JPH11503998A

JPH11503998A - レチノイン酸受容体アゴニストによる網膜色素上皮の増殖の阻止方法

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Publication number: JPH11503998A
Application number: JP8523769A
Authority: JP
Inventors: エイ．キャンポチャーロ，ピーター; エイ．ウィーラー，ラリー; エイ．チャンドラレイナ，ローシャンサ; ナグパル，スニル; ジュアン，ユージーンジュニア．デ
Original assignee: ザジョーンズホプキンスユニバーシティースクールオブメディシン; アラーガン
Priority date: 1995-02-01
Filing date: 1996-01-31
Publication date: 1999-04-06
Anticipated expiration: 2016-01-31
Also published as: US6071924A; JP4121552B2; EP0804194A1; US20020128291A1; EP0804194B1; ATE291915T1; EP0804194A4; AU4707096A; WO1996023498A1; US6372753B1; US6573271B2; DE69634532D1; US5824685A; US6075032A; DE69634532T2

Abstract

(57)【要約】手術もしくは外傷後の網膜色素上皮の増殖、または脈絡膜新生血管形成と関連した眼の疾患（例えば、加齢に関係した黄斑変性、ヒストプラスマ症候群）を生じさせる網膜色素上皮の増殖は、網膜色素上皮細胞を、治療量のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アゴニスト、好ましくはレチノイン酸受容体に対して特異的活性を有するもの、と接触させることにより阻止される。好ましくは、ＲＡＲアゴニストはＡＰ−１依存性遺伝子発現の強力なアンタゴニストでもある。また、網膜色素上皮の増殖は、治療量のＡＰ−１アンタゴニストを単独でまたはＲＡＲアゴニストとの組合せで用いても軽減される。薬剤は約５０〜１５０μg の投薬量を用いる硝子体腔へのボーラス注射により、またはリポソームからの、もしくは硝子体腔に注入された油タンポナーデからの持続放出により投与され得る。網膜色素上皮の増殖を阻止する製剤も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】レチノイン酸受容体アゴニストによる網膜色素上皮の増殖の阻止方法本出願は、1995年２月１日付けの米国特許出願第08/383,741号の一部継続出願である。発明の背景１．発明の分野本発明は、レチノイド類の薬理学的使用に関するものである。さらに特定すると、本発明は、レチノイド類を用いて眼の疾患を治療することに関する。２．関連技術の説明網膜色素上皮（retinal pigment epithelium：ＲＰＥ）は、網膜の傷の修復に関与するときを除いて、通常は有糸分裂的に不活発な感覚網膜の下にある一層の細胞層を形成している。網膜の傷の修復に際しては、それが中心的な役割を果たす。傷の修復が完了すると、ＲＰＥは増殖を停止するのが普通であるが、増殖停止に失敗すると、増殖性硝子体網膜症（proliferative vitreoretinopathy ：ＰＶＲ）や円板状瘢痕形成のような失明障害の危険がある。例えば、感覚網膜が剥離した後では、ＲＰＥの形態が変化してＲＰＥが増殖し始める。脱分化したＲＰＥ細胞の多層コロニーが形成される。その後、細胞は網膜下空間に移動しはじめて、そこで杆状体の外側部分を巻き込む。ある場合には、細胞が網膜の表面に移動して網膜の上に膜を形成する。こうした現象は、増殖性硝子体網膜症の病因、黄斑変性を伴って起こる重症の瘢痕形成、網膜が再付着した後の視力回復の低下または遅れに関係している。加齢に関係した黄斑変性（age-related macular degeneration：ＡＭＤ）は、米国では60才以上の患者の失明の主因となっている。ＡＭＤ患者の重度な視力低下は通常、脈絡膜新生血管形成（choroidal neovascularization：ＣＮＶ）の発生によるものである。レーザー治療はＣＮＶを除去することができ、網膜の中心部を巻き込まない特定のケースでは視力保持に役立っている。しかしながら、この治療の効果はしばしば一過性であって、ＣＮＶの再発頻度は高い（３年で５０％、５年で約６０％）(Macular Photocoagulation Study Group，Arch．Ophthal mol．204: 694-701，1986)。さらに、ＣＮＶを生ずる患者の多くはレーザー治療にとって好ましい候補者ではない。なぜならば、ＣＮＶがレーザー治療には大きすぎるか、または、その位置確認ができないため医師がレーザーを正確に当てられないからである。こうした重大な結果にもかかわらず、ＲＰＥ脱分化および密度依存的増殖制御の低下に関与する刺激についてはほとんど知られていない。しかし、培養下のヒトＲＰＥが、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補給した培地に維持したとき、レチノイド欠乏になることは知られている（S.R．Dasら，Biochem．J.，250:459，1988）。レチノイド類は細胞の分化に関係しており（S．Strickland ら，Cell，15:393 -403，1978; T.R．Brietman ら，PNAS，77:2936-2940，1980）、通常in vivo でＲＰＥ中に高レベルで存在している。レチノイドは視覚伝達において重要な役割を担っており、それゆえ、正常な視覚機能にはレチノイドの再循環が必要とされている。この再循環は光受容体とＲＰＥとの緊密な関係を介して起こる。網膜剥離によってこの緊密な関係が崩れるとレチノイドの再循環が妨げられ、このことが外側部分の変性およびＲＰＥの脱分化の一つの理由であり得る(P.A.Campochia roら，Invest．Opthalmol．Vis．Sci．32:65-72，1991)。培養ＲＰＥ細胞を全トランス- レチノイン酸（ＲＡ）とともにインキュベートすると、細胞の増殖が抑制され、in situ でＲＰＥに似た形態的外観を呈するようになる（P.A．Campochiaroら，前掲; J.W．Doyleら，Curr．Eye Res.，11:753 -765，1992）。全トランスＲＡと他のビタミンＡ誘導体（総称してレチノイドと呼ばれる）は多くの細胞型の増殖および分化に影響を及ぼす(S.Strickland ら，前掲; T.R．Breitman ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，7:2936-2940，1980)。したがって、レチノイン酸やその関連分子は、ＲＰＥやＰＶＲに関与している他の細胞の休止を維持したり再確立するように働くシグナルの一つであるかもしれない。レチノイドの生物学的作用は核受容体により媒介される。核受容体はリガンドにより誘導されるトランス作用因子で、トランス作用因子はＤＮＡ応答エレメントと結合して該応答エレメントを含む遺伝子の転写を調節する。これらの受容体は２つのファミリーに大別され、すなわちレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）とレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）である。各ファミリーには、α、βおよびγと称する３種類のサブタイプを構成する３つの別個の遺伝子産物が存在する（H.G.Stunne nberg，Bio Essays，15:309-315，1993）。これらのサブタイプのｍＲＮＡの別のスプライシングは、異なるイソフォームとさらに大きな多様性をもたらす。ＲＡＲおよびＲＸＲサブタイプの発現レベルは組織ごとに相違しており、サブタイプの活性度の違いがレチノイド効果の組織特異性を生じさせる（P．Dolleら，Na ture，342:702-705，1989; J.L．Reesら，Biochem．J.，259:917-919，1989）。レチノイド受容体は、転写的に活性なＲＡＲ−ＲＸＲヘテロダイマー(S．Nagpal ら，EMBO J.，12:2349-2360，1993)またはＲＸＲホモダイマー(X．Zhangら，Na ture，358:587-591，1992)としてＲＡ応答遺伝子のプロモーター領域に結合することにより遺伝子発現を増強（アップレギュレーション）させる。一方、それらはＡＰ−１のような転写因子の作用に拮抗することによって他の遺伝子の発現を低下（ダウンレギュレーション）させる(M．Pfahl，Endocrine Review，14:651- 658，1993; Nagpalら，J．Biol．Chem.，270:923-927，1995)。ＡＰ−１成分であるｃ−Ｊｕｎおよびｃ−Ｆｏｓは、細胞膜に到達する分裂誘起シグナル（例：成長因子、腫瘍プロモーター）に応答して産生される即時型遺伝子の産物である。ｃ−Ｊｕｎ／ｃ−Ｆｏｓ複合体は続いて、細胞分裂と細胞増殖に関与するＡＰ −１応答遺伝子の発現を活性化する（T．Curran & B.R．Franzo，Jr.，Cell，55 :395-397，1988; I.R．Hart ら，Biochem．Biophys．Acta.，989:65-84，1989; P.K．Vogt & T.J．Bos，Trends Biochem．Sci.