JPH10510706A - 微生物コロニーを検出及び同定するための方法及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 微生物を接種された増殖培地内の微生物コロニーを検出及び識別する方法及びシステムは、微生物を接種された増殖培地(100)の第一画像を最初に収集する。選択したインキュベーション時間間隔(110)の後、該増殖培地の第二画像を収集する(100)。第一画像及び第二画像内の対応するピクセルの差異を把握することにより差異画像を作成する(112)。差異画像内で局所的最大ピクセル強度を有し、予め決められた数の方向に減少する勾配を有するピークピクセルの位置を確認することにより差異画像内において潜在的コロニーを識別する(118)。各潜在的コロニーは、ノイズスパイクであるか又は実証済みコロニー周辺のノイズである潜在的コロニーを除去することにより実際のコロニーとして実証される(120)。

Description

【発明の詳細な説明】 微生物コロニーを検出及び同定するための方法及び装置 発明の分野 本発明は一般に、微生物を接種した表面上における微生物コロニーの自動的検 出及び同定に関する。本発明の方法及び装置は特に、微生物コロニーの成長を示 す徴候を識別及び分析し、該コロニーの成長を監視することにより微生物コロニ ーの早期検出及び識別を行う。 発明の背景 培養用ペトリ皿など、微生物を接種された表面で微生物コロニーを数えるには 、多くの方法及び装置が使用される。微生物コロニーを数える良く知られた方法 の一つは、訓練された試験所の担当者がコロニーを手動で数えることである。一 般的に、ミネソタ州、セントポールのMinnesota Mining and Manufacturingが製 造しているPETRIFILM 薄膜培養プレートなどの培養プレート装置は、特定のサン プルが接種され、微生物を接種されたサンプルの源泉を識別するために印を付け られ、同様に微生物を接種された装置と一緒に積み重ねられ、インキュベーター 内に配置される。手動の検査及び計算は一般に、約24時間後に行われる。手動の 計算には、計算に時間がかかる面倒な仕事をするための熟練技術者の雇用に関す るコストや、計算結果の正確さが限られているなど、多くの短所がある。 完全に定温培養した増殖培地、つまり24時間以上定温培養した増殖培地の全体 の数を確認するには、微生物コロニーを数える自動システムも知られている。第 一の種類の自動システムとしては、直結 回路又はディジタルコンピュータと一緒にカメラ又は映像機器を使用して培養装 置の全体的な光の吸収を測定することにより培養装置内のレベルを数えるシステ ムがある。こうしたシステムの例は、欧州公告第 0 301 600号、米国特許第 3,8 11,036号、Miyake等に付与された米国特許第 5,003,611号及びフランス公告第 2 602 074号に開示されている。これらのシステムは、少なくとも24時間インキュ ベートした培養装置内のコロニーを数えるように設計されている。 第二の種類の自動計算システムは一般に、計算過程を実行する光電検出器及び 直結回路を使用する。これらのシステムは一般に、コロニーが存在するか存在し ないかを示す信号を送信する。これらのシステムは、一定の間隔を置いたコロニ ーの強度又はコロニーの成長率に関する情報を提供しない。また、これらのシス テムは、完全に定温培養した増殖培地中でコロニーを数えるように設計されてい る。 第二の種類の自動計算システムは一般に、光電検出器の配列及び計算過程を実 行するための直結回路を使用する。これらのシステムは一般に、コロニーが存在 するか又は存在しないことを示す信号を送信する。これらのシステムは、一定の 間隔を置いたコロニーの強度又はコロニーの成長率に関する情報は送信しない。 また、これらのシステムは、完全に定温培養した増殖培地中のコロニーを計算す るように設計されている。 成長媒体が完全に定温培養される前に微生物コロニーを検出及び計算できるこ とは、有利な場合が多い。例えば、早期の検出は、食品中の雑菌混入を判断する ために食品を試験する際に望ましい。一般に、食品のサンプルを採取して培養装 置に接種し、24時間以上定温培養して食品の雑菌混入レベルを判定する。該サン プルが過度の雑菌混入を示す場合、該食品は多くの場合廃棄しなければならない 。６〜12時間の範囲内で過度の雑菌混入を確実にかつ早期に検出及び定量化する ことが望ましい。なぜなら、食品メーカーは、雑菌が混入した食品を加工の早期 に識別することができ、ひいては加工食品の廃棄に伴う余計な出費を避けること ができ、おそらく、雑菌が混入した加工機器を通ることにより追加の食品に雑菌 が混入することを避けることができるからである。 早期の検出は試験所の技術者が手動で行うことができるが、技術者が早期の検 出を行う上での短所がある。早期のコロニー成長の指標は、培養装置の連続する 指示値の増大つまり変化の率である。人間である技術者が成長率を正確に測定し たり、多数の培養装置の成長の徴候の微細な変化を識別することは、不可能では ないにしても難しいことである。また、コロニーを数えるための技術者を雇用す ることも、一般に比較的高く付く。したがって、微生物コロニーを早期に計算で きるような早期検出機能を有する自動計算システムが望ましい。 上記の自動計算システムは、完全に定温培養した培養装置上のコロニーを数え 、該培養装置の全体の光の吸収を測定することにより培養装置内の全体的な雑菌 混入レベルを検出するか、又はコロニーの成長の指標は測定せずに単にコロニー を数えるように設計されている。したがって、上記のシステムは、微生物コロニ ーの確実に正確な計数を生成する自動化された方法を提供しない。 しかし、確実な早期の検出及び計算は、コロニー成長の１つ又は複数の特定の 徴候の微細な変化を監視することにより達成することができる。こうした徴候と しては、微生物コロニーが成長する際に生成する酸又は酵素など、人の眼に見え ない指標が含まれる。定温培養の早期の段階におけるコロニー成長の特定の徴候 の変化に頼って微生物コロニーの早期検出を行う１つの方法は、1993年５月14日 に提出されてMorganに共同譲渡された米国特許出願第08／061,678に開示されて いる。Morganの方法は、成長する微生物コロニーを検出し、コロニーの成長を長 時間にわたって追跡して、媒体上で成長するコロニーの数を数えるものである。 連続した画像からのデータを処理してコロニーの検出を改善するように、複数の 画像が使用される。ヒットピクセルは、連続画像から引き出して強化されたデー タ集合から識別される。各々のヒットピクセルは閾値を超え、二つのピクセルの 距離に対して少なくとも２方向に減少する勾配を有する。最後に、ヒットピクセ ルが密集して、微生物コロニーに対応するマトリックスを生成する。Morganの方 法は更に、特定の光波長でマスク画像を入手して、成長媒体の外部にあるマスク 画像内のピクセルを識別し、それによって増殖培地の外部にあるピクセルの処理 を防ぐ。 発明の要約 本発明は、接種された増殖培地中の微生物コロニーを検出及び識別する方法及 びシステムを提供する。増殖培地の第一画像を収集した後、成長媒体は、選択し た時間間隔にわたって定温培養される。定温培養した後、成長媒体の第二の画像 を入手する。第一画像と第二画像の対応するピクセルの差異を確認することによ り、第一画像と第二画像から差異画像を生成する。潜在的コロニーは差異画像内 で識別され、潜在的な各コロニーはピークピクセル及びコロニー半径を有する。 潜在的コロニーは、該潜在的コロニーが前に実証されたコロニー周囲のノイズス パイクでもノイズでもないことを確認することにより実際のコロニーとして実証 される。 図面の簡単な説明 本発明について、添付図面を参照して完全に説明する。図中、類似の参照番号 は対応する構成要素を示す： 図１は、増殖培地上の微生物コロニーを検出及び識別するシステムの望ましい 実施例の略図である。 図２は、増殖培地上の微生物コロニーを検出及び識別する望ましい方法の流れ 図である。 図３は、環状増殖培地の中心を決定するための望ましい方法の流れずである。 図４は、増殖培地上の縁部点を決定するために三つの領域が環状成長媒体に適 用される方法を示す。 図５は、三つの縁部点を識別した後に環状増殖培地の中心を決定する方法を示 す。 