TW438809B - Modified anti-ICAM-1 antibodies and their use in the treatment of inflammation - Google Patents

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TW438809B
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Paul Edward Mcgoff
Bret Allen Shirley
David Stuart Scher
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Description

經濟部中央橾準局員工消费合作社印製 »543 88 0 9 a7 ___B7 五、發明説明（l ) 發明領域 本發明是有關經修飾的抗體，其可特異地結合至細胞 間粘著分子一 1 ( 、ICAM—1，），及此分子在治療 發炎上之用法。更特別地，本發明是有關經修飾的非一人 類抗一 I CAM— 1抗體，因爲此種修飾之結果可呈現改 善的治療特性。 發明背景： 1 ·細胞粘著分子 白血球爲了可反應感染及組織損傷，因此其必須可以 自循環系統移動至將發炎的位置。此移動可由粘著現象來 完成，其中白血球可粘著至內皮細胞上。此細胞粘著也要 對白血球與抗原一呈現細胞之附著負責，其在正常的特異 治療系統反應過程中發生•細胞粘著也可令白血球附著至 適合的標的細胞，如此可發生病毒感染的或腫瘤細胞之溶 解。 頃發現細胞粘著作用可由整合素（integrin)族之內 皮細胞表面受體與免疫球蛋白超族之白血球結合配體之結 合交互作用所調介（3?1'丨11^11，1<.人.，^1：1^6348:425-434(1990); Smith, C.W., Canad. J. Physiol. Pharmac ol.7 1:76-87 ( 1 9 93 ) ) * A .整合素族之細胞粘著分子 涉及於細胞粘著的整合素族受體分子已被稱之爲 本紙乐尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐} I---,------Λ------、1Τ----------^ (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) -4 - 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 1 3 B 8 ^ ^ A7 _B7_ 五、發明説明（2 ) CD 1 l/CD 1 8受體分子族^ 。這些分子最初以融合 瘤技術鑑定（〇371811011，0.6七31.，？1：0<：.^1；1.*03(1· Sci. USA 78:4535-4539 (1981); Springer, T. et al. Eur. J. Immunol. 9:301-306 (1979); Springer, T. e-t al., Fed. Proc· 44:2660-2663 (1985)) * CD 1 1/CD 1 8族之受體分子爲含有α亞單位（ CD1 1)及彡亞單位（CD18)之雜二體（Sanchez-ΐί a d r i d, F. e t a 1 _ ， J · E x p e r · M e d. 1 5 8 : 1 7 8 5 -1 8 0 3 ( 1983); Keizer, G.D. et al., Eur. J. Immunol. 15： 1 1 42- 1 1 47 ( 1 9 85 ))。三分子之彡鏈是相同的。雖然雜二 體之α鏈是不同的，由精確的分析顯示在其間有實質的相 似性。LFA - 1相關糖蛋白α亞單位間相似性之總費由 S a n c h e z - M a d r i d，F. e t a 1 提供（J. Ε X p e r M e d. 1 5 8 : 586-602 (1983); J· Exper. Med. 158:1785-1803 (1983 )° 三個不同的α亞單位稱爲：CD1 1 a (同樣可稱爲 LFA— 1 α亞單位），CDllb (同樣可稱爲 Mac — 1 α亞單位）及CDllc (同樣可稱爲 p 1 5 0，9 5 α 亞單位）（Ruoslahti, E et al., Science 238:491 (1987); Anderson, D.C. et al., Ann Rev· Med. 38:175 (1987)) * 頃發現C D 1 8分子具有9 5 k d之分子量，而£1鏈 分子量爲由1 5 0 k d變化至1 8 0 k d (Springer, T. ,Fed. Proc. 44:2660-2663 (1985))。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（2[OX 297公釐） ' 一 5 - {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 螋 經濟部卞央揉準局貝工消費合作杜印装 ;Ή C Α7 _Β7_ 五、發明説明（3 ) CD 1 1 a/CD 1 8雜二體見於大部份的淋巴細胞 (Springer, T.A., et al. Immunol. Rev. 68:111-135( 1982); Ruoslahti, E. et al·, Science 238:491 (1987 );Anderson, D.C. et al., Ann. Rev. Med. 38:175 ( 1987)) eCDllb/CD18 及 CDllc/ C D 1 8雜二體見於巨噬細胞，粒性細胞及大的顆粒性淋 巴細胞（Ruoslahti, E· et al.，Science 238:49 1 ( 1987); Anderson, D.C. et a 1., Ann. Rev. Med. 38: 175(1987))。這三種分子在細胞粘著上扮演其角色（Κε-ί z e r , G ‘ e 1; a 1. ， E u r J. I m m u η o 1. 1 5 : 114 2 -11 4 7 ( 1985))。 CD 1 1 a/CD 1 8複合物之重要性及其在宿主防 禦之細胞配體可由常染色體逆行特徵來鑑定（命名爲^ LAD"，白血球粘著缺失症候群之症狀）可由一再發生 的，嚴重細菌感染鑑知，其中受影響之個體無法合成正常 的 C D 1 8 分子（Ruoslahti, E. et al.，Science 238: 491 ( 1 9 8 7 ); Anderson, D.C. et a 1., Ann. Rev. Med. 38:175 (1987); Anderson, D.C., et al., Fed. Proc. 44:2671-2677 (1985); Anderson, D.C., et al., J. I-nfect. Dis. 1 5 2:668-689 ( 1 985 )) * LAD 病人之白血 球試管內呈現之缺陷，和其L FA- 1分子族已被抗體拮 抗者之正常對應部份相似*再者這些個體由於其細胞無法 粘著至細胞受質，故無法啓動正常的免疫反應（Anderson ,D. C. , et al. , Fed. Proc. 44:267 1 -2677 ( 1 985 ); A- 本紙張尺度遄用中國國家橾準（CNS > A4規格（2【OX297公釐) (請先閲讀背面之注f項再填寫本頁) -V-? -6 - 經濟部中央標準局月工消費合作杜印製 A7 88 〇9__ 五、發明説明（4 ) nderson, D.C., et al., J. Infect. Dis. 152:668-689 ( 1 985 )) 的特色說明缺乏功能性LFA-1粘著 分子，會造成LAD白血球實質上不會以正常方式牯著至 內皮細胞•來自L AD個體的白血球無法反應到這些刺激 ，其係可誘導白血球以粘著且穿越血管內皮細胞而移動（ Smith, C.W. et al.t J. Clin. Invest. 82:1746 (1988 ))- CD 1 1/CD 1 8複合物也涉及於宿主防禦力以拮 抗感染之細胞-細胞交互作用’包括i C 3 b _調理的粒 子之結合及吞噬作用，CD 1 1 b/CD 1 8在顆粒細胞 及類單核細胞上的特性，標的細胞爲T細胞及NK細胞之 Mg2+ -依賴性粘著及殺拭，CD 1 1 a/CD 1 8異形 雙螺旋鏈之特性（Ruoslahti，E et al., Science 238 : 491 (1987); Anderson, D.C. et al., Ann· Rex. Med. 38:175(1987))。 B.免疫球蛋白超族之粘著分子 CD 1 1/CD 1 8受體分子之天然結合配體是細胞 間粘著分子—1 ( 、ICAM-1，或〇〇54)(1?〇1:- h 1 e ί n R. e t a 1. , J · I m in u η 〇 i, 1 3 7 : 1 2 7 0 ( 1 9 8 6 ) ) * 歐 洲專利案 No . 2 8 9，9 4 9，Simmons，D. et al.， Nature 331:624-627 (1988); Staunton, D.E. et al., Cell 52:925-933 (1988);此參考也列入本案參考中》 I CAM— 1是免疫球蛋白超族分子中之一成員*此 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨OX297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 崦 -7 - 經濟部中央棣準局員工消費合作社印製 έα3Β8 09 Α7 Β7五'發明説明（5 ) 超族成員的特色是有一個以上I g同質區域之存在，其各 自含有雙硫橋接之環，其係在二片中排列有許多反-平行 召-摺叠股》已定出三種同質區型式，各自有一個典型長 度且在雙硫鍵的半胱胺酸間有一致的胺基酸殘基序列。（ Williams, A.F, et a 1. , Ann. Rev. Immunol. 6:381-405(1988); Hunkapillar, T, et al., Adv. Immunol. 44:1 - 63 ( 1 989 ))。 I CAM— 1爲9 7 — 1 1 4k d之細胞表面糖蛋白 =I CAM - 1有5個類I g區域。其結構和天然細胞粘 著分子（NCAM)及骨髓磷脂一相關的糖蛋白（MAG )極有關（S i mmons，D. et a 1 ·，Nature 33 1 : 6 24-627 ( 1988); Staunton, D.E. etal., Cell 52:925-933 ( 1988); Staunton, D.E. et al., Cell 61243-254 (1990 )，在此列爲參考）。 I CAM - 1可於試管內爲發炎介體於織維母細胞及 內皮細胞上誘生，如IL — 1，r干擾素及腫瘤壤死因子 ，其時間架構符合活體內淋巴細胞浸潤至發炎傷處（Dus-tin, M. L. , et. al., J. Immunol 1 37:245-254, ( 1 986 ) ;Pober, J.S., et al., J. Immunol 137:1893-1896,( 1986)) β I C AM - 1可在非造血細胞上表現，如血管 內皮細胞，胸腺上皮細胞，其他上皮細胞，及纖維母細胞 ，及在造血細胞上，如組織巨噬細胞，有絲分裂原一刺激 之T淋巴細胞胚，及在扁桃腺中之生長中心B -細胞及樹 突狀細胞，淋巴細胞結及派亞氏腺（Dustin, M.L., et. (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央橾牟局男工消f合作社印製 (:- A7 B7五、發明説明（6 ) al_， J . Immunol 137:245-254， （1986)) β I CAM— 1可在良性發炎傷處中於角質細胞上表現，如過敏性濕疹 ，扁平苔癖，疹，奪麻疹及水疱疾病。 因此，I CAM- 1可在發炎位置上差別地表現，且 通常並不爲靜止細胞所表現。其功能是充作淋巴細胞可粘 附之細胞受質，如此淋巴細胞可移動至感染或發炎位置。 可於循環中測及1〇八厘一1之'^可能性〃（即、未 固定的 # )片段（Rothlein，R·，J· Immunol. 1 47:3788 -3793 (1991))。由此片段反應發炎之程度可推測，此程 度可能是發炎有用的診斷標準（Gearing, A.J.H. etal. ,Immunol. Today 14:506-512 (1993); Rothlein, R., J. Immunol. 147:3788-3793 (1991); Blann, A.D. et al., Thromb Haemost. 72:151-154 (1994); Cush, J.J. e t a 1 _，A r t h r i t i s . R h e u m 3 6 : 1 0 9 8 - 1 1 0 2 ( 1 9 9 3 ))。 除了其在細胞粘著上之角色外，頃發現I CAM— 1 是人類鼻病毒結合之細胞受體，以啓動鼻病毒之感染。（ Greve, J.M. et al., Cell 56:839-847 (1989); Staunton, D.E. et al., Cell 56:849-953 (1989); Ohlin, A .et al., Antiinicrob. Agents Chemother. 38:1413-1415 (1994)； Cassanovas, J.M. et al., J. Virol. 68 :5882 - 5 88 9 ( 1 994))。 I CAM— 2是第二種LFA - 1配體，與I CAM —1 區別（Rothlein, R. etal., J. Immunol· 137: 1270-1274 (1986); Makgoba, M.W. et al., Eur. J. I- (請先閎讀背*之注意事項再填窝本頁) 訂 4t 本紙張尺度逍用中國國家橾準{ CNS > A4規格（210X297公釐） i43§8〇9 " A7 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 B7五、發明説明（7 ) mmunol. 18：637-640 (1988); Dustin, M.L. et al., J. Cell. Biol. 107:321-331 (1988); Staunton, D.M. et al.，FASEBJ.3:a4 46 (1989))*ICAM-2就如同 I CAM — 1 ，爲免疫球蛋白超族中的一成員。 I CAM — 2可在內皮細胞及某些間質細胞上原構地 表現。其也存在於各樣的T -及B -淋巴母細胞株上。在 未活化的內皮上，I CAM — 2爲主要的LFA—1配體 。因此據報告在正常淋巴細胞再循環及記億細胞再捕充上 分演角色，且在抗原-呈現細胞之交互作用上也有作用（ de Fougerolles, A.R. et al., J. Exper. Med. 174: 253-267 (1991))。 近來則鑑定出第三個LFA— 1配體，即I CAM -3 C de Fougerolles, A.R. J. Exper. Med. 174:253-267 (1991); de Fougerolles, A.R. J. Exper. Med. 1 75 : 1 85 ( 1 994 ); de Fougerolles, A. R. J. Exper. Med .179:619-629 (1994)) 。 I CAM— 3爲1 24 fcD 之 大量糖基化之蛋白質*其表現於白血球上，但內皮細胞中 則無· I CAM — 3與I CAM — 1有5 3%同質性。 I CAM— 3及I CAM— 1似乎交互表現·· I CAM -3由靜止細胞所表現，且由於細胞活化可降低其程度（C-ordell, J.L. et al., J. Clin. Pathol. 47:143-147 ( 1994); EI-Gabalawy, H. et al., Arthritis Rheum. 37 :846-85 4 ( 1 9 94 ))。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 '今 丨· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -10 - 經濟部中央橾隼局員工消費合作社印製 _B7_五、發明説明（8 ) C .其他粘著分子 粘著分子之選擇素（selectin)(或LECCAM) 族爲粘著分子不同的第三類。選擇素可與碳水化合物外源 凝集素確認及結合。描述三種選擇素：L 一選擇素（也稱 之爲 LECCAM— 1 ，MEL — 14，LAM— 1 -LECAM—1或淋巴細胞導向受體）；E_選擇素（也 知爲內皮白血球粘著分子一 1 ( ，ELAM— 1")或 LECCAM - 2);及卩_選擇素（也知爲CD62 * 血小板活化依賴性顆粒外膜（PADGEM)-LECCAM — 3，或顆粒膜蛋白質一 14 0 (GMP — 14 0))- L 一選擇素爲白血球所表現，且在白血球導向*至 周邊淋巴結中有其角色（GalUtin，M.W, etal., Nature 304:30-34 (1989); Lasky， L_A. et al·， Cell 56: 1045-1055 (1989); Siegelman, Μ.H. et al., Proc. Na 11. Acad. Sc i. (U.S.A. )86:5562-5566 ( 1 989 ); Tedde- r, T. F. et a 1., J. Exper. Med. 170:1 23-133 ( 1 9 8 9 ) 。其也可在顆粒細胞上表現。 E_選擇素可反應細胞動素，如TNF — or或I L — 1泠，或細菌內毒素（LP S)之細胞刺激而在內皮細胞 上表現（36丫113。9113，说.？，6士31.,5£^611〇6 243:1 1 60-165(1989); Tedder, T.F. et al., J. Exper. Med. 170 :123-133 (1989); Bevilacqua, Μ.P. et al., Proc. Na t1. Acad. Sci. (U.S.A.) 84:9238-9242 (1987); Lusc- (請先M讀背面之注$項再填寫本頁) 本紙乐尺度適用中國囷家標準（CNS )从規格（210 X 297公釐） 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（g ) inskas, F.W. et al.t J. Immunol. 143:3318-3324 ( 1989)) ·試管內，E -選擇素可調介嗜中性球，單核球 ，嗜伊紅血球•淋巴細胞子集，及某些腫瘤細胞之粘著。 E—選擇素之結合配體是SLEX (Lo.we，J.B. et al.，Ceil 63:475-484 (1990)) » E - 選擇素可在 慢性發炎疾病 中表現，如類風濕性關節炎· P —選擇素可在血小板及內皮細胞，嗜中性球，其他 骨链細胞，及T淋巴細胞子集上表現（Siegelman，M.H., Curr. Biol, 1:1 25- 1 2 8 ( 1 99 1 ); Pober, J.S. et a 1., Lab_ Invest. 64:30 1 -305 ¢1991))。依據 P -選擇素及 E —選擇素可結合S L Ex外源凝集素之事實知，二者有 相似的細胞結合概圖。P -選擇素之表現可由活化劑所誘 導•如凝血酶，組織胺·及過氧化氫。 據報告E —選擇素及P —選擇素之表現可分別對組織 傷害反映發炎及止血反應（Geng, J.G. et al.，Nature 343:757-760 (1990); Toothill, V.J. et al., J. Imm-un〇I. 1 45:2 83-2 9 1 ( 1 9 9 0 ))。據報告L-選擇素參與細 胞至發炎部位之補充（Watson, S.R. et al., Nature 349:164-167 (1991); Lewinsohn, D.M. et al., J. Im-m u η o 1. 1 3 8 : 4 3 1 3 - 4 3 2 1 ( 1 9 8 7 ))。據報告這三種選擇素 均涉及嗜中性球及其他白血球至發炎部位之補充（Arfors ,D.E. et al., Blood 69:338-340 ( 1 987 );Smith, C.W. et al., J. Clin. Invest. 82:1746-1756 (1988); Anderson, D.C. et al., Ann. Rev. Med. 38:175-194 ( 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（21 O X 297公釐） ~ (請先閎讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -12 - A7 B7 id38B〇^ 五、發明説明（） 10 1990); Larson, R.S. et al., Immunol. Rev. 114:181-217(1990)) e 據報告選擇素經由促進嗜中性球在經活化之內皮上最 初之粘著或旋轉而作用（von Andrian, ϋ.Η. et al.，P-roc. Natl. Acad. Sci. (.S.A. ) 88：7538-7542 ( 1 991 ); Ley, K. et al., Blood 77:2553-2555 (1991); Lawrence, Μ. B. et al., Cell 65:859-873 ( 1 99 1 ); Smith, C. W. et al., J. Clin. Invest. 83:2008-2017 (1989)) 。相反的，CD 1 1/CD 1 8族分子一旦到達發炎位置 ，被視爲可調介接續的移動嗜中性球之遏止（Anderson, D. C. et al., Ann. Rev. Med. 38:1 75- 1 94 ( 1 990 ); Larson, R, S. et al·, Immunol. Rev. 114:181-217 (1990 );Smith, C. ff. et al., J. Clin. Invest. 83:2 0 08-2017 (1989); Luscinskas, F.W. et al., J. Immunol. 146:1617-1625(1989))。 VCAM— 1 (血管細胞粘著分子一 1 )爲見於血管 細胞上之細胞表面受體（Hynes, R.O. CeU 48:54 9-5 54 ( 987); Price, G.E., Science 246:1303-1306 ¢1980)) 。在正常的生理條件下，VCAM — 1並不表現或表現極 微。然而，其一旦爲TNF — α或I L 一 1石所刺激可快 速被誘導。VCAM— 1已示出可與VLA—4整合素分 子結合，後者可在白血球及其他細胞上表現（Springer, T.A., Nature 346:425-434 (1990); Hemler, Μ.E. et a 1.， I m m u η o 1. R e v. 11 4 : 4 5 - 6 5 ( 1 9 9 0 ) ) e 已示出 本紙張尺度適用中國國家標丰（CNS ) A4規格（2丨OX 297公釐） "~一 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 -13 - 經濟部中央揉準局貝工消费合作社印製 id 3 B - _B7_五、發明説明（U ) V L A - 4可調介淋巴細胞與粘膜淋巴結內皮之結合（Η-ο 11 z m a η η ， B. e t a 1. ， C e 1 1 5 6 : 3 7 - 4 6 ( 1 9 8 9 ) ; (Η ο 11 z-ntann, B. et al. EMBO J. 8:1 735-1 74 1 ¢ 1 989 ))，且可 調升胞毒性T-細胞活性（Hemler，M.E. et al., J. B-iol. Chem. 2 62 : 1 1 478- 1 1 485 ( 1 9 8 7 ); Hemler, M.E. et al., In: Leukocyte Adhesion Molecules (Springer, T .A‘ et al., eds.) pp.44-57, Springer-Verlag， NY C 1989)) eVLA- 4之表現實質上不受細胞動素所影響 〇 因此總而言之，白血球維持動物健康及有活力之能力 必須要其可粘著至其他細胞上（如內皮細胞）。此粘著作 用頃發現需要細胞-細胞之接觸，此則涉及白血球細胞表 面及內皮上之特異受體分子。這些受體使白血球可粘著至 其他白血球或內皮，.及其他非一血管性細胞。缺乏這些細 胞表面受體分子之白血球之人類會呈現慢性及復發的感染 ，以及其他臨床狀況，包括具缺陷的抗體反應》 雖然細胞粘著的過程，可保護人類及其他晡乳動物免 於因感染或組織傷害所致之死亡，此種保護作用則要犧牲 重大的組織破壞，發炎及疼痛才來。（Horgan, M.J. et al.,Amer. J. Physiol. 26 I：H1 578-H1 584 ( 1 9 9 1 ); Clark, W.M, et al., J. Neurosurg. 75:623-627 (1991)) 。利用抗體及其他現代醫學治療可提供處理感染及瘡傷的 另一途徑*因此在許多例子中，希望可介入及預防細胞粘 著之發生》 本紙_^：尺度逋用中國國家標準（〇55)八4洗格（210><297公釐） A7 ί請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} I11 -14 _ ο ο Α7 Β7 五、發明説明（12 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 二種完成此介入的途徑中涉及使用抗一 CD 1 8抗體 及抗- I CAM-1抗體。不論在動物模式及試管內試驗 之有希望結果，使用此種鼠類單株抗體受限於造成抗-鼠 類抗體產生之嚴重免疫反應性問題。 基於希望對發炎狀況可提供長期之治療，如氣喘，絕 血*移植物排斥，移植，關節炎等，均希望可發展抗-I CAM- 1抗體，其較先前使用之抗體顯著較無免疫原 性。本發明提出此改進之抗體，以及其合成•純化及使用 之方法· 附圓說明 圖1示出留在經固化S I CAM — 1管柱內之結合力 百分率，此爲聚乙二醇修飾流程次數之函數關係》 圖 2 7T?出個別兔子以 enlimomab或 P E G _ enlimomab 抗體 2 1 8 3 — 6 6 Μ，或 P E G - enlimomab抗體 B I RR 1 〇腹膜內注入後之抗一enlimomab血清效價（ 按千計）。 經濟部中央揉準局員工消費合作杜印装 圖3爲個別兔子以enlimomab或P E G — enlimomab 抗體930329/4 : 1腹膜內注射後之抗-enl iinoni-ab血清效價（按千計）。 圖4爲個別兔子以enlimomab或P E G — enlimomab 抗體1 9 24 — 1 1靜脈內注射後之抗一enl im〇mab血清 效價（按千計） 圖5爲聚乙二醇一修飾之enlimofflab及天然抗體在靜 各紙乐尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -15 - 經濟部辛央標準局貝工消费合作杜印製 E43 88 09 A7 A7 B7 五、發明説明（13 ) 脈內注射28及56天後之免疫反應性。 發明要點 本發明是有關可特異結合至細胞間粘著分子一1(i I CAM— 1* )之經修飾抗體之產製及用法，以治療發 炎•更特別地，本發明是有關經修飾之非人類抗一 I CAM - 1抗體，其因爲此修飾之故可呈現改善的治療 特性。 詳細說明，本發明提出一種經聚乙二醇修飾之抗-