，14:172-175，1989）。他方、レチノイドは細胞増殖を抑制して分化を引き起こす(L.J．Guoasら，The Retinoids : Biology，Chemistry and Medicine，M.B．Spornら編，Raven Press Ltd.，New York，pp．443-520，1994)。それゆえ、上記の観察を考慮すると、ＡＰ−１依存性遺伝子発現のレチノイド媒介拮抗作用はそれらの抗増殖作用の基礎を提供する。別のレベルのレギュレーションはリガンド−受容体の親和性の差異によりもたらされる。全トランスＲＡはＲＡＲの内因性リガンドであり、一方ＲＸＲのリガンドは９−シス−ＲＡであると考えられている(R.A．He yman ら，Cell，68:387-406，1992; A.A．Levinら，Nature，355:359-361，1992 )。しかし、９−シス−ＲＡは同様にＲＡＲにも結合して、それを活性化することができる。９−シス−ＲＡは全トランスＲＡの立体異性体で、生体内では代謝中に全トランスＲＡから生成される（R.A．Heyman ら，前掲）。増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）は裂孔原性網膜剥離の手術後に最もふつうに見られる失敗の原因である。膜の細心な外科的切除およびシリコーン油（ＳｉＯ）のようなタンポナーデの使用にもかかわらず、大多数の場合、膜の完全切除とそれに続く膜成長に伴う困難さゆえに失敗が生じる。今日まで、ＰＶＲの手術の目的は、網膜上の膜および必要な場合は縮まった網膜部分を切除することにより牽引（traction）を和らげること、網膜復位術を用いてすべての網膜裂孔の周囲を取り囲むこと、そして硝子体の内腔に気体またはシリコーン油を注入することで、すべての網膜裂孔を塞ぐのに十分長い期間にわたり網膜タンポナーデを与えることである。これらの技術を用いると、１回の手術でＰＶＲを患っている眼の３５〜４５％において、複数回の手術では最高７１％において網膜の再付着が達成されている。しかしながら、それぞれの手術が原因で、視覚的予後が悪化する(S ilicone Study Group，Silicone Study Report No．2，Arch Ophthalmol.，110: 780-792，1992)。主な失敗原因は牽引と再発性剥離をもたらす網膜上の膜の再成長を伴う再増殖である。かくして、再増殖の防止がＰＶＲの治療において主要な目標となる。さまざまな抗増殖薬（例えば、ダウノマイシン）を単独でまたは硝子体網膜術と組み合わせて用いた実験が数多く報告されている。レチノイドは脂質可溶性であるが、大部分の抗増殖薬は脂質可溶性でない。ＳｉＯに溶かした全トランスＲＡをＰＶＲのウサギモデルで試験したところ、細胞増殖の持続的かつ顕著な低下がもたらされた。３kgのウサギに２〜２０μg ／mlＳｉＯの用量で投与しても網膜毒性の組織学的証拠はまったく得られず、網膜剥離の割合が未処置対照での１００％から処置ウサギ眼（８週目）での４４．５％へと減少した（J.J．Araizら，Invest．Ophthalmol．Vis．Sci.，34:522-30，1993）。このレチノイド送達法はシリコーン油をしばしば使用している進行ＰＶＲの患者に適しているが、初期もしくはあまり重症でないＰＶＲの患者または網膜再付着後にＰＶＲを発症するリスクが高い患者には適用できない。さらに、ＰＶＲの治療において、生分解性ポリマーの微小球からのレチノイン酸（ＲＡ）の持続的デリバリーを試験するためにもウサギモデルが使われた(G.G ．Giordano ら，Invest．Ophthalmol．Vis．Sci.，34:2743-2751，1993)。生分解性微小球（その中には合計約１００μg の全トランスＲＡが取り込まれている）の懸濁液で硝子体腔を満たすと、気体圧縮硝子体切除術および繊維芽細胞注入で処置した眼では牽引性網膜剥離（tractional retinal detachment ：ＴＲＤ）が著しく減少した。毒性は異物反応を表すと思われる局所の炎症に限られていた。レチノイン酸、その幾何異性体である13−シス−レチノイン酸、それらの合成誘導体はいくつかの組織において多くの生物学的作用を有する。レチノイド類は現在、急性骨髄性白血病の最前線の治療として(R.P．Warrell，Jr．ら，N．Engl ．J．Med.，324:1385-1393，1991)、いくつかのタイプの転移性がんのアジュバント療法として(K．Dhingraら，Invest．New Drugs，11:39-43，1993; S.M．Lip manら，J．Natl．Can．Inst.，85:499-500，1993)、乾癬や他の皮膚病の治療のために使用されている。レチノイドのこうした種々の作用は多数の臨床用途を提供するが、それらはまた、いずれか一つの特定疾患の治療を妨げる有害作用や毒性の土台でもある。例えば、13−シス−レチノイン酸は出産年齢の妊婦に投与するとき催奇形作用と関連がある。かくして、ＰＶＲの治療に使用するために、こうした毒性を示さない追加の合成レチノイド類似体の必要性が存在している。また、レチノイドがＲＰＥ細胞においてその抗増殖作用を発揮するメカニズムを理解することは、ＰＶＲとその関連疾患のための新しい付加的治療薬の開発を可能にするだろう。発明の概要手術もしくは外傷後の、または脈絡膜新生血管形成と関連した眼の疾患（例えば、加齢に関係した黄斑変性およびヒストプラスマ症候群）における網膜色素上皮の増殖は、網膜色素上皮細胞を治療量のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アゴニストと接触させることにより治療される。該アゴニストとしては、レチノイン酸受容体に対して特異的活性を有しかつＡＰ１依存性遺伝子発現を強力に阻止できるものが好ましい。この増殖はまた、治療量の、ＡＰ１依存的活性を阻害する他の薬剤でも治療され、こうした薬剤は単独でまたはＲＡＲアゴニストとの組合せで用いられる。上記の接触は、硝子体腔へのボーラス注射により、またはリポソーム内に保持させたり、硝子体腔もしくは眼周辺腔に注入される液体タンポナーデ中に溶解したりするような、徐放性フォーマットでＲＡＲアゴニストを提供することにより行うことができる。網膜色素上皮の増殖を阻止する製剤も提供される。図面の簡単な説明図１は、７日間のインキュベーション後のヒトＲＰＥ細胞における血清刺激ＤＮＡ合成を抑制するためのレチノイドアゴニストのモル濃度依存的効力を示すグラフである。745 は化合物 745、183 は化合物 183、ＲＡはレチノイン酸、9-ci s-ＲＡは９−シス−レチノイン酸、659 は化合物 659、701 は化合物 701を表す。図２は、ＲＰＥ細胞の形態に及ぼすレチノイドアゴニストの効果を示す、位相差顕微鏡を使った倍率×150 での一連の顕微鏡写真である。倍率×150。図２Ａ−Ｄは、４つの異なる培地で増殖させた、60才のドナーから得られた細胞（４×10⁴個）を示す。図２Ａ＝血清のみ；２Ｂ＝１μM の全トランス- レチノイン酸を補充した５％血清；２Ｃ＝１μM の化合物 701を補充した５％血清；２Ｄ＝１μM の化合物 183を補充した５％血清。図２Ｅ−Ｈは、４つの異なる培地で増殖させた、76才のドナーから得られた細胞（４×10⁴個）を示す。図２Ａ＝血清のみ；２Ｂ＝１μM の全トランス- レチノイン酸を補充した５％血清；２Ｃ＝１μM の化合物 701を補充した５％血清；２Ｄ＝１μM の化合物 183を補充した５％血清。図３は、ＲＰＥ増殖における数種の核受容体アゴニストの単独またはレチノイン酸との組合せでの効果を示すグラフである。ＲＡ＝レチノイン酸；ＤｅｘおよびＤｅｘａ＝デキサメタゾン；Ｔ３＝甲状腺ホルモン；Ｄ３＝1,25- ジヒドロキシビタミンＤ₃。発明の詳細な説明本明細書においては、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を、治療量の、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アゴニストとしての活性を有する化合物１種以上と接触させることにより、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）および網膜傷修復の他の疾患を治療する方法が提供される。ＲＡＲアゴニストは、ＲＡＲ活性化経路により媒介される培養ＲＰＥの密度制止および分化した形態を促進することによって、in vit roでＲＰＥ細胞の増殖を阻止し、また、通常は動物（例えば、ヒト）の眼の手術後および光受容体からのＲＰＥの剥離を引き起こす他の網膜損傷の後に生じるような、牽引性網膜剥離を抑制するのに臨床上有効であることが見いだされた。これらの結果は、牽引性網膜剥離の抑制がＲＡＲ活性化経路により媒介されるが、ＲＸＲ媒介経路によっては媒介されないことを示している。したがって、ＲＡＲアゴニストは一般的に、網膜瘢痕形成または網膜剥離に導くほどのＲＰＥ細胞の過度の増殖が見られる症状の治療に有用である。一方、ＲＸＲアゴニストはこのような有用な臨床効果を全く持ち合わせていない。さらに、ＲＡＲアゴニストがＲＰＥ増殖を抑制する一次メカニズムはＡＰ１活性の拮抗作用によるものである。かくして、特異的な抗ＡＰ１活性をもつＲＡＲアゴニスト、ＡＰ１活性をブロックする他の薬剤、またはこれらの他の薬剤と抗ＡＰ１活性をもつＲＡＲアゴニストとの組合せは、ＰＶＲの治療に用いることができる。本明細書中の実施例には、上記した本発明のレチノイド化合物が網膜上皮細胞の分化した表現型をもたらすことが示される。網膜色素上皮細胞の分化した機能の一つは、脈絡膜からブルーフ膜を経てＲＰＥの下方の空間または網膜下腔へと成長する新生血管の形成を阻止することである。