L.ら、J.Cell.Biol.107:321-331(1988);Staunton.D.ら、FA SEB J.3
:2446(1989)。ICAM-1のように、ICAM-2はスーパー免疫グロブリンファミ
リーの一員である。
ICAM-2は、内皮細胞および特定の間細胞で構成的に発現される。またICAM-2は
種々のＴ−およびＢ−リンパ芽細胞系にも存在する。ICAM-2は、非活性化内皮上
の主要LFA-1リガンドである。このようにICAM-2は正常なリンパ球の再集合、お
よび記憶細胞の再集合に役割を果たし、そして抗原提示細胞の相互作用に役割を
持つと報告された(de Fougerolles,A.R.ら、J.Exper.Med.174:253-267(1991))。
最近、第３のLFA-1リガンドであるICAM-3が同定された(de Fouegerolles,A.R.
ら、J.Exper.Med.174:253-267(1991);de Fougerolles,A.R.ら、J.Exper.Med.175
:185(1994);de Fougerolles,A.R.ら、J.Exper.Med.179:619-629(1994))。ICAM-3
は、白血球で発現されるが、内皮細胞中には存在しない、124kDの重度にグリコ
シルされたタンパク質である。ICAM-3はICAM-1と、53％の相同性を共有する。IC
AM-3およびICAM-1は交互に発現されるようであり;ICAM-3は休止細胞により発現
され、その発現レベルは細胞活性化の結果、低下する(Cordell.J.L.ら、J.Clin. Pathol.47
:143-147(1994);El-Gabalawy,H.ら、Arthritis Rheum.37:846-854(199
4))。
Ｃ．他の接着分子
接着分子のセレクチン（またはLECCAM）ファミリーは、接着分子の明らかな第
３の種類である。セレクチンは炭水化物レクチンを認識し、そして結合する。３
つのセレクチンがすでに記載されている；L-セレクチン(LECCAM-1、MEL-1、MEL-
14、LAM-1、LECAM-1またはリンパ球ホーミングレセプターとも呼ばれる)；Ｅ-セ
レクチン(内皮白血球接着分子-1(ELAM-1”)またはLECCAM-2としても知られてい
る)；Ｐ-セレクチン(CD62、血小板活性化依存的顆粒外膜(platelet activation
dependent granule external membrane:PADGEM)、LECCAM-3または顆粒膜タンパ
ク質-140(granule membrane protein-140:GMP-140としても知られている)。
Ｌ-セレクチンは白血球で発現され、そして白血球の末梢リンパ節への“ホー
ミング”に役割を果たす（Gallatin.M.W.ら、Nature 304:30-34(1989);Lasky,L.
A.ら、Cell 56:1045-1055(1989);Siegelman,M.H.ら、Proc.Natl.Acad.Sci. （USA ）86
:5562-5566(1989)；Tedder,T.F.ら、J.Exper.Med.170:123-133(1989)。L-セ
レクチンは顆粒球でも発現される。
Ｅ-セレクチンは、TNF-αまたはIL-1βのようなサイトカインにより、または
細菌エンドトキシン(LPS)による細胞刺激に応答して、内皮細胞で発現される(Be
vilacqua,M.P.ら、Science 243:1160-1165(1989);Tedder,T.F.ら、J.Exper.Med. 170
:123-133(1989);Bevilacqua,M.P.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)84:9238-924
2(1987);Luscinskas,F.W.ら、J.Immunol.143:3318-3324(1989))。インビトロで
、Ｅ-セレクチンは好中球、単球、好酸球、リンパ球サブセットおよびある種の
癌腫細胞の接着を媒介する。Ｅ-セレクチンの結合リガンドはＳＬＥxである(Low
e,..B.ら、Cell 63:475-484(1990)。Ｅ-セレクチンは、リューマチ関節炎のよ
うな慢性の炎症疾患で発現する。
Ｐ-セレクチンは、血小板および内皮細胞、好中球、他の骨髄性細胞およびＴ
リンパ球サブセットで発現する(Siegelman,M.H.ら、Curr.Biol.1:125-128(1991)
;Pober、J.S.ら、Lab.Invest.64:301-305(1991))。Ｐ-セレクチンおよびＥ-セレ
クチンは、両方がＳＬＥxレクチンに結合できるという事実にしたがい、同様な
細胞範囲に結合する。Ｐ-セレクチンの発現は、トロンビン、ヒスタミンおよび
過酸化水素のようなアクチベーターにより誘導される。
Ｅ-セレクチンおよびＰ-セレクチンの発現はそれぞれ、組織損傷に対する炎症的
および止血的応答を反映していると報告されている(Geng.J.G.ら、Nature 343:7
57-760(1990);Toothill.V.J.ら、J.Immmunol.145:283-291(1990))。Ｌ-セレクチ
ンは細胞の炎症部位への再集合に参加すると報告された(Watson,S.R.ら、Nature
349:164-167(1991);Lewinsohn,D.M.ら、J.Immunol 138:4313-4321(1987)。すべ
ての３つのセレクチンは、好中球および他の白血球の炎症部位への再集合に関与
することが報告された(Arfors,D.E.ら、Blood 69:338-340(1987);Smith、C.W.ら
、J.Clin.Invest.82:1746-1756(1988);Anderson,D.C.ら、Ann.Rev.Med.38:175-1
94(1990);Larson,R.S.ら、Immunol.Rev.114:181-217(1990))。
セレクチンは、好中球の活性化内皮への初期の接着、または“ローリング(rol
ling)を補助することにより作用すると報告された(von Andrian,U.H.ら、Proc.N atl.Acad.Sci.(USA)88
:7538-7542(1991);Ley,K.ら、Blood 77:2553-2555(1991);
Lawrence,M.B.ら、Cell 65:859-873(1991);Smith.C.W.ら、J.Clin.Invest.83:20
08-2017(1989))。対照的に、CD11/CD18ファミリーの分子はいったん炎症部位に
到達すれば、その後、好中
球の移動阻止を媒介すると考えられている(Anderson,D.C.ら、Ann Rev.Med.38:1
75-194(1990);Larson、R.S.ら、Immunol.Rev.114:181-217(1990);Smith、C.W.ら、J.Clin.Invest.83
:2008-2017(1989);Luscinskas F.W.ら、J.Immunol.146:1617-1
625(1989))。
VCAM-1(血管細胞接着分子-1)は、血管細胞上に見いだされる細胞表面レセプタ
ーである(Hynes,R.O.Cell 48:549-554(987);Price.G.E.Science 246:1303-1306(
1980))。正常な生理的条件下で、VCAM−1は発現されないか、または発現は最小
である。しかし、TNF-αたはIL-1βを用いた刺激で、VCAM−1は急速に誘導され
る。VCAM−1は、白血球および他の細胞上に発現するVLA-4インテグリン分子に結
合することが示された(springer,T.A.,Nature 346:425-434(1990);Hemler,M.E.
ら、Immunol.Rev.114:45-65(1990))。VLA-4は、リンパ球が粘膜リンパ節の内皮
に結合することを媒介し(Holtzmann,B.ら、Cell 56:37-46(1989);(Holtznann,B.
ら、EMBO J.8:1735-1741(1989)、そして細胞毒性Ｔ−細胞活性を媒介することが
示された(Hemler,M.E.ら、J.Biol.Chem 262:11478-11485(1987);Hemler,M.E.ら
、白血球接着分子(Springer,T.A.ら、編集)第44−57頁、スプリンジャー−ファ
ーラーグ、ニューヨーク(1989))。VLA-4の発現は、実質的にサイトカインに影響
を受けない。
このように、まとめると動物の健康および生存能を維持するための白血球の能
力には、それらが他の細胞（内皮細胞のような）に接着できることが必要である
。この接着には、白血球および内皮の細胞表面に存在する特異的なレセプター分
子が関与する細胞−細胞接触が必要であると判明した。これらのレセプターは、
白血球が他の白血球または内皮細胞、および他の非−血管細胞に接着することを
可能とする。このような細
胞表面レセプター分子を欠く白血球を持つヒトは、慢性および再発性の感染、な
らびに欠損抗体応答を含む他の臨床症状を現す。
細胞接着のプロセスはヒトおよび他の動物を、感染または組織傷害による死か
ら保護するが、そのような保護には重大な組織破壊、炎症および痛みといった代
償が伴う(Horgan,M.J.ら、Amer,J.Physiol.261:H1578-H1584(1991)；Clark,W.M.
ら、J.Neurosurg.75:623-627(1991))。抗生物質および他の現代の医学的処置の
利用可能性により、感染および外傷を取り扱うための代替法が提供される。した
がって多くの場合で、細胞接着発生を妨げ、そして防止することが望ましい。
そのような介入を行うための２つの取り組みには、抗-CD18抗体および抗-ICAM
-1抗体の使用が関与した。動物モデルおよびインビトロ試験での有望な結果にも
かかわらず、そのようなネズミモノクローナル抗体の使用は、抗−ネズミ抗体を
産生を導く重篤な免疫反応の問題により、制限されてきた。
喘息、虚血、組織片拒絶、移植、関節炎等のような炎症症状のための長期の治
療を提供することが望まれているという観点から、これまで使用された抗体より
も有意に免疫原性が低い抗−ICAM-1抗体を開発することが望ましい。本発明は、
そのように改良された抗体、およびその合成、精製および使用法を提供する。図面の簡単な説明
：
図１は、ポリ（エチレン）グリコール修飾を行った回数の関数として、固定化
sICAM-1カラム上に残る結合能力の割合を表す。
図２は、enlimomab、PEG-エンリモマブ（enlimomab）抗体2183-66MまたはPEG-
enlimomab抗体BIRR10のいずれかを腹腔注射した後の、個々の
ウサギの抗−エンリモマブ（enlimomab）血清力価（1000単位）を表す。
図３は、enlimomabまたはPEG-エンリモマブ（enlimomab）抗体930329/4:1のい
ずれかを腹腔注射した後の、個々のウサギの抗−enlimomab血清力価（1000単位
）を表す。
図４は、enlimomabまたはPEG-エンリモマブ（enlimomab）抗体1924-11のいず
れかを静脈注射した後の、個々のウサギの抗−エンリモマブ（enlimomab）血清
力価（1000単位）を表す。
図５は、静脈注射後28および56日目の、ポリ（エチレン）グリコール−修飾エ
ンリモマブ（enlimomab）および天然の抗体の免疫原性を表す。発明の要約
本発明は、炎症の処置において、細胞間接着分子−１(“ICAM-1”)に特異的に
結合する修飾抗体の生産および使用に関する。より特別には、本発明はそのよう
な修飾の結果、向上した治療特性を示す修飾した非−ヒト抗−ICAM-1抗体に関す
る。
詳細には、本発明は抗−ICAM-1抗体のポリ（エチレン）グリコール−修飾誘導
体を提供し、ここで抗体はICAM-1に結合でき、そしてICAM-1媒介細胞接着を阻害
できる。
本発明は特に、抗−ICAM-1抗体のポリ（エチレン）グリコール−修飾誘導体に
関し、ここで抗体はモノクローナル抗体である。本発明は特に、そのような誘導
体が平均２−１５分子の単官能性ポリ（エチレン）グリコールを含む態様に関し
、そしてここで単官能性ポリ（エチレン）グリコールは、ポリ（エチレン）グリ
コールのプロピオン酸のN-ヒドロキ
シスクシンイミジル活性エステル、スクシネートポリ（エチレン）グリコールの
N-ヒドロキシスクシンイミジル活性エステル、カルボキシメチル化ポリ（エチレ
ン）グリコールのN-ヒドロキシスクシンイミジル活性エステル、ポリ（エチレン
）グリコールダイマーとリシンのN-ヒドロキシスクシンイミジル活性エステル、
ポリ（エチレン）グリコールプロピオンアルデヒド、またはノルロイシンポリ（
エチレン）グリコールのN-ヒドロキシスクシンイミジル誘導体である。
本発明は特に、抗-ICAM-1抗体が（Ａ）抗体エンモリマブ、または（Ｂ）ICAM-
1に結合し、そしてエンモリマブがICAM-1に結合するのを拮抗的に阻害する抗体
である態様、そして特に誘導体が、天然の抗-ICAM-1抗体がICAM-1に結合する能
力の少なくとも約20％を保持し、かつ／または抗体の非-ポリ（エチレン）グリ
コール修飾状態よりも高いインビボ血清半減期を有する態様に関する。BIRR10は
、最も好適なポリ（エチレン）グリコール−修飾抗−ICAM-1抗体である。
また本発明は、抗−ICAM-1抗体のポリ（エチレン）グリコール修飾誘導体を提
供し、ここで誘導体は、
（ａ）活性化されたポリ（エチレン）グリコール分子の存在する中で、抗体のポ
リ（エチレン）グリコール修飾誘導体を形成するのに十分な条件下で、抗−ICAM
-1抗体をインキューベートし、
（ｂ）ポリ（エチレン）グリコール修飾抗体を、非-ポリ（エチレン）グリコー
ル修飾抗体から分離するのに十分な条件下で、形成された誘導体を疎水性相互作
用クロマトグラフィーにかけ、そして
（ｃ）形成されたポリ（エチレン）グリコール修飾抗体誘導体を、疎水性相互作
用クロマトグラフィーから回収する、
ことを含んで成る工程により調製される。
本発明はさらに、医薬組成物も提供し、これは
（ａ）抗−ICAM-1抗体のポリ（エチレン）グリコール−修飾誘導体、ここで抗体
はICAM-1に結合でき、しかもICAM-1-媒介細胞接着を阻害でき、および
（ｂ）生理的に許容できるキャリアー、賦形剤または安定化剤、
を含んで成る。
本発明は特に、中の誘導体が平均２−１５分子の単官能性ポリ（エチレン）グ
リコール分子を含むそのような医薬組成物を提供する。
また本発明は、組成物が１種以上の抗体のポリ（エチレン）グリコール−修飾
誘導体を含み、ここで各種類はそれらのインビボ血清半減期が異なってよい態様
、ならびに組成物が単一種の抗体のポリ（エチレン）グリコール−修飾誘導体を
含む態様を提供する。
本発明は、抗−ICAM-1抗体のポリ（エチレン）グリコール−修飾誘導体が、天
然の抗-ICAM-1抗体がICAM-1に結合する能力の少なくとも約20％を保持し（例え
ば、ＪＹ細胞Ｂ−リンパ芽細胞上に発現したICAM−1への結合に関して、そのよ
うなポリ（エチレン）グリコール−修飾誘導体と非修飾抗体の間の競合の程度を
測定するアッセイにより測定されるような）、かつ／またはICAM-1のポリ(エチ
レン)グリコール修飾抗体が、抗体の非-ポリ（エチレン）グリコール修飾状態よ
りも高いインビボ血清半減期を有する、そのような医薬組成物を提供する。
また本発明は、ライノウイルス感染または炎症（特異的または非特異的防御系
のいずれかの反応により引き起こされる）の処置または予防法を提供し、この方
法は有効量の上記医薬組成物を、そのような処置また
は予防が必要な受容体に提供することを含んで成る。この組成物および方法は、
自己免疫疾患；喘息；成人呼吸困難症候群；敗血症または外傷に二次的な多器官
傷害；再潅流傷害；急性糸球体腎炎；反応性関節炎；急性炎症成分を含む皮膚炎
；急性化膿性髄膜炎；中枢神経系炎症疾患；熱的傷害；血液透析；白血球搬出；
潰瘍性大腸炎；Crohn疾患；壊死性腸炎；顆粒球輸血に伴う症候群；またはサイ
トカイン−誘導毒性を処置または予防するために使用できる。
抗体の修飾種および非修飾種を含む調製物から、ポリ（エチレン）グリコール
−修飾抗体を精製する方法は、調製物を抗体の非修飾種をポリ（エチレン）グリ
コール修飾から分離するのに十分な条件下で疎水性相互作用クロマトグラフィー
に供し、そして分離したポリ（エチレン）グリコール−修飾抗体を回収すること
を含んで成る。好適な態様の説明
Ｉ． 抗−ICAM−１抗体
上記のように、抗-CD18抗体および抗-ICAM-1抗体が、細胞接着プロセスに介入
するために使用された。
抗-CD18抗体を使用したインビボの実験では、心臓、肺および腸で、虚血性傷
害の減少、および肺浸潤および全身性のモデルでの低下が示された(Arfors,K.ら
、Blood 69:338-340(1987);Hermamdez,L.ら、Amer.J.Physiol.253:H699-H703(19
87);Price,T.ら、J.Immunol.139:4174-4177(1987);Simppson.P.ら、J.Clin.Inve st.81
:624-629(1988);Vedder,N.ら、J.Clin.Invest.81:9393-944(1988))。Wang,
J.H.ら(FASEB J.8:A981(1994))は、抗-CD18および抗-ICAM-1抗体のマウスへの投
与が、イムノモジュラトリ−効果を有することを報告した。これら抗体の投与は
、エタ
ノール−誘導粘膜傷害(Dinda,P.K.ら、Gastroenterol.106:A230(1994))、自己免
疫糖尿病の発生(Heroid,K.C.ら、Clin,Res,42:119A(1994))を抑制し、そしてヒ
トの膵臓の島外植の生存を延ばす(Zeng,Y.ら、Transplant,Proceed.26:1120(199
4))と報告された。Huang,Y.W.ら(Hybridoma 12:661-675(1993))は、抗−ICAM-1
抗体を骨髄腫瘍細胞系を殺すために使用することを検討している。
抗-ICAM-1抗体が組織傷害を抑制する能力は、多数の動物モデルで研究された
。Horgan,M.J.ら(Amer.J.Physiol,261:H1576-H1584(1991))は、ICAM-1に対して
向けられたネズミモノクローナル抗体(RR1/1)が、動物モデルで、すでに肺動脈
閉塞および再潅流を経験したウサギの肺中の好中球の封鎖(sequestration)を防
止できた、と報告した。中枢神経系虚血モデルの実験(J.Neurosurg,75:623-627(
1991))では、中枢神経系組織中のICAM-1の誘導が、傷害の広がりを増大すること
が報告された。ArchelosJ.J.ら、(Brain 116:1043-1058(1993))は、抗-ICAM-1の
投与が実験モデルでアレルギー性神経炎を抑制できたことを報告した。
抗-ICAM-1ネズミモノクローナル抗体の投与は、ウサギのモデルで一時的に虚
血性傷害の程度を低下させると報告された(Clark,W.W.ら、J.Neyrosurg,75:623-
627(1991))。Weger,C.D.ら(Lung 170:267-279(1992))は、マウスモデルで白血球
接着の貢献および肺の酸素毒性の病因における浸潤を確認し、ラット抗-ICAM-1
抗体の投与が、超酸化的な肺の傷害を減少することを報告した。
Ma,X.L.ら(Circulat.86:937-946(1992))は、抗-ICAM-1抗体、RR1/1が、ネコの
モデルで虚血性の心筋の多形核白血球接着および浸潤を抑制できると報告した、
この抑制はネコの心筋を再潅流傷害から有意に保護
した。
Gorczynski,R.M.ら(J.Immunol.152:2011-2019(1994))は、マウスのモデルを使
用して、抗-ICAM-1抗体が抗原特異的プレトランスプラントまたは輸血後の皮膚
の同種移植生存を延ばすことを証明した。Williams,W.W.ら(Amer.Soc.nephrol.5
:738-(1993))は、抗-ICAM-1抗体が腎臓を虚血から保護したことを報告した。Uch
io,E.ら(Invest.Ophthalmol.Vis.Sci,35:2626-2631(1994))は、抗-ICAM-1抗体の
実験的なブドウ膜炎を防止する能力を報告した。Zhang,R.L.ら(Stroke 25:266(1
994))は、抗-ICAM-1抗体の投与が、ラットのモデルで虚血性傷害を減少したこと
を報告した。Bowes,M.P.ら(Exper.Neurol.119:215-219(1993)は、抗-ICAM-1抗体
の投与が、ラットの大脳塞栓発作モデルで発作に付随する神経的傷害を減少でき
ることを報告した。Pavilack,M.A.ら(Invest.Ophthalmol.Vis.Sci,35:1896(1994
))およびYamigami、S.(Invest.Ophthalmol.Vis.Sci,35:1877(1994))は、抗-ICAM-
1抗体の投与が、角膜移植の生存能を向上させることを報告した。
抗-ICAM-1抗体のそのような使用、および上記の記載は、細胞接着が炎症プロ
セスの組織傷害を悪化させる原因であり、そしてモデル系において、そのような
炎症プロセスが抑制できたことを示唆している。そのような研究は、抗-ICAM-1
抗体の現実的な治療的利益を提供する能力を決定するための臨床試験を促した。
Haug.C.E.ら(Transplant.55:766-773(1993))は、ネズミ抗-ICAM-1抗体(“エン
リモマブ:enlimomab”と命名された)の、腎臓同種移植を受け、そして遅延型移
植片機能の危険にあるカニクイザるへの投与を報告した。この実験では、エンリ
モマブ投与の臨床的安全性を確立した。エンリ
モマブ投与に付随する有意な“第一−投与(first-dose)”効果は見られずそして
悪い全身性の効果も検出されなかった。
残念ながら、抗体は高度に免疫原性であると判明し、ほとんど90％の受容体動
物が抗-エンリモマブ抗体を生成した。実際、免疫反応性の程度は、他のネズミ
抗体で観察されるよりも有意に高かった。抗-ネズミ抗体反応は、その投与４日
後に、サルの血清から抗体を除去（“クリーニング”）した。
Kavanaugh,A.F.ら(Arthritis Rheum.35:S43(1992);Arthritis Rheum.35:S106(
1992);Clin.Res.42:314A(1994);Immunol.91-227(1993);Arthritis Rheum.36:S40
(1993))、およびSchultze-Koops,H.ら(FASEB J.8:A745(1994))は、抗-ICAM-1抗
体エンリモマブをリューマチ関節炎に罹患している個体に投与すると、急速な臨
床的改善が生じることを報告した。この報告は、Haug、C.E.らの知見(エンリモマ
ブの受容体は、臨床的に有意な緩和を経験したが、受容体は実質的な抗−エンリ
モマブ反応を起こした)を確認した。ネズミ抗-ICAM-1抗体エンリモマブの薬物動
