CN109661473B - 用于确定微生物的存在和鉴定所述微生物的方法、系统和计算机程序产品 - Google Patents
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Abstract
一种确定至少一种确定的微生物在含一种或多种微生物菌落和培养基的培养皿中的存在的方法和系统及包含被执行时执行本发明方法的指令的计算机可读介质。方法包括获得培养皿的初始图像并对图像应用第一处理来获得像素仅与微生物菌落关联的第一处理图像；对第一处理图像应用第二处理来获得像素与微生物菌落及其周围区关联的第二处理图像；计算初始和第二处理图像间的差异以获得像素仅与培养基关联的第三处理图像；计算第二和第一处理图像间的差异以获得像素仅与周围区关联的第四处理图像；对每个颜色通道计算第三和第四处理图像的平均像素差值来确定特征值；对特征值分类来确定微生物存在指示符值；比较该值与阈值以确定该确定的微生物的存在。
Description
发明领域
本发明涉及用于分析培养皿(Petri dish)中的生物样品的微生物分析领域，所述生物样品包含微生物，并且更具体地涉及用于确定诸如细菌的微生物的存在并鉴定培养皿中的所述微生物的方法、系统和计算机程序。
发明背景
在微生物学领域中公知的是，为了确定特定细菌的存在并鉴定所述细菌，对包括例如微生物、细胞或亚细胞提取物的生物样品的生长进行分析。因此，可以诊断出对应的疾病。
在现有技术中，存在一些用于鉴定细菌的解决方案。该解决方案基于包括监督学习算法的方法，该算法使用称为描述符(descriptor)的标准。该描述符涉及细菌的颜色、形式和结构。
此类方法还使用用于确定分离的细菌菌落的位置的步骤操作。该位置可以以半自动方式由用户提供，或者通过应用特定分割算法以自动方式来提供。然而，提供位置的这两种方法都不准确并且生成一些错误，这致使位置的确定不正确。
公布的专利申请US 2015/0087017公开了一种用于细菌菌落的自动分类的方法。该方法基于培养皿内细菌菌落的分类步骤，所述分类步骤基于诸如针对每个细菌菌落的颜色、形状和轮廓的标准。
然而，此类自动化方法不适用于培养皿内容物的分析。实际上，为了鉴定与培养皿中的细菌菌落相关的特定生物现象及所述细菌菌落与培养基的相互作用，还必须分析所述细菌菌落周围的环境。此类生化反应被生物学家们用来区分不同的微生物，并允许做出或排除诊断假设。
例如，关于分析含有血琼脂培养基的培养皿中微生物的生长，现有技术的方法包括鉴定溶血现象的性质的步骤，以确定琼脂培养基中血细胞降解到何种水平，以表征特定微生物。溶血现象涉及某些微生物产生能够破坏琼脂的血细胞的蛋白质的能力。有三种类型的溶血现象，命名为如下的α、β和γ：
-α-溶血现象产生围绕血琼脂上生长的细菌菌落的绿色变色。这种溶血现象呈现血琼脂的红细胞血红蛋白的部分分解；
-β溶血现象呈现细菌菌落附近的红细胞血红蛋白的完全分解。
-γ溶血现象对应于细菌菌落周围的区域中不存在任何分解。
在其他情况下，细菌和培养基之间的相互作用生成菌落周围的可见伪影(artefact)，诸如特定颜色的出现。这些颜色变化是由于培养基和细菌产生的代谢物之间的化学反应引起的，其中取决于微生物本身的性质，所述化学反应可以解释为阳性或阴性反应。如今，此类步骤由用户提供，用户必须观察培养皿内容物，以确定溶血现象的性质或菌落周围的颜色变化。但是，这种人为分析可能会导致错误。另外，在待分析的培养皿数量增加的情况下，所述鉴定步骤是一个耗时的过程。
因此，需要改进现有技术的方法以允许以有效的方式自动鉴定培养皿中的生物要素。
发明概述
根据本发明的一个方面，提供了一种用于确定至少一种确定的微生物(诸如至少一种确定的细菌)在包含一种或更多种微生物菌落和培养基的培养皿中的存在的方法，所述培养基适于允许一种或更多种微生物菌落和所述至少一种确定的微生物(如果存在的话)在合适的生长条件下生长，该方法包括：