図６は、複数の潜在的中心点を決定した後に環状増殖培地の中心を決定する方 法を示す。 図７ａは、二つの接近するコロニーを示す。 図７ｂは、先行技術の方法及び装置が、図７ａの二つの接近したコロニーが１ 個のコロニーであると判断する方法を示す。 図８は、差異画像内のピークを発見するための望ましい方法の流れ図を示す。 図９は、種ピクセルの位置の確認を示すのに役立つ。 図10は、種ピクセルに関連する局所的な最大を決定するための望ましい方法の 流れ図である。 図11は、図10の方法が種ピクセルに関連する局所的な最大を見つける方法を示 すのに役立つ。 図12ａ及び図12ｂは、モデル化された微生物コロニーの上部断面図及び側断面 図を示す。 図13は、図８のピーク勾配試験が差異画像に適用される方法を示 すのに役立つ。 図14は、接近して密集するコロニーがどのようにして不正確な半径測定値の原 因になるかを示す。 図15ａ及び図15ｂは、ノイズ値が２個の接近するコロニー及び１個のコロニー をノイズにより区別するのに役立つ方法を示す。 図16は、潜在的コロニーを実証する望ましい方法の流れ図である。 図17は、潜在的コロニーの分類リストである。 図18は、塵がどのように差異画像に現れるかを示す大まかな側断面図である。 図19は、微生物コロニーの実際の縁部及びシステムにより微生物コロニーがモ デル化される方法を示す。 図20は、潜在的コロニーに最近の実証済みコロニーが決定される方法を示すの に役立つ。 図21ａ及び図21ｂは、実証済みコロニー及び実証されようとしている潜在的コ ロニーの上部断面図及び側断面図を示す。 図22は、差異画像が計算されない場合に微生物コロニーを検出及び識別する方 法の流れ図である。 望ましい実施例の詳細な説明 以下の望ましい実施例の詳細な説明では、本明細書の一部を構成しておおり、 本発明を実施する特定の実施例を図示する添付図面を参照する。その他の実施例 も使用することができ、本発明の範囲を逸脱せずに構造的な変化を行うことがで きることを理解すべきである。 本発明は、微生物を接種した表面上の微生物の成長を検出及び識別するための 方法及び装置を提供する。例えば、本発明の方法及び 装置は、ミネソタ州、セントポールのMinnesota Mining and Manufacturing Com panyが製造するP2000 大腸菌計算プレート上の大腸菌の成長を数えるために使用 することができる。本発明は更に、先行技術の方法に比べて処理速度を改善し、 微生物コロニーを検出する精度も改善する。本発明は特に、微生物コロニーの真 の中心を正確に発見し、該コロニーのサイズを追跡し、接近して密集するコロニ ーから１個のコロニーが生成する酸の分散から生じるノイズを識別し、密集する コロニーを正確に数える。 図１を参照すると、本発明のシステムの略図が示されている。寒天などの栄養 素媒体内の微生物コロニーを計算するには、ミネソタ州、セントポールのMinnes ota Mining and Manufacturing Companyが製造する３ＭブランドのPETRIFILM 薄 膜培養プレートなどのペトリ皿又は使い捨て式微生物培養装置など、培養プレー ト装置32に特定のサンプルを接種する。例えば、サンプルの大腸菌を試験するに は、Minnesota Mining and Manufacturing Companyが製造するP2000 PETRIFILM 大腸菌計算プレートを培養プレート装置32として使用することが望ましい。望ま しい培養プレート装置は、成長する微生物コロニーを囲むpHが低い範囲に目視可 能な色の変化が生成されるように設計されている。望ましいプレートでは、色の 変化は、大腸菌が生成する酸に応じて赤色の背景上に黄色の着色範囲を生じるプ レートの培養範囲に配置されたフェノールレッドのコーティングによって生成さ れ、これによりコロニーを識別することができる。当業者は、後述する画像シス テムを適切に変更して、望ましいプレートの代わりに他の培養装置を使用して異 なる種類の微生物を試験できることを容易に認識するであろう。 被試験材料に標準の接種手順を用いて微生物を接種した後、熱を加えて培養装 置32を定温培養する定温培養室36に培養プレート装置 32を配置する。培養プレート装置32は、加熱式毛布など、その他の手段を使って 定温培養することもできる。ある実施例では、担体30は複数の培養プレート装置 32を保持する。別の実施例では、複数の培養プレート装置32に個別の保持具を使 用する。担体30を使用することにより、システム10は複数の培養装置32を監視す ることができる。システム10は、プロセッサ12と、ビデオ表示装置などの出力装 置14、プリンタ又は記憶装置とを更に具備する。ライト16は照明を行い、電源18 により起動する。カメラ20は、プロセッサ12が処理する培養プレート32の画像を 収集する。望ましいカメラ20は、512 x 512ピクセルアレイの各々の画像を収集 する。望ましいカメラ20は、各々の画像に８ビット／ピクセルを与え、その結果 、各ピクセルには、各ピクセルで検出される光の強度に基づいて０から255 まで の値が割り当てられる。０の値のピクセルは黒い物体に相当し（カメラ20の対応 するピクセルに実質的に光を返さない）、255 の値のピクセルは完全に白い物体 に相当する（カメラ20の対応するピクセルを完全に飽和する）。担体30又は個別 の保持具では、図示されていない機械式搬送システムが、カメラ20がすべての培 養プレート32を撮影できるように培養プレート装置32を配置する。機械式搬送シ ステムはｘ−ｙテーブルで良いが、積み重ね機構であれば更に望ましい。 カメラ20はレンズ22を具備する。レンズ22は、所望の視野を得るように調節可 能であることが望ましい。レンズ22は、フィルタ24を更に具備することが望まし い。望ましい方法は反射光の特定の波長を検出することが必要なので、帯域通過 フィルタ24をカメラ20と培養装置32との間に挿入して、培養装置32から反射され る光を濾過すると良い。例えば、PETRIFILM P2000 大腸菌計算プレートの赤いゼ ラチン媒体上で大腸菌の成長を検出する場合、650nmのスペクトル ピーク、40nmの帯域幅を有する赤い帯域通過フィルタをレンズ22上に配置する。 カメラ20が収集する画像は、赤い円形ゲルとゲル周囲のフォームダムの背景との 間に高度のコントラストを有する。また、赤いフィルタは、ゲル内に存在する可 能性がある空隙など、殆どのアーティファクトを除去する。 培養プレート32に微生物を接種して定温培養室36に配置すると、カメラ20は、 図２のブロック100 に示すように培養プレート32の最初の画像を収集する。ブロ ック102 では、培養プレート32の円形ゼラチン媒体の中心位置を確認する。ゼラ チン媒体の中心は、製造工程の違いから培養プレートごとに異なる場合がある。 更に、担体30を使用する場合、一般に機械式システムを使用して、カメラ20が担 体30上のすべての培養プレートを監視できるように培養プレートを繰り返し位置 決めする。担体と共に使用する機械式システムは一般にｘ方向及びｙ方向の両方 で１個のピクセル幅未満まで正確だが、変換の際の位置決め誤差が生じる可能性 がある。したがって、媒体の真の中心を確認することが望ましい。 図３を参照すると、培養プレート32の円形ゼラチン媒体の中心を確認するため の望ましい方法が示されている。図３に示す方法は、すべての培養プレートの直 径は既知の一定であると仮定している。ブロック200 では、画像の三つの範囲に おいて縁部の検出が行われる。縁部の検出は、円形媒体の縁部に位置する点を確 認するために行われる。縁部の検出は、３個の縁部検出核を該範囲に適用するこ とにより三つの範囲で行うことが望ましい。これらの範囲は、円形媒体の縁部が 各範囲を通るのに有利なように選択する。図４には、範囲242，244及び246 が画 像240 の中心付近から画像240 の縁部に延びる望ましい実施例を示す。これらの 範囲の幅は、システムの解像力、増殖培地のサイズ及び画像を収集するために使 用する光学的 システムに応じて異なる。範囲242，244及び 246は、図４に示すように互いに直 角であることが望ましい。