I CAM— 1抗體衍生物，其中的抗體可結合至I CAM —1，及抑制ICAM—1 -調介之細胞粘著作用。 本發明特別是有關此種經聚乙二醇修飾之抗一 I CAM - 1抗體衍生物，其中的抗體是單株抗體。本發 明特別是有關此種衍生物含有平均2至15個單官能之聚 乙二醇分子之具體實例，且其中單官能的聚乙二醇爲聚乙 二醇之丙酸的N -羥基琥珀醯亞胺基活性酯，琥珀酸聚乙 二醇之N -羥基琥珀醯亞胺基活性酯，羧甲基化聚乙二醇 之N -羥基琥珀醯亞胺基活性酯，有賴胺酸之聚乙二醇- 羥基琥珀醯亞胺基活性酯二聚物，聚乙二醇丙醛，或正白 胺酸聚乙二醇之N -羥基琥珀醯亞胺基衍生物》
本發明特別是有關其中抗—I CAM— 1抗體是（A )抗體enliraomab或（B)可與I CAM-1結合之抗體 ，且其可競爭地抑制enl imomab與I C A Μ — 1之結合， 之具體實例，且特別是其中衍生物保有至少約2 0%天然 本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS > Α4規格（210X2S*7公釐） — -16 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 l··' U 'ό A7 B7 經濟部中央標準局負工消费合作杜印製 五、發明説明（14) 抗_ I CAM—1抗體與I CAM - 1結合之能力及/或 活體內之血清半衰期大於抗體之非聚乙二醇修飾型式》 B I RR1 0爲最佳的經聚乙二醇修飾之抗一I CAM~ 1抗體。 本發明也提出抗—I CAM— 1抗體之聚乙二醇修飾 之衍生物，其中衍生物由以下過程所產生： (a )在經活化之聚乙二醇分子存在下，培育抗-I CAM_ 1抗體，其所在之條件足以令抗體之聚乙二醇 一經修飾衍生物形成： (b )將所形成之衍生物接受疏水性交互作用層析， 其所在的條件令以分離聚乙二醇修飾之抗體與非聚乙二醇 修飾之抗體：及 (c )自疏水性交互作用層析中回收已形成的經聚乙 二醇修飾之抗體衍生物。 本發明進一步提出一種藥學組成物，其包括： (a )抗一 I CAM— 1抗體之經聚乙二醇修飾之衍 生物，其中抗體可結合至I CAM— 1，及抑制I CAM - 1 -調介之細胞粘著作用；及 (b )—種生理上可接受之載劑，賦形劑或穗定劑。 其特別提出此種藥學組成物，其中衍生物含有平均2 至1 5個單官能之聚乙二醇分子。 本發明也提出其中組成物含一種以上經聚乙二醇修飾 之抗體衍生物之具體實例，且其中各種類有不同的活體內 血清半衰期，以及其中組成物含有單一類聚乙二醇修飾= 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂. _ 17 - 绥濟部中央樣準局員工消費合作社印褽 A7 B7 五、發明説明（15) 抗體衍生物之具體實例》 本發明提出此種藥學組成物，其中經聚乙二醇修飾之 抗一 I CAM — 1抗髖衍生物，保有至少約2 0%天然抗 —I CAM — 1抗體與I CAM— 1結合之能力（可利用 如偵測此種經聚乙二醇修飾之衍生物及未經修飾之抗體間 與表現在J Y細胞B —淋巴母細胞上之I CAM— 1結合 之任何競爭程度之分析法爲準），及/或其中抗-I C AM — 1抗體之經聚乙二醇修飾之衍生物具有較抗體 非一聚乙二醇修飾型式還長的活體內血清半衰期。 本發明也提出治療或預防鼻病毒感染或發炎之方法（ 由特異的或非特異的防禦系統反應所引起），此方法包括 提出有效劑量的上述藥學組成物至需此治療或預防之個體 。本發明的組成物及方法可用於治療或預防與下列疾病有 關的發炎：自體免疫疾病；氣喘；成人呼吸痛苦症候群； 敗血病或創傷繽發之多重器官受損症候群；再灌注傷害； 急性血管球性腎炎；反應性關節炎：有急性發炎組份之皮 虜病；急性膿性腦膜炎：中樞神經系統發炎性失調症；熱 傷害；血液透析；白血球分離；潰瘍性結腸炎；克隆氏疾 病；壞死性小腸結腸炎；顆粒細胞輸血相關症候群；或細 胞動素_誘生之毒性。 自含有經聚乙二醇修飾之抗體及抗體未修飾者之製劑 中純化前者之方法中，係將製劑接受疏水性交互作用層析 ，所在的條件係足以自聚乙二醇修飾之種類中分離出抗體 之未修飾種類，並回收分離出之經聚乙二醇修飾之抗體。 本紙張尺度逍用中國國家標準（CNS)A4規格（210X297公釐） (請先Μ請背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -18 - 經濟部中央標準局員工消費合作杜印装 KM3 88 0 9 A7 _B7_五、發明説明（） 16 龄隹亘髏窗例之說明 1 ·抗一 ICAM— 1抗體 如上示，抗一 CD 1 8抗體及抗一 I CAM—1抗體 已用於介入細胞之粘著迥程。 利用抗一 C D 1 8抗體之活體內研究已顯示在絕血性 傷害上有所減少，且在心臟，肺*腸及全身性休克模式中 肺之浸潤有所減低（人4(^3,1[.61：31.,81〇〇(1 6 9:338-340 (1987); Hernandez, L. et al., Amer. J. Physiol .25 3: H6 9 9-H703 ( 1 987 ); Price, T. et al., J. Immunol. 139:4174-4177 (1987); Simpson, P. et al., J. Clin. Invest. 81:624-629 (1988); Vedder, N. et al. ,J. Clin, invest. 81:9393-944 (1988))· fang, J.H .et al. (FASEB J· 8:A9 8 1 ( 1 994))報告對老鼠投予抗 —CD18及抗一 I CAM— 1抗鳢具有免疫調空作用。 投予這些抗體據報告可抑制乙醇-誘生之粘膜傷害（Din-da, P. K. et al., Gastroenterol. 1 0 6.: A2 3 0 ( 1 9 9 4 )) ’ 自體免疫性糖尿病之開始（Herold, K.C. et al.，Clin· Res. 42:119A ( 1 994 )) I及延長人類胰島素小島異種移 植之存活（Z e n g，Y · e t a 1.，T r a n s p 1 a n t. P r 〇 c e e d. 2 6 :1 1 2 0 ( 1 9 9 4))。H u a n g，Y. W. e t a 1. ( H y b r i d o m a 1 2 : 661-675 (1993)討論使用抗一I CAM — 1抗體殺拭骨髓 瘤腫瘤細胞株。 抗—I CAM - 1抗體抑制或預防組織傷害之能力， 本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS) A4規格（210X297公釐) (請先《讀背面之注意事項再填寫本頁) - 訂 線 -19 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 43 88 G9_^_五、發明説明（17 ) 已於許多動物模式中研究。Horgan, M.J. et al. (Amer. J. Physiol. 261:H1 578-H1 5 84 ( 1 9 9 1 ))報告直接拮抗 ICAM—l之鼠類單株抗體（RR1/1)，可在動物 模式中預防兔子肺部嗜中性球之腐離|此動物係經驗到肺 動脈之閉塞及再灌注。由中樞神經學絕血之模式研究中（ Clark, W. M. et al. (J. Neurosurg. 75:623-627 ( 1 99 1 ))可知在中樞神經學組織中I CAM — 1之誘生可增加 傷害程度 e Archelos，J.J. et al. (Brain 1 1 6 : 1 043-1058 (1993))報告投予抗一 I CAM - 1抗體可遏止實 驗模式中之過敏性神經炎。 投予抗—I CAM - 1鼠類單株抗體據報告，可在兔 子模式中暫時減少絕血性傷害之程度（Ciark，W.M. et al., J. Neurosurg. 75:623-627 (1991)) Wegner, C.D. et al. (Lung 1 70:267-279 ( 1 992 ))證實白血球粘著及 浸潤在老鼠模式之肺氧毒性致病過程中之貢獻，且報告指 出投予大鼠抗- I CAM- 1抗體可減低氧過多性肺傷害〇 Ma, X.L. et al. (Circulat. 86:937-946 (1992)) 報告指出抗_I CAM—l抗體，RR1/1，抑制多形 核白血球粘著及絕血性心肌組織浸潤於貓科模式中之能力 。抑制作用可顯著地保護貓的心肌免於再灌注-誘生之傷 害β Gorczynsk i, R.Μ . et a 1. (J. Immunol. 1 5 2:2 0 1 1 - 2019 (1994))，使用老鼠模式來證明投予抗一 I CAM 本纸張尺度遑用中國國家棵準（CNS ) A4規格（210X297公釐了___ -20 - (請先Μ讀背面之注意事項再填窝本頁) " 經濟部令央標準局貝工消費合作杜印製 L， A7 _B7_五、發明説明（18 ) -1抗體可在抗原-特異之預移植免疫接種或輸血後延長 皮虜同種移植之存活。Williams, ff.W. et al.，（Amer. Soc. Nephrol. 5:738(1993))報告抗—I CAM - 1 抗 髖保護腎臟捨抗絕血之能力e Uchio, E. et al. (Invest .Ophthalmol· Vis. Sci- 35:262 6-263 1 ( 1 994 ))報告抗 _ I CAM - 1抗體預防實驗性葡萄膜炎之能力· Zhang, R.L· et al. (Stroke 25:266 ( 1 994))報告投予抗— I CAM-1可減低大鼠模式中之絕血性傷害。Bowes, Μ .Ρ . et al. (Exper. Neurol. 119:215-219 (1993))報 告投予抗- I CAM— 1抗體可減少兔子腦插塞中風模式 中與中風有關之神經性傷害》Pavilack, M.A. etal.( I n v e s t _ 0 p h t h a 1 ίο ο 1. V i s _ S c i.. 3 5 : 1 8 9 6 ( 1 9 9 4 ))及 Y amigami, S. (Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 35:1877 (1994))報告投予抗-I CAM - 1抗體可改善角膜移植 物之生活力。 抗_ I CAM— 1抗體的此種用途，及上述者可建議 細胞粘著可惡化發光過程中之組織損害，.且因此在模式系 統中此發炎過程可被抑制》此研究刺激臨床嚐試以決定抗 —I CAM—1抗體提供確實治療益處之能力· Haug, C. E. et al., Transplant. 55:766-773 ( 1993)報告投予鼠類抗—I CAM — 1抗體（命名爲’ e-nlimomab')至接受腎臟同種移植物之cynomolgus猴子中 ，且其有發展成延遲之移植物功能危險性*研究中發展出 投予enlimomab之臨床安全性*投予enlimomab並未見相關 本紙張尺度通用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） (请先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) 訂 -21 - 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 A7 ___B7_五、發明説明（19 ) 的顯著％第一劑量#效應，且未測及有害之全身作用* 不幸地•頃發現抗體具高度免疫原性：有幾乎9 0% 的受者動物會發展出抗一enlimomab抗體*確實*免疫反 應性之程度顯著地高於由其他鼠類抗體中所觀察到的投藥 四天後 > 抗一鼠類抗體反應會造成抗體自猴子血清中之移 除（^清除^ )。 Kavanaugh, A.F. et al. (Arthritis Rheum. 35: S 43 (1992); Arthritis Rheum. 35：S106 (1992); Clin .Res. 42：314A (1994); Immunol. 91:227 (1993); Ar-t h r i t i s R h e u m. 3 6 : S 4 0 ( 1 9 9 3 ) ) &Schultze-Koops，H. et al. (FASEB J. 8:A745 ( 1 994))報告指出對受類風濕 性關節炎之個體投予抗一I CAM抗體enl imomab，可造 成臨床上快速的改善。在大多數病人可見到各樣嚴重度之 副作用β此研究證實Haug, C.E. et al的發現，即enli-moraab受者經驗到臨床上顯著的舒緩，但其發動實質上抗 一 e η I i m 〇 m a b 反應。由 N 〇 r r i s，S. fl · e t a 1 · ( P h a r m a c e- ut. Res. 10:S334 (1993))報告鼠類抗一 I CAM — 1 抗糖enlimomab之藥物動力學* Omura, T. et al. (Immunobio 1. 1 86241 -245 ( 1 992 ))揭示經鼠抗一大鼠I CAM - 1單株抗體灌注之經同 種移植之大鼠肝會快速的排斥，且建議在某些例子中會發 生抗體循環的惡化。 綜合而言，由實驗證明抗一 I CAM — 1抗體在預防 或減緩發炎過程之試管內效力。當治療性投予時，抗體可 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注^*項再填寫本頁) 訂 -22 - E43 88 0 9 經濟部中央樣準局貝工消費合作社印装 A7 B7五、發明説明（20 ) 示出到逢其標的細胞•造成最少副作用，及調介顯著的治 療益處上之能力。然而，抗—I CAM - 1鼠類抗體投予 之治療益處和實質上抗一鼠類免疫反應有關。此反應限制 抗一 I CAM — 1單株抗體在治療慢性發炎，及治療接下 來的急性發炎失調症上之應用。 II .本發明經修飾的抗體 本發明部份衍生自以下確認，即經修飾的抗-人類 I CAM— 1抗體可呈現改善的（即降低的）治療反應性 ，而仍保有抑制內皮細胞-白血球粘著之能力》因此抗體 衍生物可用於治療或預防慢性發炎，或接下來急性發炎失 調症之介入β如此中所用的 ' 免疫反應性〃意以包括抗原 誘使抗體形成之能力（即免疫原性）以及抗原可爲抗體確 認且將與之結合之能力。 如此中所用的，抗-I CAM- 1抗體製劑可用於， 預防'或 ' 治療^目的。當預防性提出，治療抑制性化合 物可在任何發炎反應或症狀之前提供（如器官或組織移植 時之前，之時或之後立即*但在任何器官排斥症狀之前） 。化合物之預防性投藥可用以預防或減緩任何接下來的發 炎反應（如所移植器官或組織等之排斥）。當治療性提出 ，免疫抑制性化合物可在確實發炎症狀發生時（或之後立 即）提出（如器官或組織之排斥等）。化合物之治療性投 薬可用以治療目前發炎反應之.確實症狀（如氣喘|關節炎 ，或所移植器官或組織之排斥）。 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS) A4規格（210X297公釐) — (請先W讀背面之注$項再填寫本頁) -23 - 143 bb 〇 ^ A7 B7 經濟部令夬棒单局貝工消費合作杜印製 五、發明説明（21 ) 依據本發明方法修飾的抗一 I CAM- 1抗體可以是 多株單株，重組體的讀嵌合型的*此種抗體可以是完整的 疫球蛋白，或可含有如完整抗體之片段（如F a b ’ F(ab)2 ，等）或段落β 鼠類單株抗體特別理想。適合的單株抗體實例包括 RR1/1 (Rothlein, R. etal., J. Immunol, 137-1 2 7 0- 1 2 74 ( 1 986 )) ' R 6 . 5 (Springer, T. A. et al .，美國專利案系列 No.07/250,446; Rothlein, R·，et al .,J. Immunol. 141:1665-1669 (1988)’ 一者均列爲參 考），L B — 2 (Clark, E.A. et al.， In:Leukocyte Typing 1 (A. Bernard, et a 1., Eds. ), Spr i nger-Ver-1 a g p p 3 3 9 - 3 4 6 ( 1 9 8 4 ))，或 C L 2 0 3 ( S t a u η 1: ο n， D.E. et al_，Cell 56:849-853 ( 1 989 )) e 抗體 R 6 . 5，目前命名爲’ enl imomat/是用於本發明方法 的最佳抗體。 若欲求時，利用BA L B/c老鼠或相當的品系也可 得到額外的抗—I CAM-1抗體》動物較好以約25微 克的人類I CAM — 1 (或其片段）免疫接種，其先以適 合的佐劑（如Freund’s佐劑* TiterMax佐劑（Vaxcel，N-orcross, GA)等）乳化。可在二個肌肉內部位完成免疫接 種，一個在腹膜內部位，另一在尾基部之皮下部位。可在 三週後給予在正常生理食鹽水內之額外的靜脈內（IV)注 射，約25微克的I CAM— 1。第二次注射約1 1天後 ，可對老鼠抽血，並對抗一 I CAM — 1抗體之存在與否 本紙浪尺度適用中國國家標準（CNS ) Μ規格（210X297公釐) " -24 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂
IIM 柩43 88 ◦9 A7 B7 五、發明説明（ 22 經濟部中央揉準局負工消费合作社印製 進行筛選。較好針對此目的應用EL I SA。適合的分析 法由 Norris, S_H. et a 1.·描述（J· Pharm. Bi.omed. Anal. 9:211-218 (1991)， 在此已列入參考 ） 。 分析的原則 涉及偵測新穎的抗體及經生物素化之enlimomab與 I CAM - 1間之結合有與任何競爭性，其係表現在j γ B -淋巴母細胞上，並見於微滴定盤中》 較好，有最高抗體效價的老鼠可給予約2 5微克 I C AM - 1之第三劑IV注射》於3天後可回收此勖物脾 中之白血球，再利用聚乙二醇（最好選擇）與適合的骨髓 瘤細胞株（如P3x63Ag8 · 653骨髓瘤細胞株） 融合。在AHAT"1 (次黃嘌呤一胺基喋呤-胸腺嘧啶） 篩選下選出融合瘤細胞，約歷1週。生成之純系可針對其 產生ICAM — 1單株抗鱧（)之能力，以 E L I S A篩選出來。 於獲得單株抗體的一個較佳步驟中，可移出上述經免 疫接種之老鼠脾臟1瓦解之再於fi coll梯度上分離出免疫 脾細胞•分離的脾細胞，利用聚乙二醇與由BA L B/c 衍生之缺乏HGPRT (次黃嘌呤鳥嘌呤核苷酸轉移酶） 之P3x6 3xAg 8 . 653漿細胞腫瘤細胞融合。所 融合的細胞塗佈在9 6孔洞之微滴定盤中，並由其在添加 有次黃嘌呤，胺基喋呤及胸腺嘧啶之培養基中生長之能力 篩選出融合瘤融合細胞，歷約2 - 3週》平均在每1 〇β 個接受融合之脾細胞中可得到一個存活的融合瘤。典型的 脾臟有5_l〇xl 07脾細胞。 <請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -、1Τ ά 本紙張尺度適用中國®家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） -25 - ^43 88 Q 3 A7 B7 五、發明説明（23 ) 由此培育中生成之融合瘤細胞，較好針對其產生可與 I CAM — 1結合之疫球蛋白之能力而篩選。針對此目的 可用問接的E L I SA。簡言之，將融合瘤的上清液培育 在含有經固化之I CAM- 1之微滴定孔洞中。經洗滌後 ，經結合之免疫球蛋白效價利用山羊抗-老鼠抗體共軛至 辣根過氧化酶來決定。經額外洗滌後|所固化之酵素之置 再決定（如可使用色原之受質）。此篩選在融合瘤鑑定後 儘可能快速地進行，以確保欲求之純系並不致爲非分泌性 鄰居所過度生長。欲求地，可對融合盤進行數次篩選，因 爲融合瘤之生長速率多變》 如所示，抗體enlimomab爲本發明最佳的抗— I C A Μ — 1抗體。EiUimomab爲鼠類I g G 2 a單株抗 體（mAb)。一旦投予至兔子，抗饅有24 — 29小時 之血清清除半袞期（Norris, S. H. et ai.，J. Pharm. B i o m e d · A n a 1 · 9 : 2 1 1 - 2 1 8 (1 9 9 1))。涉及 e η 1 i m o m a b 累計I投予至腎或肺移植個體之I期人類臨床嚐試顯示· 在人體中enlimomab具有5 . 8及3 9 ..1小時間之血清 清除半衰期（1'1〇]：1：13,3.11,6士31.，？113『111&06111；.1?63· 10:S334 ( 1 9 93 ))。 本發明的一方面是有關以下決定，即經由修飾此種抗 —I CAM — 1 ，將可能實質地減少抗體之免疫反應性* 因此增加其血清清除半衰期而同時保有抗體之活體內治療 效力。較佳的修飾包括變化抗體以含有聚乙二醇（' PEG# )加合物。PEG是具有極髙水溶性之中度疏水 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） {請先聞讀背面之注$項再填寫本頁) *ΤΓ 魄 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 -26 - A7 B7 經濟部中央樣準局員工消費合作杜印裝 五、發明説明（24 ) 性物質》 本發明近一步方面是有關純化及獏得具有明確且聚乙 二醇一修飾作用均匀程度之均質的聚乙二醇-修飾之抗體 之能力。 最好，聚乙二醇一修飾作用反應利用活化的^ PEG衍生物來進行。如此中所用的，^活化的PEG衍 生物^爲播有親電子基之P E G衍生物，其可反應性對著 胺類（如賴胺酸）及其他親核試劑，稱之爲^活化的 P E G s # 。 這些P E G s已充份地用於P E G與蛋白質及於脂質 體調和物中之粘著作用（Davis，F.F. et al.,美國專利 案？}〇.4，1 79,337;1?1^6,¥.6七31.，美國專利案 5,304,595; Delgado, C. et. al.，美國專利案 5,349,052; Garman，. A.J.，美國專利案54，935,465;6]：-&窪士2,了.儿.6七81.,美國專利案5,091，176;113]：1'13,·!. 11.61：31.，美國專利案5,252,714;11〇〇(116，11.(^.6131. ，美國專利案5,356,633;1<11(：(^,11.1^..6七31.,人(^.0-rug Del. Rev.6:133 (1991); Ajisaka, K. et al., Bi-ochem. Biophys. Res. Commun. 97:1076 (1980); Boccu ，E. et al. Phar macol. Res. Commum. 14:113 (1982) ；Beauchamp. C.0. et al., Anal. Biochem. 131:25 ( 1983); Rajagopalan, S. et al., J. Clin. Invest.75： 413 (1985); Knauf, M . J. e t a 1., J. Biol. Chem.2 63 :1 5 0 6 4 ( 1 988 ); Abuchowski, A. et a 1. , J. Biol. Ch- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度通用中國國家標隼（CNS ) A4洗格（210X297公釐） 經濟部中央橾準局負工消费合作社印装 A7 _B7_ 五、發明説明（25 ) em . 252::3578 (1977); Davis, S. et al., Lancet 2： 281(1981); Kamisaki, Y . et al., J. Pharmacol. Ex-per. Ther. 216:410 (1981); Fuertges, F. et al., J. Contr. Rel. 11:139 (1990); Ho, D.H. et al., Drug Metab. Dispos. 