このプロセスは脈絡膜新生血管形成（choroidal neovascularization）と呼ばれている。これはいくつかの疾病の過程で起こり、そのうち最も一般的なものが加齢に関係した黄斑変性である。その結果、本発明のレチノイド化合物による治療は、分化した状態のＲＰＥを維持するように働き、それゆえ、患者における脈絡膜新生血管形成を阻止するのに役立つ。加齢に関係した黄斑変性を有する患者は最も大きなグループを構成し、このグループでは脈絡膜新生血管形成が主要な問題となっている。さらに、眼のヒストプラスマ症候群患者のような、脈絡膜新生血管形成をわずらう比較的若い患者も、本発明のレチノイド化合物を用いる治療により利益を得ることができる。本発明の方法では、治療上有効な量の、ＡＰ１のアンタゴニストとして強力な活性を有するＲＡＲアゴニストまたは他の抗ＡＰ１薬またはこれらの薬剤の組合せが、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）または脈絡膜新生血管形成を有する患者、あるいは病気、手術、外傷、加齢のためにこうした症状を発生する危険のある患者の硝子体腔または眼周辺腔に導入される。外科的手術の場合には、ＲＡＲアゴニストまたは他の抗ＡＰ１薬またはこれらの組合せをＰＶＲの手術後に投与して、ＲＰＥ細胞の増殖および網膜の再剥離を防ぐことが特に好ましい。本明細書中で用いるＲＡＲアゴニストの「治療上有効な量」とは、ＲＰＥ細胞の増殖を抑制し、ひいてはＲＰＥの分化を回復させるためにヒトまたは動物において必要とされる時間にわたり、硝子体腔または眼周辺腔に直接導入した場合は硝子体腔における治療レベルを、末梢に投与した場合は血流中の治療レベルを達成し維持するように計算された量のことである。治療量は、治療すべき眼のＲＰＥ細胞の少なくとも５０％、より好ましくは８０％の増殖を阻止するのに十分な量とすることが好適である。治療量はそれぞれのＲＡＲアゴニストの効力、所望の治療効果または他の効果に必要とされる量、物質が硝子体腔または血流に入ったとき生体がその物質を排除または分解する速度、および製剤中のＲＡＲアゴニストの量により変化するだろう。細心の慣用処方プラクティスに従って、通常、個々の薬剤の有効範囲の下限に近い投与量を最初に用い、観察された応答に応じて医師のルーチンの手法により投与量を増やしたり減らしたりする。眼の硝子体腔に直接投与する場合、手術または外傷後約２４時間以内に投与される約５０〜１５０μg の範囲の量が一般にはＰＶＲの発生を阻止する。別の実施態様では、数時間後、通常は約８〜３６時間後、好ましくは約２４時間後に、２回目のＲＡＲアゴニストを硝子体内または結膜下に注入する。また、レチノイドを投与するにあたって、レチノイドの硝子体内注入と結膜下注入の組合せを同時に採用したり、上記の時間間隔で採用することもできる。硝子体内注入においては、局所麻酔または眼球後麻酔をかけて前方の硝子体腔に注入することが好ましい。別の実施態様では、ドラッグデリバリービヒクルを使ってＲＡＲアゴニストを硝子体内に導入する。例えば、ＲＡＲアゴニストを生物学的に不活性な流動体中に溶解することができる。この流動体は網膜を適所に保持する役目をする機械的タンポナーデとしても有用で、レチノイドを溶かすシリコーン油のような油が好適である。しかし、部分的混和性を有するＲＡＲアゴニストの場合は、油以外の液体を使用することができる。しかしながら、ボーラス注射としてのレチノイドの硝子体内注入は局部の網膜損傷を生じさせることがある。加えて、本発明のレチノイドの治療効果は効果の出始めるのが遅く、可逆的であることが判明した。それゆえ、持続放出法を用いてレチノイドを投与することが有利であり、例えば、ある用量のレチノイドをリポソームのような微小ビヒクル内に保持させたものを硝子体内に注入する。微小ビヒクルからはその用量が数日間、好ましくは約３〜２０日間にわたって放出される。また、薬剤を徐放性ポリマーに取り込ませるなどして、徐放用に製剤化することもでき、ある用量の薬剤が徐放性ポリマーから数日間、例えば２〜３０日間にわたって徐々に放出される。当技術分野で公知であるように、リポソームは一般にリン脂質や他の脂質物質から誘導される。リポソームは水性媒体中に分散される単ラメラまたは多ラメラ水和液晶により形成される。無毒性で、生理学的に許容され、代謝可能で、リポソームを形成し得る脂質が用いられる。リポソームの形の本組成物は薬剤のほかに安定剤、防腐剤、賦形剤などを含んでいてもよい。好適な脂質は、天然または合成の、リン脂質およびホスファチジルコリン（レシチン）である。リポソームの形成方法は当技術分野で公知である。例えば、Prescott編，Meth ods in Cell Biology，Vol．XIV，Academic Press，New York，N.Y．(1976)，p. 33およびその次を参照のこと。投与方法にかかわらず、ＲＡＲアゴニストは天然に存在するレチノイドであっても、合成のレチノイドであってもよく、ＲＡＲのアゴニストとしての選択的活性およびＡＰ−１依存性遺伝子発現の高い拮抗作用効力を有することが好ましい。ＲＡＲアゴニストとしての活性をもつ天然レチノイドの例は、立体異性体の全トランス−レチノイン酸（全トランスＲＡ）と９−シス−レチノイン酸（９−シスＲＡ）であり、自然界では全トランスＲＡが代謝中に９−シスＲＡに変換される (J.G．Allenら，Pharmac．Ther.，40:1-27，1989)。しかしながら、９−シスＲＡはＲＡＲとＲＸＲの両方のアゴニストとしての活性を有し、全トランスＲＡもやはり、その代謝つまり９−シスＲＡへの化学的異性化のために、ＲＡＲとＲＸＲのどちらをも効果的に活性化することができる。一方、本発明の実施に際して用いられる好適なレチノイド化合物は、ＲＡＲアゴニストとしての特異的活性をもつものである。合成的に製造されたレチノイドは当技術分野で公知である。例えば、米国特許第5,234,926 号（その全体を参考としてここに組み入れる）は、ＲＡＲアゴニストとしての選択的活性を有する、ヘテロ芳香族基とヘテロ二環式基をもつ二置換アセチレンの合成方法を開示している。米国特許第4,326,055 号（その全体を参考としてここに組み入れる）は、レチノイド様活性を有する5,6,7,8-テトラヒドロナフチルおよびインダニルスチルベン誘導体の合成方法を開示している。培養下のＲＰＥ細胞の増殖は、ＲＸＲアゴニスト活性をもつレチノイド化合物ではなく、ＲＡＲアゴニスト活性をもつレチノイド化合物によりin vitroで抑制されることが知られているので、抗増殖性レチノイド化合物は、例えば、M．Pfahlら， Methods in Enzymology，1:256-270，1990に開示され、また本発明の実施例１に例示されるような公知のin vitroトランス活性化アッセイ法を用いることにより、レチノイド化合物がＲＡＲアゴニスト活性をもつか否か調べることで、簡単に選択することができる。ＲＡＲ選択的アゴニストは細胞の過増殖を抑制し、全トランスＲＡにより生じた細胞形態と見分けのつかない細胞形態を生じさせるだろう。本発明で用いるのに適した合成ＲＡＲアゴニストの例は、エチル-6-[2-(4,4- ジメチルチオクロマン-6- イル)エチニル]ニコチネート（化合物 168）および6- [2-(4,4-ジメチルクロマン-6- イル)エチニル]ニコチン酸（化合物 299）（その合成は米国特許第5,234,926 号の実施例６および24にそれぞれ記載されている）並びにp-[(E)-2-(5,6,7,8-テトラヒドロ-5,5,8,8- テトラメチル-2- ナフチル) プロペニル]-安息香酸（化合物 183）（その合成は米国特許第4,326,055 号に記載されている）である。これに対して、ＲＸＲ選択的アゴニストの例は2-[(E)-2 -(5,6,7,8-テトラヒドロ-3,5,5,8,8- ペンタメチルナフタレン-2- イル) プロペン-1- イル]チオフェン-4- カルボン酸（化合物 701）（その合成は米国特許第5,324,840 号の実施例11に記載されている）である。好ましくは、ＲＡＲアゴニストは代謝的に安定で、ＲＡＲ経路に完全に特異的なままであるように選択される。かくして、代謝中に９−シスＲＡに異性化されてＲＡＲとＲＸＲの両経路を活性化させる全トランスＲＡは本発明で用いるのに適していない。レチノイドとＡＰ−１シグナル伝達経路間の混信（cross-talk）は高増殖疾患において治療的利益を得るために操作され得る。これは、ＡＰ−１依存性遺伝子発現の強力なアンタゴニストであるレチノイドが、ＲＰＥ細胞増殖の強力なインヒビターでもあるということから本発明において実証された。強力な抗増殖性ＲＡＲアゴニストは、本発明の実施例２に例示されるような一時的トランスフェクションＣＡＴアッセイで、ＡＰ−１依存性遺伝子発現を抑制するその能力を調べることによりスクリーニングすることができる。以下の実施例は、本発明を実施するための方法を示すものである。しかし、実施例は例示を目的としたものであって、本発明をそこに記載した特定の物質および条件に限定するものとして解釈されるべきでないことが理解されよう。実施例１受容体遺伝子構築物およびレポーター遺伝子を用いてＨｅＬａ細胞を一時的に同時トランスフェクトすることによってＨｅＬａ細胞において転写を誘導するレチノイド類の能力を測定することにより、レチノイド類のトランス活性化(trans activation)特性を調べた。レチノイド受容体は相同的機能ドメインによって特徴付けられる核受容体のステロイド受容体ファミリーのメンバーなので、エストロゲン受容体のアミノ末端およびＤＮＡ結合ドメインならびにレチノイド受容体（ＲＡＲ−α、β、γまたはＲＸＲ−αのいずれか）のホルモン結合ドメインを有するハイブリッド受容体を用いた。