望ましい実施例では、水平縁部検出核は範囲242 及び 246 の範囲内のピクセル列に適用され、垂直縁部検出核は範囲244 の範囲内のピ クセル行に適用され、集合248 内の３個の潜在的縁部点など、３個の潜在的縁部 点の集合を得る。潜在的縁部点の数個の集合を得て、円形媒体の縁部沿いの３個 の円弧を生成する。潜在的縁部点の５個の集合を得ることが望ましい。図３のブ ロック202 では、潜在的縁部点が、潜在的縁部点が縁部上に位置する可能性を表 す最小レベルを超え、ひいては培地中の例えば欠点ではなく縁部点である可能性 を示す予め決められた閾値と潜在的縁部点が比較される。該閾値を超える潜在的 縁部点は、縁部点として表示される。 図３のブロック204 では、３個の縁部点の集合が選択され、円形媒体の中心が 決定される。図５を参照すると、円形媒体250 は円形縁部 252と、半径ｒ、254 とを有する。縁部点の集合は、各々Ｎ、Ｗ及びＳで示される縁部点256，258及び 260 から構成される。ブロック206 では、縁部点256 と258 の間の弦262 の中間 点及び縁部点258 と260 の間の弦264 の中間点が決定される。弦262 及び264 の 勾配の負の逆数は、各弦の垂直線の勾配を求めるために使用され、これらの垂直 線は中間点266 及び268 に位置し、二つの弦の垂直二等分線を形成する。次にブ ロック210 では、弦262 及び264 の垂直二等分線の交点を位置決めすることによ り、円形媒体250 の潜在的中心点270 が決定される。 ブロック212 では、３個の縁部点の別の集合を選択して潜在的中心点を決定す る過程が予め決められた回数だけ繰り返される。潜在的中心点の集合が決定され ると、その集合が検査され、潜在的中心点の指定距離内に予め決められた数の潜 在的中心点を有する１個の 潜在的中心点が確認される。この基準に適合する中心座標はブロック216 の指定 距離内にあった他の中心座標と平均されて、ブロック218 において最終中心座標 が求められる。例えば、図６を参照すると、縁部点の５個の集合から５個の潜在 的中心点280，282，284，286及び288 が得られる。予め決められた数の潜在的中 心点が３個であり、各潜在的中心点が存在しなければならない最大距離が10ピク セルである場合、潜在的中心点282，284，286 及び288 を平均して、最終中心座 標290 を決定する。この方法は、潜在的中心点280 など、誤った縁部点を使って 確認された中心点を除去する。 ブロック220 では、一定の状況において最終中心座標が更に検証される。円形 媒体の半径が分かっている場合、最終中心座標から任意の縁部点までの距離が既 知の半径と比較され、距離の値が近いことが確認される。 円形培地の中心を定義する最終中心座標は、多くの方法で使用することができ る。例えば、縁部において一般に生じる急速な媒体の脱水によって、円形培地の 外側のコロニーを誤って検出する可能性がある。したがって、ブロック104 では 、画像にマスクを付与する際に中心座標を使用し、培地の外側でコロニーの検出 が行われないようにする。マスクは計算された中心座標にセンタリングすること ができるので、画像にマスクを迅速かつ正確に付与することができる。更に、図 １に示すように担体30を使用する場合、システム10が複数の培養プレート32を監 視することができるように担体30を繰り返し位置決めするために、一般に機械式 システムを具備する。しかし、機械式システムはその性質上、変換の際に誤差を 生じる可能性がある。システムは、培養プレートの円形媒体の中心を確認するこ とにより、ブロック106 における変換の際の誤差の可能性を補正することができ る。確認された中心は、連続する画像を整合する基準 点として使用することができる。望ましい方法を使用して増殖培地の中心を確認 するのに必要な限られた処理は、中心を決定する先行技術の方法より速い。した がって、成長媒体の中心は、本発明の方法を使用してすべての画像について決定 することができ、すべての画像について変換の際の誤差を補正することができる ので、処理の精度が高まる。 本発明の望ましい実施例では、時間経過減法を行って差異画像を作成する。し かし、後述するように、培養プレートによっては時間経過減法は不要であり、微 生物コロニーの検出及び識別は最終画像でのみ行うことができる。時間経過減法 は、異なる時間の成長媒体の一対の画像を使用し、２枚の画像を処理して１枚の 差異画像を作成する。差異画像は、二つの画像の差異を確認して作成される画像 である。差異画像は、わずかな色の変化を容易に検出ことができるため微生物コ ロニーの早期検出に役立ち、未処理のどの画像に比ベても改善されたＳ／Ｎ比を 有する。更に、未処理画像だけを分析すると、増殖培地内の空隙及び色をコロニ ーと間違える可能性がある。減法は、この問題を効果的になくす。 最初に入手したコロニーの画像をメモリに登録して記憶した後、培養プレート 32はブロック110 において予め決められた時間だけ定温培養される。PETRIFILM P2000 大腸菌培養プレートなど、時間経過減法を行うことが望ましい培養プレー トでは、予め決められた定温培養間隔で後続の画像を収集して、ブロック112 に おいて差異画像を収集する。最初のコロニーの画像は、ブロック100 で収集され る。この画像を収集するには、カメラ20のレンズ22の前に緑色の帯域通過フィル タを配置する。緑色のフィルタは、550nmのスペクトルピーク及び40nmの帯域幅 を有することが望ましい。緑色のフィルタは、望ましい培養装置32上で成長する 微生物コロニーが生成する 黄色に感応する。最初のコロニーの画像は、最初の定温培養期間の後で収集する ことが望ましい。例えば、PETRIFILM P2000 プレートの場合、最初の画像は、定 温培養の約３時間後に収集することが望ましい。なぜなら、検出可能な成長は一 般に約４時間後に起こるからである。ブロック102 で決定された増殖培地の中心 座標を使用して、増殖培地を画像の基準位置に変換して増殖培地を登録する。登 録された最初のコロニー画像は、パーソナルコンピュータのハードディスクなど 、メモリ14に記憶される。培養装置は、１時間など、ブロック110 において予め 決められた時間間隔にわたってインキュベートし、第二のコロニー画像をブロッ ク100 で収集する。第二のコロニー画像は、緑色のフィルタを使用しても収集さ れる。定温培養に予め決められる時間間隔は、検出される微生物コロニーの成長 率及び画像システム10の感度に基づいて異なる。予め決められる時間間隔は更に 、コロニー成長の徴候、例えばpH指標の感度及び接種剤のpHによって異なる。第 二の画像も、ブロック106 において画像の基準位置に登録される。 ブロック112 では、差異画像が計算される。登録された第一コロニー画像のピ クセルは、登録された第二コロニー画像の対応するピクセルから減算される。ピ クセルごとの減法から生じる値は、差異画像の対応するピクセルに割り当てられ る。したがって、差異画像は、連続する時間間隔で収集された第一コロニー画像 と第二コロニー画像の対応するピクセルの強度の差異を表す。システムは、ブロ ック108 において最初のコロニー画像に遭遇すると、差異画像を入手するために 連続する時間帯の二つの画像が必要であるから、予め決められた定温培養期間に わたって増殖培地を定温培養する。しかし、差異画像を計算するその後の繰り返 しでは、繰り返しの第二のコロニー画像だけが収集される。前の繰り返しからの 第二のコロニ ー画像は、後続の繰り返しの第一のコロニー画像として使用される。したがって 、各増殖培地について、前の時間帯の一つのコロニー画像をメモリに記憶するだ けで良い。 プロセッサ12は、差異画像を計算した後、差異画像データを処理して潜在的コ ロニーを識別する。培養プレート32をインキュベートする際、成長媒体上の微生 物コロニーは酸を生成する。各々の微生物コロニーが酸を生成すると、酸は、コ ロニーの起点つまり中心ピークの点からあらゆる方向に比較的均一に分散する。 一般に、コロニーが生成する酸が多ければ多い程、コロニーの中心ピークを囲む 円の直径が大きくなる。通常、後続の各コロニー画像のコロニーの中心ピークに おける強度の差異は、比較的多量の酸が生成される場合に大きくなり、差異画像 に示される。プロセッサ12は、中心ピークから円形に成長するコロニーの一般的 な傾向に基づいて各々の潜在的コロニーをモデル化する。