14：349 (1986); Ho, D.H. et al., Drug Metab. Dispos. 16:27 (1988); Park, Y.K. et al., Anticanc. Res. 1:373 (1981); Abuchowski, A. et al. ,Cane. Treat. Rep. 63:1127 (1979); Abuchowski, A. et al., Cane. Treat. Rep. 65:1077 (1981); Bendich, A. et al., Clin. Exper. I mmuno1.48：2 73 ( 1 9 82 ); Davis, S. et al., Clin. Exper. Immunol. 46:649 ¢1981 ))，脂質體（大11611，1'.}(.6131.，81〇卩111^.81〇£：11-em. Acta 1061:56 (1991); Allen, T.M. et al., Biop-hys. Biochem. Acta 1066:29(1991); Blume， T.M. et al., Biophys. Biochem. Acta 1061:56 (1991); Kliba-nov, A.L. et al., Biophys. Biochem. Acta 1062142 ( 1992); Senior, J. et al., Biophys. Biochem. Acta 106277 U991))，可溶性及不溶性聚合物*及各樣具生 物關聯性之聚乙二醇修飾之分子（通常稱之爲^聚乙二醇 修飾之分子^> 特別重要的，於上述的應用中，在一端爲甲基醚基（ mPEG)加蓋之單官能的聚合物。活化的P EG s反應 並無交聯，且可造成聚合物之多重股粘著至標的分子。針 對特異應用所選用適合的衍生物，可考慮各種特性而做最 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS >A4規格（210X297公釐) (請先閲讀背面之注$項再填寫本頁) -28 ~ A7 B7 經濟部t央橾準局貝工消费合作社印製 五、發明説明（26 ) 佳選擇，如：欲求之粘著點（賴胺酸對半胱胺酸）：衍生 物之水解穗定性及反應活性；鏈結之稞定性，毒性及抗原 性及用於分析之通用性* 在許多實驗室中，P E G粘著至蛋白質或肽類方面， PEG琥珀酸酯（SS—PEG)之N-羥基琥珀醯亞胺 基（或NH S )活性酯爲首選的試劑。這些衍生物可與蛋 白質上之胺基反應，係在緩和條件及短時間內（約3 0分 鐘，4°C，pH8.5)，且生成充份修飾的，然而是活 化的共軛物。琥珀酸琥珀醯亞胺基酯在其骨架中具有酯鏈 結，且因此具有活體內進行相當快速水解之特性·利用 P E G丙酸琥珀醯亞胺衍生物（S PA — P E G)可製成 更穩定的P E G共轭物，其並不具有酯鏈結。此對相當的 羧甲基化PEG之琥珀醯亞胺基衍生物（SCM—PEG )亦是真實的，其甚至較SPA — PEG更具反應性* S CM — P E G在水解作用及胺基水解上均極具反應性， 其中水解作用在PH8.0下之半衰期少於1分鐘（然而 ，此衍生物之極反應性可在以髙速率下完成之反應中提供 益處，而使聚乙二醇修飾作用具高度選擇性）。此已示出 可生成高度聚乙二醇修飾之酵素*其相對於天然蛋白質保 有幾乎 1 0 0%的比活性。推測上，P E G衍生物之薄命限制其 在蛋白質真實表面上與賴胺酸之反應性，在此其配置似乎 不會瓦解二級結構而造成比活性之減少β 分子量5 kD之活化的單甲氧基聚乙二醇（mP EG 本紙张尺度逍用中圉國家標準（CNS ) A4規格（21 OX 297公* ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} -29 - I?43 88 09 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 A7 B7_五、發明説明（27 ) )，爲修飾本發明抗體之最佳作用物。由於N-羥基琥珀 醵亞胺基（、NHS")部份之存在使mPEG被活化。 另外可應用多至4 0 k D分子量之經活化的單甲氧基聚乙 二醇（mP EG) ·適合的經活化的單官能聚乙二醇類包 栝聚乙二醇丙酸之N-羥基琥珀醯亞胺基活性酯（' S P A - P E G ")，琥珀酸聚乙二醇之N_羥基琥珀醸 亞胺基活性酯（、SS - PEG·)，羧甲基化的聚乙二 醇之N -羥基琥珀醣亞胺基活性酯（iSCM—PEG# )•具賴胺酸之聚乙二醇之N —羥基琥珀醯亞胺基活性酯 二聚體（*PEG2 — NHS# )，聚乙二醇丙醛（， P E G - ALDEHYDE# )，或正白胺酸聚乙二醇之N -羥基 琥珀醯亞胺基衍生物（'PEG-NORLEUCINE# ) · 最佳的活化的m P E G爲m P E G丙酸之N -羥基琥 珀醯亞胺基衍生物（ 、SPA - PEG，）《mPEG單 體之聚合作用可生成經聚乙二醇修飾的（ ' 聚乙二醇修飾 之'）抗體，其爲本發明最佳的經修飾抗體。 許多文獻已致力於經由各種分子置（由5 k至4 0 k 以上）之聚乙二醇（P E G)之粘著而達到蛋白質修飾之 研究上》如所示，據報告P E G可粘著至酵素，肽及蛋白 質。 使用聚乙二醇以降低蛋白質或抗體之免疫反應性，在 技藝中已有所描述（Davis, F.F. et al.,美國專利案 Νο·4, 1 79,337; Ono, K. et al.,美國專利案 No. 5,342,940; Toraasi, T.B. et al.,美國專利案 No. 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210X297公釐) ' -30 - (請先《讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 " 經濟部中央標準局員工消費合作社印» o Ob Ο 3 Α7 _______Β7_五、發明説明（28 ) 4,732,8 63; Katre, N. et al·，美國專利案 No. 4,917,888; Nakagawa, Y. et al.,美國專利案 No. 4,791，192; Saifer，M. et 今1 .,美國專利案忖〇· 5, 283, 317;Cunninghara-Rundles, C.，美國專利案 No. 5,169,627) » 於有限的例子中，聚乙二醇已用於修飾抗體。！^!!^-si, T.B. etal (美國專利案No.4,732,8 63 )討論產生經 聚乙二醇修飾之抗體之方法，且揭示此抗體呈現減低之免 疫原性。方法涉及P E G至蛋白質分子上之三硝基苯磺酸 一可應用之胺基之共價粘著。 Tomasi, T. B. et al (美國專利案 No . 4，732，863)揭示PEG—修飾之抗體之免疫原 性依修飾程度而變化，因此在控制粘著至抗體之P EG分 子數目上+分重要，以平衡抗體減低之免疫反應性與保存 充份抗體活性程度之所需。 Tomasi等人揭示疫球蛋白•其中1 3 — 1 8%的胺基 已經修飾而大體上缺乏可測及之免疫原性，但在此範圉外 的修飾百分率則在免疫原性上有未可測知之作用。調整抗 體對單體之比例據稱可控制聚乙二醇化作用之程度* 聚乙二醇一修飾之抗體，其形成及用法由Karr，L.J. e t a 1.揭示（M e t h. E n z y in ο 1. 2 2 8 : 3 7 7 - 3 9 0 ( 1 9 9 4 ))。 這些蛋白質修飾作用意欲延長天然分子之半袞期及/ 或減少或消除被充作人類治療劑之外來蛋白質固有的免疫 原性•所報告的大部份努力係集中在這些修飾研究之步驟 本紙張尺度遥用中國國家標準（匸奶}六4规格（2丨0><297公釐) ~ -31 - (請先閲讀背面之注意ί項再填寫本頁) 訂 B7 B7 經濟部中央標隼局員工消費合作社印褽 五、發明説明（29 ) 上，P E G衍生物之合成及在動物研究或人體臨床嚐試上 之終結果：然而對於經聚乙二醇修飾之蛋白質特色之分析 方法上仍有短缺》對於以層析技術定量決定聚乙二醇修飾 程度1或決定留在反應中之未經修飾蛋白質上則少有注意 *對於此異質性之分析有一些嚐試，且並未浮現出任何技 術是適合將P E G —蛋白質製劑解析成個別的組份的。 因此本發明的一方面是有關一種新的疏水性交互作用 層析方法，不僅可自這些分子之聚乙二醇-修飾版本中分 出天然的單株抗體或F a b片段，也可分出所粘著之 P E G股數不同的偭別的經修飾物。此方法利用P EG — 修飾之蛋白質分佈至富含P E G之相中，此爲水性聚合物 二相分離中有效的技術。此新穎的層析技術在以5 K P E G衍生物修飾之蛋白質，或以更高分子量之P E G修 飾者中同樣有用。方法可發展成定量分析工具*以及在聚 乙二醇修飾作用後移去未經修飾之天然蛋白質之製備式純 化步驟。 細胞間粘著分子一 1 ( I CAM— 1 )渉及許多發炎 狀況之致病過程。已證明經由干擾I CAM — 1依賴之交 互作用而成之細胞粘著之調控作用，在各種急性狀況之臨 床前模式及/或臨床處理中是有益的，如灼傷•移植物排 斥* 絕血一再灌注傷害（Cosimi, Α·Β. et al.，In: Structure, Function and Regulation of Molecules Involved in Leukocyte Adhesion，. L i psky, P.E. , e t a 1. ，Eds., Springer Verlag， pp.373-387 (1992); Miles- 民張尺度適用中國阐家標準（CNS ) A4说格（210X297公釐) ~— -32 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 88 09 at B7 經濟部中央標準局貝工消費合作杜印» 五、發明説明（Qn) oU ki, W.J. et al., J. Surg. Res. 52:334-339 (1992); Haug, C.E. et al., Transplantation 55:766-773 ( 1 9 9 3 ); Le f e r, A.M. e t a 1., Ann, Rev. Pharmacol. T-oxicol· 33:71-90 (1993))。再者，抗一I C AM - 1 抗體療法已可有效地治療慢性發炎疾病，如類風濕性關節 炎（K a v a n a u g h , A. e t a 1.，A r t h r · R h e u m. 3 5 : S 4 3 ( 1 9 92 ))。然而在許多例子中，且尤其是當所處理的狀況 爲先前曾處理之發炎之再復發時，抗—I CAM - 1療法 可能無法利用因爲免疫反應（其由抗體最初的投予所誘生 )可拮抗外來鼠類蛋白質（其中包括enlimomab分子）之 抗原決定子。修飾抗體結構以減少免疫原性爲抗體遺傳工 程的主要目檫，其通常以分子生物技術經由·'人類化作用 ^達到。然而此方式常造成抗體之改變，而此會危害到抗 馥功能》這些蛋白質修飾作用意欲延長天然分子之半袞期 及/或減少或消除被充作人類治療劑之外來蛋白質固有的 免疫原性》 瓜.修飾方法 本發明的一方面是有關一般抗體之聚乙二醇修飾作用 之改進方法，且特別是抗—I CAM— 1抗體。二種方法 稱之爲t溶液^方法及 ' 管柱'方法。 A .以溶液爲基礎的聚乙二醇-修飾作用 在聚乙二醇一修飾作用之溶液方法中，抗—I CAM 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2】0X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 線 *143 88 〇 9 Α7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Β7五、發明説明（31 ) 一 1抗體及活化的mP E G於經緩衝之水溶液中攪拌，於 進行至欲求的點時可中止共軛反應" 反應之中止是將二甘胺酸加至反應混合物中，使達 5 0倍莫耳濃度過量於抗體上可應用之胺基。可以透析過 濾或透析方法移出反應混合物中之反應摻雜物（如未反應 .的mPEG，二甘胺酸等），並將緩衝溶液更換成50 mM磷酸鈉，100mM氯化鈉，pH6 »溶液在貯放於 4 °C前先無菌過濾》 B.管柱爲基礎的聚乙二醇一修飾作用 在管柱方法中，抗一 I CAM — 1抗體先結合至經固 化之配體上，其呈現I CAM-1或類—I CAM— 1表 位。因此，此結合涉及可與I CAM — 1結合之抗體區域 。在一個具體實例中，經固化的配體是I CAM-1之可 溶型式（'sZCAM-l# )，其已共價粘著至層析管 柱樹脂上。另外，針對此目的可使用eml imomab之抗-遺 傳性型抗體（如單株抗體CA3) * (Rothlein, R. et al., Inti. Arch. Allerg. Immunol. 100:121-127 ( 1 9 93 )，已列爲此中參考）。因此，其以和si CAM — 1同樣的方式結合至抗-I CAM_ 1抗體· 於一個管柱聚乙二醇-修飾作用之較佳具體實例中· 利用Emphaze活化的層析樹脂（azlactone chemistry)先 製備s I CAM — 1親和力管柱。s I CAM - 1較好透 析過濾至偶合緩衝溶液中（8 6 OmM檸檬酸三鈉， 本紙張尺度遑用中國圏家揉準（CNS ) A4规格（210X297公釐） {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -34 - A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、 發明説明（32 ) 1 1 0 0 m Μ Ν a H C 0 3 ，ρ Η 8 - 6 ) ，濃縮液再 調 1 I 整 至約 1 0毫克 /毫升 ο 再加 Emphaze B i osuppo rt介質 至 1 I 溶 液中 ，使各2 0毫克 的 s I CAM- 1中 有1 毫升泡 脹 r—s. 1 | 的 樹脂 。樹脂與 s I C A M _ 1溶液渦 旋混 合， 且懸浮 液 請 先 閲 J 丨 1 在 室溫 下緩和攪 動1小 時 e未偶合的s 1C AM 一 1經 樹 讀 背 [ t 脂 之洗 滌而移去 (如以 等 體稹的P B S (5 〇 m Μ磷酸 鈉 之 注 查 1 1 10 0 m Μ N a C )-p H 6 洗 十次 ，於 2 5微 米 事 項 i I 再 J 1 孔 徑之 玻璃原料 管內） 0 未反應的吖內 酯基 由樹 脂與乙 醇 % 本 1 胺 (P Η 9 )緩 和混合 二 次而中止（如 1倍 體積 之乙醇 胺 頁 1 1 先 歷3 0分鐘* 再歷2 小 時）。樹脂充份洗 滌（ 如以1 倍 1 I 體 積的 1 Μ Ν a C芡 洗 十次，再以1 倍體積的 P B S y 1 1 I P Η 6 洗三次） 。之後樹 脂充填至層析 管柱 ，以 數（如 3 1 訂 I ) 管柱 體積適合 的貯存 緩 衝溶液（如6 4 m Μ磷 酸鈉* 1 1 8 6 m Μ N a c H 2 % ( V / V ) 甘油 ，0 .0 5 % 1 1 疊 氮化 鈉，Ρ Η 6 )洗 滌 ，再貯於4 °C 下。 1 1 爲 決定s I CAM — 1至Emphaze樹脂之偶合效率.， >-h 可 定量 出偶合反 應中未 結 合之s 1 C A Μ - 1之 量，較好 1 t 利 用B C A方法 β此可 由 定量樹脂洗液 中未 結合 \ 1 I S 1C A Μ - 1 而完成 r 偶合效率據估 計2 9 5 96 〇依 序 1 1 1 填 裝管 柱以決定 s 1C A Μ — 1親和力 管柱 之能 力’直 到 1 1 觀 察到 en 1 i moina b突破限度爲止。結合能力爲每毫升凝膠 \ 1 由 8 . 2至8 . 8毫克 en 1 imomab *此代表1 :2 (en 1 i - 1 1 momab : s I C A Μ - 1 ) 之結合質量比例| 或1 en 1 i - 1 I mornabS 4 s I C AM- 1 分子之莫耳濃度it ，例。 就可衡 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準{ CNS ) A4規格（2丨OX 297公釐} -35 - A7 B7 經濟部中央榇準局貝工消費合作杜印製 五、 發明説明 (33 ) 1 I 量 之 過程而 言，希 望 所使 用 的樹脂在各聚 乙二醇修飾流程 1 1 後 能 力 之喪 失極微 且各 流 程均可產生一 致的聚乙二醇一 ! | 經 修 飾 產物 » 1 | 以 結合 至s I C AM 一 1管柱之抗體 進行共軛反應， 請 先 聞 4 1 | 因 此 遮 蔽結 合位置 使 無P E G之粘著。雖 然管柱及溶液方 背 & 1 1 1 法 產 生 之m PEG 抗- I C A Μ - 1 抗 體共軛物保有結 1 | 1 合 活 性 ，管 柱方法 使 更多 的 m Ρ E G可粘 著至抗體，使結 事 項 1 I 再 1 | 合 活 性 有更 大的保 留 。再 者 ，管柱方法可 保護 en 1 i momab f 本 I 之 結 合 位置 免於聚 乙 二醇 一 修飾作用過程 ，由是可分離出 頁 1 保 有 更 大結 合能力 之 聚乙 二 醇-修飾之抗 體衍生物。因此 1 I 管 柱 方 法是 較佳的 方 法， 優 於m Ρ E G與 抗-I C A Μ — 1 I 1 抗 體 之粘 著。下 述 方法 參 考 en1imoraab 爲較佳的抗- 1 訂 | I C A Μ — 1抗體 Q 1 1 I S 1C AM — 1. 親和 力 管柱再以5倍 管柱體積之 1 1 P B S ，Ρ Η 7 . 5 平衡 且管柱再填料 裝滿 en 1 imomab 1 1 ( 2 — 5毫 克/毫 升 ，於 P B S，ρ Η 7 .5)。活化的 1 S P A -Ρ EG ( 5 k D ) 溶液製備於1 管柱體稹之 1 P B S ,Ρ Η 7 . 5 中。 對 填加至s I C A Μ - 1管柱中 1 I 每 毫 克 en 1 i momab含 有1 毫 克m Ρ E G之 典型m Ρ E G溶 1 1 i 液 0 m PE G溶液 在 s I C A Μ _ 1管柱 於室溫下再循環 1 1 1 小 時 ，之 後以5 倍 體積 之 平衡緩衝溶液 洗滌管柱而移去 \ I 經 由 管柱 方法產 生 之m P E G — enlifflomab分子（命名 1 1 爲 B I R R 1 0 • )再 以 2倍體積之1 0 0 m Μ甘胺酸 1 1 » P Η 2 . 7溶離 y 並以 1 Μ T r i s -鹼，ρ Η 9或 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4况格（210X297公釐） -36 - 1?43 88 09 A7 B7 經濟部中央橾準局員工消费合作杜印製 五、發明説明（34 ) lOOmM碳酸鈉（PHI 1)中和，再以1M磷酸鈉（ P Η 4 . 5 )中和。 由溶液及管柱聚乙二醇修飾方法產生之粗製的 m P E G — enl imomab混合物含有殘留的（2 — 5%)未 聚乙二醇修飾之enlimomab。由於此物質含有免疫原性摻 雜物，希望可自製劑中將之移去。未聚乙二醇修飾之enl-imomab較好以製備式大小排阻層析或疏水性交互作用層 析自m P E G — enlimomab製劑中移去。 IV.純化經聚乙二醇修飾之抗體 A .大小排阻層析 於大小排阻層析中，B I RR 1 0經濃縮的粗製匯集 填加至含有適合的製備式大小排阻層析管柱之管柱中（如 2 . 6 X 6 0 公分管柱，含有 P h a r m a c i a S u p e r d e X 2 0 0 ) ，其已先在適合的緩衝溶液中平衡（如6 4mM磷酸鈉， 8 6 m M NaCj?，ρΗ6)。所浮現的單一寬峰經分 級分離移去雙端，前端含有高度經聚乙二醇修飾之enli-momab，另一尾端含略聚乙二醇修飾的及天然的enlimoro-ab * B·疏水性交互作用餍析 在欲特性化經聚乙二醇修飾之蛋白質加合物，且同時 解析個別組份而發展獨特分析技術之企圖上遭遇到二個主 要問題•首先*依所使用之聚乙二醇-修飾作用技術，製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4洗格（2IOX297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -37 - 經濟部中央標隼局—工消費合作社印製 i43 38 〇9 A7 _B7_ 五、發明説明（35 ) 劑中種類數目多樣（即P E G衍生物之化學，分子量，及 蛋白質上反應位置之數目）。再者，不同分析技術之解析 因蛋白質而異。其次，雖然顯示出異質性，但在個別的聚 乙二醇修飾種類中仍缺乏解析法*二種問題利用特異的 HPLC管柱技術可解決。 P E G是一種具極高水溶性之緩和疏水性物質。其已 用於修飾蛋白質，由是可增加其血清半衰期，且已被用於 水性2相分配系統中》此獨特的聚合物具有其他許多有趣 的特性，使其經常被用於藥學調和物及食品製劑之組份中 e ( Abuchowsk i, A. et a 1. , Cane. B iochem. Biophys. 7:175-186 (1984); Mast, A.E.et al. (J. Lab. Clin. Med. 116：58-65 (1990); Nakayomi, K. et al., Bioch-em. Inti. 22:75-84 (1990); Sada, E. et al., J. Ferment. Bioeng. 71:137-139 (1991); Matsuyama, H. et al., Chem. Pharm. Bull. 39:743-746 (1991); Zalips-ky, S. et al., Biotechnol. App. Biochera. 15:100-114(1992))。 在最佳的具體實例中，應用疏水性交互作用層析移去 未聚乙二醇修飾之抗體，以及提供具有欲求聚乙二醇修飾 水平之均質的抗體》 疏水性交互作用層析（I C')爲一種有價值的 技術，係在高鹽條件下分離蛋白質（大體可見HPLC of Β-iological Macromo 1 ecu 1 es. Methods and Applications ,Gooding, K.M. et al., Eds., Marcel Dekker, Inc. 本紙張尺度適用中园國家標準（CNS ) A4現格（21 OX297公釐） {請先聞讀背*之注意事項再填寫本頁) 訂 -38 - 經洚部中央揉準局員工消費合作社印製 A7 _B7 _ 五、發明説明（36 ) (1990))。關於蛋白質，Η I C分離基礎在於蛋白質上疏 水性胺基酸殘基與固化至層析載體上經固化的疏水性部份 之交互作用*經固化之疏水性部份可選自大範圍之烷基及 芳基。P E G是較佳的經固化部份*此部份之疏水性依烷 基長度增加而增加·在高鹽中（1 - 2 Μ ΝΗ4( S 04) 2爲較佳）蛋白質可吸附至管柱，且降低 離子強度後可溶離。進行Η I C之方法述於Cameron, G. W .et al. (Meth. Holec. Cell. Biol. 4:184-188 ¢1993 ))，Raymond，J. et, al. (J. Chromatog. 212： 199-209 (1981)), Ochoa, J.I. (Biochimie 60:1-15 ¢1978) ),Roggenbuck , D. et al. (J. Immunol. Meth.167： 207-218 ¢1994)), Michaelson, S. et al. (Pol. J. F-ood Nutr. Sci. 3/44:5-44 (1994), Rippel, G. et al. (J. Chromatog. 668:301-312 (1994)), Szepesy, L. et al.(J. Chromatog. 668:337-334 (1994)), Huddleston, J.G. et al. ( B ί otechno 1. B i oeng. 44:626-635 ( 1 994 ))，Watanabe, E. et al. ( Ann 1. NY Acad. Sci. 721： 348-364 ( 1 994))，其均列爲本案參考。 將聚乙二醇股粘附至大蛋白質上（即單株抗體）已示 出可增加抗體之疏水性，此較天然的未經修飾抗體而言。 在高鹽緩衝條件下，其可消除電荷效應及增大疏水作用， 吾等應可利用疏水性配體自聚乙二醇修飾之蛋白質中分離 出天然蛋白質。跨越大範圍疏水性之各樣商品化的Η I C 管柱化學中，將可發現可供層析分離用之適合的配體。吾 本紙張妓適财關家鮮（CNS ) ( 21GX297公嫠) ' ' -39 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 g^388 09五、發明説明（ A7 B7 37 經濟部中央棣準局員工消費合作社印袈 等也預期在結構上類似聚乙二醇之Η I C配體，可加強分 配於僞一親和力模式中，因爲經聚乙二醇修飾之蛋白質已 知可在2 —相分離系統中差別地分配於PEG相中（Waiter, H. et a 1., In: Partitioning in Aqueous Two-Phase Systems, Theory, Methods, Uses and Applications to Biotechnology, Academic Press, NY (1985); Karr, L.J. et al., J. Chromatogr. 354:269(1986); Stocks, S.J. et al., Anal. Biochem. 