これらのＥＲ／ＲＡＲ受容体は、エストロゲン受容体（エストロゲン応答エレメント）によって認識されるプロモーター配列に結合することにより転写を活性化するが、それはレチノイドに対する応答である(D．Benbrookら，Nature，333:669-672，1988)。これまでの研究により、ハイブリッド受容体の活性化特性はそれらのリガンド結合ドメインによって決定されることが示されている。レチノイド類によるハイブリッド構築物の活性化を測定するため、内因性レチノイド受容体（これは哺乳動物細胞の全てとまではいかないが殆どに存在する）によっては活性化することができないエストロゲン受容体応答性レポーター遺伝子を用いた。ＲＸＲおよびＲＡＲ受容体部位の潜在的アゴニストとしての試験化合物の活性を測定するカチオンリポソーム媒介トランスフェクションアッセイは、実質的に P.L．Feignerら，Focus，11:2，1989(参考としてここに組み込まれる)の報告に従って、そして下記にまず原則的に次にアッセイの実施方法についての具体的な指示の形で記述するように、実施される。このアッセイに関連して、レチノイン酸受容体はステロイド／甲状腺受容体スーパーファミリーのメンバーであり、またレチノイン酸受容体は各受容体の間で相互交換可能なドメインを有することが知られている。したがって、エストロゲンＤＮＡ結合ドメインおよびエストロゲン応答エレメントであるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）酵素を有するキメラレチノイド受容体用プラスミドを構築し、そして培養した特定の細菌中で増殖させる。これらのプラスミドはそれぞれキメラＲＡＲα、ＲＡＲβ、ＲＡＲγまたはＲＸＲα受容体タンパク質、およびクロラムフェニコールアセチルＡトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）酵素タンパク質をコードしている。これらのプラスミドを有する細菌は、参考としてここに組み込んでいる「核レチノイン酸受容体：クローン化、分析、および機能」と題する論文（M．Pfahlら，Methods in Enzymology，189:256-2 70，1990）に記載の方法にしたがって得ることができる。各細菌からＤＮＡプラスミドを単離するための詳しい手順は、「スーパーコイルプラスミドの単離」という題のもとに具体的な指示の形で後述する。こうして試験手順にしたがって、キメラＲＡＲα、ＲＡＲβ、ＲＡＲγまたはＲＸＲα受容体タンパク質の１つをコードするＤＮＡプラスミドをＨｅＬａ細胞の培養物にトランスフェクトする。「カチオンリポソーム媒介トランスフェクションアッセイ」として以下に詳述するアッセイの第１日にＨｅＬａ細胞を培地で培養するのは、この目的のためである。このトランスフェクションアッセイの第２日に実施されるトランスフェクション手順において、各キメラＲＡＲα、ＲＡＲβ、ＲＡＲγまたはＲＸＲαをコードするプラスミドに加えて、ＣＡＴ酵素をコードするＤＮＡプラスミドもまた各細胞培養物に添加される。公知であり、また特に上に引用した M．Pfahl らの論文に鑑みて当業者によって容易に理解されるように、このアッセイに用いられるキメラレチノイド受容体は、特異的アゴニスト分子（例えばレチノイン酸および類似体）を認識して結合するリガンド結合ドメインを包含する。これらのキメラタンパク質受容体（M．P fahl らの論文の教示にしたがって構築された）は、ＣＡＴ酵素をコードするＤＮＡプラスミドに結合した「エストロゲン応答エレメント」（ＤＮＡ断片）に結合することが可能なＤＮＡ結合ドメインをも有する。この相互作用の性質は、アゴニスト（例えばレチノイン酸または類似体）が各ＲＡＲα、ＲＡＲβ、ＲＡＲ γまたはＲＸＲα受容体のリガンド結合ドメインに結合した場合のみ、この受容体はそのＤＮＡ結合ドメインを介してエストロゲン応答エレメント−クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ構築物（ＥＲＥ−ＣＡＴ）のエストロゲン応答エレメントに結合し、そしてＣＡＴ酵素のメッセンジャーＲＮＡの転写を開始させることができる、というものである。すなわち、このアッセイにおいては、適切なアゴニストリガンドが各レチノイド受容体のリガンド結合部位に結合した場合にのみ、多数の相互作用を経てＣＡＴ酵素がＨｅＬａ細胞によって産生されるのである。エストロゲン応答エレメント−クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ構築物（ＥＲＥ−ＣＡＴ）それ自体は、参考としてここに組み込まれるG.U. Rysselら，Cell，46:1053-1061，1986に記載の方法にしたがって得られる。この方法自体は当分野で周知である。細菌からエストロゲン応答エレメント−クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ構築物（ＥＲＥ−ＣＡＴ）を単離し獲得するための具体的な詳しい手順は、「スーパーコイル(supercoiled)プラスミドの単離」という題のもとに記述する。上記のものに加え、リポフェクチン（ＬＦ）もまた各細胞培養物に添加する。リポフェクチン添加の目的は、細胞膜を介したプラスミドの輸送を容易にするためである。この方法に用いられるリポフェクチンは市販されている。当業者には良く理解されるであろうが、ＲＡＲα、ＲＡＲβ、ＲＡＲγまたはＲＸＲαキメラ受容体をコードする２５個の各ＤＮＡプラスミドを用いたトランスフェクションの結果、およびＥＲＡ−ＣＡＴ（これは上記のＣＡＴ酵素をコードする）を用いてトランスフェクションした結果、上記のプラスミドはこのアッセイにおいて培養されたＨｅＬａ細胞に組み込まれる。レチノイド受容体プラスミドは転写を受けて（ｍＲＮＡとなり）、そして次に対応するキメラ受容体タンパク質に翻訳される。したがって、このようにして得られたＨｅＬａ細胞培養物は各ＲＡＲα、ＲＡＲβ、ＲＡＲγまたはＲＸＲαキメラ受容体タンパク質を産生する。ＥＲＡ−ＣＡＴを用いたトランスフェクションの結果、このアッセイの細胞培養物はＣＡＴ酵素を産生するための遺伝情報をも含有する。しかし、上に注記したように、適切なアゴニスト化合物が細胞中の各ＲＡＲα、ＲＡＲβ、ＲＡＲγまたはＲＸＲαキメラ受容体タンパク質に結合して活性化し、そしてこの活性化されたアゴニスト−受容体複合体がＥＲＥ−ＣＡＴ構築物のエストロゲン応答エレメントに結合しないかぎり、後者の遺伝情報は転写されず、ＣＡＴ酵素はこのアッセイの各細胞培養物によっては産生されない。アッセイの第３日目に、適切な基準化合物および試験化合物（アゴニストまたは有望なアゴニスト）を好ましくは様々な濃度で各ＨｅＬａ細胞培養物に添加することにより、アッセイ手順を継続する。この添加の結果、もし試験化合物がアゴニストであれば、各ＲＡＲα、ＲＡＲβ、ＲＡＲγまたはＲＸＲαキメラ受容体タンパク質に結合し、その結果ＣＡＴ酵素をコードする遺伝情報が細胞中で転写され、それによってＣＡＴ酵素が細胞によって産生される。以下に詳述するアッセイ手順の第４日目に実施される細胞の溶解後に、溶解物のアリコートにおけるＣＡＴ酵素の活性を測定する。これは、該溶解物をクロラムフェニコールおよびトリチウム標識化アセチル補酵素Ａと共にインキュベートすることにより実施する。最終測定として、ＣＡＴ酵素が関与する酵素反応により形成されるトリチウム標識化アセチルクロラムフェニコールの量をシンチレーションカウンターで測定する。基準化合物は、ＲＡＲα、ＲＡＲβおよびＲＡＲγ受容体を用いるアッセイにおいてはレチノイン酸（すべてトランス）であり、ＲＸＲαキメラ受容体を用いるアッセイにおいては4-(E)-2-(5,6,7,8-テトラヒドロ 3,5,5,8,8-ペンタメチルナフタレン-2-イル)-プロペン-1-イル安息香酸（本出願では化合物440とも称する）である。このアッセイで得られたデータを評価し、以下に示す。各試験化合物およびＲＡＲ受容体の各サブタイプについて、シンチレーションカウンターを用いた測定で得た「１分あたりのカウント」（ｃｐｍ）を試験化合物の濃度に対して（ｙ軸上に）プロットしたグラフ（またはグラフの数学的等価物）を作成する。同様のグラフ（またはグラフの数学的等価物）をレチノイン酸について作成する。試験化合物のＥＣ₅₀は、基準化合物であるレチノイン酸を用いた同一アッセイで同一受容体において得られる最大ｃｐｍ値（最大ＣＡＴ酵素活性）の半分（５０％）をもたらす試験化合物の濃度として定義される。ＲＸＲαに対するアッセイで得られたデータを評価して示すため、試験化合物および基準化合物（化合物440）について同種のグラフ（またはその数学的等価物）を作成する。この基準化合物はＲＸＲα受容体部位の公知のアゴニストである。ＥＣ₅₀とは、化合物440 を用いた場合に同一アッセイにおいて同一受容体に関して得られる最大ｃｐｍ値（ＣＡＴ酵素活性）の半分（５０％）をもたらす試験化合物の濃度である。スーパーコイルプラスミドの単離大規模１Ｌ調製物ＤＮＡの単離１．細胞を氷上に15分間おく。細菌細胞（E.coli）を、JA14ローター、Beckman J2-21 M 遠心機を用いて250 mlのナルジーン(nalgene)チューブに入れ、7k rpm で、4 ℃で10分間遠心して集める。上清を捨てる。２．各細胞ペレットに 1.0 ml の溶液Ｉを加え、ボルテックスで撹拌してペレットを再懸濁する。1.0 ml の細胞を１本のボトルから別のボトルに移す。これを5 0 ml容オークリッジ(Oakridge)チューブに移す。