プロセッサ12は次に、 中心ピーク周囲の酸範囲の形成及び成長を追跡して、新しいコロニーの検出を試 みる際に更に情報に基づいた決定を行うことができる。各々のコロニーのモデル 化は、システム10が接近した各コロニーを区別することを可能にし、検出された 潜在的コロニーが、前に識別されたコロニーが生成する単なるノイズであるか又 は塵、食物の粒子もしくは媒体内の空隙であるかどうかを決定するのに役立つ。 例えば、図７ａは、第一中心ピーク322 を有する第一コロニー320 及び第二中心 ピーク326 を有する第二コロニー324 の二つの接近したコロニーを示す。本発明 の方法及び装置は、この二つの接近したコロニーを区別することができる。しか し、先行技術のシステムによっては、図７ａに示す二つの接近したコロニーを図 ７ｂに示す一つの中心ピーク332 を有する一つのコロニー330 として識別する場 合がある。したがって、コロニーのモデル化により、システム10は、更に正確に 微生物コロニーを検出及び確認することができる。望ましい方法及びシステムは 酸を成長の指標として使用しているが、当業者は、酸以外のコロニー成長の徴候 を分析してコロニーの成長を監視することができることを容易に認識であろう。 再び図２を参照すると、プロセッサは、ブロック114 において、該差異画像が 、遭遇した成長媒体の第一差異画像であるかどうかを判断する。プロセッサ12は 一般に、差異画像で新しいコロニーを調査する前に、後述するとおり先ず既存コ ロニーの成長を監視及び追跡する。しかし、プロセッサ12が成長媒体の第一差異 画像に遭遇する場合、既存コロニーは存在しないので、既存コロニーの成長を監 視する必要はない。こうした状況では、時間経過減法によって入手された差異画 像は、ブロック118 において中心ピークを検出するためにプロセッサ12によって 直ちに処理され、ブロック116 における既存コロニーの成長を追跡するステップ は迂回される。 図８は、新しいピーク検出の望ましい方法を示す。最初の回復期間後、コロニ ーは酸生成の点源になる。酸は、増殖培地内の拡散により分散する。図９は、酸 のスポットが形成される増殖培地の範囲に関する差異画像の一部を表す数のグリ ッドを示す。図９に示された数、差異強度値は、第一画像と予め決められた定温 培養期間後に入手された後続の第二画像との色の強度の変化の大きさを表す。ゼ ロの値は、変化がないことを表す。微生物コロニー内で生成される酸は一般に、 ４〜40の強度のピーク差異を有する。図９では、太字で示したピーク値は８であ る。二つの時間経過画像の強度の差異は、差異画像にガウス分布として表される 。したがって、図９の８のピーク値を囲む値が次第に減少することから分かるよ うに、ピーク値は酸範囲の付近又は中心に現れ、外側に向かってあらゆる方向に 徐々に消散する。図８に示す方法は中心ピークを確認し、中心ピー クを囲むピクセルを更に分析して、潜在的微生物コロニーを検出及び識別する。 図８のブロック350 では、プロセッサ12が第一種ピクセルを確認する。種ピク セルとは、最小閾値以上の差異強度値を有するピクセルである。種ピクセルを確 認するには、差異画像のマスクされていない範囲をピクセルごとに左から右へ上 から下へ走査する。例えば図９では、種ピクセルの最小閾値が４だった場合、差 異強度値が４の種ピクセル400 が、種ピクセルの基準を満たす第一ピクセルにと いうことになる。種ピクセルの位置を確認したら、ブロック352 において種ピク セルの局所的な最大を確認する。種ピクセルの局所的最大を決定する望ましい方 法を図10に示す。図10に示す方法は、１個の種ピクセルに関連する複数の局所的 最大つまり画像のピークをできるだけ速く見つけようと試みる。局所的最大を決 定するために使用するボックスのサイズは、ブロック370 において定義される。 ボックスのサイズは、互いに接近している各コロニーを区別できるように選択さ れる。したがって、サイズは、ボックス内でセンタリングした場合に１個のコロ ニーピークだけがボックス内に納まるように、システムの解像力及び実験データ によって決める。図11では、ボックス410 が５ピクセル×５ピクセルのボックス になるように５のボックスサイズを選択している。ブロック372 では、確認され た種ピクセルの周囲にボックスを配置する。望ましい実施例では、種ピクセルは ボックス内のピクセルの上の行にセンタリングされる。例えば図11では、種ピク セル400 は、ボックス410 の１行目にセンタリングされている。ボックスを種ピ クセルの周囲に配置した後、ブロック374 においてボックス内の最大差異値を確 認する。ボックス内の各々のピクセルを走査して、最大値を有する１個又は複数 のピクセルを決定する。共通の最大値を有するピクセルが数個ある 場合、共通ピクセルの重心を計算して、最大差異値の位置として割り当てる。再 び図11を参照すると、ボックス410 内の最大差異値は、７の値を有するピクセル 402 である。最大差異値の位置を確認したら、ボックスをその位置の周囲にセン タリングする。図11では、ボックス410'が移動してピクセル402 の周囲にセンタ リングされる。 最大差異値の周囲にボックスをセンタリングしたら、ボックスの範囲内で最大 差異値を確認するステップ及び新しい最大差異値の周囲にボックスを再度センタ リングするステップをブロック380 及びブロック376 において繰り返す。これら のステップは、最大数のボックス移動が予め決められた最大数の移動を超え、最 初の種ピクセルにピークが確認されないことを知らされるか、又は最大差異値が ボックスの中心に位置せず、ピーク値が確認されないことを知らされるまで繰り 返す。ブロック378 において移動数が最大を超えた場合、プロセッサ12はブロッ ク384 において最大が位置しないと判断する。ボックスの中心に最大値が位置す る場合、ブロック386 において、中心のピクセルが最初の種ピクセルの局所的最 大として割り当てられる。例えば図11では、第二のボックス移動が、８の差異値 を有するピクセル404 の周囲にボックス410'を再度センタリングする。予め決め られた最大数の移動を超えないと仮定すると、第二の移動の後、８の値を有する ピクセル404 は該ボックスの中心に位置し、種ピクセル400 の局所的最大である 。 １個の種ピクセルの局所的最大つまりピークが確認されるごとに、ブロック38 8 において、予め決められた半径を有する円形マスクが差異画像に付与される。 マスクの半径は、システム10、特にカメラ20の解像力に基づく。解像力が分かっ たら、マスクの半径を画像システムの検出可能な最小コロニーの半径に等しくな るように設定 することが望ましい。例えば、システムの解像力が 0.1mm／ピクセルであり、検 出可能な最小ピクセルの半径が 0.5mmである場合、マスクの半径は少なくとも５ ピクセルであることが望ましい。マスクは、局所的最大にセンタリングされ、ピ ークの冗長な検出の可能性をなくし、差異画像の範囲内のピークの検出及び識別 速度を高める。再び図８を参照すると、種ピクセルの局所的最大はブロック353 において記憶される。ブロック354 では、マスクされていない種ピクセルが存在 しなくなるまで、種ピクセル及びその周囲の局所的最大を確認する過程が繰り返 される。 すべての局所的最大を確認して記憶した後、後述するピーク勾配試験及び半径 試験の両方を行い、各々の局所的最大がこれらの試験に合格したら、潜在的な新 しいコロニーのリストに追加する。各々の局所的最大の認定では、図12ａ及び図 12ｂに示すように各コロニーのピークの周囲に広がってコロニーのピークを囲む 酸範囲のモデルを使用する。ピークにおいて生成される酸は一般に、円形の状態 で広がる。図12ａはコロニーモデル420 の上面図を示し、酸はピークＰ、422 で 生成され、コロニー縁部424 方向に広がり、半径Ｒ、426 を有する円を形成する 。図12ｂは、ピーク422 を有するコロニーモデル420 の側断面図を示し、差異強 度値及び半径426 を表している。 図８を参照すると、新しい潜在的コロニーを表す局所的最大は、ブロック356 においてメモリから検索される。この局所的最大は先ず、ブロック358 において ピーク勾配試験の対象になる。