態は、Norris.S.H.ら(Pharmaceut.Res.10:S334(1994))により報告されている。
Omura,T.ら(Immunobiol.186241-245(1992))は、マウス抗-ICAM-1モノクローナ
ル抗体を用いてインフューズされた同種移植ラット肝臓の急速な拒絶を開示し、
そして抗体の循環的悪化が場合によっては起こることを示唆している。
まとめると、実験では抗-ICAM-1抗体が炎症プロセスを防止マタハ弱める、イ
ンビトロ効力が証明された。治療的に投与すると、抗体はその標的細胞に到達し
て最小の副作用および有意な治療的利益をもたらす能
力を示した。しかしこの抗-ICAM-1ネズミ抗体投与の利益には、実質的な抗-ネズ
ミ免疫反応が付随する。この反応は、抗-ICAM-1モノクローナル抗体を慢性の炎
症の処置、およびその後の急性炎症疾患の処置に応用することを制限する。
II． 本発明の修飾された抗体
本発明は、修飾された抗ヒトＩＣＡＭ−１抗体が、内皮細胞−白血球接着を抑
制する能力を保持すると共に、改良された（即ち、減少した）免疫反応性を示す
という認識に一部由来するものである。かくして抗体誘導体を使用して慢性の炎
症又は急性炎症性疾患のその後のエピソードを処理又は防止することができる。
本明細書で使用した“免疫反応性”という用語は、抗原の抗体形成を誘発する能
力（即ち、免疫原性）及び抗原の抗体により認識される能力及び抗体に結合され
る能力を包含することを意図する。
本明細書で使用した“調製抗ＩＣＡＭ−１抗体”は、“予防の”目的又は“治
療の”目的のものであることができる。予防的に与えられる場合には、免疫抑制
化合物は、炎症性の応答又は症状の前に（例えば、器官又は組織移植の時点より
前又はその時点又は少し後で、しかし器官拒絶反応の症状の前に）与えられる。
化合物の予防的投与は、その後の炎症性応答（例えば、移植された器官又は組織
等の拒絶反応のような）を阻止するか又は弱める働きをする。治療的に与えられ
る場合には、免疫抑制化合物は、実際の炎症の症状（例えば、器官又は組織の拒
絶反応等のような）の開始時に（又はその少し後に）与えられる。化合物の治療
的投与は、現在の炎症性応答の急性症状（例えば、喘息、関節炎又は移植された
器官又は組織の拒絶反応のような）を処置するのに役立つ。
本発明の方法に従って修飾される抗ＩＣＡＭ−１抗体は、ポリクロナル、モノ
クロナル、組換え又はキメラであることができる。このような抗体は、無傷の（
ｉｎｔａｃｔ）免疫グロブリンであることができ又は例えば、無傷の抗体のフラ
グメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）2等）又は切片（ｓｅｃｔｉｏｎｓ）を
含んで成ることができる。
ネズミモノクロナル抗体が特に好ましい。好適なモノクロナル抗体の例には、
ＲＲ１／１（Ｒｏｔｈｌｅｉｎ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３
７：１２７０−１２７４（１９８６）、Ｒ６．５（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｔ．Ａ．
ｅｔ ａｌ．，米国特許出願第０７／２５０，４４６号；Ｒｏｔｈｌｅｉｎ，Ｒ
．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：１６６５−１６６９（１９８８
）、この両方とも引用により本明細書に組み入れられる）、ＬＢ−２（Ｃｌａｒ
ｋ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ：Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ／（Ａ．
Ｂｅｒｎａｒｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ，），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ
ｐｐ３３９−３４６（１９８４）、又はＣＬ２０３（Ｓｔａｕｎｔｏｎ，Ｄ．
Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ５６：８４９−８５３（１９８９））が包含される
。現在“エンリモマブ”（ｅｎｌｉｍｏｍａｂ）と再命名された抗体Ｒ６．５は
、本発明の方法で使用するための最も好ましい抗体である。
所望ならば、追加の抗ＩＣＡＭ−１抗体を、ＢＡＬＢ／ｃマウス又は同等な系
統を使用して得ることができる。好ましくは、該動物を、好適なアジュバント（
例えば、フロイントアジュバント、タイターマックス（ＴｉｔｅｒＭａｘ）アジ
ュバント（Ｖａｘｃｅｌ，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＡＧ）等）と共に乳化されている
ヒトＩＣＡＭ−１（又はそのフラグメント）約２５μｇで免疫する。免疫は、２
つの筋肉内部位、１つの腹腔内部位及び尾底（ｂａｓｅ ｏｆ ｔａｉｌ）におけ
る１つの内皮部位（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｓｉｔｅ）で行うことができる
。ＩＣＡＭ−１約２５μｇの追加の（ＩＶ）注入は、３週間後に標準食塩水（ｎ
ｏｒｍａｌ ｓａｌｉｎｅ）中で与えられるのが好ましい。第２の注入から約１
１日後に、マウスを出血させ、そして血液を抗ＩＣＡＭ−１抗
体の存在についてスクリーニングすることができる。好ましくは、この目的には
ＥＬＩＳＡを使用する。好適なアッセイは、Ｎｏｒｒｉｓ，Ｓ．Ｈ．ｅｔ ａｌ
．，により記載されている（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ，９：２
１１−２１８（１９９１）、引用により本明細書に組み入れられる）。このアッ
セイの原理は、マイクロタイタープレートに結合されているＪＹ Ｂ−リンパ芽
球細胞（ＪＹ−Ｂ−ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ ｃｅｌｌｓ）上に発現され
たＩＣＡＭ−１への結合について、新しい抗体とビオチニル化されたエンリモマ
ブとの競合の測定を含む。
最も好ましくは、最も高い抗体力価を有するマウスに、ＩＣＡＭ−１約２５μ
ｇの第３のＩＶ注入を与える。この動物からの脾臓白血球を３日後に回収するこ
とができ、次いで、最も好ましくはポリ（エチレン）グリコールを使用して、適
当な骨髄腫細胞株（ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）（例えば、Ｐ３Ｘ６
３Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞株のような）の細胞と融合させる。細胞を“ＨＡＴ
”（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミン）選択下に約１週間培養すること
により、ハイブリドーマ細胞を選択する。次いで、得られるクローンを、それら
のＩＣＡＭ−１に対するモノクロナル抗体（“ｍＡｂｓ”）生産能について、好
ましくはＥＬＩＳＡによりスクリーニングすることができる。
モノクロナル抗体を得るための好ましい方法では、上記の免疫されたマウスの
脾臓を取り出し、粉砕し（ｄｉｓｒｕｐｔ）、そして免疫脾臓細胞（ｉｍｍｕｎ
ｅ ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ）を、フィコール勾配上で単離する。単離された脾臓
細胞を、ポリ（エチレン）グリコールを使用して、ＢＡＬＢ／ｃ由来のＨＧＰＲ
Ｔ（ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）欠失Ｐ３ｘ６
３ｘＡｇ８．６５３形質細
胞腫細胞（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ）と融合させる。融合した細
胞を、９６ウエルのマイクロタイタープレート中にプレーテイングし、そして、
ハイブリドーマ融合細胞について、約２−３週間のヒポキサンチン、アミノプテ
リン及びチミジン補充培地中でのそれらの増殖能によりスクリーニングする。平
均して、融合に付された１０6脾臓細胞から生存ハイブリドーマ（ｖｉａｂｌｅ
ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）が生じる。典型的な脾臓は、５−１０×１０7脾臓細胞
を生じさせる。
このようなインキュベーションから生じるハイブリドーマ細胞は、好ましくは
、ＩＣＡＭ−１に結合する免疫グロブリン産生能についてスクリーニングされる
。この目的で間接ＥＬＩＳＡを使用することができる。簡単に言えば、ハイブリ
ドーマの上澄液を、固定化されたＩＣＡＭ−１を含有するマイクロタイターウエ
ル中でインキュベーションする。洗浄した後、結合した免疫グロブリンの力価を
、セイヨウワサビペルオキシダーゼに結合したヤギ抗マウス抗体を使用して決定
する。追加の洗浄の後、固定化された酵素の量を決定する（例えば、色素原基質
の使用により）。このようなスクリーニングは、所望のクローンが非分泌隣接体
（ｎｏｎ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ）により覆われ（ｏｖｅｒ
ｇｒｏｗｎ）ないことを確実にするために、ハイブリドーマの同定後できるだけ
速く行われる。融合プレートは、ハイブリドーマ増殖の速度が変わるので、数回
スクリーニングされるのが望ましい。
示されたとおり、抗体エンリモマブは、本発明の最も好ましい抗ＩＣＡＭ−１
抗体である。エンリモマブは、ネズミＩｇＧ２ａモノクロナル抗体（ｍＡｂ）で
ある。ウサギに投与すると、この抗体は２４−２９時間の血清内除去半減期（ｓ
ｅｒｕｍ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）を有する（Ｎｏｒｒ
ｉｓ，Ｓ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．
Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．９：２１１−２１８（１９９１））。腎
又は肺移植体の受容者へのエンリモマブの“アッドオン”投与（“ａｄｄ ｏｎ
” ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）を含む段階Ｉヒト臨床試験（ｐｈａｓｅ
Ｉ ｈｕｍａｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ）は、ヒトでは、エンリモマブ
は５．８時間乃至３９．１時間の血清内除去半減期を有することを示した（Ｎｏ
ｒｒｉｓ，Ｓ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍｃｅｕｔ．Ｒｅｓ．１０：Ｓ３３
４（１９９３））。
本発明の１つの観点は、このような抗ＩＣＡＭ−１を修飾することによって、
抗体の免疫反応性を実質的に減少させ、かくして抗体の生体内治療効果を保持し
ながら、その血清内除去半減期を増加させることが可能であるという決定に関す
る。好ましい修飾は、ポリ（エチレン）グリコール（“ＰＥＧ”）アダクトを含
有するように抗体を修飾することを含む。ＰＥＧは非常に高い水溶性を有する軽
度の疎水性の物質である。
本発明の更なる観点は、規定された均一な程度のポリ（エチレン）グリコール
修飾を有するポリ（エチレン）グリコール修飾抗体の均一な種を精製すること及
び得ることができることに関する。
最も好ましくは、ポリ（エチレン）グリコール修飾反応は、“活性化された”
ＰＥＧ誘導体を使用して行われる。本明細書で使用した“活性化されたＰＥＧ誘
導体”は、アミン（リシンのような）に対して反応性である求電子性基を有する
ＰＥＧの誘導体であり、そして他の求核体（ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅｓ）は“活
性化されたＰＥＧ”と呼ばれる。
これらのＰＥＧは、タンパク質へのＰＥＧの結合のため及びリポソーム製剤
、生物学的に適切な、可溶性及び不溶性ポリマー及び種々の、ポリ（エチレン）
グリコール修飾分子（普通“ポリ（エチレン）グリコール修飾分子”と呼ばれる
）において広範に使用されている。
上記した用途で特に重要なのは、一端をメチルエチル基でキャッピングされた
一官能性ポリマー（ｍＰＥＧ）である。活性化されたＰＥＧの
反応には架橋がなく、そして標的分子へのポリマーの多重鎖（ｍｕｌｔｉｐｌｅ
ｓｔｒａｎｄｓ）の結合をもたらすことができる。特定の用途に対する適当な
誘導体の選択は、所望の結合点（リシン対システイン）；誘導体の加水分解安定
性及び反応性；結合の安定性、毒性及び抗原性及び分析に対する好適性のような
種々の特性を考慮することにより最善になされる。
ＰＥＧスクシネートのＮ−ヒドロキシスクシンイミジル（又はＮＨＳ）活性エ
ステル（ＳＳ−ＰＥＧ）は、多くの実験室でタンパク質又はペプチドへのＰＥＧ
の結合のためのえり抜きの試薬であった。これらの誘導体は、短い時間に（ｐＨ
８．５、４℃で約３０分）穏やかな条件下にタンパク質のアミノ基と反応し、そ
して広範囲にわたって修飾されたまだ活性な複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）を
生じる。スクシンイミジルスクシネートは、その骨格にエステル結合を有し、従
って生体内で相対的に速い加水分解を受ける性質を有する。より安定なＰＥＧ複
合体は、エステル結合を持っていないＰＥＧプロピオン酸のスクシンイミジル誘
導体（ＳＰＡ−ＰＥＧ）の使用により製造することができる。これは、ＳＰＡ−
ＰＥＧよりも大きい反応性ですらあるカルボキシメチル化ＰＥＧの対応するスク
シンイミジル誘導体（ＳＣＭ−ＰＥＧ）についても真実である。ＳＣＭ−ＰＥＧ
は、ｐＨ８．０において１分よりも少ない加水分解半減期で加水分解及びアミノ
リシスの両方にたいして極めて反応性である。（しかしながら、この誘導体の極
端な反応性は、ポリ（エチレン）グリコール修飾を高度に選択性にする高い速度
で完了へと進行する反応において利点を与える）。これは、天然のタンパク質に
対して１００％に近い特異的活性を保持している高度にポリ（エチレン）グリコ
ール修飾された酵素を生じさせることが示された。多分、ＰＥＧ誘導体
の寿命は、タンパク質のごく表面でのリシンに対する反応性を制限し、該表面で
はリシンが配置されていても二次構造を破壊して特異的活性を減少させるような
ことはなさそうである。
分子量５ｋＤの活性化されたモノメトキシポリ（エチレン）グリコール（ｍＰ
ＥＧ）は、本発明の抗体を修飾するための最も好ましい試薬である。ｍＰＥＧは
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（“ＮＨＳ”）部分の存在により活性化される
。分子量４０ｋＤまでの活性化されたモノメトキシポリ（エチレン）グリコール
（ｍＰＥＧ）を代わりに使用することができる。好適な活性化された一官能性ポ
リ（エチレン）グリコールには、ポリ（エチレン）グリコールのプロピオン酸の
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル活性エステル（“ＳＰＡ−ＰＥＧ”）、スクシ
ネートポリ（エチレン）グリコールのＮ−ヒドロキシスクシンイミジル活性エス
テル（“ＳＳ−ＰＥＧ”）、カルボキシメチル化ポリ（エチレン）グリコールの
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル活性エステル（“ＳＣＭ−ＰＥＧ”）、リシン
とのポリ（エチレン）グリコールダイマーのＮ−ヒドロキシスクシンイミジル活
性エステル（“ＰＥＧ２−ＮＨＳ”）、ポリ（エチレン）グリコールプロピオン
アルデヒド（“ＰＥＧ−ＡＬＤＥＨＹＤＥ”）又はノルロイシンポリ（エチレン
）グリコールのＮ−ヒドロキシスクシンイミジル誘導体（“ＰＥＧ−ＮＯＲＬＥ
ＵＣＩＮＥ”）が包含される。
最も好ましい活性化されたｍＰＥＧは、ｍＰＥＧプロピオン酸のＮ−ヒドロキ
シスクシンイミジル誘導体（“ＳＰＡ−ＰＥＧ”）である。ｍＰＥＧモノマーの
重合は、本発明の最も好ましい修飾抗体である、ポリ（エチレン）グリコール修
飾（“ポリ（エチレン）グリコール修飾”）抗体の製造をもたらす。
多くの文献は、５Ｋ〜４０Ｋ又はそれより高い範囲の種々の分子量のポリ（エ
チレン）グリコール（ＰＥＧ）の結合によるタンパク質修飾の研究に当てられて
いる。示されたとおり、ＰＥＧは酵素、ペプチド又はタンパク質に結合されたも
のが報告されている。
タンパク質又は抗体の免疫反応性を減少させるためのポリ（エチレン）グリコ
ールの使用は当技術分野において記載されている。
限られた数の場合において、ポリ（エチレン）グリコールは抗体を修飾するの
に使用されている。Ｔｏｍａｓｉ Ｔ．Ｂ．等（米国特許第４，７３２，８６３
号）は、ポリ（エチレン）グリコール修飾抗体を製造する方法を検討しており、
そしてこのような抗体が減少した免疫原性を示すことを開示している。この方法
は、タンパク質分子上のトリニトロベンゼンスルホン酸利用性アミノ基へのＰＥ
Ｇの共有結合を含む。
Ｔomashi，Ｔ.Ｂ.等（米国特許４，７３２，８６３第号明細書）は、ＰＥＧ修
飾抗体の免疫原性は修飾の程度によって変動するものであり、したがって、抗体
の低減した免疫反応性を、抗体活性を十分な程度に維持するという要求とバラン
スさせるためには、抗体に結合したＰＥＧ分子の数を制御することが重要である
ことを、開示している。Ｔomashi等は、１３〜１８％のアミノ基が修飾された免
疫グロブリンは一般に検出可能な免疫原性を欠いているものの、該範囲外のパー
セントの修飾は免疫原性に対して予測外の効果を有することを開示している。ポ
リ（エチレン）グリコール化の程度は、モノマーに対する抗体の比を調整するこ
とで制御可能であると言われている。
ポリ（エチレン）グリコール修飾抗体を形成しそして使用する方法はＫarr，
Ｌ．Ｊ．等によって議論されている（Ｍeth．Ｅnzymol．228:377-390(1994)）。
これらのタンパク質修飾は、天然分子の半減期を延長し、そして／またはヒト
の治療薬として使用される外来源タンパク質に固有の免疫原性を低減するかまた
は除去することを意図している。報告された努力の殆どは、これらの修飾研究で
用いられた手順、ＰＥＧ誘導体の合成および動物研究もしくはヒトの臨床実験の
最終結果に向けられている。しかしながら、ポリ（エチレン）グリコール修飾タ
ンパク質を特性決定する分析法については不足している。クロマトグラフィー法
によるポリ（エチレン）グリコール修飾の程度を定量すること、或いは反応完了
時に残っている未修飾タンパク質の定量については殆ど注意が払われていない。
この異成分（heterogeneity）を分析する試みはわずかになされてきたが、個々
のコンポーネントへのＰＥＧタンパク質調製物を分析するのに
適切な技法は現れていない。
したがって、本発明の１つのアスペクトは、これらの分子のポリ（エチレン）
グリコール修飾各改変体から天然モノクローナル抗体もしくはＦabフラグメント
を分離し得るばかりでなく、結合したＰＥＧストランドの数が異なる個々の修飾
種の分離を許容する新規な疎水性相互作用クロマトグラフィー法に関する。この
方法は、ＰＥＧ修飾タンパク質を、ＰＥＧに富む諸相に分離するという利点を有
するが、これは水性ポリマー二相分離に有効な技法である。この新規なクロマト
グラフィー法は、５Ｋ ＰＥＧ誘導体で修飾されたタンパク質または高分子量の
ＰＥＧ誘導体で修飾されたタンパク質に等しく良好に働く。この方法は、定量分
析用ツールとして、並びにポリ（エチレン）グリコール-修飾の後に未修飾の天
然タンパク質を除去するための予備的精製工程として開発されてきた。
細胞間接着分子-１（ＩＣＡＭ-１）は、多くの炎症病の病原に関与する。ＩＣ
ＡＭ-１依存性相互作用による妨害を通じての細胞接着の調節は、例えば火傷、
移植拒絶、虚血再灌流障害のような種々の急性疾患の前臨床モデルおよび／また
は臨床治療に有益であることが証明された（Ｃosimi，Ａ.Ｂ．et al.,Ｉn: Ｓtr
ucture，Ｆunction and Ｒegulation of Ｍolecules Ｉnvolved in Ｌeukocyte
Ａdhesion,．Ｌipsky，Ｐ.Ｅ.，et al.，Ｅds.，Ｓpringer Ｖerlag，pp.373-38
7(1992); Ｍileski，Ｗ．Ｊ．et al., Ｊ．Ｓurg．Ｒes．52:334-339(1992);Ｈ
aug，Ｃ.Ｅ.et al.，Ｔransplantation 55:766-773(1993); Ｌefer，Ａ.Ｍ．et
al.，Ａnn．Ｒev．Ｐharmacol．Ｔoxicol．33:71-90．1993）。さらに、抗-ＩＣ
ＡＭ-１治療は、慢性関節リウマチのような慢性炎症疾患の治療
に有効であるとされている（Kavanaugh，Ａ．et al.，Ａrthr．Ｒheuma. 35:Ｓ4
3（1992））。しかしながら、多くの症例において、そして特に病気が以前治療
した炎症プロセスの再発である場合には、抗-ＩＣＡＭ-１治療は、エンモマブ(e
nlimomab)分子を含む外来ネズミタンパク質の抗原決定基に対する免疫応答（こ
れは抗体の初期投与によって誘発される）の故に、使用され得ない。免疫原性を
低減させる抗体構造の修飾は、通常「ヒト化（humanization）」を通じて分子生
物学技法により達成される抗体工学の主たるゴールである。しかしながら、この
アプローチは、屡々、抗体機能を危険にさらすような抗体の修飾をもたらす。こ
れらのタンパク質修飾は、天然分子の半減期を延長し、そして／またはヒトの治
療薬として使用される外来源タンパク質に固有の免疫原性を低減するかまたは除
去することを意図している。
ＩＩＩ． 修飾方法
本発明の１つの面は、一般的には抗体、詳細には抗−ＩＣＡＭ−１抗体をポリ
（エチレン）グリコールで修飾する２つの改良方法に関する。この２つの方法を
「溶液」方法および「カラム」方法と呼ぶ。
Ａ． 溶液を基とするポリ（エチレン）グリコール修飾
ポリ（エチレン）グリコール修飾の溶液方法では、抗−ＩＣＡＭ−１抗体と活
性化ｍＰＥＧを緩衝水溶液中で撹拌しそして接合反応が所望地点にまで進行した
後に反応を抑える。
反応混合物にジグリシンを該抗体上の利用可能アミノ基のモル量よりも５０倍
高いモル量で加えることで反応を抑える。透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏ
ｎ）または透析で反応汚染物（例えば未反応のｍＰＥＧ、ジグリシンなど）を反
応混合物から除去し、そして緩衝を５０ｍＭの燐酸ナトリウム、１００ｍＭの塩
化ナトリウム、ｐＨ６に変換する。次に、溶液の滅菌濾過を行った後、４℃で貯
蔵する。
Ｂ． カラムを基とするポリ（エチレン）グリコール修飾
カラム方法では、最初、ＩＣＡＭ−１もしくはＩＣＡＭ−１様エピトープを提