-获得培养皿的至少一个初始图像，其中第一初始图像包括一个或更多个可见像素，每个像素与像素值相关联；
-通过对至少一个初始图像应用第一处理获得培养皿的第一处理图像，其中第一处理图像的可见像素仅涉及与一种或更多种微生物菌落相关联的像素；
-通过对第一处理图像应用第二处理获得培养皿的多于一个第二处理图像，其中第二处理图像的可见像素仅涉及与一种或更多种微生物菌落和所述一种或更多种微生物菌落周围的周围区(surrounding zone)相关联的像素；
-通过计算至少一个初始图像和多于一个第二处理图像之间的差异获得培养皿的多于一个第三处理图像，其中所述多于一个第三处理图像包括仅涉及与培养基相关联的像素的可见像素；
-通过计算所述多于一个第二处理图像和第一处理图像之间的差异获得培养皿的多于一个第四处理图像，其中所述多于一个第四处理图像的可见像素仅涉及与周围区相关联的像素；
-通过针对红绿蓝(RGB)颜色通道的至少每个颜色通道计算所述多于一个第三处理图像的平均像素值和所述多于一个第四处理图像的平均像素值之间的差值，确定与所述多于一个第三处理图像和所述多于一个第四处理图像相关联的特征值；
-通过对所确定的特征值进行分类来确定至少一种确定的微生物在培养皿中的周围区内的存在的指示符(indicator)的值；
-将指示符的值与阈值进行比较；
-根据比较结果，确定至少一种确定的微生物在培养皿中的周围区内的存在。
在本申请的上下文中，术语“平均像素值”指：
-像素值的算术平均值，或
-像素值的中值。
根据本发明的优选实施方案，通过针对红绿蓝(RGB)颜色通道的至少每个颜色通道计算多于一个第三处理图像的中值像素值和多于一个第四处理图像的中值像素值之间的差值来确定与多于一个第三处理图像和多于一个第四处理图像相关联的特征值。
优选地，第一处理是分割处理。
根据本发明的方法提供了对培养皿内容物的自动分析，该自动分析基于自动鉴定微生物菌落周围的特定区以及自动确定分别与生物学现象诸如溶血现象或变形杆菌属(Proteus)感染相关联的细菌诸如β-溶血性细菌或变形杆菌属细菌的存在。因此，本方法避免了视觉鉴定步骤和/或视觉确定步骤的操作。
根据本发明的方法包括用于鉴定培养皿中微生物菌落周围的特定区的步骤，其中所述特定区可包括细菌菌落或细菌的菌落簇。
根据本发明的另一方面，提供了一种用于确定至少一种确定的微生物(诸如至少一种确定的细菌)在包含一种或更多种微生物菌落和培养基的培养皿中的存在的系统，所述培养基适于允许一种或更多种微生物菌落和所述至少一种确定的微生物(如果存在的话)在合适的生长条件下生长，其中该系统包括用于获得培养皿的至少一个初始图像的成像系统，以及处理系统，所述处理系统包括：
-第一处理单元，用于获得培养皿的至少一个初始图像的第一处理图像，其中第一处理图像的可见像素仅涉及与一种或更多种微生物菌落相关联的像素；
-第二处理单元，用于获得培养皿的第一处理图像的多于一个第二处理图像，其中第二处理图像的可见像素仅涉及与一种或更多种微生物菌落和所述一种或更多种微生物菌落周围的周围区相关联的像素；
-计算单元，用于通过计算第二初始图像和第二处理图像之间的差异获得培养皿的多于一个第三处理图像，其中第三处理图像的可见像素仅涉及与培养基相关联的像素，并且用于通过计算第二处理图像与第一处理图像之间的差异获得培养皿的多于一个第四处理图像，其中第四处理图像的可见像素仅涉及与周围区相关联的像素；
-特征提取单元，用于通过针对RGB颜色通道的至少每个颜色通道计算第三处理图像的平均像素值和第四处理图像的平均像素值之间的差值来确定与多于一个第三处理图像和多于一个第四处理图像相关联的特征值；
-以及分析单元，用于确定至少一种确定的微生物在培养皿中的周围区内的存在的指示符的值，将该指示符的值与阈值进行比较；以及根据比较结果确定至少一种确定的微生物在培养皿中的周围区内的存在。
如前所述，根据本发明的优选实施方案，通过针对红绿蓝(RGB)颜色通道的至少每个颜色通道计算多于一个第三处理图像的中值像素值和多于一个第四处理图像的中值像素值之间的差值来确定与多于一个第三处理图像和多于一个第四处理图像相关联的特征值。