ピーク勾配試験は、ピークからの勾配が予め決め られた数の方向に減少するかどうか、理想的にはコロニーモデル422 の断面図に 示すように全方向に減少しているかどうかを示すものである。この勾配試験は、 図13の太字のピクセル値で示す八方位など、８方向のピクセル値を 検査することが望ましい。各々の方向では、ピクセルはピークから外側に向かっ て検査され、ピクセルの値が、３個分のピクセル長さなど、予め決められた最小 勾配距離にわたって減少するかどうかを確認される。勾配試験に合格するには、 ピクセル値は、６方向など、少なくとも予め決められた数の方向に最小勾配距離 にわたって減少しなければならない。更に、特定方向の任意のピクセルの強度値 が最小強度値未満である場合は、該ピクセルが背景範囲にあることを示し、その 方向に関する試験には合格しない。 例えば図13では、背景ピクセルを示す最大強度値が２であると仮定すると、該 強度値は東、南及び西方向に３個分のピクセルの距離にわたって減少する。北東 、南東及び南西方向では、強度値は2.83ピクセル長の距離にわたって減少し、北 西方向では、強度値は5.66ピクセル長の距離にわたって減少する。しかし北方向 430 では、強度値は８から５に減少した後に６に増加する。予め決められた最小 勾配距離が２ピクセル長であると仮定すると、この方向に関しては勾配試験に不 合格である。したがって、勾配は８方向のうち７方向で減少するので、局所的最 大は、予め決められた所定の距離数が７以下である場合に勾配試験に合格するこ とになる。局所的最大が勾配試験に不合格である場合、ブロック362 においてピ ークは発見されず、ブロック366 において次の局所的最大についてこの過程が繰 り返される。 局所的最大が勾配試験に合格した場合、ピークがあるとみなされ、コロニーは 一般に円形であると仮定される。次に、ブロック360 において、勾配試験に合格 したすべてのピークについて半径試験が実施され、円の半径が決定される。半径 を決定する望ましい方法では、検査中のピークから開始して次の三つの条件のど れかに適合するまで八方位の各方向のピクセル値が走査される。 第一の条件には、半径の長さが最大半径を超える場合に適合する。この最大は 、コロニーの成長に関する前の経験に基づき、予め決められた期間に酸が広がる ことができる最大数のピクセルに設定される。したがって、計算した半径が許容 可能な最大半径に達する場合、半径は、許容可能な最大半径に等しく設定される 。この条件は、図14に示す状態を確認する。図14に示す状態では、５個のコロニ ーが接近して成長しており、ピーク430 の半径は、その長さが最大ピクセル数を 超える場合、半径432 として誤って決定される可能性がある。半径が誤って最大 ピクセル長に設定された場合、誤差は後にピーク半径試験で計算される。 第二の条件には、次のピクセル値が予め決められた最小強度値未満の場合に適 合し、該ピクセルが背景にあることを示す。理論的には、背景は差異強度値０に よって示される。しかし、実際には、ノイズは最小強度値として３など、０を超 える値を必要とする。この条件に適合する場合、ピークの半径は、ピークピクセ ルから最小強度ピクセルまでのピクセル長の数に設定される。 第三の条件には、後続のピクセル値が直前のピクセル値を予め決められたノイ ズ値だけ超える場合に適合する。この予め決められたノイズ値は、ノイズ及び接 近して成長しているコロニーを見込んでいる。例えば、このノイズ値は、微生物 に応じて０から３である。図15ａ及び図15ｂは、ノイズ値が二つの状況を区別す る方法を示す。図15ａでは、２個のコロニー、コロニー440 及び442 が接近して 成長している。コロニー442 は、ピーク444 及び最初の方向に半径446 を有する 。しかし、別の方向では、コロニー442 のピーク444 が生成する酸はピーク440 が生成する酸の中に広がる。こうした方向では、重複する点450 において強度値 が上昇し始め、予め決められたノイズ値を超える。この方向では、コロニー442 は正確に半径 448 を有する。図15ｂでは、コロニー460 は正確に半径462 を有する。しかし、 ノイズ値の設定が低すぎる場合、不正確な半径値が得られる可能性がある。図15 ｂでは、位置466 において、食品の粒子又はその他の異物など、培地中の何らか の欠陥によって生じると思われるノイズにより更に酸が生成されて、466 におけ る差異強度値が大きくなる。例えばノイズ値を０に設定する場合、466 における ピクセル強度値が該ノイズ値を超えると不正確な半径464 が得られる。しかし、 ノイズ値を適切な値に設定する場合、466 におけるノイズは該ノイズ値を超えず 、第二の条件に適合すると半径462 が正確に得られる。 すべての方向について半径の長さを決定した後、コロニーの半径を計算する。 望ましい実施例では、コロニーの半径は測定したすベての半径のメジアンである 。単純な平均を使用することもできるが、第一条件で得られる不正確な最大半径 長さなど、極値における不正確な半径長さの加重効果を避けるために、メジアン を計算することが望ましい。メジアンは望ましいが、メジアンタイプの値を決定 する任意の方法は本発明により意図されている。例えば、測定した各半径値から 中間値を平均しても良い。計算したコロニー半径は、2.1 ピクセル長など、検出 可能な最小コロニーに基づいて実験的に決定した最小半径と比較し、計算したコ ロニー半径が該最小半径より大きければピーク半径試験に合格する。計算したコ ロニー半径が該最小半径未満である場合、ピーク半径試験に合格せず、ブロック 362 において局所最大に関するピークは見つからないので、ブロック366 におい て次の局所最大についてこの過程を繰り返す。 局所最大がブロック358 におけるピーク勾配試験及びブロック360 におけるピ ーク半径試験の両方に合格した場合、該ピークの差異強度値、その座標及びその 対応する半径が図８のブロック364 にお いて潜在的コロニーとしてメモリに記憶される。メモリに記憶されたピークは潜 在的コロニーを表し、次に図２のブロック120 において、該コロニーが真にコロ ニーであり、微生物コロニーが生成した酸のように見える空隙又は塵ではないこ とを実証するために分析される。ピークの実証は、ピークを囲む重要な酸範囲の 検出を更に容易にし、比較的大きいコロニーの外側の酸範囲の単なるノイズを新 しいコロニーとして誤って識別する可能性を少なくする。図16は、コロニーを実 証する望ましい方法を示す。ピークは、ブロック500においてピーク値に基づい て分類される。その際、再上位のピーク、つまり円形コロニーの中心に最大差異 強度値を有するピークが潜在的コロニーリストの始めになり、最低ピーク、つま り円形コロニーの中心に最小差異強度値を有するピークが該リストの終わりにな るように分類される。図17は、検出されてピーク値の順に記憶された潜在的コロ ニーのリストの一部を示す。 潜在的コロニーを実証する次のステップは、ピーク値が塵、成長媒体内の空隙 又はその他の異物によるものであるかどうかを判断することである。差異画像は 一般に、これらのアーティファクトを活性の非常に明るい細い範囲として示す。 図18は、塵の断面の例を示す。塵は、数値基準に変換すると、図17のピーク番号 １のように非常に大きいピーク値を有し、急激に消滅する。したがって、塵も大 きいピーク値に対して比較的小さい半径を有する。ブロック502 では、ピーク値 対半径の比率が決定され、ノイズ比と比較される。塵554 のピーク550 対半径55 2 の比率が該ノイズ比を超える場合、該ピークはノイズスパイクとみなされて除 去される。ノイズ比は、微生物コロニーが生成する酸が、ある成長媒体上で他の 成長媒体上におけるよりも比較的粘性が高いのと同じように、成長媒体によって 決まる。例えば、５のノイズ比では、ピーク値が半径値より５倍大 きい場合、該ピークはノイズスパイクとみなされる。図17のピーク番号１は、半 径よりも12倍以上大きいので図16のブロック502 におけるノイズスパイク試験に 不合格になり、ブロック504 において潜在的コロニーリストから削除される。あ るいは、比率を使用するのではなく、ピーク値及び半径値を最大ピーク値及び最 小半径値と比較しても良い。この方法では、ピーク値が20などの最大ノイズピー ク値を超え、その半径が４などの最小ノイズ半径値未満である場合、該ピークは 潜在的コロニーとして認められない。