示するリガンド（不動態化した）に抗−ＩＣＡＭ−１抗体を結合させる。従って
、このような結合は、ＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体領域が関与する。１つの態
様における不動態化したリガンドは、可溶形態のＩＣＡＭ−１（「ｓＩＣＡＭ−
１」）をクロマトグラフィーカラムの樹脂に共有結合させておいたものである。
また、この目的でエンリモマブ（ｅｎｌｉｍｏｍａｂ）の抗イディオタイプ（ａ
ｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ）抗体（例えばモノクローナル抗体ＣＡ３）を用い
ることも可能である（Ｒｏｔｈｌｅｉｎ，Ｒ．他、Ｉｎｔｌ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌ
ｅｒｇ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１００：１２１−１２７（１９９３）、引用すること
によって本明細書に組み入れられる）。このように、これは、ｓＩＣＡＭ−１の
様式に相当する様式で抗−ＩＣＡＭ−１抗体に結合する。
カラムを用いたポリ（エチレン）グリコール修飾の１つの好適な態様では、最
初に、エムファーゼ（Ｅｍｐｈａｚｅ）で活性させたクロマトグラフィー樹脂を
用いてｓＩＣＡＭ−１親和性カラム（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｏｌｕｍｎ）を調製
する（アズラクトン（ａｚｌａｃｔｏｎｅ）化学）。好適には、ｓＩＣＡＭ−１
に透析濾過を受けさせて連成用緩衝液（８６０ｍＭのクエン酸Ｎａ3、１００ｍ
ＭのＮａＨＣＯ3、ｐＨ８．６）に移行させて、その濃度を約１０ｍｇ／ｍｌに
調整する。次に、この溶液にエムファーゼバイオサポート媒体（Ｂｉｏｓｕｐｐ
ｏｒｔ Ｍｅｄｉｕｍ）を加えて、膨潤した樹脂をｓＩＣＡＭ−１各２０ｍｇ当
たり１ｍｌ得る。渦巻き撹拌しながら、この樹脂をｓＩＣＡＭ−１溶液に入れて
混合した後、その懸濁液を室温で１時間穏やかに撹拌する。その樹脂を洗浄［例
えば、２５μｍの焼結ガラスフリット管内で、等しい体積のＰＢＳ（５０ｍＭの
燐酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ）、ｐＨ６、を用いて１０回洗浄］する
ことで、連成しなかったｓＩＣＡＭ−１を除去する。その樹脂をエタノールアミ
ン（ｐＨ９）と一緒に穏やかに混合する操作を２回（例えば最初に１体積量のエ
タノールアミンを用いて３０分間そして次に２時間）行うことで、未反応のアズ
ラクトン基を抑える。この樹脂を充分に洗浄する（例えば１体積量の１Ｍ Ｎａ
Ｃｌを用いて１０回、次に１体積量のＰＢＳ、ｐＨ６を用いて３回）。次に、こ
の樹脂をクロマトグラフィーカラムに詰めて、適切な貯蔵用緩衝
液［例えば６４ｍＭの燐酸ナトリウム、８６ｍＭのＮａＣｌ、２％（体積／体積
）のグリセロール、０．０５％のアジ化ナトリウム、ｐＨ６］をカラム容積の数
倍（例えば３倍）量で用いて洗浄して、４℃で貯蔵してもよい。
上記ｓＩＣＡＭ−１が上記エムファーゼ樹脂に連成する効率の測定では、好適
にはＢＣＡ方法を用いて、連成反応で結合しなかったｓＩＣＡＭ−１量を量化し
てもよい。樹脂洗浄溶液に入っている未結合ｓＩＣＡＭ−１の定量を行うことで
量化を達成し、推定連成効率は＞９５％である。エンリモマブを上記カラムにそ
れの漏出が観察されるまで連続的に仕込むことで、上記ｓＩＣＡＭ−１親和性カ
ラムの能力を測定する。この結合能力の範囲はゲル１ｍｌ当たり８．２から８．
８ｍｇのエンリモマブである。これは、結合質量比（ｂｉｎｄｉｎｇ ｍａｓｓ
ｒａｔｉｏ）が１：２（エンリモマブ：ｓＩＣＡＭ−１）であること、即ちエ
ンリモナブ分子とｓＩＣＡＭ−１分子のモル比が１：４であることを意味する。
測定可能方法では、各ポリ（エチレン）グリコール修飾を行った後の能力損失度
合が非常に小さくかつ各修飾で一様なポリ（エチレン）グリコール修飾生成物を
もたらす樹脂を用いるのが望ましい。
上記ｓＩＣＡＭ−１カラムに抗体を結合させた状態、従って結合部位にＰＥＧ
が結合しないようにそれをマスキングした状態で、接合反応を行う。上記カラム
方法および溶液方法の両方とも、結合活性を保持しているｍＰＥＧ−抗−ＩＣＡ
Ｍ−１抗体接合体をもたらすが、上記カラム方法の方が、その抗体により多くの
ｍＰＥＧが結合し、そしてその抗体は結合活性をより大きな度合で保持している
。更に、上記カラム方法を用いると、エンリモマブの結合部位をポリ（エチレン
）グリコール修飾
過程から保護することが可能になり、それによって、より高い結合能力を保持し
ているポリ（エチレン）グリコール修飾抗体誘導体を単離することが可能になる
。従って、ｍＰＥＧを抗−ＩＣＡＭ−１抗体に結合させようとする場合、上記カ
ラム方法が好適な優れた方法である。この方法を、以下に、好適な抗−ＩＣＡＭ
−１抗体であるエンリモマブを参考にして記述する。
次に、上記ｓＩＣＡＭ−１親和性カラムをカラム容積の５倍量のＰＢＳ、ｐＨ
７．５で平衡にした後、このカラムにエンリモマブ（ＰＢＳ、ｐＨ７．５の１ｍ
ｌに２−５ｍｇ入っている）をその能力に到達するまで充填する。活性化ＳＰＡ
−ＰＥＧ（５ｋＤ）の溶液を１カラム容積のＰＢＳ（ｐＨ７．５）中で調製する
。上記ｍＰＥＧ溶液に入っているｍＰＥＧ量は、典型的に、上記ｓＩＣＡＭ−１
カラムに充填したエンリモマブ１ミリグラム当たり１ミリグラムである。このｍ
ＰＥＧ溶液を室温で上記ｓＩＣＡＭ−１カラムに通して１時間循環させた後、平
衡用緩衝液をカラム容積の５倍量で用いて上記カラムを洗浄することで、上記ｍ
ＰＥＧ溶液を除去する。次に、１００ｍＭのグリシン（ｐＨ２．７）をカラム容
積の２倍量で用いて、上記カラム方法で生じさせたｍＰＥＧ−エンリモマブ分子
（「ＢＩＲＲ１０」と表示）を溶離させ、そして１Ｍのトリスベース（Ｔｒｉｓ
−ｂａｓｅ）（ｐＨ９）または１００ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ１１）で中和
した後、１Ｍの燐酸ナトリウム（ｐＨ４．５）で中和してもよい。
上記溶液方法およびカラム方法両方のポリ（エチレン）グリコール修飾方法を
用いて生じさせた粗ｍＰＥＧ−エンリモマブ混合物は、ポリ（エチレン）グリコ
ールで修飾されなかったエンリモマブを残存量（２−５
％）で含有する。この材料は免疫原性混入物を含有することから、それをその調
製物から除去するのが望ましい。好適には、調製用サイズエクスクルージョン（
ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィーまたは疎水相互作用クロマ
トグラフィーを用いて、ポリ（エチレン）グリコールで修飾されなかったエンリ
モナブをｍＰＥＧ−エンリモマブ調製物から除去する。
ＩＶ． ポリ（エチレン）グリコール修飾抗体の精製
Ａ． サイズエクスクルージョンクロマトグラフィー
サイズエクスクルージョンクロマトグラフィーでは、適切な緩衝液（例えば６
４ｍＭの燐酸ナトリウム、８０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６）で平衡に到達させてお
いた適当な調製用サイズエクスクルージョンクロマトグラフィー充填物が入って
いるカラム（例えばＰｈａｒｍａｃｉａ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００が入ってい
る２．６ｘ６０ｃｍのカラム）に粗ＢＩＲＲ１０濃縮プールを充填する。幅広い
単一のピークを有する流出物を分別して両末端を除去し、最初に出て来る部分に
は、高度にポリ（エチレン）グリコールで修飾されたエンリモマブが入っており
、そして後に出て来る尾部分には、軽くポリ（エチレン）グリコールで修飾され
たエンリモマブと未変性のエンリモマブが入っている。
Ｂ． 疎水相互作用クロマトグラフィー
ポリ（エチレン）グリコールで修飾された蛋白質付加体の特徴付けを個々の成
分に分解させながら行うユニークな分析技術を開発しようとする試みでは、２つ
の主要な問題に遭遇した。１番目として、調製物に入っている種の数は、使用す
るポリ（エチレン）グリコール修飾技術（即ちＰＥＧ誘導体の化学、分子量、そ
して蛋白質上に存在する反応性部位の
数）に応じて変化する。更に、異なる分析技術の分解能は、蛋白質間で変化する
。２番目として、不均質であることが分かったとしても、個々のポリ（エチレン
）グリコール修飾種に関する分解能が不足している。特定のＨＰＬＣカラム技術
を用いることで両方の問題を解決することができる。
ＰＥＧは中程度の疎水性を示す材料であり、非常に高い水溶性を示す。これを
用いて蛋白質の修飾を行うと、その蛋白質が血清中で示す半減期が長くなり、こ
れは水２相分配系（ａｑｕｅｏｕｓ ２−ｐｈａｓｅ ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎ
ｇ ｓｙｓｔｅｍｓ）で用いられて来た。このユニークなポリマーはその他に興
味の持たれる特性を数多く有していて、薬学調剤および食品調合物の成分として
頻繁に用いられている［Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ，Ａ．他、Ｃａｎｃ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、７：１７５−１８６（１９８４）；Ｍａｓｔ，Ａ．Ｅ
．他（Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、１１６：５８−６５（１９９０）；Ｎ
ａｋａｙｏｍｉ，Ｋ．他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．、２２：７５−８４（１
９９０）；Ｓａｄａ，Ｅ．他、Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｓｎｇ．、７１：１
３７−１３９（１９９１）；Ｍａｔｓｕｙａｍａ，Ｈ．他、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒ
ｍ．Ｂｕｌｌ．、３９：７４３−７４６（１９９１）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．
他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１５：１００−１１４
（１９９２）］。
最も好適な態様では、ポリ（エチレン）グリコールで修飾されなかった抗体を
除去するばかりでなくポリ（エチレン）グリコール修飾を所望度合で受けた抗体
の均一種を得る目的で疎水相互作用クロマトグラフィーを用いる。
疎水相互作用クロマトグラフィー（「ＨＩＣ」）は、蛋白質を高塩条件下で分
離する場合に価値ある技術である（一般的にはＨＰＬＣ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌ
ｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｇｏｏｄｉｎｇ，Ｋ．Ｍ．他編集、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋ
ｅｒ，Ｉｎｃ．（１９９０）参照）。蛋白質に関するＨＩＣ分離は、クロマトグ
ラフィー支持体に固定することで不動態化した疎水性部分と蛋白質の疎水性アミ
ノ酸残基を互いに作用させることを基にしている。この不動態化した疎水性部分
は、幅広い範囲のアルキルおよびアリール基から選択可能である。ＰＥＧが好適
な不動態化した部分である。この部分の疎水性はアルキルの長さを長くするにつ
れて増大する。塩の濃度を高くすると［１−２Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4が好適であ
る］、蛋白質が上記カラムに吸着され、そしてイオン強度を下げると蛋白質の溶
離が起こる。ＨＩＣ実施方法はＣａｍｅｒｏｎ，Ｇ．Ｗ．他（Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ
ｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、４：１８４−１８８（１９９３））、Ｒａｙｍｏ
ｎｄ，Ｊ．他（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．、２１２：１９９−２０９（１９８１
））、Ｏｃｈｏａ，Ｊ．Ｉ．（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ６０：１−１５（１９７８
））、Ｒｏｇｇｅｎｂｕｃｋ，Ｄ．他（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、１６
７−２０７−２１８（１９９４））、Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ，Ｓ．他（Ｐｏｌ．
Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｎｕｔｒ．Ｓｃｉ．、３／４４：５−４４（１９９４））、Ｒｉ
ｐｐｅｌ，Ｇ．他（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．、６６８：３０１−３１２（１９
９４））、Ｓｚｅｐｅｓｙ，Ｌ．他（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．６６８：３３７
−３４４（１９９４））、Ｈｕｄｄｌｅｓｔｏｎ，Ｊ．Ｇ．他（Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、４４：６２
６−６３５（１９９４））、Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｅ．他（Ａｎｎｌ．ＮＹ Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．、７２１：３４８−３６４（１９９４））（上記文献は全部引用
することによって本明細書に組み入れられる）に記述されている。
ポリエチレングリコールが結合すると、よれて、大きな蛋白質になる（即ちモ
ノクローナル抗体ではその抗体の疎水性が未変性で未修飾の抗体に比較して高く
なることが示された）。疎水性リガンドを用いると、帯電効果がなくなって疎水
効果が最大限になる高塩緩衝条件にすることで未変性の蛋白質をポリ（エチレン
）グリコール修飾蛋白質から分離することができるはずである。市販ＨＩＣカラ
ム化学は多様である（幅広い範囲の疎水性に及ぶ）ことから、クロマトグラフィ
ー分離を可能にする適当なリガンドを見付け出すことができるはずである。また
、２相分離系の場合、ポリ（エチレン）グリコール修飾蛋白質は分配で優先的に
ＰＥＧ相に入り込むことが知られていることから［Ｗａｌｔｅｒ，Ｈ．他著、Ｐ
ａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ ｉｎ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｔｗｏ−Ｐｈａｓｅ Ｓｙｓ
ｔｅｍｓ，Ｔｈｅｏｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｕｓｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ、ＮＹ（１９８５）；Ｋａｒｒ，Ｌ．Ｊ．他、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．、
３５４：２６９（１９８６）、Ｓｔｏｃｋｓ，Ｓ．Ｊ．他、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．、７３：８６（１９８８）、Ｋａｒｒ，Ｌ．Ｊ．他著、Ｓｅｐａｒａｔ
ｉｏｎｓ Ｕｓｉｎｇ ａｑｕｅｏｕｓ Ｐｈａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ． Ａｐ
ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｆｉｓｈｅｒ，Ｄ．他編集、Ｐｌｅｎｕｍ
Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９８９）］、構造的にポリ（エチレン）グリコールに類似
したＨＩＣリガンドを用いると疑似親和性様式における分配が向上するであろう
と予測されるかもしれない。このような２相系における研究で実証された分配原
理と同じ分配原理がクロマトグラフィー系にも同様に充分に適用されるはずであ
る。疎水相互作用は顕著に起こるであろうが、蛋白質に結合したＰＥＧとＰＥＧ
結合相の間の特異的相互作用は、個々のＰＥＧ−蛋白質付加体を分解することに
加えて、未変性蛋白質とポリ（エチレン）グリコール修飾蛋白質のクロマトグラ
フィー分離を助長するに充分なほど強力であり得る。
幅広い範囲の疎水性に及ぶ多様な市販ＨＩＣカラム化学の評価を行った。まず
最初に、Ｓｙｎｃｈｒｏｍ ａｎｄ Ｂｉｏ−Ｒａｄから購入したＨＩＣカラム
（利用できるアルキルリガンドの疎水性がヒドロキシプロピルからペンチルであ
りそしてそれに加えてフェニルの疎水性が利用できる点で、充分な範囲を網羅す
る）を試験した。大部分のケースで、未変性蛋白質とＰＥＧ修飾蛋白質の満足さ
れる分離は達成されなかった。ＰＥＧ修飾抗体の疎水性が高くなることは、高度
にポリ（エチレン）グリコールで修飾されたサンプルを特定カラム使用クロマト
グラフィーにかけた時に保持時間が未変性蛋白質の保持時間に比較して長くなる
ことで明らかであった。しかしながら、未変性で未修飾の抗体とポリ（エチレン
）グリコール修飾種混合物の両方が入っているサンプルをクロマトグラフィーに
かける場合には、そのようなカラムで未変性蛋白質とポリ（エチレン）グリコー
ル修飾蛋白質を分離するのは不可能であった。我々の試験で用いたポリ（エチレ
ン）グリコール修飾手順では、ポリ（エチレン）グリコールで修飾されなかった
抗体がある程度残ることから（他
の技術、即ち還元を受けさせていないＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて測定した時）、
この２成分を分離する能力を有するクロマトグラフィー方法を開発する必要があ
った。ポリ（エチレン）グリコール修飾蛋白質に未修飾で未変性の蛋白質が少量
でも入っていると免疫応答が起こり得ることが実証されていることから、このよ
うな開発は免疫学的に重要であった。
ＲａｉｎｉｎのＨｙｄｒｏｐｏｒｅ ＨＩＣカラムをそれが未変性蛋白質とＰ
ＥＧ修飾蛋白質を分離する能力に関して試験した。このカラムは、ＰＥＧが疎水
性リガンドとしてシリカを基とする粒子に組み込まれていると言ったユニークな
特性を有する（Ｈａｔｃｈ，Ｒ．Ｇ．、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｓｃｉ．、
２８：２１０（１９９０）、Ｃｈａｎｇ，Ｊ．他、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．
３１９：３９６（１９８５））。このカラムを用いて、ＰＥＧを結合相として利
用すると疎水相互作用が向上するかもしれないと言った仮定を試験した。このユ
ニークな化学は良好な性能を示し、未変性抗体とポリ（エチレン）グリコール修
飾種の分離を可能しかつ残存する未修飾抗体の定量を可能にするばかりでなく、
個々の１−ＰＥＧ、２−ＰＥＧ、３−ＰＥＧ修飾種の分離も与えた。この技術は
、若干修飾することのみでスケールアップすることができ、これを用いて、未変
性抗体が入っていないポリ（エチレン）グリコール修飾モノクローナル抗体を多
量に精製した。
Ｓｙｎｃｈｒｏｍ Ｉｎｃ．、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ Ｉｎｃ．からＳｙｎｃｈ
ｒｏｐａｋカラムを購入したが、上記カラムは、蛋白質および酵素で用いるに適
した中程度の疎水相互作用を示すシリーズのカラムである。このカラムには、３
００Åの巨視孔を有する６．５μの球形シリカが入っていて、このシリカは、疎
水性リガンド、例えばプロピル、ペ
ンチルまたはヒドロキシプロピルなどを用いて誘導されたポリアミド被膜に共有
結合している。
また、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ ＴＳＫフェニル−５−ＰＷカラムも試験した。このカ
ラムをＢｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＣＡから購入した。その粒子は、１
０００Åの巨視孔を有する１０．０μのヒドロキシル化ポリエーテルビードから
成っていて、このビードは、表面密度が非常に低い疎水性フェニルリガンドに結
合している。
また、Ｈｙｄｒｏｐｏｒｅカラムも用いた。このカラムをＲａｉｎｉｎ Ｉｎ
ｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．、Ｅｍｅｒｖｉｌｌｅ ＣＡから購入した。その詰物
は、孔サイズが３００Åの高純度シリカから成っていて、このシリカを化学的に
特許製品である親水性有機層に結合させている。その次に、その親水性単層にポ
リ（エチレン）グリコール基を共有結合させることでクロマトグラフィー材料を
生じさせる。ポリ（エチレン）グリコール（ＰＥＧ）は弱い疎水性を示す中性ポ
リマーである。高塩濃度の時に蛋白質表面の疎水領域と結合相の間の相互作用を
通して蛋白質を保持する表面密度でＰＥＧを結合させる。次に、塩濃度を低くす
ると蛋白質が高い収率で放出される。
ポリ（エチレン）グリコールで修飾されなかったエンリモマブとポリ（エチレ
ン）グリコール修飾ＢＩＲＲ１０の調製分離と分析道具の両方で用いるに適した
ＨＩＣ方法を開発した。この方法は、水ポリマー２相分離で実証したように、Ｐ
ＥＧ修飾蛋白質を分配でＰＥＧが豊富な相に入り込ませると言った利点を有する
。このようなクロマトグラフィー技術を用いると、ポリ（エチレン）グリコール
修飾調製物に入っている未変性エンリモマブのパーセントを迅速に測定すること
が可能になる。次
に、同じＨＩＣカラム材料を用いて、ポリ（エチレン）グリコール修飾材料を大
規模に精製することができる。この方法を用いると、また、ポリ（エチレン）グ
リコール修飾サンプルに入っている未変性抗体の定量を行うことができることに
加えて、ポリ（エチレン）グリコール修飾反応に関する指紋法（ｆｉｎｇｅｒｐ
ｒｉｎｔ）を与えるものであり、この方法をバッチからバッチへの変動を試験す
る場合の品質管理で利用することも可能である。この方法を用いて個々のピーク
面積を測定する（適当なソフトウエアを用いて）ことができることから、この技
術を利用して、また、ポリ（エチレン）グリコール修飾蛋白質の安定性およびポ
リ（エチレン）グリコール修飾過程の時間を監視することができる。いろいろな