4.0 ml の溶液Ｉを用いて、再度１本のボトルから別のボトルに移しながらボトルを洗浄する。これもまた上記のオークリッジチューブに移す。ピペットを用いて溶液Ｉで希釈して全容量を16 ml とし、溶液を混合する。8 mlを第２のオークリッジチューブに移す。室温で５分間保存する。溶液Ｉ 50 mM グルコース、25 mM Tris-Cl pH 8、10 mM EDNA pH 8 ３．各チューブに新たに調製した溶液IIを加える。チューブを数回逆さまにして内容物を穏やかに混合する。氷上で10分間保存する。その後、液体は凝集物のない、透明な状態でなければならない。（もし凝集塊があったら、細胞は前の段階で十分懸濁されていない。）溶液II １％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.2 N NaOH（4 mlの 10% SDS、0.8 mlの1 0 N NaOH、35.2 ml の水）４．12 ml（または適切な量の）の氷冷溶液III をチューブに加える。チューブを素早く数回逆さまにし、内容物を混合する。白色の綿状の沈殿物が現れるはずである。氷上で10分間保存する。溶液III 以下のように調製する: 60 ml の5 M 酢酸カリウムに11.5 ml の氷酢酸および 28.5 ml の水を加える。５．Beckman J2-21M遠心機 JA20 ローターを用いて、4 ℃で、17 k rpmで30分間遠心する。６．約12 ml の上清をオークリッジチューブから６個の焼成コレックス(Corex) チューブにピペットで移す。0.6 容量のイソプロパノール(7.2 ml)を加え、チューブを逆さまにして混合し、室温で15分間保存し、ＤＮＡを沈殿させる。７．JA20ローターを14 k rpmで15分間20℃で回転させてBeckman 遠心機を暖める。８．J2-21M遠心機、JA20ローターを用いて、10.5 k rpmで30分間、20℃でＤＮＡをペレット化する（コレックスチューブ用のアダプターを使用する）。９．上清を捨て、減圧フラスコ上でパスツールピペットを用いてチューブの内側を乾燥させる。 10．減圧デシケーターを用いて10分間乾燥させる。(乾燥時間がこれより長いと、ペレットを溶解するのが難しくなる。) ＣｓＣｌ密度勾配を用いて遠心によりプラスミドＤＮＡを平衡化するまで精製する。 11．各コレックスチューブに1 mlのＴＥ(10 mM Tris-Cl pH 8、1 mM EDNA pH 8) を加えてペレットを溶解する。チューブを37℃の水浴に入れてペレットの速いい溶解を促す(15 〜30分)。 12．液体をバッチから１本のチューブに移す。ＴＥを用いて容量を8.5 mlにする。 13．DNaseを含まない100 μlのRNase(2 U/μl、Boehringer Mannheim Biochemic al（BMB）製)(Indianapolis，IN)を加える。 14．10 mg/mlの臭化エチジウムを400 μl 加える。 15．9.0 g のＣｓＣｌを加え、パスツールピペットを用いて混合する。 16．２本の 13x51 mm Beckman ポリアロマー急速シール(quick seal)遠心管に溶液を加える。 17．Beckman 超遠心機、VTi65.2 ローターを用いて、50 k rpmで12時間、20℃で遠心する。 18．超遠心の後、２本のＤＮＡバンドが見えるはずである。上のバンドは直鎖状の細菌ＤＮＡおよびニックの入った（nicked）環状プラスミドＤＮＡからなる。下のバンドは閉環状プラスミドＤＮＡからなる。21ゲージの針に合った3 mlのシリンジを用いて、下のＣｓＣｌによってバンド化したＤＮＡのみを遠心管から除去する（針をチューブの側面に挿入し、1.5〜2 mlを除去する）。 19．第２ＣｓＣｌ遠心分離のための準備（9 ml - 第１ＣｓＣｌバンドの容量）- ＣｓＣｌのグラム数（9 ml - 第１バンドの容量 - 100μl 10 mg/ml 臭化エチジウム - 50μl RNase）- ml ＴＥ pH 8.0 第１バンド、ＴＥ、ＣｓＣｌ、RNase および臭化エチジウムを混合する。 20．溶液を２本の急速シール遠心管に加える。 21．超遠心機、VTi65.2 ローターを用いて、50 k rpmで12時間、または60 k rpm で４時間、20℃で遠心する。 22．ＣｓＣｌバンド化ＤＮＡ（下のバンドのみ）を２回、5 ml容Falconスナップチューブに取り除く（上記工程18に記載のように）。臭化エチジウムの抽出 23．ヒュームフードの下で同容量のイソアミルアルコールを加え、ボルテックスで攪拌し、Beckman TJ-6遠心機を用いて室温で1500 rpmで3 分間遠心する。 24．底の水層を新しい遠心管に移す。3 〜4 回、または水層が透明になる（ピンク色がなくなる）まで、遠心を繰り返す。 25．透明な水層をSpectra/Por 3 透析チューブ mwco 3500に移す。（透析チューブをクランプする前に、チューブの底の結び目をゆわえる。）パスツールピペットを用いて液体を加える。頂部または透析チューブをクランプする。輪ゴムを用いて2.8 L のＴＥ（28 ml 1 M Tris-Cl，pH 8，5.6 ml 0.500 M EDNA，pH 8）中にチューブを浮遊させる。手袋をつけて、常に透析チューブを注意深く取り扱う。 26．2.8 L のＴＥ（pH 8）を数回交換して、これを外液として水相を透析する（ 1 x 2〜4 時間、一晩および翌日1 x 2〜4 時間）。 27．組織培養フード内で、透析したＤＮＡを無菌の微小遠心管に移す。遠心管にラベルを貼り、-20℃で保存する。カチオンリポソーム媒介トランスフェクション参照文献: P.L．Felgnerら，Focus，11:2，1989 全体を通して無菌技法を用いる。 T-125 培養フラスコ中でＨｅＬａまたはＣＶ−１細胞を増殖させる。週に２回、通常は月曜日および金曜日に細胞を継代する（0.5 mlの細胞を15 mlの培地へ）。第１日：細胞をまく１．細胞をトリプシン化し、T-162 cm²培養フラスコから集める。血球計を用いて細胞を数える。通常、この細胞量は16枚の12ウエルプレートに十分である。２．細胞数に基づいて、ウエルあたり細胞60,000個という濃度になるように培地 (D-MEM 低グルコース、10% ウシ胎児血清(FBS)、2 mM 20 Glu)で細胞を希釈する。細胞計算の例：細胞40,000個／ウエルの濃度及び200 個のウエルが必要であり、 mlあたり(X)個の細胞を有するとすると、細胞40,000個／ウエルｘ 200 ウエル − 全ml数の細胞 (X) 個／ml が必要である。 200 mlのフィルターユニットレシーバーを用いて、培地に全ml数の細胞を加え、最終容量を200 mlとする。ピペッティングにより十分混合する。３．無菌の12.5 ml の滴下器(dropper)を用いて、ウエルあたり1.0 mlの細胞を加える。プレートを前後に揺する（グルグル回さない）。37℃で湿潤化5%ＣＯ₂ 環境下で一晩インキュベートする。トランスフェクションの前に細胞は約40% 集密である。トランスフェクション：第２日：ＤＮＡ／リポフェクチン複合体の調製１．50 ml のポリスチレンチューブを用いてリポフェクチン（ＬＦ）及びＤＮＡを別々に調製する。ウエルあたり2 μg のＬＦ、ウエルあたり500 ngのＥＲＥ− ＣＡＴＤＮＡ、ウエルあたり100 ngのＥＲ／ＲＡＲＤＮＡに必要なＬＦおよびＤＮＡの量を決定する。実験に必要な全容量を決定する。（ＤＮＡ濃度は各プラスミド調製物によって変わる）。Opti-Mem培地(Gibco-BRL; Gaithersburg，MD )を用いて25μl x ウエル数の容量でＬＦおよびＤＮＡを別々に希釈する：Opt i-Mem Iの容量＝（25μl x ウエル数）− ＤＮＡまたはＬＦの全量２．希釈したＬＦを希釈したＤＮＡに加え、チューブを穏やかにぐるぐる回す。室温で10分間静置する。３．ウエルから培地を吸い出し、0.5 mlのOpti-Mem Iを用いて２回洗浄する（無菌の12.5 ml のコンビチップ(combitip)、セッティング２）。４．ＤＮＡ／ＬＦ複合体をOpti-Memに加える（450 μl ｘウエル数）。チューブを逆さまにして混合する。無菌の12.5 ml の滴下器を用いて、各ウエルに500 μl を加える。プレートを前後に揺らして混合する。ぐるぐる回さない。５．細胞を湿潤化5%ＣＯ₂インキュベーター中で37℃で６時間インキュベートする。６．６時間後に0.5 mlの培地を各ウエルに加える(ダルベッコ改変イーグル培地( D-MEM)低グルコース、チャーコール処理20% FBS、2 mM Glu)。12.5 ml の滴下器を用いてインキュベーターに戻す。 10 第３日：薬剤添加１．トランスフェクションを開始して18時間後に、無菌の0.5 mlの滴下器を用いて、レチノイド類をそれぞれ３個１組のサンプルに添加し(10 μl)、湿潤化5% ＣＯ₂環境下で37℃で20〜24時間インキュベートする。薬剤希釈物重量(g) x 1 x 100 ml = ml アセトン mol.重量 (g/mol) .005 mol/L L例：レチノイド類を 5 mM の濃度となるようにアセトンに溶解し、さらにEtOHを用いて1 mMに希釈する。レチノイド類が溶解しない場合は、試験管を5 秒間湯に入れ、次に激しく攪拌する。各実験には異なる希釈スキームがあってもよい。大きさの桁(order of magnitude)あたり２つの濃度にするには、以下のように3.16 倍希釈物を用いる。すなわち、ラベルを貼った無菌の12x75 mmの試験管に、1080 μl の100% EtOH を加える。