望ましい実施例では比率を計算するが、当 業者は、ピーク値及び半径値から比率以外の関数を導いて、ピークがノイズスパ イクとみなされるかどうかを決定できることを容易に認識するであろう。 ノイズスパイク試験が行われたピークが、ブロック504 における増殖培地の試 験に合格した最初のピークである場合、該ピークはブロック520 において新しい コロニーとして正式に確認され、つまり実証され、ブロック522 において実証済 みコロニーとして記憶される。後続のすべてのピークについては、ノイズスパイ ク試験に合格した後、ピークは更に分析され、より大きいピークの外側の酸範囲 上のノイズであるかどうかを決定される。図19は、半径562 を有するモデルコロ ニー560 及び実際のコロニー564 を示す。ピーク半径試験では、コロニーは円と してモデル化されるが、実際にはおおよそ円形であるというに過ぎない。したが って、コロニーのピークにおいて生成される酸は一般に、モデルコロニーのメジ アン半径の外側に存在する。更に、酸範囲の縁部では、不均一な成長がノイズと して現れる可能性がある。このノイズは、酸の成長を比較的遅くする増殖培地中 の欠点又は酸の生成率を変える媒体内の異物による場合がある。酸範囲の周囲で は、微生物コロニーによって生成するのではないピークが生じる場合が多く、こ れらのピークは計算すべき ではない。 ブロック508 では、潜在的コロニーから最近の実証済みコロニーまでの距離が 計算される。図20は、潜在的コロニー540 及び実証済みコロニー542 を示す。潜 在的コロニー540 に最近の実証済みコロニーは、潜在的コロニー540 の縁部に最 も近く、縁部間の距離Ｘ、544 が最小である縁部を有する実証済みコロニーであ る。 潜在的コロニーに最近の実証済みコロニーを確認した後、ブロック510 におい て該実証済みコロニーについてノイズ半径が計算される。ノイズ半径は、実証済 みコロニーの縁部と同心の円を形成し、実証済みコロニーを囲む。図21ａは実証 済みコロニー550 の周囲のノイズ円552 の上面図を示し、図21ｂは側断面図を示 す。ノイズ半径556 は、前に説明して図19に示したコロニーモデルの不完全性を 考慮すると、コロニー半径554 より多少大きい。例えば、図21ａ及び図21ｂでは 、ノイズ半径554 の大きさは、実証済みコロニーの半径556 の0.7 倍である。ノ イズ半径の長さは、増殖培地によって異なる。更に、ノイズ半径が最小ノイズ半 径より小さい場合、ノイズ半径は最小ノイズ半径に等しく設定される。 ノイズ半径を計算したら、潜在的コロニーの位置をノイズ半径により定義され るノイズ円と比較する。潜在的コロニーがブロック512 においてノイズ円の完全 に外側に位置する場合、その潜在的コロニーはブロック520 において実証済みコ ロニーとして確認され、ブロック522 において記憶される。図21ａ及び図21ｂを 参照すると、潜在的コロニー560 は、ノイズ円552 の完全に外側に位置する潜在 的コロニーの一例である。 潜在的コロニーがブロック512 においてノイズ円の完全に外側に位置しない場 合、更に分析を行って、潜在的コロニーが実際に新しいコロニーであるか、又は 最近の実証済みコロニーが生成したノイ ズであるかを識別する必要がある。ブロック514 では、潜在的コロニー及び実証 済みコロニーのピーク値の比率及び半径値の比率が計算される。望ましい実施例 では比率を使用するが、当業者は、ピークピクセル値とコロニー半径値との関係 から導いた多くの値を使用することもできることを認識するであろう。実証済み コロニーに使用する中心ピーク値は、その寿命を通して観察された最大中心ピー ク値である。半径比は、0.33などの最小半径比と比較する。ブロック516 におい て半径比が最小半径比より小さい場合、潜在的コロニーはノイズであると決定さ れ、ブロック504 において除去される。潜在的コロニーが半径比試験に合格する と、ピーク比が0.5 などの最小ピーク比と比較される。ブロック518 においてピ ーク比が最小ピーク比より小さい場合、潜在的コロニーはブロック504 において 除去される。最後にブロック519 では、潜在的コロニーの中心ピーク値が最小ピ ーク値と比較される。中心ピーク値が最小ピーク値より小さい場合、潜在的コロ ニーはブロック504 において除去される。潜在的コロニーが半径比試験、ピーク 比試験及びピーク値試験に合格すると、潜在的コロニーはブロック520 において 実証済みコロニーとして確認され、ブロック522 において記憶される。半径比、 ピーク比及びピーク値は、増殖培地、画像システムの解像力及びダイナミックレ ンジによって非常に異なる。最小半径値についても、潜在的コロニーを実証済み コロニーとして確認する必要がある。再び図21ａ及び図21ｂを参照すると、潜在 的コロニー562 は、三つの試験に合格して実証済みコロニーとして確認されるコ ロニーの一例だが、潜在的コロニー564 は、三つの試験の少なくとも二つに不合 格になって除去されるであろう。ブロック524 及び526 では、この過程は、残り のすべての潜在的ピークについて繰り返され、この過程が繰り返されるごとに、 残りの最大ピーク値を有する潜在的コロ ニーが分析される。 図２のブロック114 を参照すると、差異画像が最初の差異画像ではなく、前の 差異画像で既存のコロニーが確認された場合、前に確認されて実証されたコロニ ーの成長はブロック116 において監視される。実証済みコロニーが検査され、そ の現在のピーク値がそのコロニーの過去の最大ピーク値と比較される。実証され た各々のコロニーの最大ピーク値は記憶され、前述のとおり潜在的コロニーを実 証する際にピーク比の計算に使用される。したがって、現在のピーク値が過去の 最大ピーク値より大きい場合、過去の最大ピーク値に代わって現在の値がメモリ に記憶される。実証済みコロニーの半径も更新される。半径の測定は、前に確認 したコロニーの縁部で開始し、八方位など、予め決められた同じ数の方向に外側 に行われる。最後に、更新された実証済みコロニーを構成するピクセルは、既に コロニーとして実証された画像部分上の不要な処理をなくすためにマスクで隠さ れる。 ピークを実証した後、実証済みコロニーのデータをブロック122 において分析 し、必要なら124 において出力する。実証済みコロニーに関連するデータを使っ て、多くの種類の分析を行うことができる。例えば、実証済みコロニーの数を時 間間隔ごとに計算して、コロニー計数情報を提供することもできる。コロニーを 早期に最初に検出して、残りのインキュベーション期間を通してコロニーの成長 を追跡することにより、システムは、成長する微生物コロニーを可能な最も早い 時期に検出して数えることができる。コロニーを早期に数えることによって、定 温培養期間が終了する前に推定に基づいて数を提供することができる。例えば、 ３ＭブランドのP2000 大腸菌計算プレートを成長媒体として使用する場合、定温 培養を開始してから早くも５時間後に予備的な計算を行うことができ、最終的な 推定に基づく数を14時間で提供することができる。確認した数は、24時間後まで 提供することはできない。ブロック124 では、コロニーの位置、そのサイズ及び 成長率など、他の種類のデータが出力される。 該時間帯に差異画像の分析が完了した後、ブロック110 において増殖培地を予 め決められた定温培養期間を通して定温培養する。ただし、ブロック126 におい て、24時間などの定温培養期間が終了している場合は除く。定温培養期間が終了 した後、コロニーの確認された数が提供される。 連続画像からの差異画像を使用することにより、定温培養期間が終了する前に 推定に基づくコロニー数を提供する方法を説明したが、類似の方法を使用して、 時間経過減法を行わずに、選択した成長媒体について確認された数を提供するこ とも可能である。酸化減少指標、酸化トリフェニルテトラゾリウム(TTC)を含む 選択成長媒体の例として、３ＭブランドのPETRIFILM 好気性計算プレート（ACプ レート）がある。こうした成長媒体は、時間経過減法を行っても行わなくても使 用することができる。なぜなら、成長する微生物コロニーを囲む色の変化は、成 長媒体に対して高度のコントラストを示し、特に白／ベージュの背景上に赤く着 色された範囲を示すからである。