粒子サイズで入手可能な市販ＨＩＣカラム材料を用いてこの仕事を達成する。
本方法に従い、ＢＩＲＲ１０を適切な塩溶液（例えば２Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4
、１００ｍＭの燐酸塩、ｐＨ７．０）に入れてＨＩＣカラムに付着させる。この
硫酸アンモニウム濃度を０．９Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4（１００ｍＭの燐酸塩、ｐ
Ｈ７．０中）にまで降下させる段階的勾配を用いて、最初に、未変性のエンリモ
マブを溶離させる。この塩濃度を更に降下させると［０．５Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4
（１００ｍＭの燐酸塩、ｐＨ７．０中）］、ＢＩＲＲ１０が上記カラムから単
一ピークとして溶離して来る。
ＢＩＲＲ１０の純度測定と同定はいろいろな分析方法を用いて実施可能であり
、このような方法には、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルの還元
物と未還元物を用いた電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）サイズエクスクルージョン
クロマトグラフィー、分析用ＨＩＣ、毛細管
電気泳動法、レーザー分離質量分光測定法、および円二色性が含まれる。還元を
受けさせていないクーマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル
の光学密度計測走査を行うことにより、各ポリ（エチレン）グリコール修飾種の
相対帯面積を見積もることができる。この手順を用いて、ＰＥＧの平均数はＢＩ
ＲＲ１０分子当たり約５であると推定する。レーザー分離質量分光測定を用いて
上記データを更に確証する。分析用のサイズエクスクルージョンクロマトグラフ
ィーを用いてＢＩＲＲ１０を更に特徴づける。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ゲル濾
過カラムの較正を、球状蛋白質標準とエンリモマブとＢＩＲＲ１０を比較するこ
とで行う。エンリモマブは見掛けストークス半径が２００ｋＤの蛋白質と一緒に
溶離する一方、ＢＩＲＲ１０の見掛けストークス半径は５４０ｋＤである。５ｋ
ＤのＰＥＧを５個付加させるとストークス半径が２．６倍大きくなる。
ポリ（エチレン）グリコールで修飾された材料とポリ（エチレン）グリコール
で修飾されなかった材料の混合物にこの上に記述した如き処理を受けさせると、
疎水相互作用クロマトグラフィーで分析して、その調製物には未変性の非ポリ（
エチレン）グリコール修飾材料が全く検出されなかった。
Ｖ． ポリ（エチレン）グリコール修飾抗−ＩＣＡＭ−１抗体の投与
本発明の抗体分子を公知方法に従って調合して薬学的に有用な組成物を生じさ
せることができ、この場合、所望純度の上記材料またはそれの機能的誘導体を生
理学的に受け入れられ得る担体、賦形剤または安定剤と一緒にして混合物の状態
にする。このような材料は使用投薬量および濃度で受容者に無毒である。受容患
者が投与に耐えることができるなら
ば、その組成物は「薬理学的に受け入れられ得る」と記述する。投与量が生理学
的に有意量であるならば、上記薬剤が「治療有効量」で投与されたと記述する。
ある薬剤を与えると結果として受容患者の生理が検出可能なほど変化する場合、
その薬剤は生理学的に有意である。
本発明の抗体は、非ＩＣＡＭ−１抗体に関して記述された様式と同じ様式で調
製および投与可能である（Ｂａｓｔａ，Ｍ．他の米国特許第５，１７１，６６３
号、Ｌａｎｄｕｃｃｉ他の米国特許第５，３０８，６２６号、Ｄｏｌｅｓｃｈｅ
ｌ，Ｗ他の米国特許第４，８８０，９１３号、Ｃｕｒｒｙ，Ｗ．Ｍ．他の米国特
許第４，７１９，２９０号、Ｓａｆａｉ，Ｂ．他の米国特許第４，６４９，１１
５号、Ｕｅｍｕｒａ，Ｙ他の米国特許第４，６９２，３３１号、Ｋｉｍｕｒａ，
Ｔ．他の米国特許第４，３７９，０８６号、Ｕｅｍｕｒａ，Ｙ他の米国特許第４
，３７１，５２０号、Ｏｓｔｈｅｒ，Ｋ．Ｂ．の米国特許第５，２８６，８５２
号、これらは全部引用することによって本明細書に組み入れられる）。
適切な賦形剤およびそれの組成（他のヒト蛋白質、例えばヒト血清アルブミン
などを包含）は例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編集、Ｍａｃｋ、Ｅａｓｔｏｎ
ＰＡ（１９８０））などに記述されている。貯蔵または投与に適切で薬学的に
受け入れられる組成物を生じさせる目的で、上記組成物に１種以上のポリ（エチ
レン）グリコール修飾抗−ＩＣＡＭ−１抗体種を有効量で含有させる。
本発明の組成物を、好適には、注射による非経口、迅速輸液、鼻咽頭吸収（鼻
咽頭内）、皮膚吸収または経口で投与するに適するように調合する。この組成物
は、また、筋肉内もしくは静脈内投与可能である。非
経口投与用組成物には、無菌の水溶液もしくは非水性溶液、懸濁液および乳液が
含まれる。非水性溶媒の例はプロピレングリコール、ポリ（エチレン）グリコー
ル、植物油、例えばオリーブ油など、および注射可能有機エステル、例えばオレ
イン酸エチルなどである。組織透過性を高めかつ抗原吸収を向上させる目的で担
体、アジャンクツ（ａｄｊｕｎｃｔｓ）または封鎖性包帯を用いることも可能で
ある。上記組成物には、不活性希釈剤に加えてまた、湿潤剤、乳化剤および懸濁
剤など、または甘味剤、風味剤、着色剤または香料剤などを含めることも可能で
ある。
任意に、他の材料、例えば抗酸化剤、例えばアスコルビン酸など、低分子量（
残基の数が約１０以下）のポリペプチド類、例えばポリアルギニンもしくはトリ
ペプチド類など、蛋白質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブ
リンなど、親水性ポリマー類、例えばポリビニルピロリドンなど、アミノ酸、例
えばグリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンなど、単糖類、
二糖類および他の炭水化物（これにはセルロースまたはそれの誘導体、グルコー
ス、マンノースまたはデキストリンなどが含まれる）、キレート剤、例えばＥＤ
ＴＡなど、そして糖アルコール類、例えばマンニトールまたはソルビトールなど
を加えることも可能である。
本組成物を有効量で与えるに必要な投薬量は、一般に、受容者の年令、状態、
性別、および病気の度合（もしあれば）などの如き要因、そして本分野の通常の
技術者によって調整可能な他の変数に応じて多様である。本発明の組成物の有効
量は多様であり、用量もしくは投薬１回当たり０．０１−１，０００ｍｇ／ｍｌ
であってもよいが、より少ない量もより多い量も使用可能である。
治療投与で用いる薬学組成物の滅菌は、例えば滅菌用濾過膜（例えば０．２ミ
クロンの膜）に通す濾過などで実施可能である。本組成物は凍結乾燥形態または
液状溶液として貯蔵可能である。
本発明のポリ（エチレン）グリコール修飾抗−ＩＣＡＭ−１抗体は、未変性の
抗体に比較して、実質的に向上した血清半減期を示す。従って、これを受容者に
投与すると、その受容者は、ポリ（エチレン）グリコール修飾を受けさせていな
い抗−ＩＣＡＭ−１抗体を投与した場合よりも長期間に渡って抗体を有効濃度で
持つことになる。
本発明の抗体は、ＩＣＡＭ−１が仲介する細胞接着によって引き起こされるか
或はそれの影響を受けた炎症を治療する目的で、ＬＦＡ−１または非ポリ（エチ
レン）グリコール修飾抗−ＩＣＡＭ−１と同じ様式で使用可能である。そのよう
な炎症には、特異的もしくは非特異的防御系の反応が起こる結果として引き起こ
される状態が含まれる。「特異的防御系の反応」は、特異的抗原が存在すること
に対する免疫系の応答である。「非特異的防御系の反応」は、免疫学的記憶能力
を持たない白血球が仲介する応答である。そのような細胞には顆粒球およびマク
ロファージが含まれる。
特異的防御系の反応の結果として引き起こされて本発明の抗体を用いて治療可
能な状態には、自己免疫病の結果として引き起こされる炎症、抗原（例えば風疹
ウイルス）に対する応答、Ｔ細胞が仲介する遅延型過敏応答［例えばマントー（
Ｍａｎｔａｕｘ）試験で試験した時に「陽性」を示す個体で見られる如き］など
が含まれる。非特異的防御系の反応の結果として引き起こされて本発明の抗体を
用いて治療可能な状態には、喘息、敗血症または外傷に対して二次的に起こる成
人の呼吸窮迫症候群
（ＡＲＤＳ）または多発性器官損傷症候群、心筋もしくは他の組織の再潅流損傷
、急性糸球体腎炎、反応性関節炎、急性炎症要素を伴う皮膚症、急性化膿、髄膜
炎、または他の中枢神経系炎症障害、火傷、血液透析、白血球搬出、潰瘍性大腸
炎、クローン病、壊死性全腸炎、顆粒球輸血関連症候群およびサイトカイン誘発
毒性などの如き状態に関連した炎症が含まれる。
示すように、本発明の修飾抗体を用いて、内皮細胞および他の細胞の表面に配
列しているＩＣＡＭ−１分子を遮断することができる。ＩＣＡＭ−１は、ヒトラ
イノウイルスが結合する細胞レセプタであり、それによってライノウイルスの感
染が始まる（Ｇｒｅｖｅ，Ｊ．Ｍ．他、Ｃｅｌｌ ５６：８３９−８４７（１９
８９）、Ｓｔａｕｎｔｏｎ，Ｄ．Ｅ．他、Ｃｅｌｌ ５６：８４９−８５３（１
９８９）、Ｏｈｌｉｎ，Ａ．他、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅ
ｍｏｔｈｅｒ．、３８：１４１３−１４１５（１９９４）、Ｃａｓｓａｎｏｖａ
ｓ，Ｊ．Ｍ．他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６８：５８８２−５８８９（１９９４））
ことから、鼻腔、気管および／または肺の内皮細胞にそれを結合させておくと、
ライノウイルスの感染が抑制される。このように、本発明の修飾抗体は、新規な
ライノウイルス感染予防方法を提供するばかりでなく、現存する感染を治療する
（ウイルスにさらされる未感染細胞が感染細胞による感染を受けないようにする
ことで）方法も提供する。
本発明をここに一般的に記述してきたが、特に明記しない限り本発明を制限す
ることを意図するものでない例示として示す下記の実施例を参照することで本発
明がより容易に理解されるであろう。
実施例１
抗−ＩＣＡＭ−１抗体のポリ（エチレン）グリコール修飾
臨床等級のエンリモマブ（ｅｎｌｉｍｏｍａｂ）はＫａｒｌ Ｔｈｏｍａｅ博
士、ＧｍｂIIから入手した。活性化ｍＰＥＧはＳｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙ
ｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）から入手した。これらの実
験で使用したすべてのｍＰＥＧは、分子量５ｋＤ（ｃａｔ ＃Ｍ−ＳＰＡ−５５
０００）のｍＰＥＧプロピオン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミジル誘導体であ
った。この活性化ｍＰＥＧはタンパク質上のアミノ基に反応性である。ｓＩＣＡ
Ｍ−１アフィニティ−カラムを製造するのに使用したクロマトグラフィー樹脂は
、３ＭからのＥｍｐｈａｚｅ Ｂｉｏｓｕｐｐｏｒｔ Ｍｅｄｉｕｍ ＡＢ１で
あった。緩衝液の塩は３Ｍ Ｓｃｉｅｎｃｅｓからの「超純粋」等級であり、そ
してすべての実験で使用した水は、１７ＭΩ−ｃｍ以上の抵抗を有するＢａｒｎ
ｓｔｅａｄ Ｎａｎｏｐｕｒｅ水システムによって製造された。
ポリ（エチレン）グリコール修飾抗−ＩＣＡＭ−１抗体エンリモマブは、溶液
またはカラム・ポリ（エチレン）グリコール修飾法のいずれかを使用して製造し
た。溶液ポリ（エチレン）グリコール修飾法の場合、ｍＰＥＧとエンリモマブと
の複合体は、溶液中で、緩衝水溶液中の種々の比率の活性化ｍＰＥＧおよびエン
リモマブを混合することによって製造した。反応は、種々の時点で、エンリモマ
ブ上の利用できるアミノ基の５０倍モル過剰に、反応混合物にジグリシンを添加
することによって停止させた。反応混入物（例えば、未反応ｍＰＥＧ、ジグリシ
ンなど）は、ダイアフィルトレーションまたは透析のいずれかによって、反応混
合物から除去し、そして緩衝液は、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化
ナトリウム、ｐＨ６に交換した。溶液を無菌濾過し、４℃に貯蔵した。
カラム・ポリ（エチレン）グリコール修飾法の場合、ｓＩＣＡＭ−１アフィニ
ティーカラムは、Ｅｍｐｈａｚｅ活性化クロマトグラフィー樹脂（ａｚａｃｔｏ
ｎｅ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を使用して製造した。ｓＩＣＡＭ−１を結合緩衝液
（８６０ｍＭ Ｎａ3クエン酸塩、１００ｍＭ ＮａIIＣＯ3、ｐＨ８．６）中に
ダイアフィルターし、濃度を約１０ｍｇ／ｍｌに調節した。次いで、Ｅｍｐｈａ
ｚｅ Ｂｉｏｓｕｐｐｏｒｔ Ｍｅｄｉｕｍを溶液に添加して、各２０ｍｇのｓ
ＩＣＡＭ−１について１ｍｇの膨潤樹脂を得た。樹脂をｓＩＣＡＭ−１溶液中に
渦流で混合し、懸濁液を室温で静かに１時間撹拌した。樹脂を１２５ｍｍの焼結
グラス濾過管中でＰＢＳ（５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ）
、ｐＨ６の１等量で１０回洗浄することによって、未結合ｓＣＡＭ−１を除去し
た。樹脂を１容積の３Ｍエタノールアミン（ｐＨ９）で２回、最初は３０分間、
次いで２時間静かに混合することによって、未反応アズラクトン基を消失させた
。次いで、樹脂を１容積の１Ｍ ＮａＣｌで１０回洗浄し、次いで１容積のＰＢ
Ｓ、ｐＨ６で３回洗浄した。樹脂をクロマトグラフィーカラム中に充填し、３カ
ラム容積の貯蔵緩衝液（６４ｍＭリン酸ナトリウム、８６ｍＭ ＮａＣｌ、２％
（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０５％ナトリウムアジド、ｐＨ６）で洗浄して、
４℃で貯蔵した。ｓＩＣＡＭ−１のＥｍｐｈａｚｅ樹脂への結合効率を測定する
ために、結合反応からの未結合ｓＩＣＡＭ−１の量をＢＣＡ法を使用して定量し
た。ｓＩＣＡＭ−１アフィニティーカラムの容量は
、エンリモマブの漏出が観察されるまで、カラムに連続的に通塔することによっ
て測定した。
ｓＩＣＡＭ−１アフィニティーカラムを、５カラム容積のＰＢＳ、ｐＨ７．５
で平衡させ、そしてカラムに容量までエンリモマブ（ＰＢＳ中２−５ｍｇ／ｍｌ
、ｐＨ７．５）を通塔した。活性化ＳＰＡ−ＰＢＧ（５ｋＤ）の溶液を１カラム
容積のＰＢＤ、ｐＨ７．５中に製造した。ｍＰＥＧ溶液は、ｓＩＣＡＭ−１カラ
ム中に通塔したエンリモマブのｍｇ毎に１ｍｇのｍＰＥＧを含有した。ｍＰＥＧ
溶液を室温で１時間ｓＩＣＡＭ−１カラムに再循環させ、そしてカラムを５容積
の平衡懸賞液で洗浄することによって除去した。次いで、ｍＰＥＧ−エンリモマ
ブは、２カラム容積の１００ｍＭグリシン、ｐＨ２．７２で溶出され次いで１Ｍ
Ｔｒｉｓ−塩基で中和されるか、或いは２カラム容積の１００ｍＭ炭酸ナトリ
ウム（ｐＨ１１）で溶出され次いで１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ４．５）で中和
される。
エンリモマブをＰＥＧで修飾する実験は、カルボキシメチル化ＰＥＧ５０００
ＭＷ（ＳＣＭ−ＰＥＧ）のスクシンイミジルエステルまたはスクシンイミジルプ
ロピオン酸エステル（ＳＰＡ−ＰＥＧ）を使用して行った。エンリモマブはまた
、これらの２種の誘導体の２０，０００ＭＷ類似物を使用して誘導体化した。こ
れらおよび他の結合化学はまた、５０００ＭＷ、２０，０００ＭＷおよび４０，
０００ＭＷでも試行した。
乾燥秤量されたｍＰＥＧ誘導体を抗体の溶液と短時間４℃で反応させることに
よって、エンリモマブモノクローナル抗体をＳＰＡおよびＳＣＭ誘導体で修飾し
た。反応溶液のｐＨは、６．０−８．０のｐＨ範囲内
の低イオン性強度リン酸緩衝液で維持した。高ｐＨでの反応は５０ｍｍホウ酸緩
衝液中で行った。タンパク質のｍＰＥＧに対する比率は１０：１〜１：１０の範
囲内であった。従って、幾つかの例では、リジンが過剰であり、ｍＰＥＧを限界
試薬になった（そして低い程度の修飾を起こした）。ｍ−ＰＥＧが過剰である他
の極限では、リジンが限界的であった（そして高い程度の修飾が起った）。エン
リモマブタンパク質溶液の濃度は１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲内であっ
た。ＳＰＡ誘導体を含む反応を過剰の濃厚ジグリシンで停止させ、他方短い半減
期のためにＳＣＭ反応を停止させる必要は無かった。過剰で未反応のＰＥＧは、
Ａｍｉｃｏｎ３０ｋＤまたは１００ｋＤセントリプレップ装置を使用して少なく
とも３ｘダイアフィルトレートした。
実施例２
ポリ（エチレン）グリコール修飾抗−ＩＣＡＭ−１抗体の精製のための分析方法
ポリ（エチレン）グリコール修飾抗−ＩＣＡＭ−１抗体の精製のための分析方
法を開発した。この努力の目的は２重であった：（１）ものクローアンル抗体エ
ンリモマブのポリ（エチレン）グリコール修飾試料の迅速特性決定を可能にする
疎水性相互作用クロマトグラフィー法を開発すること；（２）ＰＥＧ修飾タンパ
ク質を精製する一般的方法を提供すること。クロマトグラフィー試験は、数種の
市販のＨＩＣカラム：Ｓｙｎｃｈｒｏｐａｋ（Ｓｙｎｃｈｒｏｍ Ｉｎｃ．，Ｌ
ａｆａｙｅｔｔｅ，ＩＮから購入）、Ｈｙｄｒｏｐｏｒｅ ＨＩＣカラム（Ｒａ
ｉｎｉｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｏｎｔ Ｃｏ．，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡから購
入）、またはＢｉｏ−Ｇｅｌ ＴＳＫフェニル−５−ＰＷ（Ｂｉｏ−Ｒ
ａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｃｓ，ＣＡから購入）を使用して行った。
一連のエンリモマブポリ（エチレン）グリコール修飾誘導体は、各ＨＩＣカラ
ムを評価するのに使用した。これらの複合体は、ポリ（エチレン）グリコール修
飾の程度、結合の化学および結合操作法で使用されたＰＥＧ誘導体の分子量によ
って変わる。誘導体は、他の技法で決定されてまだ３５％もの残留未変性抗体を
有する混合物から、未変性のものが無くそして抗体当たり３０ＰＥＧ−５０００
単位をも持つポリ（エチレン）グルコール修飾種を有する混合物までの範囲内に
亙る。試料組成物のこの広い範囲によって、各カラムの分離能力を完全に評価す
ることができる。
分析ＨＩＣは、多重波長検出器１０５０、高テックピストン洗浄システムを持
つ四次ポンプ、自動インゼクター、１００μｌインゼクターループ（２．０ｍｌ
のプレプループも）よりなるＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ１０５０システム
で行った。タンパク質濃度は、２８０ｎｍのＵＶ吸収を追跡することによって監
視した。データ貯蔵は、Ｖｅｃｔｒａ４８６／３３Ｍパーソナルコンピュター上
でＨＰ Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウエアーで行った。クロマトグラムはＨ
Ｐ Ｄｅｓｋｊｅｔ Ｐｌｕｓプリンターでプリトし、記録のためにハードドラ
イブ上に貯蔵した。ポリ（エチレン）グルコール修飾生成物の性質は電気泳動法
で決定した。電気泳動法は、ＮｏｖｃｗシステムおよびＰｈａｒｍａｃｉａ Ｐ
ｈａｓｔｓｙｓｔｅｍの両方を使用して行った。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥは以下
の種類および組成物であった。Ｐｈａｓｔｇｅｌ、４〜１５％勾配は、Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ Ｐｈａｓｔｓｙｓｔｅｍ上で、１μｌ試料を適用して行った。タン
パク質濃度は１〜１０ｍｇ／ｍｌの
範囲内で変わった。
予備実験は、低い塩濃度のアイソクラテックＨＩＣ ＨＰＬＣシステムを使用
して行った。これらの実験は、未変性のＭａｂ並びにポリ（エチレン）グリコー
ル修飾エンリモマブ試料の相対疎水性の初期スクリーンとして働いた。幾つかの
カラム／試料の組合せで多重ピーク分離が見られたが、一つのカラム化学が他よ
りも有利である傾向は現れなかった。それ故、勾配ＨＰＬＣ法が開発された。
疎水性相互作用カラムの初期検査は、１００ｍＭリン酸塩ｐＨ７．０中の２Ｍ
硫酸アンモニウムから１００ｍＭリン酸塩ｐＨ７．０中の０Ｍ硫酸アンモニウム
の極めて単純逆塩勾配を使用して行った。勾配は１０カラム容積で行った；すべ
てのカラムは、４．６×１００ｍｍ（１．６６ｍｌ）であって、例外は７．５×
７５ｍｍ（３．３ｍｌ）またはそれより大きい形式だけで入手できるフェニル−
５−ＰＷカラムであって；流速は１．０ｍｌ／分であった。
Ｓｙｎｃｈｒｏｐａｋヒドロキシ−プロピルＨＩＣ樹脂を最初に評価した。塩
およびポリ（エチレン）グリコール修飾エンリモマブのクロマトグラムを、単純
勾配条件（０〜１００％Ｂから１５分）下で得た。これらの試料は、ＳＥＣ、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥおよびＴＮＢＳ検定法（遊離アミン数を決定する）に基づいて、
軽度から適度までの範囲内のポリ（エチレン）グルコール修飾に分類される。未
変性含有量は、ＨＰＬＣ ＳＥＣおよび非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの組合せから推
定して、５％以下から３５％までの範囲内に亙る。これらの試料はいずれもが、
未変性のポリ（エチレン）グリコール修飾種からの分離の程度を示さなかった。
しかし、各種試料について、ピーク形状中に顕著な差異があった。
数種のもっと高度にポリ（エチレン）グリコール修飾された試料を、Ｓｙｎｃ
ｈｒｏｐａｋヒドロキシプロピル・カラム上で同一の単純勾配を使用してクロマ
トグラフィーにかけた。ＳＰＡ−２０ＫＤ反応混合物の試料は２つのピーク、未
変性エンリモマブに分解し、そして長い保持時間の第二ピーク、従ってさらに疎
水性種が分離する。しかし、この試料のＨＰＬＣ−ＳＥＣクロマトグラムを検討
した結果、このさらに疎水性の種は極めて高度にポリ（エチレン）グリコール修
飾されたエンリモマブの小さい亜種を表した。２０ＫＤポリ（エチレン）グリコ
ール修飾エンリモマブの大部分は、ヒドロロキシプロピルカラム上で未変性非修
飾抗体から分離されなかった。極めて高度にポリ（エチレン）グリコール修飾さ
れた他の２種の試料（それぞれ１：５および１：１０比のエンリモマブ：ＰＥＧ
）は、ＰＥＧ比が増加すると共に、さらに長い保持時間の単一種の方へのシフト
を示した。しかし、これらの高度ポリ（エチレン）グリコール修飾試料中の残留
未変性エンリモマブはまだ分離しなかった。軽度なら適度までのポリ（エチレン