73:86(1988); Karr, L. J. et a 1., In: Separations Using aqueous Phase Systems. Applications in Cell Biology and B-i otechno1ogy, Fisher, D. e t a 1., Eds., Plenum Pre-ss, NY ( 1 9 8 9 ))。相同的分配原則應可同等地應用於層 析系統中，因其已證明可在這些二相系中有所作用。雖然 疏水性交互作用是顯著的，在粘著至蛋白質之P E G及 P E G —結合相間之特異交互作用足夠強以促進聚乙二醇 修飾蛋白質中天然蛋白質之層析分離，除了解析個別的 PEG—蛋白質加合物之外》 可評估跨越大範圍疏水性的各樣商品化Η I C管柱化 學。最先測試的是購自Synchrom及Bio-Red的Η I C管柱 ，其涵蓋全範圍的可運用烷基配體疏水性，由羥丙基至戊 基加上苯基=在大多數例子中均未達到自P E G -修飾蛋 白質中分離天然者之令人滿意的結果。當在某些管柱上層 析髙度聚乙二醇修飾之樣品時，相較於天然蛋白質，經 P E G修飾的抗體若疏水性愈強其滯留時間之增加愈明顯 私紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) Α4规格（210X297公釐） (请先閎讀背面之注意1C項再填寫本頁) ,ιτ -40 _ i43 88 Ο 9 經濟部中央橾準局員工消費合作社印褽 A7 B7五、發明説明（38 ) 。然而*當所層析的樣品含有天然未經修飾之抗體及聚乙 二醇修飾種類混合物時，則這些管柱將無法分離出聚乙二 醇修飾蛋白質中之天然蛋白質•因爲在吾等研究中所用的 聚乙二醇一修飾作用步驟會留下某些未聚乙二醇修飾之抗 體（由其他技術所決定，即未還原的SD S — PAGE ) ，因此需發展可分離二種組份的層析方法8此點是免疫學 上十分重要的*因爲已證明即使是少量未經修飾天然蛋白 質摻雜於聚乙二醇修飾蛋白質中，均會引起免疫反應。 測試RainirTs Hydropore HIC管柱，因其有自P E G 修飾蛋白質中分離天然蛋白質之能力。此管柱有將P E G 納入以矽石爲基礎之粒子上充作疏水性配體之獨特特性（ Hatch, R.G., J. Chromatogr. Sci. 28:210 (1990); C-hang, J. et al., J. Chromatogr. 319:396 (1985)) * 利用此管柱可測試加強與P E G之疏水性交互作用爲結合 相之假說。此獨特的化學可運作良好，使得不僅可分離聚 乙二醇修飾種類中之天然抗體及定量留下來的未經修飾抗 體，也可提供個別的1— PEG，2 — PEG，3 -P E G修飾種類之分離》在略作修飾下*此技術可擴大規 模，並用來純化大量無天然物之經聚乙二醇修飾之單株抗 腊a Synchropak管柱購自 Synchrom Inc.，Lafayette Inc .且爲可用於蛋白質及酵素的一系列緩和疏水性交互作用 管柱。此管柱由6 . 5微300A巨孔球形矽石共價鍵結 聚醯胺被覆所組成，其並以疏水性配體衍生化•如丙基， &張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 啖！ -41 - 經濟部中央橾準局I工消费合作社印装 ,-.-广 A 7 …. '_B7五、發明説明（39 ) 戊基或羥丙基。 也測試Bio — Gei 丁5尺苯基一5 — ？评管柱 。管柱購自B i 〇 — R a d，Hercules CA3這些粒子由 1 0 · 0微1 0 0 0A巨孔羥基化之聚醚珠粒，並鍵結極 低表面密度之疏水性苯基配體所組成。 也應用Hydopore管柱。管柱購自 Rainin Instrument Co. , Emeryvi 1 le CA β填充物含有3 0 0 A孔徑大小之高 密度矽石，並化學鍵結以專有的親水性有機層。聚乙二醇 基再共價粘附至親水性單層以產生層析物質。聚乙二醇（ PEG)爲弱疏水性中性聚合物。PEG在可保持蛋白質 於高鹽濃度下之表面密度時鍵結，其則係經由所鍵結相及 蛋白質表面疏水區域間之交互作用。再於低鹽濃度下以高 產率釋出蛋白質。 發展Η I C方法可用於充作分析工具*及可自經聚乙 二醇修飾之ΒIRR10中製備地分離未聚乙二醉修飾之 enlimomab。方法中利用經P E G修飾之蛋白質可分配至 富含P E G之相中，其在水性聚合物二相分離中已有所證 明。利用此層析技術，將可快速地決定在經聚乙二醇修飾 之製劑中天然enlimomab之百分率。經聚乙二醇修飾之物 質可再利用相同的Η I C管柱大規模純化。除了可定量經 聚乙二醇修飾之樣品中之天然抗體之外，此方法也可提供 經修飾聚乙二醇反應之指紋，且可用於各批次變異性試驗 之品質控制。由於以此方法可決定（利用適合的軟體）個 別峰之區域，技術也可用來追踪經聚乙二醇修飾之蛋白質 本&張尺度適用中國國家標準（€奶）厶4说格（210父297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -味！ -42 - A7 B7 經濟部中央橾準局負工消費合作社印製 五、發明説明（40 ) 之穩定性，及聚乙二醇修飾過程之時間經過*利用商品化 的Η I C管柱物質可完成此嚐試，其可應用於各種粒子大 小。 依據此方法，Β I RR1 〇於適合的鹽溶液中（如 2Μ (NH4) 2S〇4' lOOmM 磷酸鹽，pH7.0 )應用至Η I C管柱內•進行逐步梯度，當硫酸銨濃度降 低至 Ο · 9M (NH4) 2804於1 OOmM 磷酸鹽， PH7 · 〇時先可溶離出天然的eniimoraab。當鹽濃度再 進一步下降（〇 . 5M(NH4)2S04，於 l〇〇mM 磷酸鹽，PH7.0) ，BIRRl〇可自管柱中呈單峰 被溶離。 再利用各種分析方法偵測BIRR1〇之純度及本質 •包括經還原的及未經還原的硫酸十二酯鈉聚丙烯醯胺凝 膠電泳（SDS — PAGE)，大小排阻層析法，分析級 Η I C，毛細管電泳，激光解析質譜儀及循環二向色性* 未還原之考烏斯染色之S D S — P A G Ε凝膠經光密度計 掃描，可估計各聚乙二醇修飾種類相對之帶面積。此步驟 估計出每個B I RR 1 〇分子平均約有5 PEG s。激光 解析質譜儀進一步確認這些數據。分析級大小排阻層析可 進一步特徵化B I RR 1 0。以球蛋白標準品校正Supe-rdex 20Q凝膠過濾管柱|並比較enlimomab及 B I RR 1 〇 〇 enlimomab以 2 0 0 k D 蛋白質之表觀 stokes 半徑溶離 ，而 B IRR10 具 540kD 之表觀 sto-kes半徑》增加5個5kD PEGs可將Stokes半徑增 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 4t! 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規A ( 2丨0X297公釐） -43 - 經濟部中央搮準局貝工消資合作杜印製 腔43 88 09 at _B7_五、發明説明（41 ) 加2 . 6倍。 若將經聚乙二醇修飾的及未經聚乙二醇修飾的物質如 上述般處理，可進行分析級疏水性交互作用層析’在製劑 中將測不到天然的未經聚乙二醇修飾之物質。 V .投予經聚乙二醇修飾之抗一 I CAM— 1抗體 本發明的抗體分子可依據已知方法調和以製成藥學上 有用的組成物，由是這些物質或其功能性衍生物，具欲求 純度者可混合於有生理上可接受之載劑，賦形劑或穩定劑 之混合物中•此種物質在所應用之劑童及濃度下對受者而 言是無毒的。若組成物之投予可爲接受的病人所忍受.，則 可稱之爲 ' 藥理上可接受的'•若投予之劑量是生理上有 意義的，則此作用物據爲以 ' 治療有效劑量*投予。若其 存在可造成所接受病人生理上可測及之變化，則作用物是 生理上有意義的· 本發明抗體可依非- I CAM— 1抗體已述之相同方 式製備及投篥（Basta, M. et al.，美國專利案 5，171，663;1^11<111(：(：161；31.,美國專利案5，308，626; 0〇168(；1161,1^.6七&1.,美國專利案4,880，913;€111·^， 1».»1.61&1.，美國專利案 4,7 1 9,290;3&{&1，8.6丈31. ，美國專利案 4,649,1 1 5;1^1111^3，丫.61；31.,美國專利 案4,692,331;1[丨1111^3,1.6{31.，美國專利案 4,379,086; Uemura, Y· et al.，美國專利案 4, 371,520; Osther, K.B.,美國專利案5,28 6,85 2:均列爲本案之參考 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21^297公釐） "~~' (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 灯 竦 _ B7 五、發明説明（42 ) )β (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 適合的溶媒及其調和，包括其他人類蛋白質’如人類 血清白蛋白，述於如 Remington’s Pharmaceutical Sciences (16th ed.， Osol， Α.， Ed., Mack, Easton ΡΑ ( 1980))。爲了形成適於貯存或投予之藥學上可接受之組 成物，此種組成物可含有有效劑量的一種以上經聚乙二醇 修飾之抗—I CAM - 1抗體。 本發明組成物較好可調和成可經注射，快速输注’鼻 咽部吸收（鼻咽內）之腸外投薬’皮庸吸收’或口服方式 。組成物另外也可以肌內或靜脈內方式投藥。腸外投藥之 組成物包括無菌的水性或非水性溶液’懸液劑’及乳劑。 非水性溶劑之實例有：丙二醇，聚乙二醇’植物油如橄欖 油，及可注射之有機酯，如油酸乙酯。可使用載劑，佐劑 或閉鎖藥品來增加組織滲透力及加強抗原的吸收。除了惰 性稀釋劑外，此種組成物也可包含有沾濕劑，乳化及助懸 劑，或甜味劑，芳香劑•著色劑或香料等作用物。 經濟部中央樣準局—工消費合作社印製 也可加入視所需的其他組份，如抗氧化劑如抗壞血酸 :低分子量（少於約1 0個殘基）多肽如聚精胺酸或三肽 類：蛋白質，如血清白蛋白，明膠，或免疫球蛋白；疏水 性聚合物如聚乙烯吡咯啶銅：胺基酸，如甘胺酸，穀胺酸 ，天冬胺酸或精胺酸；單醣*二醣，及其他碳水化合物包 括纖維素或其衍生物，葡萄糖，甘露糖或糊精：嵌合劑如 E D TA ;及糖醇類如甘露醇或山梨醇β 一般而言|提供組成物有效劑量所需之劑量可依以下 本紙張尺度適用中國國家揉準（CMS } Α4规格U10X297公釐） -45 - 經濟部中央樣準局貝工消费今作社印裝 __B7_ 五、發明説明（43 ) 因素而變化·如受者之年齡，狀況，性別及疾病程度（若 有的話），及其他可爲一般精藝者調整之變數。本發明組 成物之有效劑量可由每劑量或應用由0.01變化至 1 ，0 0 0毫克/毫升，然也可使用較少或較大的劑量· 用於治療性投藥之藥學組成物可以是無菌的·如經由 無菌過濾膜過濾（如0 . 2微米膜）。組成物可呈經冷凍 乾燥型式或液髖溶液劑型式貯存β 本發明經聚乙二醇修飾之抗一 I CAM— 1抗體，相 較於天然抗體可呈現實質上改進的血清半衰期。因此•其 對受者之投藥可提供受者較未聚乙二醇修飾之抗一 I C AM_ 1抗體更長時間的抗體有效濃度》 本發明的抗體可以如L FA — 1或未聚乙二醇修飾之 抗一I CAM - 1般相同方式使用，以治療由I CAM-1調介之細胞粘著所引起的或影響的發炎。此種發炎包括 由於特異或非特異防禦系統反應所生成的· 特異的防禦 系統反應#爲免疫系統對特異抗原存在的一種反應* 1非 特異的防禦系統反應#則是由無免疫記億之白血球所調介 之反應。此種細胞包括顆粒細胞及巨噬細胞。 可以本發明抗體處理的，因特異防禦系統反應所致之 狀況包括由於自體免疫疾病所致之發炎，對抗原的反應（ 如風疹病毒），由T細胞調介之延遲型敏感反應（如在 Mantaux測驗中呈’陽性^測試結果之個體）等。可以本 發明抗體處理，且因非特異防禦系統反應所致之狀況包括 與以下狀況有關之發炎•如：氣喘：成人呼吸痛苦症候群 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS ) A4規格（210X297公釐）_ 46 - H· I I II - - - ^^1 - - — 1^1 n -I ^1. J m XT 4 * 、言 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 鲤濟部中央搮準局貝工消费合作社印製 A7 B7五、發明説明（44 ) (ARDS)，或繼敗血病或創傷後之多種器官傷害症候 群；心肌或其他組織之再灌注傷害；急性血管球性腎炎： 反應性關節炎；有急性發炎組份之皮虜病：膿性腦膜炎或 其他中樞神經系統發炎失調症；熱傷害；血液透析；白血 球分離術；結腸潰瘍；克隆氏病：壤死性小腸結腸炎；與 顆粒細胞輸血有關之症候群；及由細胞動素誘生之毒性。 如所示，本發明經修飾的抗體可用來阻斷排列在內皮 及其他細胞表面上之I CAM— 1分子。由於I CAM — 1爲細胞受體，由此人類鼻病毒與之結合以啓動鼻病毒感 染（0^丫6，】.！!1.6131.，〇61 1 56:839-847 ( 1 989 );5-taunton, D.E. et al., Cell 56:849-853 (1989); Ohl-i n, A. e t a 1., Antimicrob. Agents Chemother.38： 1413-1415 C1994); Cassanovas, J.M. et al., J. Vir-ol.68:5882-5889 ( 1 994)) ·結合至鼻腔氣管及/或肺之 內皮細胞以抑制鼻病毒感染。因此本發明經修飾的抗體提 出預防新鼻病毒感染之方法，以及治療既存的感染之方法 (即令曝於病毒之非感染細胞之感染與已感染細胞分開） 既已大體地描述了本發明，經由以下實例之參照將可 更加了解，實例之提出僅供說明|除另有所示不欲因此限 制本發明。 啻例1 抗一I CAM — 1抗體之聚乙二醇一修飾作用 IJ. - 1 - - - 1 ·*"- - - i s - 1^1 - .^1 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本页) 本紙張尺度通用中國國家標窣（CNS > A4規格（210X297公釐） -47 - 經濟部中央標準局貞工消費合作社印製
1643 88 0 9 at ____ B7_五、發明説明（45 ) 臨床等級的 enlimomab 得自 Dr. Karl Thomae, GmbH* 活化的 mP EG s 得自 Shearwater Polymers, Inc. ( H-untsville, AL)。於這些實驗中所用的所有mPEGs均 爲分子量5kD之mPEG丙酸（SPA — PEG)之N —羥基琥珀醯亞胺基衍生物（cat #M— SPA — 5000)。此活化的mPEG係對蛋白質上的胺基具反 應性9用來產生s I CAM— 1親和性管柱之層析樹脂爲 來自 3 Μ 的Emphaze Biosupport Medium AB1。所用的緩 衝鹽爲3M S c i e n c e s之| U 11 r a P u r e 〃級，且所有實驗中 用的水由 Barnstead Nanopure water system產生，具有 大於17ΜΩ—cm之電阻。 聚乙二醇修飾的抗-I CAM — 1抗體enl imoniab利 用溶液或管柱聚乙二醇修飾法製備。於溶液聚乙二醇修飾 方法中，於溶液中混合各種活化的m P E G及enlimomab 比例於經緩衝之水溶液內以產生m P E G及enlini〇raab共 軛物。反應於各時間點時中止，即加二甘胺酸至反應混合 物中使其較enl imoinab上可運用胺基髙出5 0倍莫耳濃度 。可以透析過濾或透析法移出反應混合物中之反應摻雜物 (如未反應的mPEG，二甘胺酸等），且緩衝溶液更換 成50mM磷酸鈉，10mM氯化鈉，pH6。溶液無菌 過濾再貯於4 °C下。 於管柱聚乙二醇修飾方法中，利用Emphaze活化的層 析樹脂（吖內酯化學）製備s I CAM — 1親和力管柱》 s I CAM— 1透析過濾至偶合緩衝溶液中（860mM (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本纸張尺度適用中國國家揉準（CNS)A4規格（ 210X297公釐）_ 48 — 經濟部中央樣準局貞工消費合作社印裂 i43Se OQ A7 B7 _ 五、發明説明（46 ) 檸檬酸三鈉，100mMNaHCO3 * pH8 . 6)， 並將澳度調至約1 0毫克/毫升β再加Emphaze Biosupp -ort Medium至溶液中，生成各2 0毫克的s I CAM — 1 有〜1毫升泡脹的樹脂。樹脂混合至s I CAM — 1溶液 中（渦旋方式），且懸浮液在室溫下緩和攪動1小時。未 偶合的s ICAM — 1則以等體積的PBS (5〇mM磷 酸鈉，100mM NaCJ?) ，pH6 . 0 洗滌樹脂 + 次而移去，於1 2 5毫米多孔之玻璃陶製管內*未反應的 吖內酯基則由樹脂與1倍體積的3M乙醇胺（pH9 )緩 和混合二次，首先3 0分鐘，再來是2小時而中止。樹脂 再以1倍體積的1M Na CJ2洗十次，再以1倍镫積的 PBS，pH6洗三次《樹脂填充至層析至層析管柱內* 以三倍體積之貯存緩衝溶液（6 4mM磷酸鈉* 8 6mM NaCj? ，2% (v/v)甘油，〇 · 05% 叠氮化鈉 ，PH6)洗滌，再貯於4°C下。爲決定s I CAM— 1 對Emphaze樹脂之偶合效率，利用B C A方法定量偶合反 應中未結合之s I CAM — 1之含量。依序填加管柱直到 觀察到enUmoraab之突破以決定s I CAM-1親和力管 柱之容量g s I CAM - 1親和力管柱與5倍管柱體積之PBS ’ P Η 5平衡，且管柱以enlimomab填加至容量C 2 — 5 毫克/毫升於PBS，pH7 . 5)。於1倍管柱體積 PBS，pH7 . 5中製備活化的SPA-PEG (5 kD)溶液。填加至s I CAM— 1管柱中，每毫克en- 本紙張尺度適用中國固家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 一 49 - 1^. -·I -- -I —^1 I- **Λ— I - - n (請先聞讀背面之注意事項再4寫本頁) A7 B7 五、發明説明（47 ) limomab中含1毫克的m P E G e m P E G溶液在 s I CAM— 1管柱中循環，於室溫下歷1小時，再以5 倍體積的平衡緩衝溶液洗滌管柱而移去。再以二倍管柱體 積的下列任一者溶離出m P E G — enliraomab: 1 〇 〇 mM甘胺酸，pH2 . 7再以1M T r i s —鹸，ph 9中和*或是lOOmM碳酸鈉（pHll)，再以1M 磷酸鈉（pH4 · 5)中和。 利用羧甲基化之PEG 500MW之琥珀醯亞胺基 酯（SCM - PEG)或丙酸琥珀醯亞胺酯（SPA — PEG)進行以PEG對enlimoraab修飾之實驗。enlim-omab也可利用此二衍生物之2 0，0 0 0MW同系物衍生 化。這些及其他的偶合化學也在5 0 0 0MW， 20，000MW及 40，000MW下嚐試。 經濟部中央標準局貝工消費合作社印策 (請先W讀背面之注意事項再填寫本頁) 總而言之，以SPA及SC Μ衍生物修飾en limomab 單株抗體，係以抗體溶液反應無水重童下之m P E G衍生 物，於短的明確時間內* 4 °C下*以低離子強度之磷酸鹽 緩衝溶液維持反應溶液之pH在6·0-8.0範圍內。 於5 0 mM硼酸鹽緩衝溶液中進行較高p Η值下之反應》 蛋白質對mPEG衍生物之比例爲10:1至1:10。 因此，在某些例中有過量的賴胺酸，使mP EG爲有限試 劑（且因此是低程度的修飾作用）·在其他例子中則有過 置的m — P E G，賴胺酸則受限（及發生髙度的修飾作用 )。en limomab蛋白質溶液之濃度由1毫克/毫升至1 0 毫克/毫升。涉及S P A衍生物之反應以過量的濃縮二甘 本紙張尺度通用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -50 - A7 B7 五、發明説明（48 ) 胺酸中止，而由於短的半衰期並勿需中止S CM反應。過 量及未反應的？丘6利用八111丨(：〇11301^〇或1001^1) centriprep裝置至少透析3次。 窗驗2 純化經聚乙二醇修飾的抗- I CAM— 1抗體之分析 方法 發展可純化經聚乙二醇修飾的抗_ I CAM— 1抗體 之分析方法。此努力的目的有二層：（1)以發展出疏水 性交互作用層析方法，而可快速地鑑定單株抗體enliino-mab之經聚乙二醇修飾之製劑；及（2 )提出純化經 P E G修飾之蛋白質之一般方法。利用數種商品化的 Η I C管柱進行層析試驗：Synchropak (購自Synchrom I.nc .，Lafayette, IN) ，Hydropore HIC管柱（購自 Ra-i n i η I n s t r u m e n t C ο · ( E m e r y v i 1 1 e，C A))，或 B i ο — G e 5 T S K pheny 1 — 5 — PW (購自 B i o — R a d ， Hercules, CA)。 經濟部中央標準局真工消費合作社印裝 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 在評估各Η I C管柱時使用一系列enlimomab聚乙二 醇修飾之衍生物。這些共軛物在聚乙二醇修飾作用程度， 偶合化學及偶合步驟中所用之P E G衍生物分子置上各異 。衍生物可由仍保有多至3 5%留下之天然抗體（由其他 技術所決定）之混合物，變化至缺乏天然的而含有每抗髖 分子3 0個P E G — 5 0 0 0單位之聚乙二醇修飾類之混 合物•此樣品組成上大範圍的變化·使各管柱之分離能力 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS) A4規格（210X297公釐） ^43 88 0 9 A7 _____ B7 五、發明説明（49 ) 有完整之評估* (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 在Hewlett-Packard 1 0 5 0系統上進行分析級 Η I C，此系統包括多重波長之偵測器1 0 5 0，有高技 術活塞洗滌系統，自動注射裝置，1 0 0微升注射環（及 2 _ 0毫升製備環）之四組份泵。蛋白質濃度則以2 8 0 毫微米下之U V吸光度來追踪。以HP Chemstat〖on軟體在 Vectra 4 8 6/3 3M個人電腦上進行以處理數據之貯 存•在HP Deskiet Plus印表機上印出層析譜，再貯存在 硬碟上以公文處理之。由電泳決定經聚乙二醇修飾之產物 之本質。未還原的SDS-PAGE凝膠爲以下的型式及 組成。Phastgel，4 — 1 5 %梯度，在 Pharmacia Phast-system上進行，有1微升之樣品取樣裝置。蛋白質濃度由 1一10毫克/毫升中變化。 經濟部中央標準局員工消f合作社印製 利用低鹽濃度等密度Η I C HPL C系統進行初步 實驗。這些實驗充作天然M a b以及經聚乙二醇修飾之 enl imomab製劑相對疏水性之初步篩選。雖然以某些樣品 1管柱之組合可見多重峰之分離，但並未見有較喜一管柱 化學甚於他者之傾向浮現。因此可發展出梯度的Η P L C 方法。 利用極簡易的逆向鹽梯度進行疏水性交互作用管柱之 最初審閱，即由2Μ (ΝΗ4) 2504於1 0 OmM磷酸 鹽PH7 . 0至0M硫酸銨於lOOmM磷酸鹽pH 7 .0。梯度進行歷1 0倍管柱體積；所有的管柱除了 P-henyl — 5- PW管柱外均爲4 · 6x1 00毫米（ 本紙伕尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2I0X297公釐） -52 - A7 B7 五、發明説明（) 1 . 66毫升），前者爲7 . 5X75毫米（3 . 3毫升 )或更大的格式；流速爲1.0毫升/分。 {請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 首評估Synchropak經基—丙基Η I C樹脂》在單純的 梯度條件下（15分鐘由0 — 100%Β)可得eniimo-mab及聚乙二醇修飾之enlimoraab之層析圖。這些樣品依據 在SEC，SDS — PAGE及TNBS分析上之層析行 爲分類（以決定自由態胺之數目）|爲緩和至中度聚乙二 醇修飾。由HPLC SEC及非還原的SDS— P A G E組合中可估計出天然的含量範圍由少於5 %至 3 5 %。這些樣品中無一者呈現出天然的自經聚乙二醇修 飾之種類中分離的任何程度。然而在各樣品之峰形狀上有 顯著的差異。 經濟部中央樣準局—工消费合作社印装 更高度聚乙二醇修飾之樣品•也利用相同單獨的梯度 在Synchropak經基丙基管柱上層析。S P A — 2 0 k D反 應混合物樣品可解析成二個峰*天然的enlimomab及在較 長滯留時間下的一個第二峰，因此分離出較具疏水性之種 類。然而，一旦檢査此樣品之Η P L C - S E C層析譜， 此較疏水性種類代表少量極髙度聚乙二醇修飾之enlimo-mab種類*在羥丙基管柱上大部份2 0 k D經聚乙二醇修 飾之enlimomab均無法自天然的未經修飾之抗體中解析* 也經高度聚乙二醇修飾的其他二種樣品，（分別有1:5 及 1 : 1 0 之enlimontab: mPEG 比例）其 PEG 比例 增加之單一種類顯示有較長的滯留時間。然而，在這些經 高度聚乙二醇修飾之製劑中，仍無殘留的天然enl imomab 本紙張尺度適用中國國家搮準（CNS ) A4规格（210X297公釐） -53 - A7 B7 五、發明説明（51 ) 之分離。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 由緩和至中度聚乙二醇修飾之enl imoinab製劑之層析 中所得之結果可提供證據指出，天然的及經聚乙二醇修飾 的enlimomab間是可達到分離的。 在一嚐試中測試略具疏水性配體，以助天然的enli-momab自經聚乙二醇修飾之加合物中之分離。利用Synch-ropak甲基Η I C管柱重覆先前某些層析實驗》此次只進 行中度聚乙二醇修飾之enlimomab衍生物（5 : 1 w t . w t比例）之層析。此管柱配髖無法將天然抗體自其經聚 乙二醇修飾的衍生物中解析出來•即使當梯度延長3 0分 鐘亦然（相當於約2 0倍管柱體積）。以2 0倍管柱體積 梯度，可達到最佳的始自聚乙二醇修飾的enlimooiab樣品 層析譜之肩部。配體疏水性由羥丙基至甲基之逐步增加， 無法改進天然的及經聚乙二醇修飾的enUmomab間之分離 。當以如前之相同樣品測試Synchros系列中下一個配體-丙基時（其較先前配體更具疏水性）可得相似的結果。 經濟部十央標準局負工消费合作社印製