こうした成長媒体では、差異画像を不要である 。したがって、成長媒体の個々の画像は、定温培養期間が終了した後に収集する 。図22を参照すると、ブロック600 において画像を収集した後、ブロック602 に おいて新しいピーク検出が行われる。システムは、差異画像ではなく成長媒体の 画像を分析するので、未処理のピクセル強度を分析する。ACプレートの場合、ピ ークは白い背景上の赤い範囲であり、画像内の最低強度ピクセルである。したが って、図10の方法を使用して最大を調査するのではなく、同じ方法を使用して、 最小ピクセル強度を調査すると良い。あるいは、画像のネガを入手して、最大強 度を決定しても良い。次に、図８と同様に、ピーク勾配試験及びピーク半径試験 を実施してピークを確認し、その半径を決定する。 ブロック604 では、ピークの実証を行う。本発明の一実施例では、図16の方法 を使用して、潜在的コロニーを実証する。別の実施例では、ピークは、ブロック 602 で確認されるので、潜在的コロニーとして記憶され、その半径の長さに基づ いて分類される。ピークを実証する際、コロニーは最大半径から最小半径まで実 証される。最大のコロニーは自動的に実証される。各々の潜在的コロニーについ てはその後、最近の実証済みコロニーが最初に確認される。潜在的コロニーは、 実証済みコロニーとして確認されるには、最近の実証済みコロニーから最小距離 に位置しなければならない。潜在的コロニーが最小距離の範囲内にある場合、潜 在的コロニーのリストから除去され、ノイズとみなされる。ブロック606 及び60 8 では、実証済みコロニーの数、その位置及びそのサイズなど、実証済みコロニ ーに関連するデータが決定され、出力される。 本発明について、望ましい実施例を図示して説明したが、当業者は、説明した 特定の構成及びステップの代わりに、同じ目的を達成するために考えられる任意 の方法又は装置を使用できることを評価するであろう。本出願は、本発明の改作 又は変形を含むことを意図している。したがって、本発明は添付の請求の範囲及 びこれの対応物によってのみ限定されることを明確に意図する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．接種された増殖培地中で微生物コロニーを検出し、そして同定するための 方法であって： ａ）第一コロニーの画像データを収集するために上記増殖培地をイメージング し； ｂ）所定の時間間隔にわたり上記増殖培地をインキュベートし； ｃ）第二コロニーの画像データを収集するために上記増殖培地をイメージング し； ｄ）上記の第一コロニーの画像データと上記の第二コロニーの画像データとの 差異を求めることにより得られる差異画像を作成するために、上記第一及び第二 コロニー画像を処理し； ｅ）上記差異画像内で、潜在的コロニーであって各々がピーク・ピクセル及び コロニー半径を有するものを同定し；そして ｆ）上記潜在的コロニーが確認されたコロニーであることを保証するために上 記の各潜在的コロニーを確認する、 段階を含むことを特徴とする方法。 ２．請求項１に記載の微生物コロニーを検出し、そして同定するための方法で あって、その各々の潜在的コロニーを確認する段階が： ａ）その潜在的コロニーが、ノイズ・スパイクである場合、その潜在的コロニ ーを除去し；そして ｂ）その潜在的コロニーが、確認されたコロニーの周辺のノイズである場合、 その潜在的コロニーを除去する、 段階を含むことを特徴とする方法。 ３．請求項２に記載の微生物コロニーを検出し、そして同定するための方法で あって、その潜在的コロニーがノイズ・スパイクであ る場合、その潜在的コロニーを除去する段階が； ａ）その潜在的コロニーのピーク・ピクセルのピーク・ピクセル強度値を、ス パイク・ピークの閾値と比較し； ｂ）その潜在的コロニーのコロニー半径を、スパイク半径閾値と比較し；そし て ｃ）そのピーク・ピクセル強度値が、そのスパイク・ピーク閾値を超え、そし てそのコロニー半径が、そのスパイク半径閾値を超えない場合、その潜在的コロ ニーを除去する、 段階を含むことを特徴とする方法。 ４．請求項２に記載の微生物コロニーを検出し、そして同定するための方法で あって、その潜在的コロニーがノイズ・スパイクである場合、その潜在的コロニ ーを除去する段階が： ａ）その潜在的コロニーのピーク・ピクセル強度とコロニー半径から得られる 計算値を計算し； ｂ）その計算値をスパイク・ピーク値と比較し；そして ｃ）その計算値がそのスパイク・ピーク値を超える場合、その潜在的コロニー を除去する、 段階を含むことを特徴とする方法。 ５．請求項２に記載の微生物コロニーを検出し、そして同定するための方法で あって、その潜在的コロニーが確認されたコロニー周辺のノイズである場合、そ の潜在的コロニーを除去する段階が： ａ）その潜在的コロニーに関連するピーク・ピクセルの値に従ってその潜在的 コロニーを分類し； ｂ）最大ピーク・ピクセル強度値をもつ上記潜在的コロニーに最も近い確認さ れたコロニーを同定し； ｃ）上記の最も近い確認されたコロニーについてノイズ半径を計算し； ｄ）その潜在的コロニーが上記の最も近い確認されたコロニーのノイズ半径の 外側にある場合、その潜在的コロニーを確認し； ｅ）上記の潜在的コロニー及び上記の最も近い確認されたコロニーのピーク・ ピクセル値から得られる計算されたピーク値を計算し； ｆ）上記の潜在的コロニー及び上記の最も近い確認されたコロニーの半径の値 から得られる計算された半径値を計算し； ｇ）上記の計算された半径値が閾半径値を超え、上記の計算されたピーク値が 閾ピーク値を超え、上記の潜在的コロニーのピーク・ピクセル値が閾ピーク確認 値を超え、そして上記の潜在的コロニーの半径が閾半径確認値を超える場合、そ の潜在的コロニーを確認し；そして ｈ）上記の潜在的コロニーが確認されたコロニーではない場合、その潜在的コ ロニーを除去する、 段階を含むことを特徴とする方法。 ６．請求項５に記載の微生物コロニーを検出し、そして同定するための方法で あって、最も近い確認されたコロニーの同定が： ａ）その確認されたコロニーの外縁であって、各確認されたコロニーのピーク ・ピクセルとコロニー半径により定められるものを、定め； ｂ）その潜在的コロニーの潜在的外縁であって、その潜在的コロニーのピーク ・ピクセルとコロニー半径により定められるものを、定め；そして ｃ）その潜在的コロニーの潜在的外縁に最も近い外縁をもつ上記の確認された コロニーを、上記の最も近い確認されたコロニーとして標識付けする、 段階を含むことを特徴とする方法。 ７．請求項１に記載の微生物コロニーを検出し、そして同定するための方法で あって、その差異画像内の潜在的コロニーの同定段階が： ａ）その差異画像内に、ピーク・ピクセルであって、局所的最大ピクセル強度 をもち、そしてさらに、閾ピーク強度値を超えるものを置き； ｂ）所定数の方向において上記ピーク・ピクセルからの勾配を測定し； ｃ）少なくとも最小数の上記勾配が、最小勾配距離にわたって減少する場合、 上記ピーク・ピクセルを潜在的コロニーとして標識付けし； ｄ）上記ピーク・ピクセルについてそのコロニー半径を測定し； ｅ）所定のサイズの第一マスクであって上記ピーク・ピクセル上に中心をもつ ものをその第一コロニー画像上に配置し；そして ｆ）上記ピーク・ピクセルのいずれかの上に中心をもつマスクにより覆われて いないピクセルについて、段階ａ）〜段階ｅ）を繰り返す、 段階を含むことを特徴とする方法。 ８．請求項７に記載の微生物コロニーを検出し、そして同定するための方法で あって、その局所的最大ピクセル強度をもつピーク・ピクセルを配置する段階が ： ａ）その差異画像を走査して種ピクセルであって、閾種値を超える強度値をも つものを配置し； ｂ）所定のボックス・サイズをもつボックスを定め； ｃ）上記ボックスの上の行を上記の種ピクセルの上にセンタリングし； ｄ）最大ボックス・ピクセルであって、上記ボックス内に最大強 度値をもち、そして数個のピクセルがその最大強度値をもつすべてのピクセルで ある場合、数個のピクセルの重心である最大ボックス・ピクセルを同定し； ｅ）上記最大ボックスピクセル上に上記ボックスを、そのボックスがその最大 ボックス・ピクセル上に中心をもつように、再配置し； ｆ）ボックス移動の数が、所定の最大ボックス移動数を超えるか又はその最大 ボックス・ピクセルが２回の連続する繰り返しにおいて同じになるまで、段階ａ ）〜段階ｅ）を繰り返し；そして ｇ）上記の最大ボックス・ピクセルが、２回の連続する繰り返しにおいて同じ になった場合、その最大ボックス・ピクセルをそのピーク・ピクセルとして標識 付ける、 段階を含むことを特徴とする方法。 ９．請求項７に記載の微生物コロニーを検出し、そして同定するための方法で あって、そのピーク・ピクセルのコロニー半径を測定する段階が： ａ）そのピーク・ピクセルから所定数の方向においてピクセル値を走査し； ｂ）その半径距離が所定の最大半径距離に等しくなり、そのピクセル値が閾半 径強度値末端であり、又はそのピクセル値が、先に走査されたピクセル値を所定 のノイズ値分超えるまで、上記各方向について半径距離を計算し；そして ｃ）所定数の方向について上記半径距離のメジアン値を計算する、 段階を含むことを特徴とする方法。 10．接種された増殖培地上で微生物コロニーを検出し、そして同定するための 装置であって： 上記増殖培地をインキュベートするためのインキュベーション・チャンバー； 上記増殖培地の画像を得るための画像獲得手段であって、１回目に第一コロニ ー画像を獲得し、そして２回目に第二コロニー画像を獲得する画像収集手段； 差異画像を作成するための処理手段であって、その差異画像が上記第一コロニ ー画像と上記第二コロニー画像の差異を求めることにより得られるような処理手 段； 上記差異画像の範囲内の潜在的コロニーを同定するための手段であって、その 各潜在的コロニーがピーク・ピクセル及びコロニー半径をもつような同定手段； 及び 上記潜在的コロニーが確認されたコロニーであることを保証するためにその各 潜在的コロニーを確認する確認手段、 を含んで成ることを特徴とする装置。 11．請求項10に記載の微生物コロニーを検出し、そして同定するための装置で あって、その確認手段が： ａ）その潜在的コロニーが、ノイズ・スパイクである場合、その潜在的コロニ ーを除去する手段；及び ｂ）その潜在的コロニーが確認されたコロニーの周辺のノイズである場合、そ の潜在的コロニーを除去する手段、 を含んで成るそのことを特徴とする装置。 12．請求項11に記載の微生物コロニーを検出し、そして同定するための装置で あって、その潜在的コロニーがノイズ・スパイクである場合、その潜在的コロニ ーを除去する手段が： ａ）その潜在的コロニーのピーク・ピクセルのピーク・ピクセル強度値をスパ イク・ピーク閾値と比較するための手段； ｂ）その潜在的コロニーのコロニー半径をスパイク半径閾値と比 較するための手段； ｃ）そのピーク・ピクセル強度値が、そのスパイク・ピーク閾値を超え、そし てそのコロニー半径が、そのスパイク半径閾値を超えない場合、その潜在的コロ ニーを除去する手段、 を含んで成ることを特徴とする装置。 13．請求項11に記載の微生物コロニーを検出し、そして同定するための装置で あって、その潜在的コロニーがノイズ・スパイクである場合、その潜在的コロニ ーを除去する手段が： ａ）その潜在的コロニーのピーク・ピクセル強度とコロニー半径から得られる 計算された値を計算するための手段； ｂ）上記計算値をスパイク・ピーク値と比較するための手段；及び ｃ）上記計算値がそのスパイク・ピーク値を超える場合、その潜在的コロニー を除去するための手段、 を含んで成ることを特徴とする装置。 14．請求項11に記載の微生物コロニーを検出し、そして同定するための装置で あって、その潜在的コロニーが確認されたコロニー周辺のノイズである場合、そ の潜在的コロニーを除去する手段が： ａ）その潜在的コロニーに関連するピーク・ピクセルの値に従ってその潜在的 コロニーを分類するための手段； ｂ）最大ピーク・ピクセル強度値をもつ上記潜在的コロニーに最も近い確認さ れたコロニーを同定するための手段； ｃ）上記の最も近い確認されたコロニーのノイズ半径を計算するための手段； ｄ）その潜在的コロニーが上記の最も近い確認されたコロニーの外側にある場 合、その潜在的コロニーを確認するための手段； ｅ）上記の潜在的コロニーのピーク・ピクセル値及び上記の最も 近い確認されたコロニーから得られる計算されたピーク値を計算するための手段 ； ｆ）上記の潜在的コロニー及び上記の最も近い確認されたコロニーの半径値か ら得られる計算された半径値を計算するための手段； ｇ）上記の計算された半径値が閾半径値を超え、上記の計算されたピーク値が 閾ピーク比値を超え、その潜在的コロニーのピーク・ピクセル値が閾ピーク確認 値を超え、そしてその潜在的コロニーの半径が閾半径確認値を超える場合、その 潜在的コロニーを確認するための手段；及び ｈ）上記の潜在的コロニーが確認されたコロニーではない場合、その潜在的コ ロニーを除去する手段、 を含んで成ることを特徴とする装置。 15．請求項14に記載の微生物コロニーを検出し、そして同定するための装置で あって、最も近い確認されたコロニーを同定するための手段が： ａ）その確認されたコロニーの外縁であって、各確認されたコロニーのピーク ・ピクセルとコロニー半径により定められるものを、定めるための手段； ｂ）その潜在的コロニーの潜在的外縁であって、その潜在的コロニーのピーク ・ピクセルとコロニー半径により定められるものを定めるための手段；及び ｃ）その潜在的コロニーの潜在的外縁に最も近い外縁をもつ確認されたコロニ ーを、上記の最も近い確認されたコロニーとして標識付けするための手段、 を含んで成ることを特徴とする装置。 16．請求項10に記載の微生物コロニーを検出し、そして同定するための装置で あって、その差異画像内の潜在的コロニーを同定する ための手段が： ａ）その差異画像内に、ピーク・ピクセルであって、局所的最大ピクセル強度 をもち、そしてさらに閾ピーク強度値を超えるものを置くための手段。 ｂ）所定数の方向において上記ピーク・ピクセルからの勾配を測定するための 手段； ｃ）少なくとも最小数の上記勾配が、最小勾配距離にわたって減少する場合、 上記ピーク・ピクセルを潜在的コロニーとして標識付けするための手段； ｄ）上記ピーク・ピクセルについてのコロニー半径を測定するための手段；及 び ｅ）所定サイズの第一マスクであって上記ピーク・ピクセル上に中心をもつも のをその第一コロニー画像上に配置するための手段、 を含んで成ることを特徴とする装置。 17．請求項16に記載の微生物コロニーを検出し、そして同定するための装置で あって、その局所的最大ピクセル強度をもつピーク・ピクセルを配置するための 手段が： ａ）その差異画像を走査して種ピクセルであって、閾種値を超える強度値をも つものを配置するための手段； ｂ）所定のボックス・サイズをもつボックスを定めるための手段； ｃ）上記のボックスの上の行を上記の種ピクセルの上にセンタリングするため の手段； ｄ）最大ボックス・ピクセルであって、上記ボックス内に最大強度値をもち、 そして数個のピクセルがその最大強度値をもつすべてのピクセルである場合、数 個のピクセルの重心である最大ボックス・ピクセルを同定するための手段； ｅ）上記最大ボックス・ピクセル上に上記ボックスを、そのボックスがその最 大ボックス・ピクセル上に中心をもつように、再配置するための手段； ｆ）ボックス移動の数が、所定の最大ボックス移動数を超えるか又はその最大 ボックス・ピクセルが２回の連続する繰り返しにおいて同じであることを判定す るための手段；及び ｇ）上記の最大ボックス・ピクセルが、２回の連続する繰り返しにおいて同じ だった場合、その最大ボックス・ピクセルをそのピーク・ピクセルとして標識付 けするための手段、 を含んで成ることを特徴とする装置。 18．請求項16に記載の微生物コロニーを検出し、そして同定するための装置で あって、そのピーク・ピクセルについてのコロニー半径を測定するための手段が ： ａ）そのピーク・ピクセルからの所定数の方向においてピクセル値を走査する ための手段； ｂ）その半径距離が所定の最大半径距離に等しくなるか、そのピクセル値が閾 半径強度値未満になるか、又はそのピクセル値が先に走査されたピクセル値を所 定のノイズ値分超えるまで、その方向について半径距離を計算するための手段； 及び ｃ）上記の所定数の方向について上記半径距離のメジアン値を計算するための 手段、 を含んで成ることを特徴とする装置。