）グリコール修飾エンリモマブのクロマトグラフィーで得られた結果は、未変性
およびポリ（エチレン）グリコール修飾エンリモマブ種の間の分離が達成され得
ると言う証明を提供した。
ポリ（エチレン）グリコール修飾付加物から未変性エンリモマブを分離するの
を促進する試みにおいて、少しさらに疎水性のリガンドを使用した。Ｓｙｎｃｈ
ｒｏｐａｋメチルＨＩＣカラムを使用して、以前のクロマトグラフィー実験を幾
つかを反復した。今回は、適度のポリ（エチレン）グリコール修飾エンリモマブ
誘導体（５：１重量／重量比）だけをクロマトグラフィーにかけた。このカラム
リガンドは、勾配を３０分
（約２０カラム容積に同価である）に延長した場合でも、未変性抗体をそのポリ
（エチレン）グリコール修飾誘導体から分離できなかった。２０カラム容積の勾
配を用いて、達成され得る最良は、ポリ（エチレン）グリコール修飾エンリモマ
ブ試料のクロマトグラム中の肩の初めであった。ヒドロキシプロピルからメチル
へのリガンド疎水性の増加によっては、未変性とポリ（エチレン）グリコール修
飾エンリモマブ種との間の分離を改善することはできなかった。Ｓｙｎｃｈｒｏ
ｍシリーズ、プロピル中で、既存のリガンドよりも少しさらに疎水性である次の
リガンドを以前と同一の試料セットで試験した場合、同様の結果を得た。
Ｓｙｎｃｈｒｏｍシリーズ、ペンチル中の最後のアルキル鎖のリガンドも、他
のカラムで使用したのと同様の方式で試験したが、余りにも疎水性であって、勾
配の終点においてさえエンリモマブが解放されることが分かった。このクロマト
グラフィー実験では、未変性エンリモマブ抗体は、１００％Ｂ緩衝液（１００ｍ
Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ４．５）でも溶出されなかった。事実、ペンチルカラムか
らエンリモマブを溶出するためには、塩が無添加の水を使用することが必要であ
った。
アルキル鎖シリーズ中のますますさらに疎水性のリガンドは分離に正の効果を
有しないから、異なった種類の化学、フェニルを検討した。フェニル基は、サイ
ズに基づいて、プロピル基とほぼ同程度に疎水性であるが、そのフェニル環によ
ってｐｉ−ｐｉ相互作用の高い性質を有する。ＢｉｏＲａｄフェニル５−ＰＷカ
ラム（７．５×７５ｍｍ、３．３ｍｌカラム容積）を利用する勾配ＨＩＣ−ＨＰ
ＬＣ法の開発を行った。クロマトグラフィー勾配運転を、フェニルカラム上で、
標準１５分線形逆塩勾配（５カラム容積）および３０分線形勾配（１０カラム容
積）の両
方を使用して行った。５から有無容積勾配は、ポリ（エチレン）グリコール修飾
種から未変性エンリモマブを適切に分離するのに十分ではなかったが、種々の試
料の不均質性がフェニルカラムを使用してで示された。１０カラム容積勾配を用
いると、未変性エンリモマブおよびポリ（エチレン）グリコール修飾種の分離に
よっておよび多重ＰＥＧ−エンリモマブ付加物の分離から明示されるように、ク
ロマトグラフィー分解に顕著な改善があった。フェニルリガンドを使用するＨＩ
Ｃは、エンリモマプのポリ（エチレン）グリコール修飾試料中の幾らかの不均質
性を明らかにすることができる。このカラムは、それがエンリモマブのポリ（エ
チレン）グリコール修飾形態から未変性エンリモマブを分離する能力において、
大きい潜在性を示した。アルキルリガンドシリーズからフェニルへの変化によっ
て、ポリ（エチレン）グリコール修飾エンリモマブ試料の不均質性を明らかにす
るのに十分な選択性が提供された。
さらに独特の疎水性樹脂ＨＩＣ法を行った場合、さらに良好な選択制および分
離性が得られた。この方法は、軽い疎水性のみであるＲａｉｎｉｎハイドロ多孔
性（ｈｙｄｏｒｏｐｏｒｅ）カラムを使用した。ハイドロ多孔性カラムは偶然に
も、その疎水性リガンドのようなＰＥＧを有する。ＰＥＧを取り込む２相システ
ム中に見られた相互作用の機構はクロマトグラフィー的分離において真であり、
そしてこのリガンドを使用すると、未変性タンパク質をＰＥＧ修飾タンパク質が
ら分離することができると考えられる。初期のクロマトグラフィー実験は、同一
の試料を使用する他のＨＩＣカラム上で使用したものと同一の条件下で行った。
軽度から適度までのポリ（エチレン）グリコール修飾された試料の幾つかからの
クロマトグラムは、試料の大多数について、保持時間のシフト
（疎水性の増加の方に）を示し；最も修飾度の低い試料プールは、未変性種およ
び明らかに２種の異なったＰＥＧ修飾種であるものとの間の相当な分離性を示す
。この試料を他のＨＩＣカラム上で試験した場合、分離は全く検出されず、未変
性抗体に関する保持時間のいずれの相当な変化も確認されなかった。従って、Ｐ
ＥＧ修飾付加物からの未変性エンリモマブの或る程度の分離は、このカラム上で
達成された。
適度にポリ（エチレン）グリコール修飾されている試料の場合、未変性エンリ
モマブは、ハイドロ多孔性ＨＩＣカラム上のこのクロマトグラフィー技術によっ
て全く検出されなかった。しかし、溶出種の保持時間は、未変性エンリモマブよ
りの２分長くなった。
さらにもっと高度にポリ（エチレン）グリコール修飾された試料がハイドロ多
孔性ＨＩＣカラムシステムを使用して試験された場合、未変性エンリモマブに関
するＰＥＧ誘導体の保持挙動に劇的な変化があった。エンリモマブのさらに高度
にポリ（エチレン）グリコール修飾された種、例えば、ＳＣＭ−５ＫＤ１：１０
ポリ（エチレン）グリコール修飾種を用いると、保持時間は３分または２カラム
容積増加し、そしてクロマトグラフィーピークは、修飾度の低い試料に関して鮮
明になった。１５分、１０カラム容積勾配では、これは４００ｍＭの溶出塩の差
異に達し、そしてポリ（エチレン）グリコール修飾エンリモマブおよび未変性抗
体の間の疎水性の巨大な変化を示した。
ＳＰＡ−２０ＫＤ反応混合物は、２０ＫＤの単一ＰＥＧ鎖がエンリモマブに結
合する場合対５ＫＤの多重鎖の場合との疎水性の差異を示す。未変性および２０
ＫＤポリ（エチレン）グリコール修飾種との間の基線分離を用いて、残留未修飾
エンリモマブの定量は簡単になった。ＳＤＳ
−ＰＡＧＥゲルおよび２０ＫＤ試料ＳＥＣクロマトグラムはこれらの結果を確証
した。ヒドロキシプロピルカラム上で既に見られた分離は、未変性エンリモマブ
および１〜２０ＫＤのＰＥＧ−エンリモマブは疎水性で同価であり（それらは共
溶出するから）そして１０．２９分の保持時間の第二ピークは２−ＰＥＧ誘導体
であることを示した。
種々の試料について、ポリ（エチレン）グリコール修飾付加物から未変性エン
リモマブを分離するのにハイドロ多孔性ＨＩＣカラムを使用する効果を示したが
、方法の限界を決定するために、さらに詳細な研究を行った。低い末端の１０：
１から極めて高い末端の１：１まで変化する比率で、軽度から極めて重度までの
範囲内に亙って修飾された一連のＳＣＭ−５０００のエンリモマブ誘導体を製造
した。これらの試料中の残留未変性エンリモマブを定量する際のハイドロ多孔性
ＨＩＣの結具を表１に示す。未変性エンリモマブを、予備レンジング試験に基づ
いて、１％未満の水準でおよび４０％を以上の水準で検出することが可能である
。
ハイドロ多孔性カラムを使用する上記のＨＩＣ分析によって、反応中に残留す
る未変性エンリモマブのパーセントを、反応混合物中のＰＥＧ／エンリモマブの
比の関数として決定することができる。ＳＣＭ−５０００シリーズからの選択さ
れたクロマトグラムを得た。これらのクロマトグラムは、未変性エンリモマブの
ポリ（エチレン）グリコール修飾の増加する程度の関数として見られたクロマト
グラフィー中の変化を説明する。最も少なくポリ（エチレン）グリコール修飾さ
れた試料、ＳＣＭ−５０００ １０：１では４１．２％の未変性エンリモマブが
残留し、そしてポリ（エチレン）グリコール修飾種は主として、第二のポリ（エ
チレン）グリコール修飾種を暗示する肩を持つ、高い疎水性の単一主要ピークと
して見られた。ピークの同定のための確証的証拠は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥか
ら得た。ＳＣＭ−５０００ １０：１試料は、かかるＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で、未
変性エンリモマブ、主要な１−ＰＥＧ種および少量の２−ＰＥＧ種に分離した。
ＳＣＭ−５０００シリーズからの他の数種の試料も同一の方法で電気泳動して、
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの電気泳動およびハイドロ多孔性ＨＩＣクロマトグ
ラフィーとの間の対応する相関を得た。これらの結果は、上記のクロマトグラフ
ィー技術が、ポリ（エチレン）グリコール修飾種試料中の未変性エンリモマブの
％を決定するのに有用であることが示している。
ハイドロポアＨＩＣカラムは現在１２μｍの粒子ザイズのものと５μｍの粒子
ザイズのものが利用可能である。一般に、粒子サイズの減少の関数としてバック
プレッシャーの増大が期待される。これは、モデルとして小さい分子を使用する
逆相（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｈａｓｅ）ＨＰＬＣシステムにおいて正しい。しかし
、粒子サイズの関数としてのタンパク質の分離に関しては、分離能の増強はあま
り大きくない。かくして、粒子サィズを１２μｍから５μｍにすることにより、
ＨＩＣ分離能の著しい改良は期待することはできない、そして、このことは、ハ
イドロポアＨＩＣパッキング材料においても妥当する。このあまり大きくない改
良は未変性エンリモマブ（ｅｎｌｉｍｏｍａｂ）及び１−ＰＥＧ種のみならず、
個々の１−ＰＥＧ、２−ＰＥＧ、３−ＰＥＧ等の種間の分離に関しても、見られ
る。一般的傾向は概して粒子サィズを１２μｍから５μｍにすることにより、ピ
ークの鋭さが増す。これはより粒子サイズの小さいカラムでは理論的にプレート
カウントが増加するためである。
この方法の開発に使われた初期の実験は１２μｍの粒子を使用して行われ、Ｓ
ＣＭ−５０００ポリ（エチレン）グリコールー修飾シリーズの５μｍ粒子カラム
により実験が繰り返された。未変性エンリモマブのポリ（エチレン）グリコール
修飾種からの改善された分離により通常の分析用サンプルのために５μｍの粒子
カラムが採用された。この技術は、ポリ（エチレン）グリコール修飾反応におけ
る不均質性の再現可能性のための分布の測定のためにそして安定性指示法（ｓｔ
ａｂｉｌｉｔｙ ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）として有用である。ポ
リ（エチ
レン）グリコール修飾化学、ＰＥＧ誘導体の分子量及びポリ（エチレン）グリコ
ール修飾誘導体に対する天然タンパク質の疎水性によって、１２μｍの粒子の材
料を使用した多くの場合においても同一の結果を得ることが可能である。５μｍ
粒子のハイドロポアカラムは、１２μｍ粒子よりもより大きい分解能を達成する
ことができるが、スケールアップの重要なファクターである、バックプレッシャ
ーを十分に下げることにより１２μｍの粒子でも十分な分離が得られる。
ポリ（エチレン）グリコール修飾種から未変性タンパク質を分離する、本技術
の応用例の１つとして、他の抗体のＦａｂへカップリング（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）
したＡｌｄ−５０００ＰＥＧ誘導体を用いてポリ（エチレン）グリコール修飾反
応の時間経過をモニターすることがある。該反応は２４時間にわたって追跡され
る。Ｆａｂはエンリモマブよりも疎水性でない。即ち、Ｆａｂは、７．１４分で
溶出するのに対して、後者は、９．５４分かかる（１５分、線形勾配）。そして
単一の５０００ＭＷ ＰＥＧが装着されたポリ（エチレン）グリコール修飾Ｆａ
ｂは、９．７０分で溶出する未変性分子よりも相当強い疎水性である。この場合
、１−ＰＥＧ−Ｆａｂ種は未変性Ｆａｂから容易に分離され、天然タンパク質の
残渣の量は、分離の基準線とされる。しかし、基準線の分離は未変性エンリモマ
ブとポリ（エチレン）グリコール修飾種のと中間で達成されないため、精製に使
用するための方法として評価する前に、この状況を補正するために、本来の勾配
に対して改良が行われた。
おおよそ１０カラム量である、１２μｍの粒子サイズのハイドロポアの４．６
ｘ１００ｍｍのカラム上の１５分間の直線の勾配でスタートして、その勾配を３
０分間又は約２０カラム量延長し、そして次にＳＣＭ
−５０００ ５：１調製物を試験混合物として充填したカラムに６０分間又は４
０カラム量延長する。一日に６０分間の勾配を複数のサンプルを分析する方法は
、実際的ではないが、そのような勾配が未変性エンリモマブとポリ（エチレン）
グリコール種との間の分離を改善する簡単な方法を提示した。改善された分解能
と効率との妥協として３０分間の勾配が５０％Ｂから出発して線形に１００％Ｂ
まで変化する実験が行われた。未変性エンリモマブのポリ（エチレン）グリコー
ル修飾種からの分離は、６０分間の勾配のものとほぼ同じであり、３０分間実験
時間が短縮された。この改良されたより高分解の方法によりエンリモマブ−ＰＥ
Ｇ反応混合物はそれぞれ１−ＰＥＧ、２−ＰＥＧ、３−ＰＥＧ他の種に分けられ
る。これらの均一なポリ（エチレン）グリコール修飾付加物はその結合活性につ
いて、比較の特定ＥＬＩＳＡ（未変性エンリモマブに対する）を用いて、ＳＥＣ
、非減少及び減少ＳＤＳＰＡＧＥにより完全に分析され、純度を決定するために
ハイドロポアＨＩＣ上でレクロマトグラフ化（ｒｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ
ｅｄ）された。
実施例１の粗ｍＰＥＧ−エンリモマブ混合物中に存在する未変性（非ポリ（エ
チレン）グリコール修飾）材料はｍＰＥＧ−エンリモマブ調製物から疎水性相互
作用技術により除去され、それによりモノクローナル抗体エンリモマブの迅速な
特性決定が可能となりそしてこのような修飾されたタンパク質の一般的な方法が
提供される。
ハイドロポアリガンドの独特な特性により未変性エンリモマブをポリ（エチレ
ン）グリコール修飾エンリモマブから分離できるばかりでなく、付着するポリ（
エチレン）グリコール単位の数の異なる個々のポリ（エチレン）グリコール修飾
種の分別も可能となる。この高分解技術は未変
性エンリモマブをポリ（エチレン）グリコール修飾エンリモマブから分離するの
みならずさらなる特性決定のために個々の種をさらに分別するために使用するこ
とができる。ハイドロポアはポリ（エチレン）グリコール修飾プロセスを特定す
るために、未変性、１−ＰＥＧ、２−ＰＥＧ、３−ＰＥＧ他の種の定量のために
そしてより大きい規模（５００ｍｇまで）でのポリ（エチレン）グリコール修飾
エンリモマブの精製のために分析的に使用することができる。
高度にポリ（エチレン）グリコールで修飾されたサンプルは、クロマトグラム
及びエレクトロフェログラムにより決定されるように、未変性ＰＥＧの残部を含
まない。ポリ（エチレン）グリコール修飾サンプル中の未変性抗体を定量するこ
とが可能であることに加えてポリ（エチレン）グリコール修飾反応の特性評価を
する方法が提供されそしてバッチによる変化（ｂａｔｃｈ−ｔｏ−ｂａｔｃｈ
ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）をコントロールするためのクオリテイーコントロール
に使用することができる。ＨＰケムステーションソフトウエア（ＨＰ ｃｈｅｍ
ｓｔａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して個々のピークの面積を決定する
ことができることからポリ（エチレン）グリコール修飾タンパク質の安定性をモ
ニターしたり、経時的にポリ（エチレン）グリコール修飾反応の進行をモニター
すること等ができる。この方法の重要な用途の一つに調製物中に残った非ポリ（
エチレン）グリコール修飾タンパク質のパーセントを決定するための使用がある
。これにより、小さいタンパク質の半減期を増大させ又天然タンパク質の免疫原
性を減少させるというポリ（エチレン）グリコール修飾の目的のための免疫原性
試験（ｉｍｍｕｎｏｇ ｅｎｉｃｉｔｙ ｔｒｉａｌｓ）又は薬物動態学的研究
のいずれかに実
際に使用できる可能性を残す。一旦ポリ（エチレン）グリコール修飾調製物中に
天然タンパク質が残っていることが決定されれば、次にポリ（エチレン）グリコ
ール修飾調製物から天然タンパク質を除去することが可能となる。これもまた同
一のハイドロポアＨＩＣカラムを使用することにより可能となろう。実施例３
ポリ（エチレン）グリコール修飾抗−ＩＣＡＭ−１抗体の精製のための調製方法
カラムモジユールの設計により、分析レベルから調製規模のレベルにＨＩＣ法
の規模を拡大することは容易である。従って、例えば４．６ｘ１００ｍｍカラム
で分析方法を開発したら２１．４ｘ１００ｍｍカラムに容易に移行することが可
能であり、それにより数百ｍｇの精製が、一回のクロマトグラフ実験で可能であ
る。初期の精製実験が１０．０ｘ１０００ｍｍのカラムを使用して行われた。
下記の構成のクロマトグラフシステムにより大規模の精製が行われる。２個の
ウオータース（Ｗａｔｅｒｓ）５９０ポンプ、１個のウオータース（Ｗａｔｅｒ
ｓ）６８０勾配（グラジエント）コントローラー、そして１個のクラトス（Ｋｒ
ａｔｏｓ）７７３マルチ波長デイテクター。サンプルは、レオジン（Ｒｈｅｏｄ
ｙｎｅ）９１２５ ６口インジェクションバルブを使用し、５．０又は２０ｍl
のピークループのどちらかを使用して注入された。クロマトグラフのデータは、
当研究所の自動実験システム（ＬＡＳ）にリンクしたＡ−Ｄを通じて収集された
。表２は、スケールアップのパラメータを示す。
勾配の適当な場所に定組成塩保持段階を組み込むことによりより、天然抗体と
ＰＥＧ誘導体種との間の分離をより高い度合いでおこなうことが可能である。ち
ょうど勾配中の（５０％バッファーＢ）の地点で未変性エンリモマブが溶出し始
め、これらの条件はもう２カラム維持された後、１００％バッファーＢまでその
勾配が続いた。この分離は、未変性抗体に対応するバンドが実際にに存在しない
非減少（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｉｎｇ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥに示される。
ポリ（エチレン）グリコール修飾エンリモマブを精製するために、カラムプロ
セスにより調製された粗ｍＰＥＧ−エンリモマブ反応混合物を２Ｍ硫酸アンモニ
ア、１００ｍＭのフォスフェート、ｐＨ６、そして、２Ｍから０．５Ｍの段階的
な勾配の０．５Ｍ硫酸アンモニア中のＨＩＣカラムに適用される。この未変性エ
ンリモマブは、はじめ硫酸アンモニア濃度が０．９Ｍに近づくにつれて溶出し、
そして、ポリ（エチレン）グリコール修飾抗体誘導体はその後の溶出部分として
溶出する。
実施例４
ポリ（エチエン）グリコール修飾エンリモマブの精製
数回の溶出の溶離液をプールし、１５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。次に、この未精
製のプールを、分取スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）２００サイズ排除ク
ロマトグラフィーカラムに添加した。現れた単一の広いピークを、両方の末端、
すなわち、大量にポリ（エチレン）グリコール修飾されたエンリモマブを含んで
いる前の末端、及ぴわずかにポリ（エチレン）グリコール修飾されたそして天然
のエンリモマブを含んでいる後部を除くために分取した。
ポリ（エチレン）グリコール修飾エンリモマブの精製のためのＨＩＣ樹脂を評
価する場合、予想される最終規模を考慮しなければならない。理想的な樹脂は、
強い機械的保全性及ぴ化学的耐性を示し、十分なタンパク質容量を有し、そして
研究室規模の精製において用いられるシリカに基づく物質に匹敵する選択性を提
供することに加えて、中−低圧精製技術及び装置に適用できる形態において市販
されている。
Ｐｏｒｏｓ ＨＰ、ＰＨ、ＰＥ、ＢＵ、及びＥＴは、Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ Ｃ
ｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙモードにおけるペプチド、タンパク質、及び他の生
体分子の疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）のために考案されたポリ
マー充填剤である。これらの充填剤は、非常に速い物質輸送のための特徴的な二
様式の細孔サイズ分布を有する架橋したポリスチレン／ジビニルベンゼンｆｌｏ
ｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ粒子から成る。これらの粒子は、架橋しているポリヒドロキ
シル化ポリマーで被覆された面である。この被覆を、フェニル基（ＰＯＲＯＳ
ＨＰ及びＰＨ）、フェニルエーテル基（ＰＯＲＯＳ ＰＥ）、ブチル基（ＰＯＲ
Ｏ
Ｓ ＢＵ）、またはエーテル基（ＰＯＲＯＳ ＥＴ）でさらに機能的なものにする
。
Ｐｏｒｏｓ ＨＩＣ樹脂の全てが所望される特性にかなうけれども、Ｐｏｒｏ
ｓ ５０μ樹脂が、市販されているので、好ましい。ポリ（エチレン）グリコー
ル修飾エンリモマブの調製を用いて、この樹脂を、ポリ（エチレン）グリコール
修飾エンリモマブから天然のエンリモマブを分離する能力に関して試験した。
最初の実験は、ポリ（エチレン）グリコール修飾エンリモマブ調製物の１００
μｌサンプルの、ＢｉｏＣａｄ ６０ ワークステーションを用いた４．６ ｘ １
００ｍｍ分析Ｐｏｒｏｓ ＰＥ ＨＩＣ上へ直接注入に関した。Ｐｏｒｏｓ ＰＥ
樹脂の選択性を試験するために、２Ｍ−５Ｍ硫酸アンモニウムからの単一の１０
カラム容量の直線的な逆の塩濃度勾配（１００ｍＭリン酸塩、ｐＨ ６．０バッ
クグラウンド）を用いた。これらのクロマトグラフィー条件の下で、多数のピー
クが観察される場合、ＢｉｏＣａｄワークステーションの大きい能力を利用して
方法の最適化を達成することができる。一般的なＢｉｏＣａｄパラメーターを以
下の表３に略述する。
ＢｉｏＣａｄバッファーを、１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ ６．０、２
Ｍ硫酸アンモニウムの開始条件でｐＨモードにおいてコンフィギュレーションを
行う。勾配を、１０カラム容量にわたって直線的に２Ｍ硫
酸アンモニウムから０．５Ｍまで変化するようにプログラムした。１００ｍＭリ
ン酸塩、ｐＨ ６．０は、クロマトグラフィー溶出の間中一定である。クロマト
グラムは、単一の１０カラム容量の濃度勾配の結果として２つのピークを示した
。このことは、樹脂Ｐｏｒｏｓ ＰＥのポリ（エチレン）グリコール修飾エンリ
モマブから天然のエンリモマブを分離する能力における選択性を示す。この単一
の濃度勾配を用いて、多数のクロマトグラフィー溶出を行い、ピーク１及ぴピー
ク２の分画を集め、分析した。この分析は、ピーク１が天然のエンリモマブを含