Synchrom系列中最後的烷鏈配體-戊基，也以如其他 管柱般之相似方式測試，但證明因太具疏水性因此即使在 梯度末端也無法釋出enlimomab。在此層析流程中，天然 的enl imomab抗體即使在1 0 0%B緩衝溶液下（1 〇 〇 mM磷酸鹽緩衝溶液，pH4 . 5 )也無法被溶離出來。 事實上必須使用未加鹽之水以助enUmoraab自戊基管柱之 溶離。 由於烷鏈系列中疏水性配體之逐漸增強對解析無正面 本紙浪尺度適用中國國家樣準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -54 - A7 _____B7_ 五、發明説明（52 ) 效應，因此撿視不同的化學型式，即苯基。在大小基礎上 苯基之疏水性大約如丙基一般，但在苯環間有P i - P i 交互作用之額外組份。於是進行利用BioRad Phenyl 5 — PW管柱（7 . 5x75mm毫米，3 · 3毫升管柱體積 )之梯度Η I C — HP LC方法•在苯基管柱上進行層析 梯度流程，利用標準的1 5分鐘線性逆向鹽梯度（5倍管 柱體積）及3 0分鐘梯度（10倍管柱體積）*雖然5倍 管柱體積不足以提供天然enli mom ab自經聚乙二醇修飾種 類中適度之分離，利用苯基管柱仍可證明各種樣品之異質 性。以1 0倍管柱體稹梯度時在層析解析上就有顯著的改 進，可由天然enlimomab及經聚乙二醇修飾種類之分離及 多重P E G — enlimomab加合物之解析中證知π應用苯基 配體的Η I C可解析經聚乙二醇修飾之enlimomab樣品中 的某些異質性。此管柱顯示出其自經聚乙二醇修飾之en-limomab中分出天然型式之能力潛力•由烷基配體系列變 化至苯基，提供解析經聚乙二醇修飾之enlimoinab製劑異 質性之足夠選擇性。 經濟部中央標隼局貝工消費合作社印裝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 當進行更獨特的疏水性樹脂Η I C方法時，可得更佳 的選擇性及解析。此方法應用Rainin’s Hydropore管柱， 其僅具緩和的疏水性。Hydropore管柱意外地有P E G爲 其疏水性配體。希望見於2相系（其中納有PEG)之交 互作用機制在層析分離中亦如此，且此配體之使用可使天 然蛋白質自經P E G修飾之蛋白質中分離。利用和其他利 用相同樣品之Η I C管柱中所用之相同條件下進行最初的 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -55 - j43 88 〇9_b7_ 五、發明説明（53 ) 層析流程。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 對大多數樣品而言，某些由緩和至中度聚乙二醇修飾 樣品之層析譜在滯留時間上呈現一個移動（至更大的疏水 性）：最未修飾之樣品匯集中則在天然種類中顯示出顯著 的解析，且其爲明顯的2個不同的PEG修飾種類。當此 樣品在其他Η I C管柱上測試時’則根本測不到任何分離 ，在滯留時間上相較於已鑑知之天然抗體也無任何顯著的 變化。因此在此管柱上已可達成天然enl imomab自經 P E G修飾之加合物中某程度之分離· 對於中度聚乙二醇修飾之樣品，以此層析技術在Hydropore HIC 管柱上並未測及天然的 enlimomab* 然而 •所 溶離物之滯留時間大於天然enlimoniab達2分鐘。 當利用Hydropore HIC管柱系統測試更高度聚乙二醇 修飾之樣品時*相較於天然的enlimomab，P E G衍生物 之滯留行爲有戲劇性變化•再更高度聚乙二醇修飾之en-limomab，如SCM — 5kD 1 : 10聚乙二醇修飾之 經濟部中央標準局員工消费合作社印掣 種類，滯留時間可增加3分鐘或2倍管柱體積，且和較未 修飾之樣品比較，層析峰十分陡峭。在15分鐘，10倍 管柱體積梯度中，此相當於在4 0 OmM溶離鹽上之差異 •且代表經聚乙二醇修飾之en. limomab及天然抗體間疏水 性巨大的變化。 當20kD之單一 PEG股粘附至enl imomab，相對 於5kD之多重股| SPA — 20kD反應混合物可說明 疏水性上之差異。就天然的及2 0 k D聚乙二醇修飾種類 本紙張尺度適用t國國家標準（CNS ) A4現格（210X297公釐） -56 - 14 3 6〇 U ϋ Α7 Β7 五、發明説明（54 ) 間之基線解析，殘留的未經修飾enl imomab之定量是筆直 的。2〇kD樣品之SDS - PAGE凝膠及SEC層析 譜可證實這些結果·由羥丙基管柱上先前所見之分離顯示 ，天然的 en 1 i momab及 l — 20kD PEG — enlimom-ab在疏水性上是相當的（因爲被共溶離出來），且在 10 . 29分鐘滯留時間下的第二峰爲2 — PEG衍生物 〇 既已證明Hydropore HIC管柱於各樣製劑中自經聚乙 二醇修飾之加合物中分離天然enlimomab之利用價值1於 是進行更周到的研究以決定方法之限度》製備一系列 SCM— 5000 enlimomab 衍生物，由 1 0 ·· 1 下限 略修飾比例變化至1:1上限高度修飾比例。 定量這些樣品中殘留的天然enlimomab之Hydropore Hi C結果示於表1 *依據初步範圍研究，也可偵測少至1 %及髙至4 0%之天然enl intomab水平。 ---：------ I ---I--,11 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印装 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -57 - A7 B7 五、發明説明（55 ) 表1 en1imomab對 SCM 活化之PEG之比例 天然％ (毫克/毫克） 10:1 41. 2 5:1 18.3 4:1 9.9 3:1 5.4 2:1 0.6 1:1 未測及 經濟部中央標準局負工消費合作社印裝 利用Hydropore管柱的上述Η I C分析可決定留於反 應中天然enl imomab之百分率，其爲反應混合物中P E G / enl imoniab比例之函數關係。可得S CM-5 0 0 0系 列選出之層析譜。這些層析譜說明所見層析中之變化，爲 本紙張尺度適用中國圉家揉準（CNS > A4说格（210 X 297公釐）_ π _ <請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央樣準局貝工消费合作社印装 A7 _____B7_ 五、發明説明（56 ) 天然enl imomab經聚乙二醇修飾渐增程度之函數關係。在 最不被聚乙二醇修飾之樣品中，即S CM — 5 0 0 0 1 0 : 1 ，此中留下4 1 . 2%的天然enlimomab，且可 見經聚乙二醇修飾之種類主要呈疏水性所增加之單一主峰 ，其肩部示意爲第二個聚乙二醇修飾之種類。由未還原之 SDS — PAGE可得此峰確認之認證。S CM — 5000 10:1樣品可在此SDS-PAGE中分離 成天然的enlimomab，一個主要的1 — P E G及一個次要 的2 - PEG » SCM-5000系列中的其他許多樣品 也以相同方式電泳，並在未還原的SD S - P AGE凝膠 電泳及Hydropore HIC層析間有相當的交互關係。這些結 果證明，上述的層析技術可用來決定經聚乙二醇修飾的製 劑中天然enlimomab之百分率。 目前可運用的Hydropore HI C管柱*爲1 2微米之粒 子大小或5微米之粒子大小。一般而言吾等可預期隨著粒 子大小減低之函數關係在背壓上可有所增加。此點在以小 分子爲模型之逆相HP L C系統中仍是確實的。然而，在 蛋白質分離上由於粒子大小函數關係使解析增加則更爲謹 慎。因此吾等在由1 2微米至5微米粒子之Η I C分離上 並不預期有豆大的改進，則此即爲Hydropore HIC充填物 質之例。在此於天然的enlimomab及1 一 P E G種類間之 解析可見有適度的改進·以及在個別的1-PEG | 2 — PEG，3 - PEG等種類間之分離上也有改進。一般的 趨勢是由12至5微米粒子時在峰陡峭性上有整體的增加 J-----------/ —— (請先M讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家梂準（CNS ) A4规格（2丨OX297公釐） -59 - 經濟部中央標準局貞工消费合作社印裝 A7 __B7_ 五、發明説明（57 ) ，這是由於對較小粒子大小之管柱而言理論上的平板計數 增加之故。 雖然用於發展此方法之最初實驗係在12微米粒子上 進行，而S CM — 5 0 0 0聚乙二醇修飾之系列則以5微 米粒子管柱重覆。至於例常分析的樣品，則5微米粒子管 柱可適用因爲天然的enlimomab自經聚乙二醇修飾之種類 中之分離可更加改進·此技術也可用於描繪聚乙二醇修飾 反應*以供異質性之再現及作爲穩定度之指示方法。依據 聚乙二醇修飾化學，P E G衍生物之分子量及相較於經聚 乙二醇修飾衍生物之天然蛋白質之疏水性，在許多例子中 以1 2微米粒子物質可達到這些相同的結果。即使5微米 Hydropore管柱可達到較1 2微米粒子更大的解析，以較 大的粒子在顯著較少的背景壓力下仍可達到適度的分離， 此爲依此擴大的一個重要因素。 利用此技術自經聚乙二醇修飾之種類中分出天然蛋白 質的另一個實例，利用偶合至另一抗體F a b上的A 1 d - 5 0 0 0 P E G衍生物追踪聚乙二醇一修飾作用反應 之時間流程。此反應歷2 4小時。F a b之疏水性不如 enlimomab，在7 1 4分對9 · 5 4分處溶離（1 5分 鐘之線性梯度），且有一個單一5000MW PEG粘 附上的經聚乙二醇修飾之Fab，顯著地較在9 . 70分 鐘溶離出之天然分子更具疏水性"在此例中· 1- PEG —F a b可自天然F a b中容易地分離，且當達到基線解 析時殘留的天然蛋白質可直接地定量。但由於在天然en- 本紙張尺度適用中國國家梂準（CNS ) A4规格（2[0X297公釐） n ml *1 —ϊ— 1^1 t - - - -1 (請先閩讀背面之注意事項再填寫本頁) -60 - Α7 «?43 88 Ο 9 ______Β7__ 五、發明説明（58 ) 1 imomab及聚乙二醇修飾種類間並未達到基線解析，因此 在繼績進行以按比例變化方法以用於純化前可改進原先的 梯度以企圖補正此狀況。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 以1 5分鐘線性梯度在1 2微米粒子大小之Hydrop-ore 4. 6X10 0毫米管柱上開始，其約有10倍管 柱體積，梯度並延長至3 0分鐘或約2 0倍管柱體積，再 至約6 0分鐘或4 0倍管柱體積，並以S CM-5 0 0 0 5 - 1製劑爲測試混合物。對每天多種樣品而 經濟部中央標準局負工消费合作社印11 言，以6 0分鐘梯度進行之分析方法可能並不實際，此種 梯度無法明示出改善天然enl imomab及經聚乙二醇修飾種 類間解析之簡易方法。爲在改進的解析及方法效率上取得 妥協，於是進行3 0分鐘梯度，始自5 0%B梯度並直線 變化至10 0%Β»雖然天然enl imomab自經聚乙二醇修 飾種類中之分離，幾乎和在6 0分鐘梯度中所見的一樣好 ，但3 0分鐘的流程時間較省時。以此經改進之較髙解析 方法·可再將enl imomab - P E G反應混合物分級分離成 個別的1-PEG，2 - PEG，3-PEG等種類。這 些目前均質的經聚乙二醇修飾之加合物可進行結合活性之 充份分析，利用競爭性特異E L I SA (相較於天然的 enlimomab )，利用S E C，未還原的及經還原的— P A G E及在Hydropore HIC上再層析以決定純度v 總而言之，存在於實例1粗製的mPEG — enlimo-raab混合物中之天然物質（即未經聚乙二醇修飾的）以疏 水性交互作用技術自m P E G - enl imomab製劑中移去， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐） ~ 61 - i43 88 C 9 A7 _____B7_ 五、發明説明（59 ) 且可快速特性化單株抗體en 1 imomab經聚乙二醇修飾之製 劑，並提供分析此經修飾蛋白質之一般方法*
Hydropore配體之極獨特特性，不僅可分出經聚乙二 醇修飾之enlimomab中之天然enlimomab，也可將粘附各種 聚乙二醇單位數目的個別的聚乙二醇修飾種類分級分離。 此高度解析技術可用來分出聚乙二醇修飾之enlimomab中 之天然enlimomat^以及分級分離個別的種類以進一步鑑 定。使用Hydropore在分析上可特性化聚乙二醇修飾過程 ，可定置天然的，1 — PEG，2 — PEG，3 — PEG 等種類，也可在較大規模下（多至5 0 0毫克）純化聚乙 二醇修飾之enlimomabe 經濟部中央搮準局負工消费合作社印製 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁} 頃發現高度聚乙二醇修飾之樣品，以層析譜及電泳決 定知其無殘留的天然P E G。除了可定量經聚乙二醇修飾 之樣品中之天然抗體之外，此方法也可提供聚乙二醇修飾 反應之指紋，且可用於批次間變化性測試之品質控制之用 。由於利用此方法，在使用Η P化學穩定軟髖下將可能可 決定個別峰之面積，吾等也可使用此技術追踪經聚乙二醇 修飾蛋白質之穩定性，追踪聚乙二醇修飾反應進展達一段 時間。此方法的一個重要用途是可決定製劑中殘留的未經 聚乙二醇修飾蛋白質之百分率*其最終可用於免疫原性試 驗或藥物動力研究中，在此聚乙二醇修飾作用之目的是增 加小蛋白質之半衰期或減少天然蛋白質之免疫原性。一旦 決定出聚乙二醇修飾製劑中殘留的天然蛋白質，之後可移 出聚乙二醇修飾製劑中之天然蛋白質。利用相同的Hydr- 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -62 - A7 B7 五、發明説明（6〇 ) opore HIC管柱物質也可完成此嚐試· 奮驗3 純化聚乙二醇修飾之抗—I CAM— 1抗體之製備方法 由於管柱單位之設計，因此可容易極擴大Η I C方法 ，由分析層次到製備規模層次。因此，在4·6X100 毫米管柱上展開的分析方法，可容易地轉移至2 1 . 4 X 1 0 0毫米管柱•在此於單一層析流程中可達到數百毫克 之純化。利用Hydropore 10. 〇xl 00毫米管柱可 進行最初之純化。 可在以下組份之層析系統進行大規模純化：2 Waters 5 9 0 栗，Waters 6 8 0_度控制組，及^81:-os 7 2 3多波長偵測器^利用Rheodyne 9 1 2 5六孔 注射閥注射樣品，可利用5.0或20毫升PEEK環· 經由A — D連接將層析數據收集至室內L A S >實驗室自 動化系統中。表2示出擴大之變數。 (請先閲讀背面之注項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局負工消費合作社印裝 本紙張尺度適用中國國家標準（〇^)八4規格（210>：297公釐> -63 - 五、發明説明（61 ) 腔 43 88 0 9 at __B7 表2 大小 體積 最大毫 規模 容量 (毫米） (毫升） 升/分 (毫克） 4.6X100 1.66 4.0 1.0 20 10.0X100 7. 85 15.0 4.7 100 21.4X100 36.0 6 5.5 21. 6 450 41.4X100 135 30 0.0 81 1600 .1^1 - - — ^^1 I 4*λI—- --- - 1^1-----I (請先閎讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部令央橾準局員工消费合作社印製 將等密度鹽納入，將有可能達成天然抗體及經P E G 一衍生種類間甚至更大程度之分離，此鹽安排在梯度適合 的點上》在天然enliiaomab開始溶離之梯度點處（5 0 % B緩衝溶液）這些條件可保持額外2個管柱體積，之後繼 績梯度至1 0 0%B緩衝溶液。此分離由非還原的SD S 一 PAGE示出*其中相當於天然抗體之帶目視上不可見 〇 爲純化經聚乙二醇修飾之enlimomab，由管柱過程產 生的粗製的mP E G - enl iraomab反應混合物填加至 本紙張尺度逍用中闺囷家棣準（〇奶）八4規格（210/297公釐}_64_ 腔43 88 ◦9 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 A7 ____B7______五、發明説明（62 ) HI C管柱中，於2M硫酸銨，lOOmM磷酸鹽* pH 6中，再進行由2M至0.5M硫酸銨之逐步梯度。當硫 酸銨濃度接近0 . 9M時可先溶離出天然的enlimoniab’ 且經聚乙二醇修飾之抗體衍生物在後一流份中被溶離。 眚驗4 純化經聚乙二醇修飾的enl imomab 匯集經數次流程之溶離液，並澳縮至1 5毫克/毫升 。此粗製的匯集物再填加至製備式Superdex 2 0 0大小 排阻層析管柱。所浮現的單一竟峰市以分級分離以移去二 端，前端含有高度經聚乙二醇修飾之erUimomab，且後一 尾部含略聚乙二醇修飾的及天然的enl iniomab。 於評估Η I C樹脂在純化經聚乙二醇修飾之enl imo-mab方面，應考慮預期的最終規模。理想的樹脂應呈現強 的機制完整性及化學抗阻性，有良好的蛋白質能力且可以 可應用於中至低壓純化技術及設備之型商品化，且對以實 驗室規模純化中所用的以矽膠爲基礎之物質，可提供可比 較之選擇性。 Poros HP，PH，PE，BV及ET爲聚合充填物 ，經設計可呈Perfusion Chromatography模式設計成供肽 ，蛋白質及其他生物分子之疏水性交互作用層析（Η I C )之用。充填物含有經交聯的聚乙二醇/二乙烯基苯流通 粒子，具有有專利的生物形態孔徑大小分佈，以供極快速 質量運送。粒子的表面塗佈以交聯的聚羥基化聚合物。此 —^—-i Jn- n ^^1 . -: ml I 111 in--n^i (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )人4洗格（2丨0><297公釐） -65 - A7 ____ B7_ 五、發明説明（63 ) 塗層進一步以苯基（POROS HP及PH)，苯基乙醚基 (POROS P E ) ，丁基（p〇r〇sB U )或醚基（p0R〇s E T )官能化。 雖然所有的Poros Η I C樹脂符合欲求之概論，但 仍以商品化的Poros 5 0微米粒子爲較佳》此聚合物利 用聚乙二醇修飾之enlimomab製劑測試其自經聚乙二醇修 飾之enlimomab中分離天然enlimomab之能力· 最初賁驗涉及將100微升的經聚乙二醇修飾之en-1^〇111313製劑直接注入4,6\100毫米分析級卩〇1*〇3 Ρ Ε Η I C，利用 Bi〇Cad 60 Workstation進行。使 用由2M— 5M硫酸銨（l〇〇mM磷酸鹽，pH6 . 0 背景）之單純1 0管柱體積線型逆向鹽梯度來測試Poros Ρ E樹脂之選擇性。在這些層析條件下，若觀察到多重 峰則利用BioCad workstation充份能力可達到使方法更療 完善。一般的BioCad變數表列於下表3 : HIn — J· .^1 - in - - n — I— n I n m (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標隼局員工消费合作社印製 本纸張尺度適用中國國家揉準（<：那）八4说格（2丨0/297公釐）一66-
7 7 A B 五、發明説明（64) 表3 流速（ 毫升/ 分） 速率 管線A 管線B 管線 C 管線D 10.0 3 6 0 0 1. 0M pH 6. 0 1. OM pH 8.0 水 3M (NiU)2S〇4 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央揉準爲貝工消费合作社印装
BioCad緩衝溶液以pH模式構想，以1 0 OmM磷酸 鈉，ρΗ6 . 0，2M硫酸銨爲起始條件。梯度設定程式 以由2M硫酸銨以線性方式變化至0·5Μ歷10管柱體 積11〇〇mM磷酸鹽ρΗ6.0固定地貫穿層析流程中 *層譜示出二個峰·爲單純1 〇管柱體積梯度之結果*此 證明樹脂Poros ΡΕ在分離聚乙二醇修飾之enl imomab中之 天然enlimoraab能力上之選擇性。利用此單純梯度進行多 重層析流程，並收集及分析1及2峰之流份。由分析中可 證明：1峰含有天然的enlimomab，而2峰含有經聚乙二 醇修飾之enlimoniabe發展進一步方法以改善自P E G η enlimomab加合物之組成中天然enlimomab之基線解析。 經完善化之Η I C方法涉及2個不同的梯度，其中等 密度保持步驟則定於某鹽濃度下，如此天然的未經聚乙二 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（ 210X297公釐）_ 67 _ 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 A7 ______B7_ 五、發明説明（65 ) 醇修飾之enlimomab自P E G n — enlimomab加合物中有最 佳的分離。方法包括以下步驟： 1 ·管柱平衡 2.填加樣品製劑 3 .以平衡緩衝溶液洗滌管柱 4.梯度 I 2M— 0.9M(NH4)2SO4於 5 管柱體積 5 . 0 . 9 Μ保持1 〇管柱體積 6 梯度 Π 〇.9M-〇.5M(NH4)2SO<1 於2管柱體積 7 . 0 . 5M保持5管柱體積 8 .梯度更換至平衡緩衝溶液 1 0 0微升經聚乙二醇修飾之enlimomab製劑注入P-〇1*〇3?£管柱中。在0.9.1^保持步驟中可溶離出6111丨^-omab，且可與P E G - enlimomab清楚分離，後者在 0 . 9M及〇 . 5M硫酸銨間之第二梯度中溶離。此在分 析級PorosPE 4. 6X1 00毫米管柱上發展出的更 完善方法再予以擴大以純化，並使用較大規格的Poros 20 PE管柱》 於經聚乙二醇修飾的enlimoniab擴大規模純化中，製 備更大的管柱，其中利用爲中至高壓力系統所設計之Wafer’ AP 玻璃管柱系統 ° Poros PE 2 0微米培養基可配 J,---.------X------ΪΤ <請先鬩讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家揉率（CNS > A4i^( 210X297公釐） 68 - 脬43 88 Q 9五、發明説明（66 ) A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 合BioCad或HPLC系統使用，此當以小粒子（2 0微米 )產生之背壓超過低壓系統限度時。2 · 0公分X 1 9 . 8公分床之Poros 20 PE管柱* 62毫升體積，利 用BioCad系統充填《充填緩衝溶液爲去離子化的水，流 速50毫升/分。在充填過程中背壓不超過500ps i •在此規模下方法中之基本要件保持不變，除了製備經聚 乙二醇修飾之enliraomab溶液供管柱填加。由於在管柱填 加步驟中希望儘可能捕獲較多的蛋白質，於是在填加前加 3 Μ硫酸銨至聚乙二醇修飾反應溶液中·小心加入聚乙二 醇修飾反應混合物之濃縮鹽，將可能可達到有助1 0 0% 蛋白質混合物捕獲之條件》由此點上知，本方法和上述的 小規模層析步驟相同。由6 2毫升P〇ros 2 0 ΡΕ管柱上進 行BioCad流程之層析譜顯示，enl imoinab可在最初的等密 度保持步驟中溶離，且經P E G修飾之 e η 1 i moma b加合物 在方法的第二梯度部份中呈單峰被溶離。 經溶離物質之考馬斯染色之未還原的S D S -P A G Ε凝藤顯不'少量的單—P E G — enlimomab可在 等密度保步驟中被溶離（其中係溶離出天然的enlifflomab )=也可得到含有經p E G修飾之enlimomab加合物並無 殘留的未聚乙二醇修飾之天然enl imomab之流份。因此擴 大至有Poros 20 PE樹脂之較大的管柱規模是成功的》此 規模使得相當大量的經聚乙二醇修飾的enl i m 〇 m a b可利用 BioCad或Η P L C系統製備。爲了符合大規模純化同時 依賴低壓餍析設備之額外要求，利用5 0微米粒子之Por- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格{ 2丨ΟΧ 297公釐) (請先Μ讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 ^ -69 - 經濟部中夬標準局男工消費合作社印製 iM3 88 C , A7 ___B7 _ 五、發明説明（67 ) os PE介質之擴大規模可被瞭解。 