根据本发明的另一方面，提供了一种包括指令的计算机程序产品，当该指令被执行时，使得可编程数据处理装置执行根据本发明的方法的步骤。
附图简述
现在将通过实例的方式参考附图，其中：
图1代表根据本发明的实施方案的系统的简化图；
图2代表根据本发明的实施方案的轮形状的控制器，包括圆形孔、白色背景圆圈和黑色背景圆圈；
图3是根据本发明的实施方案的成像系统的简化图，显示了应用于培养皿的不同类型的照明光束；
图4显示了根据本发明的实施方案确定细菌存在的方法的流程图；
图5显示了根据本发明的实施方案确定溶血性细菌的存在的方法的流程图；
图6代表根据本发明的实施方案的含有血琼脂和溶血性细菌的培养皿的原始图像，所述原始图像涉及背光照明；
图7a、图7b和图7c以中间仰视图(median bottom view)分别显示了根据本发明的实施方案的原始图像的红色、绿色和蓝色通道图像；
图8显示了根据本发明的实施方案的原始图像的称为生长掩膜(GrowthMask)的二进制图像；
图9a显示了根据本发明的实施方案的与图6的原始图像的光晕掩膜(HaloMask)相关的图像；
图9b显示了根据本发明的实施方案的图6的原始图像的培养基掩膜(CultureMediumMask)；
图10a和图10b分别显示了根据本发明的实施方案的具有50个像素的膨胀参数(dilation parameter)的200×200像素的像素块(pixel patch)的光晕掩膜和培养基掩膜；
图11a、图12a和图13a分别显示了根据本发明的实施方案的具有10个像素、50个像素和60个像素的膨胀参数的光晕掩膜的像素块；
图11b、图12b和图13b分别显示了根据本发明的实施方案的具有10个像素、50个像素和60个像素的膨胀参数的培养基掩膜的像素块；
图14a显示了根据本发明的实施方案的特征在块水平上在包含β-溶血性细菌、α溶血性细菌和γ溶血性细菌的培养皿中的分布；
图14b代表显示了根据本发明的实施方案的关于蓝色通道上光晕掩膜和培养基掩膜之间的颜色差值的像素块分布的图；
图15显示了根据本发明的实施方案确定变形杆菌属细菌存在的方法的流程图；
图16a显示了根据本发明的实施方案的包含CPS培养基和变形杆菌属细菌的培养皿的原始图像；
图16b显示了根据本发明的实施方案的图16a的原始图像的称为二进制生长掩膜(BinaryGrowthMask)的二进制图像；
图17a显示了根据本发明的实施方案的图16a的原始图像的彩色生长掩膜；
图17b显示了根据本发明的实施方案的图16a的原始图像的彩色光晕掩膜；
图17c显示了根据本发明的实施方案的图16a的原始图像的彩色培养基掩膜；
图18a显示了根据本发明的实施方案的、叠加有培养皿的底部环形视图的具有70个像素的膨胀参数的光晕掩膜的轮廓，所述培养皿包含CPS培养基和4类细菌；
图18b显示了根据本发明的实施方案的、叠加有培养皿的底部环形视图的具有10个像素的膨胀参数的光晕掩膜的轮廓，所述培养皿包含CPS培养基和4类细菌；
图19显示了根据本发明的实施方案的代表变形杆菌属细菌存在的概率分布的图；
图20显示了根据本发明的实施方案的培养皿的原始图像，所述培养皿含有不透明培养基诸如不透明CPS与变形杆菌属细菌；
图21和图22分别显示了根据本发明的实施方案的图20的培养皿关于左底部环形视图和顶部环形视图的图像；
图23代表显示了根据本发明的实施方案，用CART算法和SVM算法的变形杆菌属细菌存在的概率p(Halo/X)的分布以及对于含有半透明培养基的培养皿中变形杆菌属细菌存在的最终概率的分布的图；
图24代表显示了根据本发明的实施方案的用CART算法和SVM算法的变形杆菌属细菌存在的概率p(Halo/X)的分布以及对于含有不透明培养基的培养皿中变形杆菌属细菌存在的最终概率的分布的图。
优选实施方案的详述