んでなり、一方、ピーク２がポリ（エチレン）グリコール修飾エンリモマブ種を
含んでなることを示した。さらなる方法の開発は、ＰＥＧnエンリモマブ付加物
の混合物からの天然のエンリモマブのベースライン解像度を改善する方法をもた
らした。
最適化したＨＩＣ法は、ＰＥＧn−エンリモマブ付加物から天然の非ポリ（エ
チレン）グリコール修飾エンリモマブの最大限の分離を可能にする塩濃度に定め
られたアイソクラチック保持工程を有する２つの異なる濃度勾配に関する。この
方法は、以下の工程、
１．カラムの平衡化
２．サンプル調製物の添加
３．平衡化バッファーでのカラムの洗浄
４．５カラム容量での勾配Ｉ ２Ｍ−０．９Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4
５．１０カラム容量の間０．９Ｍ保持
６．２カラム容量での勾配II ０．９Ｍ−０．５Ｍ（ＮＨ4）2
ＳＯ4
７．５カラム容量の間０．５Ｍ保持
８．平衡化バッファーへの勾配の変更
を含んでなる。
１００マイクロリットルのエンリモマブポリ（エチレン）グリコール修飾調製
物を、Ｐｏｒｏｓ ＰＥカラム上に注入した。エンリモマブは、０．９Ｍ保持工
程の間に溶出し、０．９Ｍ及び０．５Ｍの間の硫酸アンモニウムの第二の勾配の
間に溶出されるＰＥＧ−エンリモマブから明確に分離される。次に、分析用Ｐｏ
ｒｏｓ ＰＥ４．６ ｘ １００ｍｍカラムに対して開発されたこの最適化した方
法を、より大きい型のＰｏｒｏｓ ２０ ＰＥカラムを用いた精製のためにスケー
ルアップした。
中ないし高圧系のために考案されたＷａｔｅｒｓ’ ＡＰガラスカラム系を用
いて、より大きいカラムをポリ（エチレン）グリコール修飾エンリモマブのスケ
ールアップ精製のために調製した。小さい粒子（２０μｍ）で生じる背圧は、低
圧系の限界を越えるので、Ｐｏｒｏｓ ＰＥ２０ミクロン媒質は、ＢｉｏＣａｄ
またはＨＰＬＣ系との使用を意図されている。６２ｍｌ容量の２．０ｃｍ ｘ １
９．８ｃｍベッドのＰｏｒｏｓ ２０ ＰＥカラムをＢｉｏＣａｄ系を用いて充填
した。充填バッファーは、５０ｍｌ／分の流速で脱イオン水であった。背圧は、
充填工程の間５００ｐｓｉを越えなかった。カラム添加のためのポリ（エチレン
）グリコール修飾エンリモマブ溶液の調製を除いて、方法の本質的な要素は、こ
の規模で変更しないままであった。カラム添加工程中にできるだけ多くのタンパ
ク質を捕獲することが望まれるので、３Ｍ硫酸アンモニウムを添加前にポリ（エ
チレン）グリコール修飾反応溶液に加えた。ポリ（エチレン）グリコール修飾反
応混合物の濃い塩の注意深い添加により、タンパク質混合物の１００％の捕獲を
促進する条件に達することが
可能であった。方法のこの時点からは、上記の小規模クロマトグラフィー法と同
一であった。６２ｍｌのＰｏｒｏｓ ２０ ＰＥカラム上でのＢｉｏＣａｄ溶出か
らのクロマトグラムは、エンリモマブが最初のアイソクラチック保持工程の間に
溶出し、そしてＰＥＧ修飾エンリモマブ付加物がこの方法の第二の勾配部分の間
に単一のピークとして溶出したことを示した。
溶出した物質のクーマシー染色した非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、少量のモ
ノ−ＰＥＧ−エンリモマブが（天然のエンリモマブが溶出する）アイソクラチッ
ク保持工程の間に溶出したことを示した。残存する非ポリ（エチレン）グリコー
ル修飾の天然のエンリモマブを含まずにＰＥＧ修飾エンリモマブ付加物からなる
分画を得ることが可能であった。このように、Ｐｏｒｏｓ ２０ ＰＥ樹脂を用い
たより大きいカラム型へのスケールアップは成功した。この規模は、比較的大量
のポリ（エチレン）グリコール修飾エンリモマブをＢｉｏＣａｄまたはＨＰＬＣ
系を用いて調製することを可能にする。低圧クロマトグラフィー装置に頼りなが
ら大規模精製の付加的な要件にかなうために、５０ミクロン粒子を用いたＰｏｒ
ｏｓ ＰＥ媒質でのスケールアップを行った。
Ｐｏｒｏｓ ＰＥ疎水性相互作用クロマトグラフィー媒質は、低圧系における
その使用を可能にする５０μｍの形態において提供されている。Ｕｐｃｈｕｒｃ
ｈ Ｓｃｉｃｎｔｉｆｉｃ’ｓ Ｏｍｅｇａシリーズ１０．０ ｘ １００ｍｍピ
ークカラムを７．８５ｍｌのこの新しい媒質で充填した。Ｐｏｒｏｓ ＰＥ ２０
ミクロン物質のために開発されたＨＩＣ法の５０μｍ粒子のＰｏｒｏｓ ＰＥで
の試験は、これらの２樹脂間の疎水性リガンド適用範囲の違いのために、いくつ
かの修正をもたらし
た。天然のエンリモマブは、Ｐｏｒｏｓ ２０ ＰＥ樹脂よりＰｏｒｏｓ ５０ Ｐ
Ｅにおいてより高い硫酸アンモニウム濃度で溶出したので、より大きい粒子は疎
水性がより低いようであった。
Ｐｏｒｏｓ ５０ ＰＥに対して開発された方法は、天然のエンリモマブを溶出
するために必要とされる硫酸アンモニウムの濃度においてのみＰｏｒｏｓ ２０
ＰＥ法と異なった。この変更は、エンリモマブを溶出するために必要な硫酸アン
モニウムの濃度を反映する勾配及ぴ最初の保持工程における対応する変更を促し
た。しかしながら、これらの変更の結果は、Ｐｏｒｏｓ ２０ ＰＥクロマトグラ
フィーに比較して、ポリ（エチレン）グリコール修飾エンリモマブからの天然の
エンリモマブのクロマトグラフィー分離に影響しなかった。表４は、Ｐｏｒｏｓ
ＰＥカラム上でのＨＩＣの結果の要約を示す。ほぼ最大カラム圧力でカラムを
流した
この方法により、市販されている疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ
）樹脂を用いて溶液において生成されたｍＰＥＧ−エンリモマブを精製した。未
精製のｍＰＥＧ−エンリモマブ反応混合物を、２Ｍ硫
酸アンモニウム１００ｍＭリン酸塩、ｐＨ ６バッファーで平衡化したＨＩＣカ
ラムに添加した。Ｐｏｒｏｓ ＰＥ疎水性相互作用マトリックスへの完全な保持
を確実にするために、カラム添加前にポリ（エチレン）グリコール修飾反応混合
物において硫酸アンモニウム濃度を調整した。硫酸アンモニウム濃度を０．９Ｍ
まで下げ、そしてさらに１０カラム容量の間このレベルで保持するように、最初
に天然のエンリモマブ溶出を伴う逆の塩濃度勾配工程を行った。第二の濃度勾配
工程の間に、塩濃度をさらに０．５Ｍまで下げ、ｍＰＥＧ−エンリモマブを単一
のピークとしてカラムから溶出する。
ポリ（エチレン）グリコール修飾エンリモマブの純度及び同一性を、分析ＨＩ
Ｃ、還元及び非還元ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、並びにサイズ排除クロマトグラフィーを含む分析法の組み
合わせを用いて測定することができる。非還元のクーマシー染色したＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥゲルのデンシトメーター走査は、ＢＩＲＲ１０の各ポリ（エチレン）グリ
コール修飾種の相対的なバンド面積の概算を可能にする。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ゲルは、エンリモマブの重鎖及び軽鎖上のＰＥＧ鎖の位置及び分布に関する情報
を与える。
ポリ（エチレン）グリコール修飾及び非ポリ（エチレン）グリコール修飾物質
の混合物を前述のように処理し、分析疎水性相互作用クロマトグラフィーを行う
場合、いかなる天然の非ポリ（エチレン）グリコール修飾物質も検出することは
できない。
実施例５
抗−ＩＣＡＭ−１抗体に対する競合ＥＬＩＳＡ
ポリ（エチレン）グリコール修飾抗体を特性化し、そしてそのインビ
トロでの効果を評価するために、２つの競合ＥＬＩＳＡを用いた。エンリモマブ
により認識されるｓｌＣＡＭ−１抗原（ｓｌＣＡＭ−１）に基づく第一の競合Ｅ
ＬＩＳＡを、様々なｍＰＥＧ−エンリモマブ誘導体の結合定数を天然の（「非ポ
リ（エチレン）グリコール修飾」）エンリモマブのものと比較するために用いた
。マイクロタイタープレート（９６ウェル）をＰＢＳ、ｐＨ７．１中の１０μｇ
／ｍｌ ｓｌＣＡＭ−１の溶液（１００μｌ／ウェル）で被覆した。次に、プレ
ートの開口部をＰＢＳ、ｐＨ ７．１中の１％ＢＳＡ溶液２５０μｌ／ウェルで
ブロックした。プレートからプレートの多様性の影響を最小限にするために、各
マイクロタイタープレート上で、ビオチン化エンリモマブ及びエンリモマブ、並
びにビオチン化エンリモマブ及びｍＰＥＧ−エンリモマブ間で競合を行った。ビ
オチン化エンリモマブの濃度を２．５μｇ／ｍｌで一定に保持した。
エンリモマブとｍＰＥＧ−エンリマモブは８００００ｎｇ／ｍlでカラム２で開
始し１．４で終了し、そして３：１にプレート上で薄められた。一晩インキュベ
ートした後、プレートを洗い、それぞれのウエルは９０分間ストレプアビジン西
洋ワサビパーオキシターゼの１：５０００希釈液１００ｍlで９０分間インキュ
ベートされた。プレートを洗いそれぞれのウエルにＯ−フエニレンジアミン液１
０mlを加え色をつけた。発色は２ ＮＱ Ｈ２ ＳＯ４を１００μl／ウエルを加え
て停止し、それぞれのウエル吸収は４９０ｎｍであった。データは非線形ＳＡＳ
ルーテイーンで分析された。エンリモマブに関するそれぞれのmPEG−エンリモマ
ブ誘導体の結合活性はmPEG−エンリモマブ誘導体結合定数とそれぞれのプレート
のエンリモマブのそれとを比較することによって定められた。それぞれのmPEG−
エンリモマブ誘導体の相対的結合活性を定めるために最低３つのプレートが実験
された。
sICAM−１に基づくELISAに加えて、全体のヒトJY細胞に基づく競合性ELISAが使
用された。当分析ではsICAM−１ではなく、ICAM−１を表面に表すヒトJY細胞で
それぞれのミクロタイタープレートを上に被覆した。競合反応、発色、およびデ
ータ分析は基本的には上記sICAM−１ ELISAとおなじであった。
sICAM−１ ELISAのBIRR10に対する結合活性定数はエンモリマブのそれの２５
％と評価された一方、JY細胞の結合活性ELISAは、より適切な測定を表すのだが
エンモリマブの７０％であった。
実施例６
ポリエチレングリコール修飾反応の特徴
実施例１のポリエチレングリコール反応はもっとも望ましい反応状態を定めるた
めに特徴づけられている。実施例１のmPEG／エンリモマブ反応のｐＨ依存性を調
べるためにｐＨ値７．０、７．５、及び８．０で実験が行なわれた。すべての反
応で、エンリモマブの最終濃度は１ｍｇ／ｍl，重量: 重量基準でmPEG: エンリ
モマブ比が１：１、そして、すべての反応は４℃で行われた。１、２、３、４、
５、６、及び２４時間の時点で分別された物はそれぞれの反応から除去され冷却
された。エンリモマブのポリエチレングリコール修飾率を定めるため、クーマシ
ー(coomassie)を染み込ませた非減少SDS−PAGEゲルが全てのアリコートに対して
試された。この分析の結果、mPEg／エンリモマブ反応はｐＨに強く依存すること
が調査された範囲内でわかった。ｐＨ７．０では非変性材料は反応混合物の中で
２４時間後においても残在したがｐＨ８．０では非ポリエチレングリコール修飾
材料は２時間後で見出されなくなった。反応混合物でほとんど、又は全く非変性
材料を含んでいない反応混合物がさらに調査されるべく選ばれた。結合活性の残
留はsICAM−１に基つく競合性ELISAによって定められた。結果は表５に示される
とおりである。
ｍＰＥＧのエンリモマブに対する接合反応の重量対重量比の効果を調査するため
、mPEG: エンリモマブ比２：１から１：５の範囲で６種の違う実験を行なった。
それぞれの反応は非減少SDS−PAGEにより分析された未変性材料とほとんど、又
は全く含まないサンプルが更なる分析のため選択された。
少量または全く非変性材料を含んでいないサンプルをさらに分析するため選び出
した。これらのサンプルの為、残り結合活性がCAM−１に基づいたELISAを用いて
定めた。結果は表６のとおりである。
上記の研究結果により、示される反応状態がポリエチレングリコール修飾エンリ
モマブを製造するため溶液ベースの修飾法を用いてpH７．０、４℃、mPEG: エン
リモマブ１：１、反応時間２４時間の反応条件が選択された。
これらの反応状態を使って大量に生産するためプロセスをスケールアッ
プした。これらの方法によって修飾されたエンリモマブはポリエチレングリコー
ル添加物を平均２−１０を含んでいた。
ポリエチレングリコール修飾を導入するためのカラムに基づく方法の参照として
、ｓＬＣＡＭ−１とエンフエイズ樹脂を樹脂洗浄液中の非結合CAM−１をＢＣＡ
法に基づいて定量する事により解決された。これは膨潤した樹脂１ｍlに対し共
有結合したsICAM−１約１９ｍｇに相当する。エンリモマブに対するsICAM1親和
性樹脂の結合容量はｐＨの関数として定められた。結果は表７に示されるとおり
である。これらのデータによると調べたｐＨ範囲の中で、sICAM−１−Emphaze樹
脂１ｍlにつきに結合容量はエンリモマブ約８mgであった。
ポリエチレングリコール修飾試験は単一ｓＩＣＡＭ−１アフィニテイーカラム
において、その方法の再現率を調べるために８回行われた。それぞれの試験から
得られたSDS−PAGE結合パターンは良好に再現生可能でそれぞれの反応はポリエ
チレングリコール修飾に類似した割合いで（例: 平均５peg5 kD添加物）mPEG−
エンリモマブ接合物を生産した。それぞれのポリエチレングリコール修飾試験で
負荷段階を突破にしたエ
ンリモマブとポリエチレングリコール修飾反応後カラムから溶出された材料が集
められた。これらの材料を定量し分析のためそれぞれのサンプルのＳＥＣ保持時
間が定められた。表８で示されるとおりサイズエクスクルージヨンクロマトグラ
フィーによる各試験の保持時間は再現性に大変優れ、（＜１％ＲＳＤ）、カラム
mnポリエチレングリコール修飾プロセスは再現が可能であることを示している。
表８で、”Ｂ”は突破、”Ｅ”は溶出、”ＮＤ”は不実施表す。
実施例７
可溶性ＩＣＡＭ−１カラムの阻止
ポリ(エチレン)グリコール反応における主要反応物はエンリモマブ上のリシン
基である。エンファーゼ(Emphaze)マトリックスと結合されたｓＩＣＡＭ−１部
分中の感受性リシン類がポリ(エチレン)グリコール修飾され、そのような分子を
エンファーゼと適切に結合できなくさせる。この潜在的な問題を最少にするため
に、リシン基阻止工程が開発された。ＤＬ−グリセルアルデヒド、スルホ−Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミド−アセテートおよび無水琥珀酸を含む試薬がそのよう
な阻止工程で使用されている。
ｓＩＣＡＭ−１−エンファーゼカラムは実施例１に記載されている通りにして
製造された。このカラムをさらにｐＨ６.０調合緩衝液（５０ｍＭ 燐酸ナトリウ
ム、１００ｍＭ ＮａＣｌ）で平衡化した。５００ｍＭ ＤＬ−グリセルアルデヒ
ド、１００ｍＭ シアノホウ水素化ナトリウムのｐＨ６.０調合緩衝液中溶液を次
に製造しそして数分間にわたり撹拌混合した。シアノホウ水素化ナトリウム（１
５７ｍｇ）を次に加えそして約３０秒間にわたり撹拌混合した。依然としてかな
りの量の未溶解グリセルアルデヒドを含有する白色溶液をエンドオーバーエンド
ミキサー(end-over-end mixer)上に置きそしてそのままさらに１５分間混合した
。このインキュベーション後に、溶液を濾過した。わずかな残存している不溶性
白色粒子を溶液の濾過により０.２μｍゲルマン・アクロディスク(Gelman Acrod
isc)（２５ｍｍ）が充填された３０ｃｃ注射器を通して新しい容器の中に除去し
た。
この阻止溶液を次にｓＩＣＡＭ−１エンファーゼカラム（５ｍＬのカ
ラム容量）上に毎分１.２ｍｌの流速で加えた。１０ｍｌが充填されそして１５
ｍｌが充填管の中に残った時に、カラム出口を充填管の中に入れてループを閉じ
た。溶液を室温でこの配置で２時間そのまま循環させた。
２時間後に、出口を除去して廃棄しそしてカラムを５容量のｐＨ６.０調合緩
衝液で洗浄した。この点で、カラムはポリ(エチレン)グリコール−修飾抗−ＩＣ
ＡＭ−１の製造における使用の準備がなされている。阻止されていないｓＩＣＡ
Ｍ−１カラムのエンリモマブ結合能は連続使用につれて減少する（図１）。上記
の工程を使用することにより、エンリモマブの結合能はカラムの２０サイクルに
わたり大きく増加した。
実施例８
別の抗−ＩＣＡＭ−１抗体（ＲＲ１／１.１.１）のポリ(エチレン)グリコール修
飾
ポリ(エチレン)グリコール修飾の上記の方法の一般性を示すために、エンリモ
マブ以外の抗−ＩＣＡＭ−１抗体を使用してそのような修飾を試みた。ＲＲ１／
１.１.１と称する抗−ＩＣＡＭ−１抗体は従って実施例１に記載された溶液およ
びカラムポリ(エチレン)グリコール−修飾法の両者で使用された。これらの実験
で使用されたポリ(エチレングリコール)はＳＰＡ−５０００Ｍ.Ｗ.誘導体であっ
た。溶液およびカラム反応は実施例１に記載されている通りであった。この実験
の結果は表９に示されている。
実施例９
リンパ球同型集合を阻害するポリ(エチレン)グリコール修飾抗−ＩＣＡＭ−１抗
体の能力
実施例１のポリ(エチレン)グリコール−修飾反応が、エリザにより測定してｓ
ＩＣＡＭ−１を結合可能なポリ(エチレン)グリコール修飾エンリモマブを生成し
た。インビトロリンパ球集合試験を行ってそれらがリンパ球同型集合を阻害する
能力により示されるような抗−ＩＣＡＭ−１
機能を保有していたポリ(エチレン)グリコール修飾誘導体を同定した。
この検定で使用されたＩＣＡＭ−１およびＬＰＡ−１の両者を発現するＪＹ
Ｂ−細胞系（Terhost，C.T．et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 73:910(1976
)）を１０％胎牛血清（ＦＢＳ）および５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンが補充
されたＲＰＭＩ１６４０培地（モンタナ州、セントルイス、シグマ）からなる完
全培地中に保った。幼若細胞をマカクザルおよびリスザルから培養した。血液を
ヘパリン中で集めそして白血球をフィコール−ハイパーク勾配分離（ファーマシ
ア、スエーデン）により単離した。細胞を５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンが補
充された１０％ＥＢＳ−ＲＰＭ１１６４０からなる培地の中で１３日間にわたり
培養した。
培養された細胞をＲＰＭＩ１６４０で２回洗浄しそしてＦＢＳを有するＲＰＭ
Ｉ１６４０の中で１０6個の細胞／ｍｌの濃度となるまで懸濁させた。平らな底
の９６ウェルマイクロタイタープレート（マサチュセッツ州、ケンブリッジ、＃
３５９６、コスター）に１００μｌの適当に希釈された抗体または１００μｌの
ＦＢＳを有するＲＰＭＩを対照として加えそして１００μｌの細胞をＦＢＳを有
するＲＰＭＩ１６４０中の１０6個の細胞／ｍｌの濃度で加えた。活性化を必要
とするウェルには、２.７×１０-5Ｍのホルボール１２−ミリステート１３−ア
セテート（ＰＭＡ）が加えられた。これは１.４×１０-5ＰＭＡおよび１×１０5
個の細胞／ウェルの最終濃度を生じた。プレートを３７℃においてインキュベー
トした。ＪＹ細胞を含有するプレートを１時間にわたりインキュベ
ートしたが、サルＴ細胞を含有するものは４時間にわたりインキュベートした。
集合を光顕微鏡を使用して１００の倍率で評価した。評価はシングルウェルの中
で無作為に行われ、エンリモマブを０.１〜５００μｇ／ｍｌの間の最終濃度で
試験した。集合度は０〜５＋の間で評価された。０の評価点は本質的に細胞がク
ラスター中になかったことを示し、１＋は細胞の１０％より少ない量が集合体中
にあったことを示し、２＋は細胞の２０％より少ない量が集合体中にあったこと
を示し、３＋は細胞の１００％近くまでが小さいゆるいクラスター中にあったこ
とを示し、４＋は細胞の１００％近くまでが比較的大きいクラスター中にあった
ことを示し、そして＋５は細胞の１００％が大きい非常に密な集合体中にあった
ことを示した。
抗体はそれらの各々のＩＣ50（すなわち、集合の５０％が阻害される濃度）を
測定することによりＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ−１接着相互作用により仲介された同
型集合の抑制に関して機能的に同定された。生来のエンリモマブおよび種々のポ
リ(エチレン)グリコール修飾誘導体の比較結果を表１０に示す。
表１０に示されているように、Ｂ−細胞同型ＪＹ集合中のＢＩＲＲ１０のＩＣ50
は約０.２μｇ／ｍｌであった。ポリ(エチレン)グリコール修飾エンリモマブ
のＩＣ50は異なるポリ(エチレン)グリコール修飾法の間では変動することが見い
だされた。数種のポリ(エチレン)グリコール修飾誘導体（ＢＩＲＲ１０を含む）
は生来のネズミエンリモマブと同等のＩＣ50を保有していた。
ポリ(エチレン)グリコール修飾エンリモマブ誘導体をサルＴ細胞の結合能およ
びそれによってＰＭＡ活性化により誘発される同型集合の阻害
能に関して試験した。１９２４−１１（溶液中のポリ(エチレン)グリコール修飾
）およびＢＩＲＲ１０（ｓＩＣＡＭ−１カラム上のポリ(エチレン)グリコール修
飾）の両者は試験濃度（１０.０μｇ／ｍｌ）においてリスザルＴ幼若細胞並び
に生来のエンリモマブ抗体の集合を阻害した。さらに、ＢＩＲＲ１０はマカクザ
ルＴ幼若細胞並びに生来のエンリモマブの集合を阻害した。（表１１）。表１１
は１０μｇ／ｍｌの示されている抗体を使用する場合の同型集合度を示す。溶液
法ポリ(エチレン)グリコール修飾エンリモマブは平均２−３ＰＥＧ付加物を有し
ていた。カラム法ポリ(エチレン)グリコール修飾エンリモマブは平均５ＰＥＧを
有していた。
実施例10
ポリ（エチレン）グリコール修飾抗-ICAM-1抗体のFcR結合特性
IgGのFc領域の結合に特異的なセレプター（"FcR"）が免疫系のいくつかのタイ
プの細胞の表面に存在する。高親和性FcR（FcRI、CD64）はマクロファージおよ
び活性化された多核白血球に存在する(Anderson,C,L.ら、Immunol.Today 7:264(
1986);Lynch,R.G.ら、Molec.Immunol.27:1167(1990)；Shen，L.ら、1987．L．Im
munol．139:534(1987))。低親和性FcR（FcRII，CD32）は、マクロファージ、Ｂ
細胞、および好中球に存在する。(１、Petroni,K.C.ら、J.Immunol.140:3467(1988
)；Bentin，J.ら、Cell Immunol．132:339(1991))。集合されかつ抗原と結合さ
れたとは言え、IgGは、双方のタイプのFcR、すなわち、異なる結合親和性でFcRI
およびFcRIIに結合するヒトおよびマウスのIgGの様々なアイソタイプに良好に結
合する(Ravetch,J.V.ら、Annu．Rev．Immunol．9:457(1991))。FcRの主な機能は
免疫応答の調節、例えばマクロファージでの免疫複合体の内面化および分解、な
らびにＢ細胞での抗体応答の負の調節にあるとみられる(Ravetch,J.V.ら、Annu.