Poros PE疏水性交互作用層析介質已供應於5 0微米 模式中，其可准許在低壓系統中使用。一種Upchurch Sc-ientific's Omega系列1 0 . 0 x 1 0 0毫米管柱被充填 以7 . 8 5毫升此新的介質。利用5 0微米粒子P〇ros PE 測試針對Poros PE 20微米物質所發展之HI C方法* 因爲二種樹脂間有疏水性配體涵羞之差異因而導致某些變 化。較大的粒子似乎較不具疏水性，因爲天然的enlimo-mab在Poros 50 PE上以較在Poros 20 PE樹脂更高的硫酸 銨濃度時溶離* 爲Poros 50 PE所發展出之方法和Poros 20 PE方法相 異處僅在於溶離天然enlimomab所需之硫酸銨濃度。此變 化促使梯度及第一保持步驟有相當的變化，其係反映出溶 離enlimomab所需之硫酸錢濃度β然而和Poros 20 PE層析 比較下，這些變化結果並不會影響天然的enl imomab自經 聚乙二醇修飾之enlimomab之層析分離β表4提供在Poros PE管柱上Η I C結果之綜論。管柱在接近最大管柱壓力下 進行。 {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙伕尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4规格（210 X 297公釐） -70 - Α7 B7 把43 88 Ο 9 五、發明説明（68 ) 表4 尺寸（毫米） 4.6X100 20 X 198 16X52 體積（毫升） 1.66 62 10 流速（毫升/分） 10 50 20 線性（公分/小時） 36 0 0 950 600 應力（p s i ) 1500 900 70 粒子（微米） 20 20 50 保持步驟 條件（mS) 89 + 2 91 + 2 103 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 依據此方法，產生於溶液中之m P E G — enlimomab 利用商品化的疏水性交互作用層析（Η I C )樹脂。粗製 的m P E G— enlimomab反應混合物填加至Η I C管柱， 其並以2Μ硫酸銨1 0 OmM磷酸鹽，ρ Η 6緩衝溶液平 衡。在填加至管柱前硫酸銨濃度在聚乙二醇修飾反應混合 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2丨0X297公釐） 經濟部中央樣準局員工消費合作杜印製 ^43 88 Ο 9 Α? __Β7_五、發明説明（69 ) 物中先調整，以確保完全滯留至Poros PE疏水性交互作用 基質。進行逆向鹽梯度，當硫酸銨濃度減少至〇.9M且 此水平保持額外的10管柱體積時可先溶離出天然的en-limomab。在第二梯度步驟中，鹽濃度進一步降至0 . 5 Μ *則mP E G—enlimomab呈單一峰自管柱中溶離s 可測度經聚乙二醇修飾之enlifflomab之純度及本質， 利用包括分析級Η I C，還原的及未還原的硫酸十二酯鈉 聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS- PAGE)及大小排阻層 析之組合方法進行。非還原的考馬斯藍染色的S D S — PAGE凝膠經密度計掃描可估計出BIRR1〇各聚乙 二醇修飾種類之相對帶面積。由還原的S D S — P A G E 凝膠可對enlimoinab重及輕鏈上P E G股之位置及分佈提 供資料。 若經聚乙二醇修飾及未經聚乙二醇修飾之物質之混合 物依此地處理並進行分析級疏水性交互作用層析•則測不 到天然的未經聚乙二醇修飾的物質。 窗例5 用於抗一 I CAM - 1抗體之競爭性EL I SAs 使用二個競爭性EL I SAs來描述經聚乙二醇修飾 之抗體之特色，且評估其試管內之效力。依據由enlimo-mab確認之s I CAM — 1抗原（s I CAM — 1)爲基 礎之第一競爭性EL I SA，可用來比較各種mPEG — enlimomab衍生物與天然的（未經聚乙二醇修飾的）enn- 本紙張度適用中國國家標準（CNS ί A4規格（210Χ297公釐） __ -ί ώ - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 B7 經濟部中央標準局員工消费合作杜印製 五、發明説明（70) momab間之結合常數。微滴定盤（9 6孔洞）塗佈以1 〇 微克/毫升 s I CAM-1 於 PBS，pH7 . 1 ( 1 00微升/孔洞）之溶液。盤上的開放位置以250微 升/孔洞的1%BSA於PBS，pH7 . 1之溶液阻斷 。爲將盤之間變化性之效應減至最低，在各微滴定盤上進 行經生物素化一 enlimomab及enlimomab及'經生物素化一 enlimomab之m P E G — enlimomab間之競爭作用》經生物 素化之enlimoraab濃度保持固定在2 . 5微克/毫升。在 整個盤上 enliraomab及 m P E G — enlimomab以 1 : 3 稀釋 ，始自管柱2之80，000毫微克/毫升，終於管柱 1 2的1 . 4毫微克/毫升。經一夜培育後，洗滌盤且各 孔洞以10 0微升的1 : 5，0 0 0鏈抗生物素一辣根過 氧化酶稀釋液共培育9 0分鐘。洗滌盤，再加1 〇 〇微升 鄰位-苯二胺溶液至各孔洞以展開顏色。加1 〇 〇微克/ 孔洞2N H2S04以停止呈色，且於4 9 0毫微米下讀 取各孔洞之吸光度。利用非直線的S A S例常法分析數據 。將m P E G — enlimomab衍生物之結合常數與各盤上的 enlimomab比較，以決定相對於enlimomab，各m P E G — enlimomab衍生物之結合活性。最少進行3盤以決定各 m P E G - enlimomab衍生物之相對結合活性" 除了 s I CAM— 1爲基礎之EL I SA外，也可利 用以整個人類J Y細胞爲基礎之競爭性E L I S A。在此 分析中，可在其表面表現I CAM— 1之人類JY細胞， 於各微滴定盤上塗佈，而非塗以s I CAM - 1。競爭性 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本J) 訂 本紙張尺度適用中國國家標孳（CNS ) A4規格（210X297公釐） -73 - ^43 88 0 9 A7 ___B7 ___ 五、發明説明（71 ) 反應1呈色及數據分析基本上和上述s I CAM— 1 E L I S A相同。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) sICAM-1 ELISA估計出BIRR10之 結合抗髋親抗原性常數爲enlifflomab的2 5 %，而J Y細 胞抗體親抗原性ELI SA，代表更適合的測度，爲en-limomab的 7 0 % 0 實例6 聚乙二醇-修飾反應之特性描繪 將實例1聚乙二醇修飾反應特性加以描述以決定最佳 的反應條件。 爲檢視實例1 in P E G / enlimoma b反應之P Η依賴 性，反應在ΡΗ7 . 〇，7 . 5及8 . 0下進行·對所有 反應而言，enlifflomab的最終濃度爲1毫克/毫升， m P E G : enl imomab比例按重/重基礎計爲1 : 1，且 所有反應均在4 °C下進行。各反應中移出各份，並在1 ’ 經濟部中央標準局5工消費合作杜印製 2，3，4，5，6及24小時時中止。爲決定呈PH及 時間函數關係的enliraomab經聚乙二酵修飾之程度，所有 各份均進行考馬斯藍染色之非還原的SD S — PAGE凝 膠。由此分析頃發現m P E G/enlimomab反應在所檢視 之範圍中係強烈依賴pH值的《在ph8 . 0下，於僅2 小時後無未聚乙二醇修飾之物質可見，而在PH7.0下 即使在2 4小時後天然的物質仍可保持在反應混合物中· 選出含少或無天然物質之反應混合物以進一步分析•利用 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格Π10Χ297公釐） 7/) _ '=43 88 Ο 9 * Α7 . __Β7 _ 五、發明説明（72 ) 以s I CAM — 1爲基礎之競爭性EL I SA決定道些樣 品殘留的結合活性。這些結果示於表5中。 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 表5 反應pH值 反應時間 相對於enlimom- (小時） ab之結合％ 7 24 20¾ 7.5 4 11¾ 7. 5 5 9% 7. 5 6 7% 7.5 24 2% 8.0 1 12¾ 8. 0 2 3¾ 8.0 3 0% 本紙張尺度適用中國國家樣隼（CNS ) A4規格（2丨Ο X 297公釐）_ 75 _ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 ____B7_ 五、發明説明（73 ) 爲檢視共軛反應中m P EG對enl imomab重量對重量 比例之效應，進行6種不同反應，其中mPEG :enlira-omab之比例由2 : 1變化至1 : 5 °各反應中enlimomab 之最終濃度爲1毫克/毫升。所有的反應均在ΡΗ7.0 ，4°C下進行2 4小時*各反應以非還原的SDS — P A G E分析。選出含少或無天然物質之樣品以進一步分 析。利用以s I CAM— 1爲基礎之競爭性EL I SA決 定這些樣品之殘留結合活性•這些結果示於表6中。 表6 mPEG：en1i momab 反應時間 相對於en 1 i mom- (小時） ab之結合Λ 1:1 24 14% 2:1 24 1% 經濟部中央棵準局貝工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 由上述結果選出以下反應條件以產生經聚乙二醇修飾 的enl imomab，利用溶液爲基礎的修飾步驟：PH7 . 0 ，4°C，mP EG : enlimomab 1 : 1 ，及 2 4 小時的 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐） -76 - 陷43 88 〇 9 47 A7 _______B7 五、發明説明（74 ) 反應時間。利用這些反應條件可擴大過程以產生較大量物 質。以此方式修飾的enlimoraab含有平均2 — 1 0個聚乙 二醇加合物。 參考引入聚乙二醇修飾作用的管柱方法，s I CAM 一 1以約9 0 — 9 8 %之效率偶合至Emphaze樹脂，係利 用BCA方法定量樹脂洗液中未結合的s I CAM—1而 決定的*此相當於各毫升泡脹的樹脂中的約有1 9毫克共 價結合的s I C AM — 1。決定出enlimomab對 s I CAM - 1親和力樹脂之結合能力爲pH之函數關係 «結果示於表7 »這些數據顯示在受檢之P Η範圍內，各 毫升的s I CAM — 1 Emphaze樹脂有約8毫克enlirao-mab之結合能力。 (ti先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部十央揉準局員工消费合作社印製 本紙張尺度適用中國國家揉芈（CNS ) A4規格（210X297公釐）_ 77 - 五、發明説明（75 ) 表7 平衡pH值 結合的en 1 imom- 毫克 e η 1 i m o m a b / ab總毫克數 毫升凝膠 6. 0 43 8. 6 7. 0 44 8.8 8.0 41 8.2 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 在單一 s I CAM— 1親和力管柱上進行8個聚乙二 醇修飾作用流程，以評估方法之再現性。由各流程所得之 S D S — PAGE成帶型式相當具再現性，且各反應可產 生具相似聚乙二醇修飾程度之mP E G — enl imomab共軛 物（即平均5PEG 5kD加合物）。對各聚乙二醇修 飾流程而言，收集頃加相中間突破之en 1 imomab *及經聚 乙二醇修飾反應後自管柱溶離出之物質。這些物質予以定 量，並對各樣品決定分析級S E C滯留時間。於表8中可 見，以分析級大小排阻層析（S E C )所得之流程間之滯 留時間是極可再現的（<1%RSD)，顯示管柱式聚乙 二醇一修飾過程是可再現的。於表8中，表示突破 ;•表示溶離；、ND〃表示未進行· 本紙張尺度適用中國囷家標準（CNS)A4規格（ 210X297公釐> -78 - 經濟部中央標準局員工消費合作杜印裂 暇 4388 09 A7 ____B7 五、發明説明（76 ) 回收率 毫克 回收率 時間（分） SEC滯留 變數 m 00 Μ td C*1 03 CO <0· 5 o A, 〇 CO CO 00 私 g — 流程數 CO CO 私 1 35. 3 CD 00 05 g to CJ1 33. 6 bo CD —a CO a> o 30. 6 to CO —a CO ·—* oo CO CD 〇〇 ΓΌ CO cn 〇〇 CO —3 ΓΟ 11.82 CJ1 CjO 27. 7 CO -a 11. 82 1_ CD σ> CO 27. 2 CO CO 私 11. 82 CJ1 CO CO CO σΐ o 00 03 CO OT — μ-k 00 03 oo —Jin ί-I--- · r ——!---- :, 丁 •τ (請先鬩讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4洗格（210X297公釐） 79 r P8
Q A7 B7 經濟部中央標率局負工消费合作社印製 五、發明説明（77 ) 實例7 可溶性I CAM - 1管柱之阻斷 在聚乙二醇反應中的主要反應物爲enlimomab上之賴 胺酸。也可能s I C AM - 1部份偶合至Emphaze基質之 疑似賴胺酸可被聚乙二醇修飾’因此使此分子無法正確地 結合至enl imomab。爲了將此潛在的問題減至最小’於是 發展步驟阻斷賴胺酸殘基。於此一阻斷步驟中使用以下試 劑：D L —甘油醛，磺基一 N —羥基琥珀醯亞胺一醋酸酯 及琥珀酐。 如實例1所述製備s I CAM-1- Emphaze管柱。 管柱進一步以PH6 0調和緩衝溶液（5 0mM磷酸鈉 -1 〇 〇 m M NaCj?)平衡。再製備 500mM DL-甘油醛，100mM氣基氫硼化鈉於pH6.0調 和緩衝溶液，並混合渦旋數分鐘。再加氰基氫硼化鈉（ 1 5 7毫克）並混合渦旋約3 0秒。白色溶液仍含有相當 大量未溶解的甘油醛，置於上下倒轉之混合器內，並令其 再混合15分鐘。此培育後將溶液澄明化。少量留下的不 溶白色粒子再將溶液經過3 0毫升注射器，其上裝配以 0 . 2微米Gelman Acrodisc( 2 5毫米）由過減注入新 鮮容器內而移去。 - 此阻斷溶液再弓丨入s I C AM — 1 Emphaze管柱（ 5毫升管柱體稹），流速爲12毫升/分鐘。當已填入 1 0毫升且1 5毫升留於填料管時，將管柱出口置入填料 管內以關閉環線。令溶液在室溫下於此構造內循環2小時 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 表紙張尺度適用中囷囷家標率（CMS ) Μ規格（210X 297公董） -80 — Α7 Β7 經濟部中央標隼局員工消費合作社印裝 五、發明説明（78 ) 9 2小時後*出口移出以丟棄且管柱以5倍管柱體稹之 pH 6 , 0調和緩衝溶液洗滌。在此點時，管柱即可用於 製備經聚乙二醇修飾之抗一 I CAM— 1 *未經阻斷之 s I C A Μ — 1管柱結合enlimomab之能力隨繼續使用而 降低•（匾1)利用上述步驟•結合enlimomab之能力大 大增加可歷2 0個管柱循環* 官例B 另一抗—ICAM—1 抗體（RR1/1 . 1 . 1)之聚 乙二醇修飾作用 爲了證明上述聚乙二醇修飾作用方法之一般性，利用 enlimomab以外的抗-I CAM-1抗體進行此修飾作用 。因此於實例1所述之溶液及管柱聚乙二醇修飾方法中使 用命名爲RR/1 . 1 . 1之抗-I CAM-1抗體》利 用於這些實驗中之聚乙二醇爲SPA — 5 0 0 0MW衍生 物。溶液及管柱反應如實例1所述。此寅驗結果示於表9 中 β (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -81 - 經濟部中央標準局員工消f合作社印裝 A7 B7 五、發明説明（79 ) 表9 形成PEG-加合物之溶液方法 RP1/1.1.1：PEG 5000 比例 反應 pH 時間 PEG修飾 平均程度 sICAM-1 分析 中之活性 1:1 1小時 6.0 1 未進行 1:1 I小時 7.5 1 78¾ 1:1 1小時 8,0 2 58¾ 1:1 1小時8.5 3 56¾ 1:1 24小時7.5 2 未進行 1:2 24小時7.5 4 31% 1:3 24小時7.5 6 21% 1:4 24小時7.5 6 0% 1:2 4小時 7.5 4 28¾ 1:2 24小時7.5 4 36¾ 形成PEG-加合物之管柱方法 1:1 7. 5 5 39¾ <請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -82 - *4388 09 at _____B7_ 五、發明説明（8〇 ) 賨例9 經聚乙二醇修飾之抗一 I CAM— 1抗體抑制淋巴細胞同 型凝集作用之能力 實例1之聚乙二醇修飾反應可生成經聚乙二醇修飾之 enlimomab衍生物，其以E L· I SA決定可結合至 s I CAM— 1。試管內淋巴細胞凝集作用研究經了解可 鑑定出經聚乙二醇修飾之衍生物，由其抑制淋巴細胞同型 凝集之能力可證明仍保有抗一 I CAM— 1功能。 經濟部中央梯準局男工消费合作社印製 (讀先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 在此分析中所用的可表現I CAM— 1及LFA— 1 之 J Y B —細胞株（Terhost，C.T. et al.，Proc· N-atl. Acad. Sci. USA 73:9 1 0 ( 1 976 ))維持在完全培養 基中，其中含有RPMI 1640培養基（Sigma, St. Louis, M0)並添加有10%胚牛血清（FBS)及50 微克/毫升健大霉素*自cynomolgus及鼠猴中培養T細胞 母細胞。血液收集於肝素中，再以f i c ο 1 1 - h y p a q u e梯度分 離（Pharmacia, Sweden)分離出白血球"細胞在含有添 加5 0微克/毫升健大霉素之1 0%FB S — RPMI 1640之培養基中培養13天。 經培養的細胞以RPMI 1640洗二次•再以 1 0β細胞/毫升濃度懸浮於加有FBS之RPMI 1 6 4 0中。在平底的9 6孔洞微滴定盤（Costar #3596 ,Cambridge, ΜΑ)中加入10 0微升經適當稀釋之抗體 或充作對照組之100微升加有FBS之RPMI ，之後 加入1 0 0微升濃度爲1 0β細胞/毫升於加有FB S之 本纸浪尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2丨0X297公釐） -83 - ^43 88 〇 9 Α7 經濟部中央樣準局貝工消費合作社印製 _Β7_五、發明説明（Μ ) RPMI 1640之細胞•在需活化之孔洞中’加入 2.7X10 _5M phorbol l 2 -肉豆蔻酸酯 B -醋 酸酯（PMA) ·此可生成1 _ 4xl_5PMA及lx 1 05細胞/孔洞之終濃度。盤並在3 7 °C下培育。含有 J Y細胞之盤培育1小時’而含有猴子T細胞者則培育4 小時•利用1 0 0 X放大倍數之光學顯微鏡訐數凝集作用 *在單一孔洞中盲目地進行計數。enlimomab受試之終澳 度介於0·1至500微克/毫升之間*以〇及5+間之 計數評定凝集程度。〇之記分表示群集中基本上並無細胞 ;1 +表示凝集團中的細胞少於1 〇% : 2+表示少於 5 0% ; 3 +表示多達1 0 〇%的細胞在小的且鬆散的群 集中；4 +表示多達1 〇 〇%細胞凝集在較大的群集中： 且十5表示1 0 0%細胞在大的且緊密的群集中。 由決定個別的I C 30可功能上描繪由LFA — 1/ I CAM — 1粘著交互作用所調介之同型凝集之抑制作用 之特性（即，5 0%凝集作用被抑制時之濃度）β天然的 exl imomab及各種經聚乙二醇修飾f?生物間比較的結果示 於表1 0中 (诗先Μ讀背面之注意事項再填寫本頁> 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -84 - A7 B7 五、發明説明（82 ) 經濟部中央標準局員工消费合作社印繁 表10 實驗系列I 以溶液爲基礎之修飾作用 IC5〇微克/毫升 en 1 i momab 0.2 毫克 enl imomab:毫克 PEG 1:1 0.2 1:2 3. 0 1:3 1.5 1:4 <0.1 10:1 0. 4 實驗系列π 以溶液爲基礎的修飾作用 IC5。微克/毫升 enliraomab 1. 5 毫克 enlimomab:毫克 PEG 4:1 6. 0 10:1 1.5 20:1 0.8 50:1 0.8 100:1 1.5 (请先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
1T 本紙張尺度通用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -85 - A7 經濟部中央揉準局—工消资合作社印製 B7 、發明説明（83 ) 表10績 實驗系列m 以溶液爲基礎的修飾作用 IC5。微克/毫升 enlimomab 0.1 毫克 enlimomab:毫克 PEG 時間 10:1 30分 0.8 10:1 1小時 0. 4 10:1 2小時 0.4 20:1 30分 0.2 20:1 1小時 0.4 20:1 2小時 0.4 4:1 1 5分 3. 0 實驗系列IV IC5。微克/毫升 以管柱爲基礎之修飾作用 enlimomab 0. 6 BIRR10 0.2 如表1 0中所示，B i RR1 0在B —細胞同型JY 凝集作用中之I C5。約0 . 2微克/毫升。頃發現經聚乙 二醇修飾之enlimomab I C50在不同的聚乙二醇修飾過 各紙張尺度適用中國國家梯準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先鬩讀背面之注意事項再填寫本頁)