上記の1 mM溶液を用いて、500 μl を次の試験管に移す(316μM)。ボルテックスで攪拌し、そして次の試験管に移すことを繰り返す。ある種のレチノイド類、特にＲＡおよび13-シスＲＡは光に感受性なので、赤色光又は非常にかすかな光のもとで用いなければならない。例第４日：混合相ＣＡＴアッセイ１．0.50 ml の1X PBS（Ca/Mg を含まない）を用いて、12 mm のウエル中で細胞を１回洗浄する。２．5 mlのピペットを用いて、下記のように調製した100 μlの氷冷1% Triton、 1 mM Tris-Cl pH 7.8、2 mM EDTA pH 8、DNase I を添加する。溶解緩衝液（低浸透圧緩衝液） 2.0 mg DNase I（Sigma，St．Louis，MO） 4.925 ml 水 50.0μl 100% Triton X-100（BMB） 5.0μl 1 M Tris-Cl pH 7.8 20.0μl 0.5 M EDTA pH 8 5.0 ml ３．60分間氷上に置く。時折攪拌する。４．チャンネル#1、#3、#6にチップを付けたタイタートレック(titertrek)マルチチャンネルピペットを用いて、３個のウエル由来の50μl の溶解物を一度に96 Ｕ底ウエル（Costar，Cambrige，MA）に移す。（未使用溶解物の）プレートを-2 0 ℃で保存する。５．1.25 ml のコンビピペット（セッティング１）を用いて、ウエルあたり50μ l のプレ混合物(premix)を加え、プレートを穏やかに揺すり、37℃で2 時間インキュベートする。ブランク反応あたりのあたりの容量容量 X (アッセイ数) = 合計容量 47.0 27.0μl 緩衝液Ｉ（250 mM Tris-Cl pH 7.8、5 mM EDTA） 1.5 1.5μl 1 mM HCl *** 20.0μl 5 mM クロラムフェニコール(緩衝液Ｉ中で新たに調製） 0.75 水に溶解した0.75μl 4 mM アセチル CoA（新たに調製） 0.80 0.80μl 3H-アセチル CoA（New England Nuclear，Boston， MA #NET-290L、200 mCi/mmol）６．タイタートレックマルチチャンネルピペットを用いて、100 μl の7 M 尿素 (Mallincrokt，Chesterfield，MD)を各反応ウエルに添加し、反応を停止させる。一度に６個のウエルを処理する。７．タイタートレックマルチチャンネルピペットを用いて、200 μl の反応混合物を5 mlのプラスチックシンチレーションバイアル(Research Products Interna tional #125514、Mount Prospect，IL)に移す。一度に３つの反応混合物を処理する。８．1 mlの0.8% 2,5−ジフェニルオキサゾール(PPO)/トルエン(3.2 g PPO(Malli nckrodt-RPI)/4L トルエン(Mallinckrodt ScintillAR^TM)を加える。ボルテックスで5 秒間激しく攪拌し、15分間相を分離させる。Beckman LS 3801で２分間ｃｐｍを測定する。受容体サブタイプＲＡＲ−α、ＲＡＲ−β、ＲＡＲ−γおよびＲＸＲ−αに対するレチノイド活性を測定した。下記の表１は、この研究に用いた各レチノイドについての、ＲＡＲ−α、β、 γおよびＲＸＲ−αを活性化するためのＥＣ₅₀を示す。４つの作用物質が、ＲＸＲ受容体と比較してＲＡＲ受容体の活性化の方に良好な選択性を示した。２つの作用物質、すなわち9-シス-ＲＡおよび合成アゴニストである化合物659 はＲＡＲ受容体およびＲＸＲ受容体の両方を活性化する。実施例２ここに参考としてその全体を組み入れるP.A．Campochiaroら，Invest．Ophtha lmol．Vis．Sci.，27:1615-1621，1986 に記載の技法を用いて、Old Dominion E ye Bank(Richmond，VA)または Eye Bank of Maryland（Baltimore，MD）から得た眼から、ヒト網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の一次培養物を樹立した。この研究に用いたＲＰＥ細胞系は年齢がそれぞれ60歳および76歳の２人のドナーに由来する。それぞれの細胞系を公知の技法を用いてサイトケラチン(cytoker atin)で均一に染色した(K.H．Leschey ら，Invest．Ophthalmol．Vis． Sci．31:839-846，1990）。全トランスＲＡはSigma(St．Louis，MO)より入手し、9-シスレチノイン酸および合成レチノイドアゴニストはAllergan，Inc.(Irvin e，CA)より入手した。 [³H]チミジンの取り込みのために、継代３または４のＲＰＥ細胞を軽くトリプシン化し、そして24ウエルプレートの16mmのウエルにまいた。トランスフェクトした細胞を一晩付着させ、次に5%ウシ胎児血清(FBS)を含有する培地にレチノイド類またはビヒクルのみを補充した。ジメチルスルホキシド(DMSO)を用いてレチノイド類の原液(10^-3 M)を調製し、使用時まで凍結アリコートとして保存した。 DMSOの最高最終濃度は0.1%であり、これは対照培養物に対しても用いた。新たに調製されたレチノイド類を含有する培地を３日ごとに交換した。第７または10日目に、2 μCi/ml の[³H]チミジン（比活性: 6.7 Ci/mM; New England Nuclear， Boston，MA）を培養物に添加し、上述の方法で(Leschey、前出)取り込みを測定した。ヒトＲＰＥ細胞における血清刺激ＤＮＡ合成の抑制に対するレチノイドアゴニストの効力を試験した。ＲＰＥ細胞（4x10⁴細胞）を24ウエルプレートの16 mmのウエルにまいて、10% ウシ胎児血清(Life Technologies，Inc.)を含有するDMEM 中で６日間増殖させた。この培地は種々の濃度の下記化合物の１つで補充されていた。すなわち、化合物#745、183、659または701、全トランスレチノイン酸（ＲＡ）または9-シスレチノイン酸（9-シス-ＲＡ）である。細胞を同一濃度のレチノイドを含有する無血清培地に移し、次に10% 血清を用いて18時間パルスした。その後、[³H]チミジンの取り込みを測定した。対照培地で増殖させた細胞のチミジン取り込みを用いて、４つの濃度の各レチノイド（各濃度とも３個１組のサンプルを使って試験した）によって誘導されたチミジン取り込みの抑制パーセントを算出した。これらの濃度は次に各細胞系を生成するのに用いた。図１にまとめた結果から分かるように、ＲＰＥ細胞を全トランスＲＡまたは9- シス-ＲＡ中で７日間インキュベートすると、[³H]チミジン取り込みの用量依存性の抑制がもたらされる。表２にまとめた結果から分かるように、10日間のインキュベーションはより大きな抑制をもたらし、全トランスＲＡおよび9-シス-ＲＡの効力は非常に類似している。ＲＡＲ受容体を選択的に活性化する４つの合成レチノイドのそれぞれを用いてＲＰＥ細胞を７または10日間インキュベートすると、[³H]チミジン取り込みの強い抑制がもたらされる。ＲＸＲ受容体選択性アゴニスト（化合物701）はＲＡＲ選択性アゴニストよりも遙に効果の少ないＲＰＥ[³H]チミジン取り込みのインヒビターであった。そして、ＲＸＲおよびＲＡＲ受容体の両方を活性化するアゴニスト（9-シスＲＡおよび化合物659）はＲＡＲ受容体のみを活性化するアゴニストに較べてより良好なインヒビターではなかった。実施例３レポーター遺伝子および受容体発現ベクターを用いてＨｅＬａ細胞を一時的に同時トランスフェクトすることによってＨｅＬａ細胞におけるＡＰ−１依存性遺伝子発現を抑制するレチノイド類の能力を測定することにより、レチノイド類の抗ＡＰ−１特性を調べる。ＲＡＲのＤＮＡ結合ドメインはＡＰ−１依存性遺伝子発現の抑制に関与しているので(R．Schuleら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA， 88:6092-6096，1991)、トランスフェクションアッセイにＲＡＲのホロ受容体（h oloreceptor）(α、βおよびγ)を用いて、ＡＰ−１依存性遺伝子発現の拮抗作用におけるレチノイド類の相対的効力を定量化する。組換えプラスミドＲＡＲ（α、βおよびγ）の発現ベクターについてはすでに記述されている(E .A．Allegretto ら，J．Biol．Chem.，268:26625-26633，1993)。ＡＰ−１レポータープラスミド構築物である Str-AP-1-CAT は、ラットストロメリシン−１(s tromelysin-1)プロモーター(L.M．Matrisianら，6:1679-1686，1986)の−84から＋１までの塩基対を pBLCAT3の Hind III-Bam HI部位にクローン化することにより調製された(B．LuckowおよびG．Schutz，Nucl．Acids Res.，15:5490，1987) 。ストロメリシン−１プロモーターのこの配列は、唯一のエンハンサーエレメントとしてＡＰ−１モチーフを含んでいる(R.C．Nicholsonら、EMBO J.，9:4443-4 454，1990)。