Rev.Immunol.9:457(1991))。
治療薬として投与される抗体は、その抗体の標的抗原が単球もしくはリンパ球
の表面上の分子である場合、インビボでFcRと結合しそして免疫系に独特の状況
を提示する。FcR陽性細胞に結合した治療的抗体のモノクローナル抗体特異性が
リンパ球に対し向けられる場合は、リンパ球とFcR陽性細胞との間の交差結合が
細胞性活性化および副作用をもたらしうる(Krutmann，J.ら、J．Immunol．145:1
337(1990)；Thistlewaite，J.R.ら、Am．J．Kidney Dis，11:112(1988))。FcRI
およ
びFcRIIに結合することが示されている領域であるCH2ドメインでの点突然変異の
導入（Woof，J.M.ら、Mol．Immunol．21:523(1984)；Duncan,A.R.ら、Nature 33
2:563(1988)）は、FcRに対する抗体の親和性を低下させることが見出された(Ale
gre，M.-L.ら、J.Immunol.146:3461(1992)；Angal,S.ら、Mol.Immunol.30:105(1
993))。FcR結合特性でのこれらの変化がインビトロで細胞性活性化に対する抗体
の効果を非特異的に有意に低下させること(Alegre,M.-L.ら、J.Immunol.146:346
1(1992))、およびまた、抗体のインビボでの特徴を変化させる（Angal,S.ら、Mo
l.Immunol.30:105(1993)）ことも立証されている。かように、治療薬として評価
されている抗体のFcR結合特性を検討することが望ましい。
FcR結合は、典型的にはロゼット形成アッセイで測定される(Fritsche,R.ら、J
.Immunol.121:471-478(1978))。ロゼット形成アッセイでは、抗体は固定された
赤血球（Ｅ）に被覆され、そして被覆されたＥの、FcRIおよび／もしくはFcRII
陽性細胞に結合する能力が、ロゼット形成細胞（３個またはそれ以上のＥが結合
された細胞）の数を計測することにより測定される。Ｅ上に被覆された抗体は、
本質的には集合し、また、これはFcRIの結合とFcRIIの結合との間を区別する能
力を排除するとは言え、FcRIおよびFcRIIを特異に発現しならびにFcRに対する抗
体を阻害する細胞集団の使用が、FcRIおよびFcRIIに対するFc結合特性の割り当
てを可能にする。この試験では、ロゼット形成アッセイを、BIRR10（ポリ（エチ
レン）グリコール修飾抗-ICAM-1抗体）のFcR結合特性を親抗-ICAM抗体エンリモ
マブ(enlimomab)のそれと比較するのに使用した。
かように、FcR結合を測定するため、細胞を計測し、１度洗浄し、そしてRPMI
1640、10％FCS中に1×107/mlで再懸濁した。ロゼット形成チューブを、丸底ポリ
プロピレン培養チューブ中に記述されるように（Yodoi，J.ら、J．Immunol．122
:2577(1979)）セットし、そして、６μlのFCS、15μlの被覆された固定雄ウシ赤
血球（Eo）(2％溶液)、15μlのRPMI-1640、10mMのHEPES、pH7.3、15μlのHBSS、
15μlの1×107/mlの細胞(細胞1.5×105個)から成った。エンリモマブのF(ab')2
を各チューブに50μg/mlの最終濃度で包含して、指標細胞として使用されている
リンパ球／単球の表面上のICAM-1への、抗-ICAM-1で感作されたEoの非特異的結
合を防止した。若干のサンプルには、HBSSに代わりに15μlの抗FcRI（0.1mg/nl
）を添加し、そして感作されたEoの添加前に細胞と10分間プレインキュベーショ
ンした。全ての成分の添加後、チューブを簡単に低速でボルテックス攪拌し、37
℃で10分間インキュベーションし、低速でボルテックス攪拌し、700rpmで７分間
遠心分離し(GS-6KR遠心分離器、Beckman)、氷上に置きそして冷中で一夜インキ
ュベーションした。
赤血球の被覆については、雄ウシ血をColorado Serum Co,、コロラド州デンバ
ーから得た。赤血球は記述されたように（Fritsche,R.ら、J.Immunol．121:471-
478(1978)）固定し、かつD-PBS中8％溶液として保存した。固定雄ウシ赤血球（E
o）を、新たに調製した0.1M酢酸ナトリウム、pH5.0（酢酸緩衝液）中で１度洗浄
し、そして酢酸緩衝液中4％溶液に再懸濁した。Eoを被覆するため、酢酸緩衝液
中に250μlの洗浄されたEoを、丸底のポリプロピレン製バイアル中の250μlのタ
ンパク質溶液（等量の酢酸緩衝液およびホウ酸緩衝生理的食塩液中100μg）
に添加し、そして室温で２時間回転した。感作されたEoを冷ハンク平衡塩溶液（
HBSS）中で３度洗浄し、そしてHBSS中に2％の最終濃度で再懸濁した(Fritsche,R
.ら、J.Immunol.121:471-478(1978))。
ロゼットを計測するため、色素溶液を新たに調製し、そして0.4mlのHBSS、0.1
mlのFCS、0.25mlのD-PBS中0.2％トルイジンブルーから成った。計測するため、
ロゼット形成したサンプルを氷から取り出しそして２個の手の間で17回回転させ
、20μlを取り出しそして丸底の培養チューブ中の9.2μlの色素溶液に添加し、
サンプルをピペットの先端で３度混合しそして血球計算器に移した。細胞が安定
した後、最低300個の総リンパ球／単球（青）を計測し、そしてロゼットを、最
低３個の付着したEoの存在として点数化した。凝集塊は無視した。計測した細胞
全体のロゼット形成した細胞のパーセントを算出した(Angal,S.ら、Mol.Immunol
.30:10513(1993))。
最初の実験で、CD19+細胞（Ｂ細胞）およびCD14+細胞（単球）を末梢血単核細
胞から単離した。末梢血は、２もしくは３人のドナーからヘパリン被覆真空容器
中に静脈穿刺により収集した。末梢血単核細胞を、製造元の使用説明書に従い、
フィコールパック（Ficoll-Paque）（Pharmacia）を使用する勾配沈降分離によ
り単離した。CD19+細胞は、製造元（Dynal）の使用説明書に従い、ダイナビーズ
(Dynabead)細胞分離処置を使用して単離した。末梢血単核細胞を、ダイナビーズ
M-450Pan-B（抗CD19被覆磁気ビーズ）とインキュベーションし、ダイナルMPC磁
石を使用して単離し、洗浄し、そして、製造元の使用説明書に従い、デタック(D
ETACH) a BEAD-19 抗血清を使用してダイナビーズから遊離させた。CD14+細胞
は、製造元により記述されたように、
抗CD14被覆磁気ビーズ（AMAC）を使用して単離した。CD19-、CD3-枯渇細胞は、
製造元の使用説明書に従い、AMAC磁気分離製品を使用して、上のダイナビーズM-
450 Pan-B（抗CD19）に結合しなかった細胞を使用して非磁気フラクションとし
て単離した。AMAC IO ビーズ-抗マウスIgGを抗CD3（AMAC）で被覆した。CD19-
細胞を抗CD3被覆ビーズとインキュベーションし、そしてCD3+細胞を除去した。
２回りの陰性選択を実行してCD19-、CD3-枯渇細胞を得た。
細胞は、冷FACS緩衝液（ダルベッコリン酸緩衝生理的食塩液(D-PBS)、2％BSA
、0.2％アジ化ナトリウム）中で１度洗浄し、各サンプルについて50μlのFACS緩
衝液中に再懸濁し(サンプルあたり細胞1.0−0.5×105個)、そして"Ｖ"底の96穴
ポリスチレン製プレート(Dynatech Laboratories、001-010-2701)で培養した。
全ての染色処置は氷上で実施した。第一段階の抗体を下に記述されるように100
μlのFACS緩衝液中に添加した。細胞を多チャンネルピペットで混合し、そして
氷上で１時間インキュベーションした。
抗FcRI（CD64）（クローン10.1、マウスIgG1）をResearch Diagnostics，Inc.
（RDI-CBL491）から購入しそして10μg/mlの最終濃度で使用した。抗体を含有す
る培養上清を２倍の最終希釈で使用した。抗FcRIII(CD15)（クローンCLB-149、
マウスIgG2a）をResearch Diagnostics,Inc.（CLB-CD16、ロット＃1389-0401）
から購入しそして10μg/mlの最終濃度で使用した。抗体エンリモマブ（マウスIg
G2a）を20μg/mlの最終濃度で、5mg/mlのストック溶液から使用した。抗体RPC-5
（マウスIgG2a）はCappel（Oregon Teknika Corp.）から購入し、そして20μg/m
lの最終濃度でアイソタイプのコントロール抗体
として使用した。U7.6抗体を産生する細胞を血清を含まない培地中で増殖し、そ
して、Hardy,R.R.(Handbook of Experimental Immunclogy,D.M.Weir編、Blackwe
ll Scientific Publication，マサチューセッツ州ケンブリッヂ中，p.13(1986))
により記述されたように精製した。U7.6は10μg/mlの最終濃度でアイソタイプの
コントロール抗体として使用した。
表面の表現型分析には不十分な数のCD19+細胞が存在した。末梢血単核細胞の
表面マーカーについての染色は、期待されたように、リンパ球集団がFcRI-、FcR
II+であることを示した(第12表)。CD14+細胞は染色後、抗CD14磁気ビーズで再集
合させそして分析前に濾過した。
フローサイトメトリーを使用して細胞集団を分析した。細胞を、50μlの濾過
した（0.2μm）ウシ胎児血清（FCS）をれぞれのサンプルの下におき、そしてプ
レートを1600rpm（GS-6KR遠心分離器、Beckman）で６分間遠心分離することによ
り洗浄した。上清培地を吸引することにより除去し、そして第２段階の染色試薬
、すなわちヒトIgGに吸収されたR-フィコエリトリン結合親和性精製ヤギF(ab')2
抗マウスIgG（TAGO、4950（Biosource International）を、100μlのFACS緩衝液
に添加した(100倍希釈)。細胞を多チャンネルピペットを用いて再懸濁し、そし
て暗所で氷上で１時間インキュベーションした。
細胞を50μlの濾過したFCSをれぞれのサンプルの下におきそしてプレートを16
00rpm6分間遠心分離することにより洗浄した。上清培地を吸引した後、細胞をD-
PBS、0.2％アジ化ナトリウムで１度洗浄し、そして D-PBS、1％パラホルムアル
デヒド（0.5ml）中に固定した。サンプルはフローサイトメトリー分析（FACSCAN
，Beckton-Dickenson）
に先立ち暗所４℃で保存した。
フローサイトメトリー分析は、残存する集団が主として FcRIおよびFcRIIにつ
いて陰性のリンパ球であったことを示した。これは、こうした細胞がＴリンパ球
であることおよびロゼット形成した細胞の低いパーセントと矛盾しない(下を参
照)。未分離の末梢血単核細胞集団のフローサイトメトリー分析は、単球集団が
、期待されたように、はっきりとFcRI+およびFcRII+であったことを示した（第1
2表）。第12表において、報告されたデータは、前方および側方スキャッターに
より２個の集団として分析された、染色された未分離の末梢血単核細胞の表面の
表現型についてである(リンパ球および単球)。凡例は、−、全ての細胞が表面マ
ーカーについて陰性、+、全ての細胞が表面マーカーについて弱く陽性、++、全
ての細胞が表面マーカーについて強く陽性、である。細胞集団の一部が陽性の場
合はそのパーセントを与える。FcRIII腸性リンパ球は、低いおよび高いFcRIIIレ
ベルを表す２個の集団として存在した。パーセントは双方の陽性集団を一緒に反
映する。
結果は、BIRR10が、エンリモマブに比較してFcRIおよびFcRIIの双方への低下
した結合を表すことを示唆する。
"CD14+"細胞により形成されたロゼットのパーセントは小さかった。なぜなら
、分析され得たこの集団の細胞はリンパ球であったからである。CD19+およびCD1
4+の集団の類似の表現型の分析を擁護して、２種の集団でのロゼット形成の結果
は同様であった。エンリモマブ、キメラIgG1、マウスIgG2、ヒトIgG1、もしくは
ヒトIgG4で被覆されたEoは、類似のパーセンテージのロゼットを形成した(47.5
％±4.9)。GSA被覆Eoによるバックグラウンドのロゼット形成は23.9％であった
。ポリ（エチレン）グリコール修飾抗-ICAM-1（BIRR10）で被覆されたEoは、試
験された他のEoより有意に低いパーセントのロゼット(それぞれ29.2％および35.