,1T -86 A7 B7 五、發明説明（84 ) 程中有異。許多經聚乙二醇修飾之衍生物（包括 B I RR1 〇)保有相當於天然鼠類enl imomab之I C s。 Q 測試經聚乙二醇修飾之enlimomab衍生物與猴子T細 胞母細胞結合之能力，及由此抑制由ΡΜΑ活化作用所誘 生之同型凝集作用> 1 9 24 — 1 1 (聚乙二醇修飾於溶 液中）及Β I RR1 〇聚乙二醇修飾於s I CAM_1管 柱）均可抑制鼠猴T細胞母細胞以及天然的enlimomab抗 體在受試濃度下（1 0 . 0微克/毫升）之凝集作用。再 者，B I RR 1 〇 可抑制 Cynomo lgus猴子T細胞母細胞以 及天然enliaomab之凝集作用（表11)。表11示出同 型凝集作用之程度•利用1 0微克/毫升所示之抗體。經 溶液聚乙二醇修飾之enlimomab平均有2 — 3個P E G加 合物。經管柱聚乙二醇修飾之enlimomab平均有5個 P E G加合物。 (請先閲讀背面之注$項再填寫本頁) 訂 -1 經濟部中央標隼局員工消费合作杜印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4洗格（2丨〇><297公釐） 843 88 Ο 9 五、發明説明（85 ) 表1 1 抗體 PEG/ 抗體 鼠猴 1 2 Cynomo 1 gus 猴 1 1 無抗體 (對照組） - 3.0 + 3.0 + 4.0 + 4.0 + en1i momab 0 1.0 + 0.0 + 2. 0 + 3.0 + 經溶液PEG-修飾 的 en 1 imomab 2-3 1. 0 + 1.0 + 4. 0 + 4.0 + 經管柱PEG-修飾 的 enl imomab (BIRR10) 5 0.5 + 1.5 + 3. 0 + 3. 0 + 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 啻例1 〇 經聚乙二醇修飾的抗_ I CAM- 1抗體之F CR結合特 性 可與I gG Fc區結合的特異的受體（*FcR# 本紙張尺度適用中國國家搮考（CMS ) A4規格（21^297公釐) ~ (請先閣讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 ίj ί 3 8 6 C 9 經濟部中央標準扃員工消費合作社印袈 Α7 _Β7____五、發明説明（86 ) )存在於免疫系統中許多細胞型式的表面上。髙親和力 FcR (FcRl ，CD64)存在於巨噬細胞及經活化 的·多形核白血球（Anderson, C. L· et al., Immunol. Today 7:264 (1986); Lynch, R. G., et al.,. Molec. Immunol. 27:1167 (1990); Shen, L., et al.,. 1987. J · Innaunol· 1 39 : 534 ( 1 987 ))。低親和力的 F c R ( FcRn，CD32)存在於巨噬細胞，B細胞，乃嗜中 性球（1，P e t r ο n i, K C. e t a 1.，J. I m m u η ο 1. 1 4 0 : 3467(1988); Ben t i η, J. et a 1., Cell Immunol. 13 2： 339 ( 1 99 1 )) ·雖然經凝集的及抗原一絡合的IgG可與 二型FcR均充份結合，但人類及老鼠IgG不同的同型 以不同的結合親和力結合至FcRl及1^〇1^11(1?3 7-etch, J . V. et al., Annu. Rev. Immunol. 9：457 ( 1991)) 。F c R之主要功能似乎在調控免疫反應，如在 巨噬細胞中免疫複合物之中和作用及降解作用，及在B細 胞中抗體反應之負面調控（1?&761：(：11,>1.¥,6七31.，人11-nu. Rev. Immunol. 9:457 (1991)) 0 抗體呈治療劑投予時可與活體內之F c R結合且在免 疫系統中呈現獨特的狀況，此係當抗體之標的抗原是單核 球或淋巴細胞表面上之分子時。若治療性抗體之單株抗體 特異性（其結合至F c R陽性細胞）是直接拮抗淋巴細胞 ，則淋巴細胞及F c R陽性細胞間之交聯會造成細胞活化 及有害的副作用（Krutmann, J. et al.，J. Immunol. 1 4 5:1 33 7 ( 1 9 9 0 ); Thistlethwaite, J. R. et a 1., Am. (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 本紙張尺度適用中國國家梯準{ CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 89 - 經濟部中央操隼局員工消費合作社印裝 A7 B7五、發明説明（87) J . Kidney Dis，11:112 (1988)) ·在可結合 F c R 1 及 FcRll 之區域—CH2 區域（ffoof，J· M_，etal .,Mol. Immunol. 21:523 (1984); Duncan, A. R. et al .，Nature 332: 56 3 ( 1 9 88 )〕中引入點突變頃發現可 降低抗體對F cR之親和力（Alegre, M.-L· et al., J. Immunol. 146:3461 (1992); Angal, S. et al., Mol. Immunol. 30:105 (1993))。這些F cR結合特性上之變 化已證明可顯著地降低抗體在試管內細胞活化作用上之非 特異效應（Alegre, M.-L. et a 1.，J. Immunol. 146: 346 1 ( 1 992))也會改變抗體之活髖內特性（Angal, S. et al., Mol, Immunol. 30:1 05 ( 1 993 ))。因此希望可 檢視已評估可作爲治療劑之抗體之F c R結合特性。 F c R結合典型上可在玫瑰花型分析中測知（Frit-sche, R. et al., J. Immunol. 121:471-478 (1978)) 。於玫瑰花型分析中，抗體塗佈至固定的紅血球（E )上 ，且經塗佈的E結合F cR I及/或F c Rn陽性細胞之 能力·藉由計數形成玫瑰花型細胞之數目而測知（細胞上 結合有3個以上經塗佈之E)。塗佈在E上的抗體基本上 是凝集成群的，雖然此可消除區別FcRI及FcRn結 合之能力，使用可差別地表現F c R I及F c R Π以及可 阻斷F c R抗體之細胞族群|將可將F c結合特性歸於 F c R I或F c R Π。於此研究中，使用玫瑰花型分析法 以比較B I RR1 〇 (經聚乙二醇修飾之抗一I CAM-1抗體）F c R結合特性與親代抗一 I CAM抗體，即e- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) - 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局負工消费合作社印装 A7 __B7__ 五、發明説明（S8 ) nlimomab之結合特性。 因此，爲偵測F c R結合，細胞計數，洗一次並以1 X107/毫升再懸浮於RPMI 1640-10% F C S中》玫瑰成型管依所述建立（Yodoi, J. et al., J. Immunol. 1 2:25 77 ( 1 9 79 ))於圃底聚丙烯培養管中’ 其中含有6微升，F C S，1 5微升經塗覆且固定的牛紅 血球（E。）（2%溶液），15微升RPMI -1 640 · 10mM HEPES，pH7.3’15 微 升HBSS，15微升1X107/毫升細胞（1 · 5x 105細胞在各管中包括有終濃度50微克/毫升之 enlimomab之 F(ab )2 * 以避免爲抗—ICAM — 1敏感化之E。與淋巴細胞/單核細胞表面上之Ϊ CAM 一 1之非特異的結合*後者充作指示細胞。在某些樣品中 ，加入15微升抗-FcRI (0 · 1毫克/毫升）以取 代HB S S並與細胞預培育1 0分鐘，再加入經敏化的 E 〇 。加入所有的組份後，管在低速下快速渦旋’在3 7 °C下培育1 〇分鐘，在低速下快速渦旋，在700 r pm 下離心7分鐘（G S — 6 K R離心機，Beckman )，置冰 上再於冷處培育一夜。 於塗佈紅血球細胞時|牛血得自Colorado Serura Co. ,Denver, CO. *紅血球如所述固定並貯於D — P B S中 呈 8% 溶液（Fritsche, R. etal., J. Immunol. 121-471-478 (1978))。經固定的牛紅血球（E。）以新鮮製 備的0 · 1M醋酸鈉，pH5 . 0 (醋酸鹽緩衝溶液）洗 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4規格（2!〇X：2W公釐） ~ 經濟部中央標隼局貝工消費合作社印製 A7 _______B7_五、發明説明（89 ) 一次，並再懸浮至4%溶液於醋酸鹽緩衝溶液中》爲塗佈 E。，於醋酸鹽緩衝溶液中之250微升經洗過之Εβ加 至2 5 0微升蛋白質溶液（1 0 0微克於等體稹的醋酸鹽 緩衝溶液及硼酸鹽緩衝之食鹽水（BBS))，於圓底的 聚丙烯小瓶內，再於室溫下旋轉2小時。經敏化的E。以 冷的Hank's平衡鹽溶液（HBSS)洗3次，並再懸浮 + 至118 5 5中呈2%終濃度（？1'^3(：116，1?.6丈&1.，11. Immunol. 121:47卜478 (1978))。 爲計數玫瑰花型，新鮮製備染料溶液並含有0.4毫 升 HBSS，0 . 1 毫升 FCS，0 . 2 5 毫升 0 . 2% 甲苯胺藍於D - PBS。爲計數，於是將成玫瑰花型之樣 品自冰中移出再於二手中推移1 7次，移出2 0微升再加 至9 . 2微升染料溶液於圓底培養管中•樣品以吸量管尖 混合3次並轉移至血球計數器上•一旦細胞沈降，至少可 計數共300個淋巴細胞/單核球（藍），且當存在至少 3個粘附上之E。時可計數玫瑰花型數目•忽略團塊。計 算所計數之總細胞中成玫瑰花型細胞之百分比（Angal, S e t a 1. , Μ ο 1. I m m u η ο 1 ‘ 3 0 : 1 0 5 1 3 ( 1 9 9 3 ))。 於第一個實驗中·自周邊血液單核細胞中分離CD出 9+細胞（B細胞）及CD14+細胞（單核球）。周邊 血液係以靜脈穿刺收集自2或3位志願者再收集於有肝素 之真空管內。以梯度沈積法分離周邊血’液單核細胞，依廠 商指示以 Ficoll-Paque (Pharmacia)進行。C D 1 9 + 細 胞依廠商指示（Dynal)利用Dynabead細胞分離步驟分離 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 •^ 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -92 - 經濟部中央橾隼局—工消费合作社印製 HS4388 09 A7 ____B7_五、發明説明（g〇 ) *周邊血液單核細胞與Dynabeads M-450 Pan-B(塗佈有 抗一CD 1 9之磁性珠粒）共培育，利用Dynal MPC磁鐵 分離，洗滌，再利用DETACH (—種BEAD— 1 9抗血清）依 廠商指示自Dynabeads中釋出* CD 1 4 +細胞利用塗佈 有抗—CD 1 4之磁性珠粒（AMAC)如廠商指示地分 離。CD 1 9 — ，CD3 -耗盡之細胞分離成無磁性流份 ，利用不與 Dynabeads M-450 Pan-B (抗一CD 1 9 )結 合之細胞，依廠商指示利用ΑΜΑ C磁性分離產物進行》 A M A C 1 0 beads -抗老鼠1 g G則塗佈以抗一 CD3 (AMAC) »CD19-細胞與塗佈有抗一 CD3之珠粒培育，再移出CD3 +細胞。進行二輪陰性 篩選以生成CD 19 — CD 3 -耗盡的細胞。 細胞以冷的F A C S緩衝溶液洗一次（〇111&6(^〇’3磷 酸鹽緩衝的食鹽水CD-PBS) ，2%BSA，0.2 %疊氮化鈉），再懸浮於每樣品各50微升的FACS緩 衝溶液中（1 . 0 — 0 . 5X105細胞/樣品），並塗 佈在-底之9 6孔洞聚苯乙二醇盤孔洞中（Dynate ch Laboratories, 00 1 - 0 1 0-2 7 0 1 )。所有的染色步驟均 在冰上進行。如下述將第一步驟抗體加於1 0 0微升 F A C S緩衝溶液中。細胞以多管式吸量管混合，再於冰 上培育1小時· 抗 FcRI ( C D 6 4 )(純系 10 . 1 ，老鼠 I g G 1 )購自 Research Diagnostics, Inc. (RDI-CBL491)並以1 〇微克/毫升之終濃度使用。含有抗體之 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本I) 訂 味 本紙浪尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐} f. A 3 SB Ο 9 經濟部中央標準扃員工消费合作社印製 A7 £7___五、發明説明（91 ) 培養物上清液以1 : 2抗一 FcRDI (CD1 6)之最終 稀釋倍數（純系CLB-149，老鼠IgG2a)使用 ，其購自 R e s e a r c h D i a g η 〇 s t i c s，I n c. (C L B - C D1 6，1 〇 t #1389-0 4- 01)並以1 0微克/毫升之終濃度使用°抗體 enlimomab (老鼠I gG2 a )使用自5毫克/毫升貯液 ，終濃度爲20微克/毫升。抗體RPC — 5 (老鼠 I g G 2 a )購自 Cappel (Organon Teknika Corp.)並 以2 0微克/毫升終澳度充作同型對照用抗體》可產生 U7 . 6抗體之細胞（老鼠IgGl抗一 TNP)於無血 清之培養基中生長，並如Hardy, R. R.所述地純化（In: Handbook of Experimental Immunology. D. M. Weir, ed . Blackwell Scientific Publications, Cambridge, MA, p. 1 3. ( 1 986)) · ϋ 7 _ 6 以 1 0 微克 / 毫升之終 濃度充作同型對照甩抗髖* 於表面表型分析上CD 1 9 +細胞之數目不夠。染色 周邊血液單核細胞以爲表面標幟顯示，如所預期的’淋巴 細胞族群爲FcRI- ，FcRD+ (表12) * CD 1 4 +細胞於染色後可與抗一 CD 1 4磁性珠再凝集 ，並於分析前過濾* 使用流體細胞計數來分析細胞族群。細胞以5 0微升 經過濾的（0 . 2微米）牛胚血清（FCS)舖於各樣品 下，再於1 600 r pm下離心6分鐘（GS-6KR離 心機，Beckman)而洗滌•以吸取取出上清液培養基’再 將二步驟染色試劑，R —藻紅蛋白共軛之經親和力純化的 本纸張尺度適用中國國家揉準（CNS )八4規格（210X29?公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 蟓 -94 -
經濟部中央標準局貝工消费合作社印«. A7 ____B7_五、發明説明（92 ) 山羊F (ab >) 2抗一老鼠I gG，人類I gG吸收之 (TAGO，4950 (Biosource International))，加入 100微升FACS緩衝溶液中（1/1 〇〇稀釋）^細 胞以多管式吸量管再懸浮，並培育在冰上暗處1小時。 細胞底下舖以5 0微升經過濾的F C S，再以 1 6 0 0 r pm離心6分鐘而洗滌·一旦吸取上清液培養 基後，細胞以D — PBS，〇 . 2%曼氮化鈉洗一次，並 固定於D — PBS，1%伸甲醛（〇 . 5毫升）中》樣品 貯於4°C下之暗處，再行流體細胞計數分析（FACSCAN, Beckton-Dickenson) · 由流體細胞計數顯示，留下之族群主要爲F c R Γ及 F c R Π呈陰性之淋巴細胞。此和T淋巴細胞符合，且有 低的玫瑰花型細胞形成百分率（見下）。未分離的周邊血 液單核細胞族群之流體細胞計數分析顯示，單核細胞清楚 地是FcRI +及FCRDI+ ，如所預期一般（表12) •於表1 2中，所報告的數據爲經染色的未分離周邊血液 單核細胞之表面表型，由向前及側掃描分析成二個族群（ 淋巴細胞及單核球）：說明：-，所有細胞之表面標幟均 呈陰性：，所有細胞之表面標幟爲弱陽性：+ +，所有 細胞之表面標幟爲強烈陽性*當部份細胞族群爲陽性時， 示出其百分率。F c Rm陽性之淋巴細胞呈2個族群，表 現低的及髙的F c RIE水平。百分率反映二陽性族群* (诗先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 噪 本紙張尺度適用中國K家揉準（CNS ) A4規格（210X29?公釐） j/13 SB Q 9五、發明説明（93 ) —--- 表12 實驗1 實驗2 表面標様 淋巴細胞 單核球 淋巴細胞 單核球 FcRI - + + - + + FcR H 13¾ + + + 12.5¾ ++ + FcRIH 13% + 13¾ + 20% + 15« + ICAM-l + + + + + (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央棵準局貝工消費合作社印装 結果建議，和enl imomab比較下B I R R 1 〇與 F cR I及F cRII之結合呈現較低比例。 由'CD 1 4 + 細胞所形成的玫瑰花型百分率也低 ，因爲此族群之細胞可分析者爲淋巴細胞。爲支持 CD1 9 +及CD1 4 +族群相似的表型分析，在二族群 上成玫瑰花型之結果是相似的^ E〇塗佈以enlimomab， 嵌合的IgG，老鼠IgG2a’人類IgGi ，或人類 I gG4可形成相似的成玫瑰花型百分率（4 7 ‘ 5% 土 本紙張尺度遥用中國國家揉準（cm ) A4规格（210X 297公釐） 經濟部中央橾準局貝工消费合作社印製 143 Sc ； ^ A7 _B7_五、發明説明（94 ) 4 . 9)。塗佈GSA之E。其背景成玫瑰花型值爲 23 9%。塗佈以經聚乙二醇修飾之抗一1 CAM — 1 (BIRRl〇)2E。，其成玫瑰花型之百分率明顯較 受試的E〇爲低（29 . 2%及35 6%)。 於第二實驗中，自周邊血液單核細胞中分離出 CD19+細胞（B細胞）及CD19- ，CD3-耗盡 的細胞（單核細胞）。其用於表面表型分析之CD19+ 細胞數目不夠多。針對表面標幟對周邊血液單核細胞胞染 色再次顯示，淋巴細胞族群爲FcRI- ，FcRn+ ( 表12) *CD19 - ，CD3-耗盡之細胞有42%單 核球，此和未分離之周邊血液單核細胞族群之3 1 %單核 球可比較之。因此以CD1 9 +及CD3 +細胞之磁性珠 粒耗盡方式加璺單核球並不充份*對未分離之周邊血液單 核細胞族群行流體細胞計數再次顯示，單核球族群清楚的 是FcRI及FcRlI+ ，如所預期的（表12)。 CD1 9 +及CD1 9 —，CD3 —耗盡細胞對E〇 之結合結果和第一實驗中所得的相似。塗佈以經聚乙二醇 修飾之抗一 I CAM—1抗體（B IRR10)之E。其 成玫瑰花型之百分率（分別爲25.3%及21.3%) 較在CD1 9 +細胞上受試的其他E〇還低（3 1 . 7% ±3 1) ·雖然加豐CD19 —，CD3 —耗盡細胞中 之單核球，且族群更類似未分離的周邊血液單核細胞，成 玫瑰花型結果和在CD 1 9 +細胞上的相似。除了不相關 的I g G 4例外之外，塗佈以經聚乙二醇修飾的抗一 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210><297公釐） 經濟部中央橾準局貞工消费合作社印製 粑Λ一…五、發明説明（95 ) ICAM-1(BIRR10)之E。，其成玫瑰花型百 分率（分別爲25.5%及21.6%)較在CD19-，CD3 -耗盡的細胞上測試之E〇還低（35 . 6% 土 2 · 2) »當在成玫瑰花型分析中（以嵌合的I gG:進 行）納入抗- F c R1 ，則成玫瑰花型之百分率會降低（ 分別爲24.2%及25.0%)至BIRR10中所見 之水平。此顯示由CD19 — CD3 —耗盡之細胞所形成 之玫瑰花型，大部份反映出以抗體塗佈之E。與F c R 1 之結合* 上述結果顯示，經聚乙二醇修飾之抗一〗 1 抗體（B I R R 1 0 )塗佈在固定的牛紅血球上，其與 C D 1 9 + ( B )細胞之結合會降低，就較enlimomab及 嵌合的I gGl而言》於第一實驗中，來自表型分析之結 論是此反映出與F C.R Π之結合降低。 經聚乙二醇修飾之抗一 I CAM— 1抗體（ B I RR1 0)塗佈在届定的牛紅血球上，與CD1 9_ ，CD3 -耗盡之細胞（單核球有所加豐的）之結合也呈 現降低現象•將CD19— ，CD3-耗盡之細胞與抗一 F cR I預培育可顯著地降低與嵌合型I gGl之結合。 此顯示於第二實驗中，即有B I RR 1 0塗佈之牛血紅球 與CD 19 — ，CD3 —牦盡細胞降低之結合反映出與 F c R I也是降低之結合。這些結果和當利用經凝集之 I gG (經塗佈之紅血球）在髙親和力F cR I存在下無 法區別與F c R Π之結合是一致的。可預期在所使用之成 A7 B7 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS ) Α4规格（210X297公釐） -98 - 1Β43 88 〇 9 Β7 經濟部中央橾牟局貝工消費合作杜印装 五、 發明説明 (96 ) 1 1 玫 瑰 花型 條 件 下 * F C R ί結合是占 優 勢的·結果顯示 1 | Ρ Ε G與 B I R R 1 0 之 粘著可降低 F C之結合。 1 1 I 請 | 直 例 11 先 閱 1 | 讀 1 4 兔 子 免疫 原 性 研 究 背 面 之 1 ! 爲測 試 不 同 的 聚 乙 二 醇修飾過程 > 於是進行兔子免疫 意 1 I 事 1 原 性 實驗 4 設 計 試 Β6Δ. 願 以 評 估enlimomab分子及其衍生物之 項 再 1 f 1 免 疫 原性 其 中 利 用 劑 量 療程及投藥 路 徑似乎可產生免疫 本 t 1 反 ITftf Μ 之狀 況 Λ 只 1 1 1 針對 每 抗 原 使 用 來 自目前許可 的 S P F賣方任一性 I 1 別 的 4隻 N e W Zeal an d白兔*依據ACUC Standard Method 1 1 #91- 0 1-D 〇 投 予 麻 醉 藥 — acepromaz i ne (1毫克/公斤） 訂 1 皮 下 ，2 0 分 鐘 後 再 收 集 血清。每週 注 入1毫克/公斤無 1 I 菌 的 抗體 調 和 物 ( 每 蛋 白 質濃度下） 腹 膜內或靜脈內共歷 1 | 4 週 以使得 兔 子 對 鼠 抗 體 敏感*在抗 體 各次注入前及最後 I 1 % 免疫 接種 後 2 週 白 耳 中 央動脈內採 血 〇 i I 以Ε L I S A 偵測 兔 子血清內之 抗 -鼠類抗體》在採 1 血 1 小時 內 離 心 以 白 兔血 中製備血清 〇 血清再分裝並冷凍 1 於 — 7 0 °c 下 直 到 使 用 爲 止。經敏化 之 天然鼠類抗體塗佈 1 1 在 9 6孔 洞 的 Li nbro E .I .A.盤上，係將5 0微升濃度爲 1 L 1 0 微克 / 毫 升 ( 稀 釋 於 Du 1becco' s 磷 酸鹽緩衝之食鹽水 Γ 1 I 中 — Dpbs ) 之 抗 體 吸 童 至 適合孔洞中 0 盤在室溫下培育1 1 1 I 小 時 。孔 洞 以 2 0 0 微 升 Dpbs洗三次 Φ 孔洞再以2%牛血 1 1 清 白 蛋白 / Dpbs ( bs a - -Dpbs) (2 C C 丨微克/孔洞）於 1 1 本紙張尺度適用中國國家標率（CNS > A4規格（210X29*/公釐） £43 88 〇9 A7 經濟部中央橾準局貝工消費合作社印製 _B7_五、發明説明（97 ) 4 °C下歷一夜而阻斷。在加入血清滴定物前應移移出阻斷 物（稀釋於l%bsa—Dpbs) (50微克/孔洞）。通常 針對各血樣使用1 2份2倍稀釋液來決定兔子效價*血清 滴定物在3 7 °C下培育2小時。孔洞以2 0 0微升的Dpbs 洗三次。偵測用抗體，山羊F(ab) >2抗一兔子Ig (H&L ) —馬辣根過氧化酶共軛物（Tago )以1 / 1 8 0 0 (稀釋於l%bsa — Dpbs中）及5 0微升/孔洞 加入。孔洞在3 7 °C下培育1小時。孔洞以Dpbs ( 2 0 0 微克/孔洞）洗3次。孔洞以5 0微升ABTS受質緩衝 溶液洗一次*再加5 0微升ABTS受質（Zymed )。在 Molecular Devices Vmax ELISA 計讀器上以 4 0 5 毫微 米讀取顏色。由對照組抗體（兔子抗一老鼠I gG，在1 微克/毫升下）達到約1.OOOOD值來決定終點。爲 比較兔子間之時間點及抗體調和物*使用約0.50D讀 值之血清滴定物。可對17種enlimomab衍生物的特性加 以描繪。在所有研究中之所有兔子上，enlimomab均可誘 生免疫反應》鑑定出三種衍生物，其可產生免疫原性顯著 地下降，同時保有充份的（大於天然老鼠抗體之2 0%) I CAM - 1結合能力以會其可充作人類治療劑使用》 圓2示出個別兔子之抗一enlimoaab血清效價（按千 計），係在腹膜內注入enl imomab，抗體2 1 8 3 — 6 6M (—種每個抗體分子平均有5個PEG加合物之 P E G — enlimomab衍生物，其利用CA3抗-同型管柱 獲得），或BIRR10( —種每個抗體分子平均有5個 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本莧) 訂 味 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） -100 - 經濟部中央標率局貞工消费合作杜印裝 IB4388 09 a? _—__B7_五、發明説明（98 ) PEG加合物之PEG - enl imomab衍生物，其可利用 s I CAM — 1管柱獲得）之後所得•圖中證明經PEG 修飾之enlimoraab具有較天然抗體還低的免疫原性。 圖3示出個別兔子之抗一enliraomab血清效價（按千 計），係腹膜內注入enl imomab或抗體930329/4 + : 1之後（一種P E G—enlimomab衍生物，每個抗體分 子平均有3個PEG加合物）*此圖也證明經PEG修飾 之enl imomab實質上具低於天然抗體之免疫原性。 圖4示出個別兔子之抗—enlimomab血清效價（按千 計），係靜脈內注入enl imomab或抗體1 9 2 4 — 1 1之 後（一種P E G - enl imomab衍生物，每個抗體分子平均 有2個PEG加合物）。如圖中所示，PEG修飾的en-limomab有較天然抗體實質上還低的免疫原性。 在固相載體上製備二種衍生物，由是可保護enlimo-mab之結合位置*製備自CA3 ICAM-1抗-同型 管柱之衍生物2183 - 66M，會顯著地減低免疫原性 。經4劑1毫克/公斤抗體之腹膜內投予（IP)，平均 對數血清效價由5 . 55 (抗一 enl imomab活性）減少至 4.50(抗- 2183 - 66M活性），由t-試驗分 析知在統計上是有意義的（表13)。此減少反映出對鼠 類抗體免疫反應有1 0倍的減低。另一 enlimomab衍生物 ，P0045，製備自s ICAM-1管柱。經4劑1毫 克/公斤I P，平均對數血清效價會由5 . 55 (抗一 e-nlimomab 活性）減至 4 · 88 (抗—s I CAM — 1 活性 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 矣紙張尺度適用中國固家揉準（CNS ) A4規格（X 297公釐） 101 A7 經濟部中央標準局男工消費合作社印装 ? R8 Ο 9 _Β7___ 五、發明説明（99 ) )。此減少以t -試驗分析知在統計上並無意義（表1 3 )。於表13中，指平均標準偏差。 — ：---.------------ΪΤ------^ (請先閱婧背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家梯準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -102 -
A 五、發明説明（iOO) 經濟部中央標準局員工消費合作社印装 | 表13 第27天之血清效價 化合物 平均 標準偏差 SEM Τ P值 enlirnomab 5. 55 0. 627 0. 313 PEG-enlimomab (在CA3抗-同型 管柱上製成） 4.50 0.549 0. 274 2. 528 0. 045 PEG-enlimomab BIRR10(管柱方法 PEG-enlimomab) 4. 88 0. 995 0, 497 1. 151 0. 293 enlimomab 4. 12 0. 620 0. 310 PEG-enlimomab BIRR10(溶液方法 PEG-enlimomab) 3. 11 0. 488 0. 244 2. 558 0. 043 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