このプロモーター配列は、末端にHind IIIおよび BamHI 制限部位を有する２つの合成オリゴヌクレオチドである5'- AGAAGCTT ATG GAA GCA ATT A TG AGT CAG TTT GCG GGT GAC TCT GCA AAT ACT GCC ACT CTA TAA AAG TTG GGC T CA GAA AGG TGG ACC TCG A GGATCCAG -3'（配列番号１）および5'-CT GGATCC TCG AGG TCC ACC TTT CTG AGC CCA ACT TTT ATA GAG TGG CAG TAT TTG CAG AGT CAC CCG CAA ACT GAC TCA TAA TTG CTT CCA T AAGCTT CT -3'（配列番号２）をアニーリングすることにより調製した。スーパーコイルプラスミド発現ベクターおよびレポーターベクターを得るための具体的な詳細は実施例１に詳しく記述されている。細胞のトランスフェクションおよびＣＡＴアッセイレチノイド媒介ＡＰ−１拮抗作用アッセイのため、10% ウシ胎児血清(FBS，Li fe Technologies，Inc.)を含有するダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で増殖させたＨｅＬａ細胞を、カチオンリポソーム媒介トランスフェクション法(P． L．Felgnerら，Focus，11:2，1989)を用いてトランスフェクトする。トランスフェクションの18時間前に細胞を約40% のコンフルエンスで12ウエル組織培養プレート(Costar，Cambridge，MA)にまく。各ウエルにつき１μg の受容体構築物Str -AP-1-CAT および0.2 μg のヒトＲＡＲα、βまたはγ発現ベクター、ならびに 2 μg のリポフェクタミン(Lipofectamine)(Life Technologies，Inc.)を全容量 500 μl 中で用いて、細胞をトランスフェクトする。組換えHeLa細胞のプレーティングの詳細は実施例１に記述されている。ウエルあたり2 μg のリポフェクタミン、ウエルあたり1 μg の Str-AP-1-CAT および0.2 μg のＲＡＲ発現ベクターを50 ml のポリスチレンチューブ中で混合することにより得られるＤＮＡ／リポフェクタミン複合体は、本発明の実施例１のＤＮＡ／リポフェクチン複合体について記述したのと全く同じ方法で処理し、HeLa細胞と共にインキュベートする。細胞に移入する前に、リポフェクタミンを用いてＤＮＡを室温で30分間沈殿させる。トランスフェクションの5 時間後に、チャーコールで処理した20% FBS(Ge mini Bioproducts，Inc.，CA)を含有する500 μl のDMEMを加える。すべてのトランスフェクションは３回の反復実験を実施する。トランスフェクションの18時間後に試験レチノイド類（濃度10^-10から10^-7 M）を添加し、そしてその６時間後に12-O-テトラデカノイルホルビル-14-アセテート(TPA)を用いて細胞を処理しＡＰ−１活性を誘導する。レチノイド類を濃度 5 mM となるようにアセトンに溶解し、さらにこの原液からエタノールを用いて希釈する。翌日、カルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝化生理食塩水(Life Technologies，Inc.)で洗浄した後、細胞を集め、そして本発明の実施例１の混合相ＣＡＴアッセイの節に記述したDNase I、T riton X-100、Tris-HClおよびEDTAを含有する低張緩衝液（100 μl/ウエル）を用いて細胞を時折攪拌しながら60分間溶解する。96-ウエルＵ底プレート(Costar )中で［³H］アセチル補酵素Ａ（DuPont NEN）を用いて、50μl の溶解細胞抽出物におけるＣＡＴ活性をアッセイする。液体シンチレーションカウンターを用いてクロラムフェニコールの³H-アセチル化体の量を測定することによりＣＡＴ活性を定量化する。ＣＡＴアッセイおよびクロラムフェニコールの標識化アセチル化体のシンチレーション計測の詳しい手順は、本発明の実施例１に記述されている。実施例３に記載したＡＰ１活性の抑制におけるレチノイドアゴニストの効果を表３に示す。表３には、実施例２に記述するように測定された、ＲＰＥ細胞増殖の抑制における同じレチノイドの効果をも示す。ＡＰ１活性の強力なインヒビターである化合物（例えば、化合物521、183および659)は、すべてＲＰＥ細胞増殖の有効なインヒビターである。対照的に、ＡＰ１活性の効果のないインヒビターである化合物(例えば、化合物867および810)は、ＲＰＥ細胞増殖の抑制においても効果がない。実施例４甲状腺ホルモン（Ｔ３）によって活性化される甲状腺ホルモン受容体、デキサメタゾン(Dex)によって活性化されるグルココルチコイド受容体、1,25-ジヒドロキシビタミンＤ₃（Ｄ３）によって活性化されるビタミンＤ受容体を含む他の核受容体は、抗ＡＰ１活性を媒介することができる。ＲＰＥ細胞増殖に対するデキサメタゾン、Ｔ３およびＤ３の効果（実施例２に記載のように測定した）を単独で、およびレチノイン酸（ＲＡ）との組合せで検討した。結果を図３に示す。デキサメタゾンはＲＰＥ細胞増殖を抑制したが、Ｔ３およびＤ３は抑制しなかった。しかし、これらの作用物質のそれぞれは、レチノイン酸と組み合わせて用いた場合、相乗的効果を有した。このことは、ＲＡＲアゴニストがＲＰＥ細胞増殖を抑制する作用機構はＡＰ１活性の拮抗作用によるものであることを支持する証拠を提供し、またＡＰ１活性の他の有効なインヒビターを単独で又はＲＡＲアゴニストと組み合わせて用いるとＰＶＲの治療に有効であることを示唆している。実施例５ＲＰＥ細胞形態に及ぼす種々のレチノイドの効果を確認するため、実施例１に記述した２人のドナー由来のＲＰＥ細胞を35 mm のウエルにまいて、プラスチック上で5%血清を含有する培地を用いて10日間、下記の３つのレチノイドのうち１つの存在下(１μM)または不在下で増殖させた。すなわち、全トランスＲＡ、ＲＡＲ選択性アゴニスト(化合物183)またはＲＸＲ選択性アゴニスト(化合物701)である。図2Aおよび2Bに示すように、5%血清を含有するが他の添加物を含まない培地で増殖させたＲＰＥ細胞は、１個の細胞からの多数の突起(processes)が近隣の細胞上に伸びていく広範な過増殖を示した。全トランスＲＡで処理した細胞は細胞の過増殖を示さず、図2Cおよび2Dに示すようにＲＰＥ本来の形態により類似した形態をもたらした。ＲＡＲ選択性アゴニストもまた細胞の過増殖を阻止し、全トランスＲＡによってもたらされた形態と区別のつかない形態をもたらした(図2E および2F)。他方、ＲＸＲ選択性アゴニストは細胞の過増殖を阻止せず、図2Gおよび2Hに示すように対照と区別のつかない形態をもたらした。トリパンブルー排除試験は、各レチノイドを補充した全培養物において10% 未満の細胞染色を示し、対照との間に統計学的な差はなかった。実施例６ H.A．Senら(Arch．Ophthalmol.，106:1291-1294，1988)（参考としてここに全体を組み入れている）によって最初に記述されたＰＶＲのウサギ細胞注入モデルを用いてレチノイド類の硝子体内注射の効果を検討した。すなわち、色素沈着したウサギを5 mg/kg のキシラジンおよび25 mg/kgのケタミンの皮下注射により麻ながら、5x10⁵個のＲＰＥ細胞を硝子体腔の視神経のすぐ前に注入した。最初の実験では、ウサギに100 μg の全トランスＲＡ、選択的ＲＸＲアゴニスト(化合物701)、選択的ＲＡＲアゴニスト(化合物183)またはビヒクルの硝子体内注射を行なった。第7、14および28日目に間接検眼鏡検査によりウサギを検査し、牽引性網膜剥離を等級づけた。全トランスＲＡの注射後、局在化した沈降物の黄色い曇りが硝子体に出現し、数週間残った。他のアゴニストの注射は、白色の曇りをもたらした。２〜３週間のうちに局在化した曇りは小さくなり、消えた。網膜には可視的な変化は全くなかった。表４にまとめたデータが示すように、全トランスＲＡを注射した眼は、ビヒクル単独を注射した眼よりも牽引性網膜剥離の発生が少なく (p<0.05)かつ重症度が低かった。他方、ＲＸＲ選択性アゴニストを注射した眼は対照と差異がなかった。最初のウザギグループにおいては、５匹がＲＡＲ選択性アゴニストの硝子体内注射を２回受けた。これらのウサギはどれも網膜剥離を発症しなかったが、全てが脱毛および食欲不振を体験し、そのうち２匹は２８日間の観察期間の終了する前に死亡した。脱毛および恐らくは食欲不振ならびに死亡は、眼から全身に行き渡った薬剤の全身毒性によるものと思われた。別のグループのウサギを、50μg のＲＡＲアゴニスト、50μg および100 μg のＲＡ、または100 μg のＲＸＲアゴニスト(701)、またはビヒクル単独の硝子体内注射を、ＲＰＥ細胞注入の１日後に１回施す方法で試験した。ＲＡＲアゴニストまたはＲＡを注射した眼は、対照の眼よりも網膜剥離の発生が少なく(p<0.05)かつ重症度が低かった。しかし、ＲＸＲアゴニストを注射した眼は、対照と統計学的に差異はなかった。どのウサギも脱毛を経験せず、また死亡したものもなかった。これらのウサギの食欲は正常なように思われた。実施例７眼毒性を検査するため、100 μg の全トランスＲＡ、ＲＡＲ選択性アゴニスト (化合物183)、ＲＸＲ選択性アゴニスト（化合物701）、ＲＡＲおよびＲＸＲの両方を活性化するアゴニスト(化合物659)、またはビヒクル単独をウサギの硝子体内に１回注射した。注射の２週間後にウサギを屠殺した。ウサギ網膜の組織病理学的検査の結果を表５にまとめて示す。一般に、網膜はよく保存されていて、アーチファクト（人工産物）にすぎないと思われる軽度の変化が見られるのみであった。下記の表５のデータが示すように、ビヒクルを注射したものも含めて全ての眼は軽い硝子体炎を示した。ＲＸＲアゴニストを注射した眼の１つ、およびＲＸＲとＲＡＲの両方に活性を示すアゴニストを注射した眼の１つは、網膜壊死の２〜３の病巣域を示した。