6％)を形成した。
第二の実験では、CD19+細胞（Ｂ細胞）およびCD19-、CD3-枯渇細胞（単球）を
末梢血単核細胞から単離した。表面の表現型の分析に不十分な数のCD19+が存在
した。表面マーカーについての末梢血単核細胞の染色は、ここでも、リンパ球集
団がFcRI-，FcRII+であることを示した(第12表)。CD19-、CD3-枯渇細胞は、未分
離の末梢血単核細胞集団での31％の単球に比較して42％の単球であった。かよう
に、CD19+細胞およびCD3+細胞の磁気ビーズの枯渇による単球の濃縮は効率的で
なかった。未分離の末梢血単核細胞集団のフローサイトメトリー分析はここでも
、期待されたように、単球集団がはっきりとFcRI+かつFcRII+であったことを示
した(第12表)。
CD19+細胞およびCD19-、CD3-枯渇細胞のEoへの結合は、第一の実験で得られた
ものと類似の結果を与えた。ポリ（エチレン）グリコー
ル修飾抗-ICAM-1抗体（BIRR10）で被覆されたEoは、CD19+細胞で試験された他の
Eo（31,7％±3.1）より低いパーセントのロゼット（それぞれ25.3％および21.3
％）を形成した。CD19-、CD3-枯渇細胞は単球により濃縮され、かつ、集団は未
分離の末梢血単核細胞により類似していたとは言え、ロゼット形成の結果はCD19+
細胞でのそれと同様であった。関連しないIgG4を除いては、ポリ（エチレン）
グリコール修飾抗-ICAM-1抗体（BIRR10）で被覆されたEoは、CD19-、CD3-枯渇細
胞で試験された他のEo（35.6％±2.2）より低いパーセントのロゼット（それぞ
れ25.5％および21,6％）を形成した。抗FcRIをキメラIgG1でのロゼット形成アッ
セイに包含した場合、形成されたロゼットのパーセントはBIRR10で見出されたレ
ベルに低下した(それぞれ24.2％および25.0％)。これは、CD19-、CD3-枯渇細胞
により形成されたロゼットが抗体で被覆されたEoのFcRIへの結合を優位に反映し
たことを指摘した。
上に記述された結果は、固定雄ウシ赤血球上に被覆されたポリ（エチレン）グ
リコール修飾抗-ICAM-1抗体（BIRR10）が、エンリモマブおよびキメラIgG1に関
してCD19+（Ｂ）細胞への低下した結合を表したことを指摘した。第一の実験で
は、表現型分析からの結論は、これがFcRIIへの低下した結合を反映するという
こととなろう。
固定雄ウシ赤血球上に被覆されたポリ（エチレン）グリコール修飾抗-ICAM-1
抗体（BIRR10）はまた、CD19-、CD3-枯渇細胞（単球が濃縮された）への低下し
た結合も表した。キメラIgG1の結合は、CD19-、CD3-枯渇細胞を抗FcRIとともに
プレインキュベーションすることにより有意に低下した。これは、第二の実験で
は、CD19-、CD3-枯渇細
胞へのBIRR10被覆雄ウシ赤血球の結合がFcRIへの低下した結合を反映することを
指摘する。これらの結果は、集合されたIgG（被覆された赤血球）を使用した場
合、高親和性FcRIの存在下にFcRIIへの結合を区別することの不能と矛盾しない
。使用されたロゼット形成条件下ではFcRI結合が優位となるとみられると期待さ
れよう。この結果は、BIRR10へのPEGの付着がFcR結合を低下させることを指摘す
る。
実施例11
ウサギ免疫原性試験
様々なポリ（エチレン）グリコール修飾過程を試験するため、ウサギの免疫原
性の実験を行った。試験は、免疫応答を産生するであろうとみられる投薬レジメ
ンおよび投与経路を使用して、エンリモマブ分子およびその誘導体の免疫原性を
評価するようデザインした。
現在承認されているSPFの商人からのいずれかの性の４匹のニュージーランド
白ウサギを、ACUC標準的方法#91-01-Dに従って１抗原あたりに使用した。麻酔薬
アセプロマジンを、血清収集前20分に皮下に投与した(1mg/kg)。ウサギを、４週
間の腹腔内もしくは静脈内への1mg/kgの滅菌抗体処方（タンパク質濃度について
）の週１回注入により、マウス抗体について感作した。血液を、抗体の各注入前
および最後の免疫後２週間に、中心耳動脈から収集した。
ELISAをウサギ血清中の抗マウス抗体の検出に使用した。血清を、ウサギ血液
から、血液収集後１時間以内の遠心分離により調製した。血清を等分にし、そし
て使用まで−70℃で凍結させた。感作する本来のマウス抗体を、適切な穴に10μ
g/mlの濃度の（ダルベッコリン酸緩衝生理的食塩液、Dpbs中で希釈された）抗体
50μlをピペッティング
することにより、96穴リンブロ(Linbro)E.I.A，プレートに被覆した。プレート
を室温で１時間インキュベーションした。穴を200μlのDpbsで３度洗浄した。穴
をDpbs中2％ウシ血清アルブミン(bsa-Dpbs)(200μl/穴)で4℃で一夜ブロックし
た。ブロックを、血清滴定(1％bsa-Dpbs中で希釈された)（50μl/穴）の添加直
前に除去した。通常、各血液について 12回の２倍希釈（500倍から開始する）を
使用してウサギの力価を決定した。血清滴定を37℃で２時間インキュベーション
した。穴を200μlのDpbsで３度洗浄した。検出抗体すなわちヤギF(ab')2抗ウサ
ギIg(H＆L)−ワサビペルオキシダーゼ複合体（Tago）を1800倍（1％bsa-Dpbsで
希釈された）で穴あたり50μl添加した。穴を37度で１時間インキュベーション
した。10μlのABT基質（ザイメド(Zymed)）を添加した。色を、分子装置(Molecu
lar Device)Vmax ELISAリーダーで4405nmで読みとった。終末点はおよそ1.000の
OD示度に到達するコントロール抗体（1μg/mlのウサギ抗マウスIgG）により決定
した。ウサギ、時間点、および抗体処方の間を比較するために、およそ0.5ODの
示度の血清滴定を使用した。17種のエンリモマブ誘導体を特徴づけした。エンリ
モマブは全ての試験の全てのウサギで免疫応答を顕在化した。３種の誘導体が、
ヒトの治療薬としてのそれらの使用を許す十分な（本来のマウス抗体の＞20％）
ICAM-1結合能力を保持しつつ、免疫原性での著明な低下を生じたことが明らかに
された。
第２図は、エンリモマブ、抗体2183-66M(CA3抗イディオタイプカラムを使用し
て得られた抗体分子あたり５個のPEG付加物の平均を有するPEG-エンリモマブ誘
導体)、もしくはBIRR10（sICAM-1カラムを使用して得られた抗体分子あたり５個
のPEG付加物の平均を有す
るPEG-エンリモマブ誘導体）のいずれかの腹腔内注入後の個々のウサギの抗エン
リモマブ血清力価（1000で）を示す。この図は、PEG修飾エンリモマブが本来の
抗体より本質的により低い免疫原性を有したことを立証する。
第３図は、エンリモマブもしくは抗体930329/4:1（抗体分子あたり３個のPEG
付加物の平均を有するPEG-エンリモマブ誘導体）のいずれかの腹腔内注入後の個
々のウサギの抗エンリモマブ血清力価（1000で）を示す。この図もまた、PEG修
飾エンリモマブが本来の抗体より本質的により低い免疫原性を有したことを立証
する。
第４図はエンリモマブもしくは抗体1924-11（抗体分子あたり２個のPEG付加物
の平均を有するPEG-エンリモマブ誘導体）のいずれかの腹腔内注入後の個々のウ
サギの抗エンリモマブ血清力価（1000で）を示す。図に指摘されるように、PEG
修飾エンリモマブは本来の抗体より本質的により低い免疫原性を有した。
固体支持体上で２種の誘導体を調製し、それによりエンリモマブの結合部位を
保護した。CA3 ICAM-1抗イディオタイプカラムから調製された誘導体2183-66M
は免疫原性を有意に低下させた。1mg/kgの抗体の腹腔内の４用量後、平均の対数
血清力価は5.55（抗エンリモマブ活性）から4.50（抗-2183-66M活性）まで低下
し、これはt-検定解析により統計学的に有意であった。(第13表)。この低下はマ
ウス抗体の免疫反応の10倍の低下を反映した。別のエンリモマブ誘導体P0045をs
ICAM-1カラムから調製した。1mg/kgIPの４用量後、平均の対数血清力価は5.55（
抗エンリモマブ活性）から4.88（抗-sICAM-1活性）まで低下した。この低下はt-
検定解析により統計学的に有意でなかった
(第13表)。第13表で"SEM"は平均の標準誤差を指す。
免疫原性の低下に有効と同定された第三の誘導体は溶液中で調製した。この誘
導体をIP、1mg/kg、４用量投与した。平均の対数血清力価は4.12（抗エンリモマ
ブ活性）から3.11（抗-930活性）まで低下し、これはt-検定により統計学的に有
意であり(第13表)、免疫応答での10倍の低下を反映した。この誘導体を静脈内（
IV）投与によりさらに試験した。免疫スケジュールは、４回の週１回 1mg/kgIV
注入、その後の1mg/kgIVの月１回注入から成った。血清サンプルを各IV投与の７
日後に収集した。４回の週１回の用量後に、4.09（抗エンリモマブ活性）の平均
の対数力価から3.04（抗1924-11活性）までの統計学的に有意の免疫応答の低下
が存在した。その後の月１回の用量（静脈内注入による）の後、抗エンリモマブ
活性の平均の対数力価は4.77に増大し、また、ポリ（エチレン）グリコール修飾
-1924-11誘導体の平均の対数
力価は増加しなかった（3.07）(第１４表)。注目すべきは、４匹のウサギのうち
２匹がELISAにより測定可能な免疫応答を装備しなかった。データは第５図に示
される。
上に記述されたウサギ免疫原性実験は、エンリモマブのポリ（エチレン）グリ
コール修飾がマウス抗体の免疫原性を調節したことを示す。さらに、インビトロ
結合試験およびインビボの炎症実験は、エンリモマブの特異性がポリ（エチレン
）グリコール修飾後に保持されることを示す。17種のポリ（エチレン）グリコー
ル修飾エンリモマブ誘導体のわれわれの試験では、３種の誘導体が免疫原性（イ
ンビボ）を著明に低下させた機能性生成物（インビトロ）と同定された。ICAM-1
結合能力は各誘導体についてほぼ同じであった(エンリモマブのFab断片の結合に
等価)。全３種の誘導体は、腹腔内に投与された場合に免疫原性を10倍低下させ
た。異なるポリ（エチレン）グリコール修飾誘導体の間で、免疫原性を低下させ
る能力において統計学的差は存在しなかった。注目すべきは、これらの実験での
異なる動物によるエンリモマブに対する免疫応答の変動の観察結果であった。こ
の変動性は、エンリモマブを投与された他の種およびヒトで発生される応答につ
いて予測的でありうるとは言え、免疫応答はエンリモマブを投与された全てのウ
サギで発生された。
同様に、ポリ（エチレン）グリコール修飾エンリモマブを投与されているウサギ
もまた、修飾抗体に対し変動する応答を生じたが、しかしながら、若干の動物は
検出可能な免疫応答（ELISAにより測定可能な）を生じなかった一方、他者は大
きく低下された反応を有した。これらのデータは、エンリモマブ抗体のポリ（エ
チレン）グリコール修飾により、生物学的に有意のヒト抗マウス抗体（HAMA）応
答を誘導することなく、慢性の炎症性疾患に必要とされうるように、抗-ICAM-1
療法で患者を再治療しうることを指摘する。
要するに、エンリモマブは、IPもしくはIVのいずれかで1mg/kgで投与された場
合に、全てのウサギで免疫応答を生じた。３種のポリ（エチレン）グリコール修
飾誘導体（溶液相で作成さた１種、sICAM-1カラム上で作成された１種、そしてC
A3カラム上で作成された１種）は、1mg/kgIPで反復して投与された（４用量）場
合に免疫原性を10倍低下させた。さらに、誘導体1924-11がIV経路により投与さ
れた場合、４匹のウサギのうち２匹はポリ（エチレン）グリコール修飾抗体の６
用量に応答しなかった一方、残りの２匹のウサギは最小の応答を有した。
実施例12
ポリ（エチレン）グリコール修飾抗-ICAM-1抗体のFcR誘導性酸化的バースト分析
マウスモノクローナル抗体の治療的使用は、細胞表面のFcレセプター（FcR）
に結合する抗体のFc部分により誘導される炎症応答により複雑になっていた。循
環からの治療的抗体の加速された浄化に加え、いくつかの生物学的作用がFc-FcR
相互作用により引き起こされる。FcRの交差結合により開始されるこうした作用
は、食作用、スーパーオキシ
ドの発生、メディエータの放出(IL1、IL6、TNF-α、など)、Ig産生の調節および
高められた抗原提示（van de Winkel，Jan G.J.ら、Immunology Today,14:215.2
21(1993)）を包含する。FcγRI（CD64）はモノマーのIgGに結合し、そして、構
成的に単球で発現され、また好中球上に誘導されうる。FcγRII（CD32）は、そ
の多重結合の形態（免疫複合体でみられるような）で構成的に単球、顆粒球およ
びヒト抗体に結合するＢ細胞に発現され、かつまた多重結合のマウスIgG2a抗体
にも結合する。
エンリモマブすなわちマウスIgG2aは、PBMCのFcγRIおよび好中球のFcγRIIを
介してヒト白血球に結合するであろう。エンリモマブ分子のFc部分に対する様々
なポリ（エチレン）グリコール修飾過程の影響を試験するため、酸化的バースト
試験を行った。この試験はFc-FcR相互作用による細胞性活性化を検出するようデ
ザインした。ポリ（エチレン）グリコール修飾によるFcR結合能力の排除（減衰
された酸化的バーストにより立証されるような）は、循環から迅速なように浄化
されないであろう抗-ICAM-1 mAbで有益であろうし、かつ、所望されない生物学
的効果が緩和されるであろう。
ポリスチレン製チューブ（Exoxemis、テキサス州サンアントニオ）を、ダルベ
ッコのPBS（"Dpbs"、Gibco、ニューヨーク州グランドアイランド）で10μg/mlの
濃度に希釈した、精製された可溶性ICAM-1の100μlで、室温で４時間被覆した。
このチューブをDpbsで２度洗浄した。チューブを250μlの2％ウシ血清アルブミ
ン-Dpbsで4℃で一夜ブロックした。チューブを空にし、そして100μlの適切な抗
体を、1％bsa-Dpbsで希釈された50μg/mlの濃度で37℃で１時間添加した。
チューブを使用直前にDpbsで２度洗浄した。この手順を使用して、mAbが、抗体
のFc部分が白血球のFcRレセプターで束縛されるのに利用できるようにする一方
で抗体結合部位が固体の基質に付属されたリガンドにより不活性化されるように
志向した。ヒト末梢血はヘパリン中に収集した。好中球およびPBMCは、デキスト
ラン沈降、その後フィコールパック（Pharmacia、スウェーデン・ウプサラ）勾
配分離を使用して製造元の使用説明書に従い単離した。
酸化的バースト実験には、細胞を３度洗浄しそしてダルベッコのPBS（Gibco、
ニューヨーク州グランドアイランド）中に３×106細胞/mlで再懸濁した。ルミノ
ール平衡塩溶液（Exoxemis、テキサス州サンアントニオ）600μlを、その後100
μlのFMLPを各チューブに添加した。最終体積は800μlでありFMLPの最終濃度は
１×10-7Mであった。精製された細胞100μlを各チューブ（３検体ずつ）に、酸
化的バーストの測定直前に３×106細胞/mlの濃度で添加した。10-7MのFMLP濃度
は、それが単独ではPBMCからの酸化的バーストを刺激しなかったが、しかしPBMC
の準備をしそれによってレセプター束縛により発生した酸化的バーストを高めた
ため、選択した。コントロールのサンプルで省かれたいかなる成分もそれぞれの
緩衝液の等価の体積で置換した。サンプルを、Berthold Autolumat LB953蛍光
計（Wildbad、ドイツ）中で37℃で90分間測定した。時間経過曲線を創出しそし
て曲線下の積分面積をBertholdからのソフトウェアで算出した。
この実験の結果は、エンリモマブが、単独で酸化的バーストを誘発した（3.7
×107化学蛍光積分）かもしくは細菌のペプチドFMLPの至適下の準備する刺激と
ともにパーストを高めた（4.7×107化学蛍光積分）
ことを立証した。
エンリモマブ抗体のポリ（エチレン）グリコール修飾は、好中球およびPBMC双
方のFc-FcR結合の相互作用により引き起こされた酸化的バーストを調節した(第1
5表)。ポリ（エチレン）グリコール修飾は、単球のFcγRIによる引き起こすこと
の阻害を反映する、未刺激のPBMCの酸化的バーストをほぼ基礎の値まで低下させ
た(3.0×107化学蛍光積分)。さらに、エンリモマブのポリ（エチレン）グリコー
ル修飾はまた、好中球のFcγRIIによる引き起こすことの阻害を反映する、未刺
激の好中球上の酸化的バーストも完全に阻害した(1.8×107化学蛍光積分)。エン
リモマブのポリ（エチレン）グリコール修飾はまた、FMLPに刺激されたPBMCおよ
び好中球の増加された酸化的バーストも基礎のレベルまで低下させた(それぞれ4
.1×107および6.9×107化学蛍光積分)。
上に記述された酸化的バースト実験は、エンリモマブのポリ（エチレン）グリ
コール修飾がFc構造の細胞性活性化の成分を調節したことを
立証した。本来のマウス抗-ICAM-1抗体エンリモマブは、細胞表面のFcγRIおよ
びFcγRIIでの相互作用を通してヒトPBMCおよび好中球の双方での酸化的バース
トを誘発することが示されている。エンリモマブ抗体のポリ（エチレン）グリコ
ール修飾は、効果的に抗体の能力を低下させてこのFc-FcR誘発性の酸化的応答を
誘発した。２種のポリ（エチレン）グリコール修飾エンリモマブ誘導体（インビ
トロで機能性生成物として同定され、また、ウサギで低下された免疫原性を示し
た）は、ヒト白血球で著明に低下されたFc-FcR誘発性酸化的バーストを表した。
これらの誘導体は、ヒトPBMCのFcγRIならびにヒト好中球のFcγRIIで誘導され
た酸化的バーストを基礎の値まで低下させた。さらに、FMLPで準備されそしてそ
の後ポリ（エチレン）グリコール修飾エンリモマブに曝されたPBMCおよび好中球
の双方は、本来のエンリモマブにより誘発された増大された酸化的バーストに比
較されるような酸化的バーストを生じなかった。これらのデータは、エンリモマ
ブ抗体のポリ（エチレン）グリコール修飾により、Fc-FcR相互作用が排除され、
そして従ってポリ（エチレン）グリコール修飾抗ICAMもそうであったことを指摘
した。Fc-FcR相互作用の阻害は、マウス抗体の望まれない効果および免疫原性を
低下させることにおける大きな前進である。ポリ（エチレン）グリコール修飾は
インビボでのエンリモマブの半減期を延長し、それにより抗-ICAM-1療法の初期
治療をより効果的にしうる。加えて、ポリ（エチレン）グリコール修飾は免疫原
性を低下させ、そして慢性炎症性疾患の臨床応用におけるポリ（エチレン）グリ
コール修飾エンリモマブの投与を可能にする。
要するに、溶液中で実行されたポリ（エチレン）グリコール修飾過程
ならびに可溶性ICAM-1の固形支持体上で実行されたものは、酸化的バーストを排
除し、これは、エンリモマブのFc部分の能力が白血球のFcRともはや相互作用し
得ないように修飾され、そして従って望まれない生物学的効果が緩和されたこと
を指摘した。
実施例13
サル炎症実験
BIRR10を、リスザル（Saimiri Sciureus）での局所炎症を阻害するその能力に
ついて、エンリモマブ（"エンリモマブ"）と比較した。動物の背中の多数の部位
での炎症メディエータの皮内（ID）注入は、同じ動物のコントロール部位との比
較を可能にした。放射活性タンパク質の注入後の皮膚部位での放射活性測定は、
注入部位での血管透過性の定量を提供した。
この試験では、10μgの細菌多糖（S.typhosa、LPS）もしくは生理的食塩液のI
D注入を与えた。24時間後に、動物を、静脈内（IV）注入によりBIRR10もしくは
エンリモマブのいずれかで処理した。別個の群の動物は未処理のコントロールで
あった。抗体投与後、生理的食塩液もしくは100μgのザイモザンの第二の皮内注
入を、生理的食塩液／生理的食塩液、生理的食塩液／ザイモザン、LPS／生理的
食塩液およびLPS／ザイモザンの注入での部位が存在するように与えた。30分後
に各動物に20μCiの125I-標識ウシ血清アルブミン（BSA）をIV注入により与えた
。５時間後、血液サンプルを採取し、動物を殺し、そして背中の皮膚を除去した
。注入部位を直径8mmの生検パンチにより切り取り、そしてそれらの放射活性を
測定した。血漿のアリコートを作成し、そして、125Iの活性を、皮膚の放射活性
が血漿同等物のμlに変換され
るように測定した。皮膚の厚さでの動物の変動およびBSAのバッチ間の変動を正
規化するため、透過性を、生理的食塩液が注入された部位からの増加の倍数で表
す。結果を第16表に示す。"n"は実験の数を示す。用量はmg/kgである。30もしく
は100μgでザイモザンを伴うBIRR10についての、および100μgでザイモザンを伴
うエンリモマブについてのデータは、コントロール（マウスIgG2a）群に比較し
てP＜0.01を有する。LPSおよびザイモザンを伴うエンリモマブについてのデータ
はコントロール群に関してP＜0.05を有する。
第16表に指摘されるように、試験された用量での抗体のいずれによっても、血
管透過性でのLPS誘発性のわずかな増大の阻害は存在しなかった。試験の日に30
およぴ100μgのザイモザンを注入された部位は、コントロール部位に比較してそ
れぞれ２および3.7倍多い血漿を有した。エンリモマブおよぴBIRR10は、100μg
のザイモザンにより誘発された血管透過性の増大を、それぞれ、57±3％およぴ5
9±5％阻害した。BIRR10は、30μgのザイモザンにより誘発された透過性の増大
を39±3％阻害した。エンリモマブもまたこの効果を阻害するようであったが、
しかしながら、エンリモマブで処理された２匹の動物のみが30μgの用量のザイ
モザンで試験されたため、これは統計学的に有意ではなかった。エンリモマブお
よびBIRR10はまた、LPSで前処理されその後ザイモザンで刺激された部位の透過
性の増加を、それぞれ43±7％
および47±7％阻害した。
未処理の動物からの組織の組織学的検査は、LPSおよびザイモザンで処理され
た領域での顆粒球の存在を示したが、しかし、生理的食塩液／生理的食塩液のコ
ントロール部位では示さなかった。LPSは、霊長類の皮膚に対し、インビトロで
白血球を増すICAM-1のアップレギュレーションを引き起こし、また、リスザルの
皮膚血管でのICAM-1発現を増加させる(エンリモマブの免疫組織化学により測定
されるように)。ザイモザンは、C5aを包含する補体を活性化することが知られて
いる酵母（Saccharomyces cerevisiae）からの細胞壁抽出物である。C5aは化学
走性の作用物質であり、かつ、顆粒球を活性化する。コントロール動物でのザイ
モザンで処理された部位での白血球の存在、エンリモマブ処理された動物でのザ
イモザンで処理された部位での白血球の低下、およびザイモザン誘発性の血管透
過性の阻害は、この現象がICAM-1に依存する、顆粒球に媒介される炎症であるこ
とを示唆する。上に記述された分析からのデータは、BIRR10は顆粒球が媒介する
この損傷を阻害することにおいてエンリモマブと同じくらい効果的であったこと
を指摘する。
本発明はその特定の態様とともに記述されたが、それはさらなる修飾が可能で
あり、ならびに、この出願は、全般的に本発明の原則に従い、かつ、本発明が関
する技術分野内の既知のもしくは通例の実務内に入るような、および、上に述べ
られた本質的な特徴および付録として付けられた請求の範囲での以下のように出
願されうるような、本開示からの離脱を包含する、本発明のいかなる変動、使用
もしくは翻案を取り扱うことが意図されることが理解されるであろう。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ｃ０７Ｋ 16/20 Ｃ０７Ｋ 16/20
16/28 16/28
Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ
Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ
，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ
，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ
Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ
，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，
ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ
Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ
，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ
(72)発明者 シヤーリー，ブレツト・エイ
アメリカ合衆国コネチカツト州06776ニユ
ーミルフオード・エレナコート24
(72)発明者 シヤー，デイビツド・エス
アメリカ合衆国コネチカツト州06810ダン
バリー・トライアングルストリートナンバ
ー１ 120