,1T 味--^---Γ.------
Μ 公 7 9 2 X A7 B7 五、發明説明（101) 經鑑知可有效減低免疫原性的三種衍生物係於溶液中 製備的*衍生物IP投予，1毫克/公斤，共4劑。平均 對數血清效價可由4 · 1 2 (抗一 enl imomab活性）降低 至3 . 11 (抗—930活性），其以t —試驗知是統計 上有意義的（表13)，反映出免疫反應有10倍之降低 。此衍生物進一步由靜脈內（rv)投藥測試之。免疫接種 程序包括每週注入1毫克（公斤（IV)共4週，再每月注 入1毫克/公斤IV，在各孔投藥後7天收集血清樣品。在 4個每週劑量後免疫反應有統計上有意義的減低，由 4 . 0 9之平均對數效價（抗一 enl imomab活性）降至 3 . 04 (抗一1924 — 11活性）。在接下來每月的 投予後（經靜脈內內注射），抗一enl imomab活性之平均 對數效價增加至4 . 7 7，且經聚乙二醇修飾之抗-1 9 2 4 - 1 1衍生物之平均對數效價並不增加（ 3.07)(表14)。值得注意的，4隻兔子中有2隻 並未啓動爲EL I S A可測及之免疫反應。數據示於圖5 (请先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央橾準局貝工消费合作社印装 本紙張尺度逍用中團國家標準（CNS ) ( 2丨OX2?7公釐） -104 - 腔43 88 Ο 9 at Β7 五、發明説明（102) 經濟部中央樣準局負工消費合作社印製 紙 4 表14 在第28天及56天時血清之效價 化合物 平均 標準偏差 SEM T P值 第28天 enlimomab 4. 09 0. 284 0. 142 PEG-enlimomab (溶液方法） 3, 04 0.404 0. 202 4. 26 0. 005 第56天 enlimomab 4, 77 0. 874 0. 437 PEG-enlimomab (溶液方法） 3. 07 0. 569 0. 284 3. 25 0. 017 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂·— I— --- 束！ 準 標 ti 阁 國 f 用 通 105
經濟部中央標牟局貝工消费合作社印SL 438809 A7 __B7_五、發明説明（103) 上述的兔子免疫原性實驗證明，enlimomab之聚乙二 醇修飾作用可調控鼠抗體之免疫原性。再者，試管內結合 研究及活體內發炎實驗顯示，經聚乙二醇修飾作用後可仍 保有enlimomab之特異性。在吾等1 7種經聚乙二醇修飾 的enlimomab衍生物之研究中，可鑑知三種衍生物爲功能 性產物（試管內）·其可顯著地減低免疫原性（活體內） 。每一衍生物之I C AM— 1結合特性大約相同（相當於 enlimomab F a b片段之結合）。三種衍生物當於腹膜 內投予時均可減低免疫原性達1 0倍。在減低免疫原性之 能力上，不同的聚乙二醇修飾衍生物間並無統計上的差異 。所應注意的是在這些實驗中可觀察到不同的動物對enlimomab 有不同 的免疫反應。 雖然此變異性可用以 預言在 接受enlimomab的其他種類及人類中所產生之反應，但免 疫反應可在接受enlimomab的每一兔子中產生。相似地， 接受經聚乙二醇修飾的enlimomab的兔子，也可對經修飾 的抗體產生可變的反應，然而，某些動物並不會產生可測 及之免疫反應（由EL I SA測及）而其他的則有大大減 低的反應β這些數據顯示由enl imomab抗體之聚乙二醇修 飾作用，吾等可以抗—I CAM — 1療法再處理病人，就 如同慢性發炎疾病所需的而不會誘生生物上顯著的人類抗 一老鼠抗體（HAMA)反應。 綜而言之，enl imomab以1奄克/公斤I P或IV投薬 ，可在所有兔子中產生免疫反應*有三種經聚乙二醇修飾 之衍生物（一者在溶液相中製成，另一者在s I CAM - 本紙張尺度通用中國國家搮丰（CNS ) A4現格（2Ϊ0Χ 297公釐1 J---------1------訂------Φ; (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -106 - 經濟部令央樣隼局員工消费合作社印製 A7 ____B7__五、發明説明（104) 1管柱上且又一者在CA3管柱上製成）當以1毫克/公 斤IP重覆投藥（4劑）時可減低免疫原性達10倍。再 者，當衍生物1 9 24_1 1以IV路徑投予時，4隻兔子 中有2隻並不反應6劑經聚乙二醇修飾之抗體，而其餘2 隻兔子具極少量的反應》 窗例1 2 經聚乙二醇修飾之抗-I CAM— 1抗體之由F c R —誘 生之氧化破裂分析 鼠類單株抗體之治療用途因抗體F c部份所誘生之發 炎反應而變複雜，後者係可結合至細胞表面之F c受體（ FcRI)。除了治療性抗體自循環中增速的清除之外， 由F c- F cR交互作用可啓動許多重要的生物功能•這 些經由F c R (交聯所啓動之功能包括吞噬作用，過氧化 物之產生，介體之釋出（IL1 ，IL6，TNF-a， 等），Ig產生之調控及抗原呈現之加強（vande Wink-e1, Jan. G. J., et a 1., Immunology Today, 14:215-221 (1993)) 。F c rR I (CD 6 4 )可結合至單體的 I g G且可在單核球上原構地表現，且可於嗜中性球上誘 生。FcrRH (CD32)可在單核球，顆粒細胞及B 細胞上原構地表現，並以其多元型與人類抗體結合（以免 疫複合物型式被看出）且也可結合至多元的鼠類 I g G 2 a抗體。 enlimomab，一 種鼠類 I g G 2 a ，可經由 p BMC 氏浪尺度適用中國國家標準（CNS Μ4規格（21 ox 297公釐） I.---------έ------IT------< {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -107 -
缠濟部中失橾单局員工消費合作杜印II A7 ___B7____五、發明説明（1〇5) 上之F c rR I及嗜中性球上之F c rRn結合至人類白 血球上。爲測試不同聚乙二醇修飾作用過程在enlimomab 分子F c部份上之作用，於是進行氧化破裂研究。這些研 究經設計可偵測經由F c - F c R交互作用之細胞活化作 用*經由聚乙二醇修飾作用消除F c R結合能力（由減弱 的氧化破裂所證知）是有益的，因爲抗一 I CAM - 1 mAb無法自循環中如此快速地清除，且不佳的生物作用 可予以改善。 聚苯乙稀試管（Exoxemis，San Antonio, TX)塗佈 以1 0 0微升經純化之可溶性I CAM - 1，其稀釋於 Dulbecco's PBS中（'Dpbs# , Gibco, Grand Island， NY) ，10克/毫升之濃度下在室溫中歷4小時。試管再 以Dpbs洗二次》之後以2 5 0微升2%牛血清白蛋白-D-pbs ，在4 °C下阻斷一夜。使試管倒空，加入5 0微克/ 毫升濃度下1 0 0微升適合的抗體，其並稀釋於1 % bsa —Dpbs中，3 7 °C下歷1小時·試管以Dpbs洗二次才使 用。此步驟用以擺正mAh如此抗體之F c部份可啣接白 血球上之F c R受體，而抗體結合位置可由粘著至固相受 質之配體所失去活性。人類周邊血液收集於肝素中。嗜中 性球及P BMC利用右旋糖沈積作用繼以Ficoll-Paque (Pharmacia, Uppsala, Sweden)梯度分離而予以單離， 並依廠商指示進行。 於氧化破裂實驗中，細胞洗三次並以3 X 1 0β細胞 / 毫升再懸浮於 Dulbecco’s PBS 中（Gibco, Grand Inla- 本紙張尺度適用中國國家揉率（CNS ) A4規格（210X 297公漦) I;----------襄-------訂------線！ (请先閲讀背面之注意事項再填寫本I) 一 1Q8、 *43 88〇9 A7 B7 經濟部中央榇隼局具工消費合作社印装 五、發明説明（106) nd，NY)。在各管中加入6 0 0微升魯米諾（luminol) 平衡鹽溶液（Exoxemis, San Antonio, TX)，再加 100微升FMLP ·終體積爲800微升，PMLP終 濃度爲1 X 1 0 -7M。在各管中加入1 〇 0微升經純化的 細胞（重覆三次），濃度爲3X108細胞/毫升，再立 即偵測氧化破裂。選擇1 0 之FMLP濃度，因爲其 單獨無法刺激P BMC之氧化破裂，但確實可啓動 P BMC由是加強由受體啣接所產生之氧化破裂*在對照 組樣品中省略掉的任何組份可替換以等量的個別緩衝溶液 。樣品在 Berthold AutoLumat LB953 發光計 Cffildbad， Germany )中於3 7 °C下讀取9 0分鐘。產生時間經過曲 線，並以Berthold之軟體估計出曲線下之完整面積。 此實驗結果證明enlimomab可單獨誘生氧化破裂（ 3 . 7x 1 07化學發光積分）或加強細菌性肽FMLP 次最佳起動刺激之破裂（4 . 7 X 1 07化學發光積分） enlimomab抗體之聚乙二醇修飾作用可調控由F c -F c R在嗜中性球及PMB C上結合交互作用所誘生之氧 化破裂（表15)。聚乙二醇修飾作用可將未經刺激之 PBMC之氧化破裂減低至幾乎基線值（3 _ 0X107 化學發光積分）反映出單核球上經由F c r R I啓動之抑 制作用。再者，enl imomab之聚乙二醇修飾作用也會完全 抑制未經刺激的嗜中性球上之氧化破裂（1 · 8 X 1 07 化學發光稹分）*反映在嗜中性球上經由FctRII啓動 本紙伕尺度適用中國國家揉車（CNS ) A4规格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁〕 訂 -109 - 3 p p 〇 9 A7 B7 五、發明説明（l〇7) 之抑制作用。enl imomab之聚乙二醇修飾作用也可以將由 FML P刺激之P BMC及嗜中性球所增強之氧^破裂滅 低至基線值（分別爲4·lxlO7及6·9X107化 學發光稹分）。 J---------隻------訂------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中失樣準局貞工消費合作社印製 本紙張尺度逋用中國國家樣準（CNS M4規格（210X29?公嫠） 110 -
A7 7 B 五、發明説明（108) 經濟部中央梯準局員工消費合作杜印裝 表15 Fc-FcR誘生之氧化破裂 化學發光：107之積分 mAb 無 FMLP FMLP 處理 Expt. I Expt. Π Expt. I Expt. Π PMBC 無mAb 2. 8 1.5 3. 3 3.3 enl imoniab 3. 7 2.2 4. 7 4. 9 2-PEG-enlimomab 3. 0 2.4 4. 1 3. 0 5-PEG-enlimomab (BIRR10) 3.2 2.4 4.0 3. 3 顆粒細胞 無mAb 1.8 3. 1 7.2 27. 0 enlimomab 2.4 0.9 10.5 17.6 2-PEG-enlimomab 1.8 1.2 6. 9 9. 6 5-PEG-enlimomab (BIRR10) 2. 0 1.3 5. 3 7. 4 .(請先聞讀背面之注意事項再填寫本莧) 楚 訂 A S N C 竿 株 豕 困 τ 及 个 * 公 7 9 2 X ο -111 - 經濟部中央標隼局貝工消費合作社印装 A7 _B7_五、發明説明（109) 上述氧化破裂實驗證明* enlimomab之聚乙二醇修飾 作用可調控F c結構之細胞活化作用組份。天然的鼠類抗 一 I C A Μ — 1抗體enl imoinab已示出可經由細胞表面上 與F c rR I及F c rRn之交互作用而誘生人類 P BM C及嗜中性球中之氧化破裂。enlimomab抗體之聚 乙二醇修飾作用可有效地減低抗體誘導此F c _ F c R誘 生之氧化反應之能力。二種經聚乙二醇修飾的enlimomab 衍生物（其在試管內充作功能性產物上相同，且在兔子上 顯出減低之免疫原性）可在人類白血球中呈現顯著減少的 由F c — F cR誘生之氧化破裂。這些衍生物可減少誘導 人類P BMC上F c rR I及人類嗜中性球上F c rRE 之氧化破裂至基線值。再者，充滿FML P並再曝於經聚 乙二醇修飾之enl imomab下之PBMC及嗜中性球，和由 天然enlimomab所誘導之增強的氧化破裂比較下，前者並 不會產生氧化破裂。這些數據顯示enl imomab抗體經由聚 乙二醇修飾作用可消除F c — F c R交互作用及因此的經 聚乙二醇修飾之抗一 I C AM ·在減少不要的作用及鼠抗 體免疫原性上，F c - F c R交互作用之抑制是在重要步 驟。聚乙二醇修飾作用可延長enl imomab活體內治療之半 衰期，因此使抗—I CAM- 1治療的最初處理更爲有效 率。此外，聚乙二醇修飾作用可減少免疫原性，並可再投 予經聚乙二醇修飾之enl imomab以臨床應用於慢性發疾病 中β 總而言之，在溶液中進行的聚乙二醇修飾過程*以及 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) Α4说格（210Χ297公釐） J—------U------tr------it (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) -112 - 經濟部中央搮準扃員工消費合作社印製 at ___Β7_ 五、發明説明（！1〇) 在可溶性I C AM — 1固相載劑上進行的均可消除氧化破 裂，顯TKenlimoinab F c部份被修飾如此其不再與白血 球之F c R s交互作用之能力，及因此可舒緩不要的生物 作用。 窗例1 3 猴子發炎實驗 在鼠猴中（Saimiri Sciureus)比較 B I RR 1 0 及 enl imomab抑制局部發炎的能力。在動物背上多處皮內（ I D )注入發炎介體以與相同動物之對照部位作比較《在 放射活性蛋白質注入後偵測皮虜位置上之放射活性，可對 注射位置之血管通透性提供定量決定。 在此研究中給予1 0微克細菌脂多醣（S. typhosa, LPS)之I D注射。2 4小時後動物以B I R R 1 0或e-niimomab靜脈內（IV)注射以處理之。不同的動物組爲未 處理的對照組。投予抗體後，給予第二劑之食鹽水皮內注 射或1 0 0微克的酵母聚糖，如此有食鹽水/食鹽水，食 鹽水/酵母聚糖，L P S /食鹽水及L P S/酵母聚糖注 射部位。3 0分鐘後各動物給予2 0微居里12SI -標記 之牛血清白蛋白（BSA)經IV注射。5小時後抽出血樣 ，動物殺死，再移出背部皮虜。注射部位以8毫米直徑之 活組織檢査針切出，並偵測其放射活性。分裝血漿並偵測 1251活性|如此皮虜之放射活性可轉化成微升之血漿當 置》爲使動物皮虜厚度上之差異及B S A中各批次之差異 本紙浪尺度通用中國國家標準（CNS ) A4*H格（2丨0X297公釐） J--^------隻------訂------線 {請先閲讀背面之注意事項再填寫本瓦) -113 - ，3 S3 〇9 ^ ϋ Α7 Β7 五、發明説明（111) 合於規格，以超過食鹽水注射部位之倍數增加來表示通透 性=結果示於表1 6 ( 表示實驗數目；劑量按毫克 /公斤計；有酵母聚糖之B I RR 1 0數據在3 0或 1 0 0微克*有酵母聚糖之enl iraomab在1 0 0微克，和 對照組（老鼠IgG2a)比較P<0 _ 01 :有LPS 及酵母聚糖之enliraomab數據和對照組比較P < 0 · 0 5 I.---—Λ------€------訂------線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本f ) 經濟部中央橾準局員工消費合作社印策 本紙張尺度適用中國國家搮準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -114 - 經濟部中央標準局員工消费合作社印策 B7 五、發明説明（112)
Dd CO 3 ?σ H-· 卸1 1—k 白 1—Η Ο o 〇q 1 3 CD 〇a σ- c? CO CO CO o CO CD CT5 CO 3 μ-Α H-k l—i tr^ * • • CJ1 A cn CO 〇 1+ 1+ 1+ w Ο ο o m CO 〇> CJ1 o tn 关 m — I—4 to CJi ISD CO o /--v CO 骤 0¾ a> o 鏵 w 扭 1+ 〇> /-"N p II CO 'w, 1+ C3 翔 雜 CO 1—k (—k 03 CJ1 σ> 1—1 〇 m 1+ CD * 1—^ CO l-*« 1+ o *—i Ki !+ 〇 tn 〇 鏵 c〇t 庙 雜 CO CO A CO o m —J 1+ o 1+ o 1+ o 域 CO CO to CO CJ1 — M (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 涑 本紙張尺度逍用中國國家橾隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） -115 - «943 88 0 9 A7 B7 經濟部中央標準局負工消費合作社印裝 五、 發明説明 (113) 1 I 如 表1 6 所 示 ) 以 所測 試劑量 下的 任一抗體|由略 J L P S -誘 使 的 血 管 穿 透性 之增加 並無 抑制作用。在研究 1 當 曰 9 注以 3 0 及 1 0 0微 克酵母 聚糖 之部位分別有2及 1 I 請 I 3 7 倍多 之 血 漿 » 和 對照 部位比 較而 言。對於由1 0 0 先 閲 1 1 微 克 酵 母聚 糖 所 誘 使 的 血管 通透性 之增 加 1 enlimomab及 背 面 I B I R R 1 0 分 別 可 有 5 7 ± 3 % 及5 9 ± 5 %之抑制。 注 意 童 1 I B I R R 1 0 對於 3 0 微克 酵母聚 糖誘 使的通透性增力α可 ψ 項 再 1 I 有 3 9 ±3 % 之 抑 制 作 用。 enl imomab似乎也可抑制此作 埃 寫 本 1 I 用 y 然 而， 因 爲 以 en 1 i moma b處理的動物中僅二者以3 0 頁 1 1 微 克 的 酵母 聚 糖 測 試 此在 統計上 並無 意義 0 enl imomab 1 1 及 B I R R 1 0 也 可 抑 制以 L P S 預處 理部位穿透性之增 1 1 加 更 甚 於以 酵 母 聚 糖 刺 激者 ，抑制 百分 率分別爲43±7 訂 1 % 及 4 7 土 7 % 0 1 | 白 未處 理 動 物 之 組 織檢 査中顯 示， 在LPS及酵母聚 1 1 糖 處 理 區域 中 有 顆 粒 細 胞， 但食鹽 水/ 食鹽水對照位置上 1 1 涑 則 否 〇 L P S 可 造 成 I C A Μ — 1 於試 管內之正面調控而 i I 補 充 白 血球 至 靈 長 類 皮 虜| 並可增 加鼠 猴皮0血管中 ί I C A Μ - 1 之 表 現 ( 以e.n 1i moma b免疫組織化學測度） 1 ί 9 酵 母 聚糖 是 一 種 萃 取 自酵 母（啤 酒酵 母）之細胞壁•其 1 已 知 可 活化 包 括 C 5 a 之補 髖* C 5 a 是一種趨化劑且可 1 ί 活 化 顆 粒細 胞 Q 在 對 照 動物 經酵母 聚糖處理部位存在有白 1 I 血 球 1 於經 en 1 i moma b處理動物之酵母聚糖部份則白血球 1 1 1 有 所減 少， 並 可 抑 制 由 酵母 聚糖誘 導之 血管通透性，由此 1 1 推 測 此 現象 是 依 賴 I C AM -1之 顆粒 細胞調介之發炎》 1 1 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -116 - ο A7 B7 五、發明説明（114) 由上述分析之數據顯示，B I RR 1 0如enlimomab般可 有效地抑制此顆粒細胞調介之傷害。 雖然本發明已配合其特殊具體實例加以描述，但應了 解其中仍可進一步修飾，且本申請案意欲涵蓋任何變化， 用途或改編，一般只要依循本發明之原則即可，包括在本 發明所參與之技藝內已知或習用之演練中但偏離本揭示者 ，且可應用至上文所示之基本特色及依循於所附申請專利 範圍內。 (請先閣讀背面之注意事項再填寫本頁) -t- -訂 來： 經濟部中央標準局員工消費合作社印榘 本紙張尺度適用中國國家橾率（CNS ) A4規格（210X297公釐） -117

Claims (1)

  1. 六、申請專利範圍Λ 修正 附件（A) : l!lll ----- -裝--- (請先閱讀背面之注意事項4填寫本頁) 第85110360號專利申請案 中文申請專利範圍修正本 民國89年12月修正 1 .—種經聚乙二醇修飾之抗一 I CAM— 1抗體衍 生物均質系（h 〇 in 〇 g e n e 〇 u s s p e c i e s )，其中該抗體可結 合至ICAM-l ’且可抑制由ICAM — 1調介之細胞 粘著作用，該均質系具有界定且一致之聚乙二醇修飾程度 ，且係本質上不含有具有不同聚乙二醇修飾程度之抗一 I C A Μ — 1 抗體。 2 _如申請專利範圍第1項之經聚乙二醇修飾的抗-I CAM- 1抗體衍生物均質系，其中該抗體是一種單株 抗體。 3. 如申請專利範圍第1項之經聚乙二醇修飾的抗-I CAM -；L抗體衍生物均質系，其中該衍生物平均含有 2至15分子的單官能聚乙二醇° 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 4. 如申請專利範圍第3項之經聚乙二醇修飾的抗-I C AM- 1抗體衍生物均質系’其中該單官能聚乙二醇 是聚乙二醇琥珀酸之N -羥基琥珀醯亞胺酯。 5. 如申請專利範圍第3項之經聚乙二醇修飾的抗-I C AM- 1抗體衍生物均質系’其中該單官能聚乙二醇 是聚乙二醇丙酸之N_羥基琥珀醯亞胺酯。 6. 如申請專利範圍第2項之經聚乙二醇修飾的抗— I CAM— 1抗體衍生物均質系’其中該抗體是（A)抗 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） Α8 Β8 C8 D8 ^43 δΒ 〇 9 六、申請專利範圍 體exlimomab，或（B )可結合I C AM — 1之抗體且可 競爭地抑制enlimomab對Ϊ C AM — 1之結合^ 7·如申請專利範圍第6項之經聚乙二醇修飾的抗-I C AM — 1抗體衍生物均質系，其中該抗體是抗體enl_ i momab ° 8 _如申請專利範圍第1項之經聚乙二醇修飾的抗-I C AM- 1抗體衍生物均質系，其中該衍生物至少保有 約20%天然抗—I CAM—1抗體與I CAM — 1結合 之能力。 9.如申請專利範圍第1項之經聚乙二醇修飾的抗一 I CAM- 1抗體衍生物均質系，其中該衍生物之活體內 血清半衰期大於該抗體之未經聚乙二醇修飾之型式。 1◦.如申請專利範圍第8項之經聚乙二醇修飾的抗 一 I CAM - 1抗體衍生物均質系，其中該衍生物是抗體 B I R R 1 〇。 11.如申請專利範圍第1項之經聚乙二醇修飾的抗 —I CAM — 1抗體衍生物均質系，其中該衍生物由以下 方法所產生包括： (a )將抗一 I CAM— 1抗體於經活化的聚乙二醇 分子存在下培育，在PH6〇至8·5下足以令該抗體 之聚乙二醇修飾衍生物形成，其中該抗體對該經活化的聚 乙二醇的莫耳比係1〇 : 1至1 : 10 ; (b)將所形成的衍生物接受疏水性交互作用層析’ 其所在的條件足以自未經聚乙二醇修飾之抗體中分離出經 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公g ) ------------n^--- (請先閱讀背面之注意事項再^寫本頁) 's] 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α8 Β8 C8 D8 、申請專利範圍 1 8 .如申請專利範圍第1 2項之藥學組成物，其中 該經聚乙二醇修飾的抗一I CAM- 1抗體衍生物保有至 少約2 0%天然抗—I CAM— 1抗體結合至I CAM — 1之能力。 1 9 .如申請專利範圍第1 2項之藥學組成物|其中 該經聚乙二醇修飾的抗一 I C AM— 1抗體衍生物，其活 體內血清半衰期大於抗體之未經聚乙二醇修飾之型式。 2 0 .如申請專利範圍第1 2項之藥學組成物，其中 該經聚乙二醇修飾的抗一ICAM-1抗體衍生物是抗體 B I R R 1 0。 21.—種純化單一均質經聚乙二醇修飾之抗體的方 法，其係自含有該抗體及未經修飾之抗體的製劑中純化· 該均質系具有界定且一致之聚乙二醇修飾程度，且係本質 上不含有具有不同聚乙二醇修飾程度之抗_ I CAM - 1 抗體，此方法包括將製劑接受使用聚乙二醇爲疏水性配體 之疏水性交互作用層析，其所在的條件足以自經聚乙二醇 修飾種類中分出抗體之未修飾型，並回收該分出的經聚乙 二醇修飾的抗體，其中該疏水性交互作用層析條件包括： 將製劑填加至已平衡的疏水性交互作用層析管柱內：自該 管柱中以約2M至約〇.9M之硫酸銨鹽梯度浸漬管柱而 溶離出經聚乙二醇修飾的抗體。。 2 2 .如申請專利範圍第2 1項之方法，其中該疏水 性交互作用層析條件足以分離出有不同聚乙二醇修飾程度 的經聚乙二醇修飾的抗體。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21(U 297公釐） —Λ — (請先Μ讀背面之沒意事項再填寫本頁) -裝--------訂---------> ί 經濟部智慧財產局員Η消費合作社印製
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