このＲＸＲを注射した同じ眼は内網膜水腫の２〜３の病巣域をも示し、類似の病巣域はＲＡＲアゴニストを注射した眼の１つにも見られた。ＲＡＲアゴニストを注射した眼の１つおよびＲＸＲとＲＡＲの両方に活性を示すアゴニストを注射した眼の１つに、光受容体変性の病巣域が散見された。薬剤を注射した眼のうち数個において、網膜が白色化した領域が見られ、これは薬剤の沈降と関連していた。このことは、化合物168 または299 の高濃度の局在化領域は、網膜剥離の高率発症に関与しうる網膜損傷を引き起こす可能性があることを示唆していた。硝子体におけるレチノイド類の溶解性が乏しいことが沈降物および高濃度の局在化領域を生じ、これらが毒性をもたらした、と結論された。実施例９いくつかのＲＡＲアゴニストには毒性があるため、そしてレチノイド類の効果は発現が遅延され又可逆的であるため、レチノイド類の持続的放出方法を検討した。持続的放出デリバリーの選択すべき方法を調べるため、ウサギにヒトＲＰＥ細胞 5x10⁵個を硝子体内注入した後、0.3 mgの化合物168、299 またはＲＡを１日１回５日間結膜下注射した。表７に示す結果は、対照と比較して、５日間にわたって行なわれた全３種類のレチノイドの結膜下注射は牽引性網膜剥離(TRD)を低下させた。ＲＡＲ特異的アゴニストの治療的効果は、ＲＸＲおよびＲＡＲの両方に対するアゴニストであるＲＡのそれよりも大きかった。網膜に対する毒性の徴候は全く見られなかった。実施例１０ＰＶＲのウサギモデルを用いて、ＲＡＲアゴニストの結膜下注射の効果を実施例７に記述するように試験した。ただし、ＲＰＥ細胞の代わりに、ヒト皮膚繊維芽細胞を硝子体腔に注入した。一般に、このモデルはＲＰＥ細胞を使用したモデルよりもより高率で網膜剥離を発症し、かつより重篤な剥離を示す傾向がある。しかし、表８のデータに示すように、化合物168、299および全トランスＲＡの結膜下注射は全て、対照と比較しての改善は実施例９ほど大きくなかったが、実施例９に記載の試験の結果と比較して網膜剥離の数を減少させ、それが発症する速度を低下させた。実施例１１この実験では、標準的技法を用いてレチノイドを脂質微小胞(microvesicle)に組み込んだ。ウサギにヒト皮膚繊維芽細胞 5x10⁵個を硝子体内注入した後、その当日に全トランスＲＡ、化合物168または299 を封入した微小胞およびビヒクルを硝子体腔に注射した。下記の表９のデータに示すように、化合物168を含有する微小胞は牽引性網膜剥離を阻止するのに非常に効果的であった。他方、化合物 299 または全トランスＲＡを含有する微小胞は、対照群と比較して有効ではなかった。レチノイドを脂質微小胞に組み込み、ヒト皮膚繊維芽細胞 5x10⁵個を硝子体内注入した後、その当日にウサギの眼の結膜下に注射した。下記の表10のデータに示すように、化合物168は他のレチノイドまたはビヒクルよりも牽引性網膜剥離を阻止するのに実質的により効果的であった。本発明の上記の記述は、説明の目的上適例となるものである。本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の改変がなされうることが理解されねばならない。したがって、以下の請求の範囲はそのような改変をすべて包含するものとして意図されている。配列の概略配列番号１は、ストロメリシン−１プロモーターのためのオリゴヌクレオチドプライマーである。配列番号２は、ストロメリシン−１プロモーターのためのオリゴヌクレオチドプライマーである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 31/465 ＡＢＬＡ６１Ｋ 47/24 Ｇ 47/24 9/14 Ｋ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者キャンポチャーロ，ピーターエイ. アメリカ合衆国 21210 メリーランド州バルチモア，ウエストレイクアベニュー 920 (72)発明者ウィーラー，ラリーエイ. アメリカ合衆国 92715 カリフォルニア州アービン，バレービュー 18 (72)発明者チャンドラレイナ，ローシャンサエイ. アメリカ合衆国 92691 カリフォルニア州ミッションビジョー，エンプレッサ 25841 (72)発明者ナグパル，スニルアメリカ合衆国 92715 カリフォルニア州アービン，ジョランダンアベニューナンバー16ビー，17552 (72)発明者デジュアン，ユージーンジュニア. アメリカ合衆国 21287−9277 メリーランド州バルチモア，ノースウォルフストリート 600 ザジョーンズホプキンスホスピタルザウィルマーホスピタル，モーメニー 721

Claims

【特許請求の範囲】１．網膜色素上皮（ＲＰＥ）の増殖と関連した疾患の改善方法であって、それを必要としている被験者の網膜色素上皮細胞を、レチノイン酸を除いた、治療量のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アゴニストと接触させることを含んでなる方法。２．ＲＡＲアゴニストが特異的なＲＡＲアゴニストである、請求項１に記載の方法。３．ＲＡＲアゴニストがＡＰ−１依存性遺伝子発現を実質的に抑制する、請求項１に記載の方法。４．ＲＡＲアゴニストがエチル-6-[2-(4,4- ジメチルチオクロマン-6- イル)エチニル]ニコチネート（化合物 168）である、請求項２に記載の方法。５．ＲＡＲアゴニストが 6-[2-(4,4- ジメチルクロマン-6- イル)エチニル]ニコチン酸（化合物 299）である、請求項２に記載の方法。６．ＲＡＲアゴニストが p-[(E)-2-(5,6,7,8- テトラヒドロ-5,5,8,8- テトラメチル-2- ナフチル)プロペニル]-安息香酸（化合物 183）である、請求項２に記載の方法。７．その結果として増殖性硝子体網膜症が実質的に阻止される、請求項１に記載の方法。８．ＲＡＲアゴニストがＡＰ−１依存性遺伝子発現のアンタゴニストでもある、請求項１に記載の方法。９．ＲＡＲアゴニストが非内因性である、請求項１に記載の方法。 10．ＲＡＲアゴニストを硝子体腔に注入する、請求項１に記載の方法。 11．治療量が約５０〜１５０μg の範囲である、請求項１に記載の方法。 12．前記の接触が手術または外傷後約２４時間以内に投与される１回量によるものである、請求項11に記載の方法。 13．前記の接触が持続放出によるものである、請求項11に記載の方法。 14．持続放出が約３〜２０日間である、請求項13に記載の方法。 15．ＲＡＲアゴニストをリポソーム内に保持させる、請求項13に記載の方法。 16．ＲＡＲアゴニストを微粒子に圧縮製剤化する、請求項13に記載の方法。 17．微粒子を強膜ポケットまたは結膜下腔に投与する、請求項16に記載の方法。 18．ＲＡＲアゴニストを生物学的に不活性な液体に溶解する、請求項12に記載の方法。 19．前記の液体がシリコーン油である、請求項18に記載の方法。 20．ＲＡＲアゴニストが９−シス−レチノイン酸である、請求項１に記載の方法。 21．網膜色素上皮（ＲＰＥ）の増殖と関連した疾患の改善方法であって、それを必要としている被験者の網膜色素上皮細胞を、治療量のＡＰ−１アンタゴニストと接触させることを含んでなる方法。 22．牽引性網膜剥離の改善方法であって、それを必要としている被験者の網膜色素上皮細胞を、治療量のＡＰ−１アンタゴニストと接触させることを含んでなる方法。 23．牽引性網膜剥離の改善方法であって、それを必要としている被験者の網膜色素上皮細胞を、治療量のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アゴニストと接触させることを含んでなる方法。 24．レチノイン酸を除いた、治療量のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アゴニストを含有する、網膜色素上皮の増殖を治療するための組成物。 25．ＲＡＲアゴニストが特異的なＲＡＲアゴニストである、請求項24に記載の組成物。 26．ＲＡＲアゴニストがエチル-6-[2-(4,4- ジメチルチオクロマン-6- イル)エチニル]ニコチネート（化合物 168）である、請求項24に記載の組成物。 27．ＲＡＲアゴニストがＡＰ−１依存性遺伝子発現を実質的に抑制する、請求項 24に記載の組成物。 28．ＲＡＲアゴニストが 6-[2-(4,4- ジメチルクロマン-6- イル)エチニル]ニコチン酸（化合物 299）である、請求項27に記載の組成物。 29．ＲＡＲアゴニストが p-[(E)-2-(5,6,7,8- テトラヒドロ-5,5,8,8- テトラメチル-2- ナフチル)プロペニル]-安息香酸（化合物 183）である、請求項24に記載の組成物。 30．網膜色素上皮細胞の増殖が実質的に抑制される、請求項24に記載の組成物。 31．脈絡膜新生血管形成と関連した眼の疾患の改善方法であって、それを必要としている被験者の網膜色素上皮細胞を、治療量のＡＰ−１アンタゴニストと接触させることを含んでなる方法。 32．眼の疾患が加齢に関係した黄斑変性である、請求項31に記載の方法。 33．眼の疾患がヒストプラスマ症候群である、請求項31に記載の方法。 34．脈絡膜新生血管形成と関連した眼の疾患の改善方法であって、それを必要としている被験者の網膜色素上皮細胞を、治療量のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アゴニストと接触させることを含んでなる方法。 35．眼の疾患が加齢に関係した黄斑変性である、請求項34に記載の方法。 36．眼の疾患がヒストプラスマ症候群である、請求項34に記載の方法。