以下描述基于具体实例以足够清楚和完整的方式公开了本发明。然而，该描述不应被理解为将保护范围限制于下面描述的具体实施方案和实例。
在下面的描述中，术语“培养皿”定义培养平板(Petri plate)和覆盖培养平板的盖子的组件。培养皿可包括显示在培养平板上或盖子上的绢印(serigraphy)。
在下面的描述中，术语“像素”涉及图像中的位置，并且术语“像素值”指所述图像中的像素的对应捕获强度的检测值。
在下面的描述中，术语“暗像素”涉及具有像素值为0的像素。
在下面的描述中，术语“可见像素”涉及具有除0之外的值的像素，也称为亮像素。
所描述的计算操作涉及与相关图像的像素值相关联的操作。
在下面的描述中，对培养皿表面的表示(representation)发生在正交空间x、y、z中，其中z是x和y的函数，诸如z＝f(x,y)。
在下面的描述中，与培养皿相关联的像素在称为器皿掩膜(DishMask)的图像中界定区。
在下面的描述中，与培养基相关联的像素在称为培养基掩膜的图像中界定培养基区。
以类似的方式，位于微生物菌落周围的像素在称为光晕掩膜的图像中界定周围区或光晕区。
在下面的描述中，术语“原始图像”涉及用图像捕获设备采集的培养皿的图像。
在下面的描述中，术语“初始图像”涉及培养皿的图像，其中初始图像可以涉及原始图像或者在用图像捕获设备采集之后已经在成像系统内处理过的图像。
图1示出了根据本发明的系统100的实例。系统100包括样品器皿库102、自动划线机104、智能培养箱系统106、处理系统108和分析单元110。
样品器皿库102手动或自动地产生样品器皿，生物样品可以在其中生长并被分析。样品器皿通常是培养皿，但也可以使用其他器皿。因此，本文对培养皿的提及不意图是限制性的。
样品器皿库102将适当的培养基添加到培养皿中以使生物样品能够生长。
自动划线机(automatic streaking machine)104将生物样品应用于培养皿，并且然后以已知方式分配生物样品。例如，在培养皿中，使用长度近似等于培养皿半径的梳子应用生物样品。梳子被应用，然后致力于(turn to)将生物样品铺展在培养皿的表面上。合适的自动划线机104的一个实例由申请人以
Isola商标名称商业化。
一旦生物样品已经被分配在培养皿中的培养基上，培养皿就由操作者手动或借助于传送带或其他自动化系统传递到该过程的下一阶段，即智能培养箱系统106。
智能培养箱系统106包括培养箱112和成像系统114。将培养皿引入智能培养箱系统106中并在预定温度孵育预定时间。这致使生物样品生长，在培养皿内的培养基表面上产生许多微生物菌落。一旦已经根据需要孵育培养皿，培养皿就被传递到成像系统114。成像系统114是用于产生整个系统100中生成的菌落和培养物的图像的系统。下面将进一步描述成像系统114的细节。
图像用于生物样品的第一阶段分析。该阶段可以鉴定生物样品的菌落和其他方面，以帮助和促进整个系统100的进一步活动和功能。
在培养皿的图像已经产生之后，培养皿然后被传递到该过程的下一阶段，即处理系统108。这可以通过传送带或其他自动系统自动执行，或者由操作者执行。
处理系统108可以根据所需的生物样品分析采取各种不同的形式。例如，可以基于图像提取特定菌落，用于进一步分析或处理。此时可以将许多其他处理应用于培养皿。如果需要，培养皿可以返回到智能培养箱系统106以便进一步生长和/或返回到成像系统114。
在完成所有必要的处理和成像之后，可以借助于手动或自动过程将培养皿传递到分析单元110。
如前所述，智能培养箱系统106包括成像系统。成像系统114包括基本单元。基本单元包括用于生成红色、绿色和蓝色背光照明的光学器件和控制电路。基本单元可以包括控制器，该控制器可以是具有三个位置的轮形状，如图2所示。这些位置对应于不同的照明，即“无背景(noBackground)”、“白色背景(whiteBackground)”和“黑色背景(blackBackground)”。“无背景”位置涉及轮中的圆形孔150。“白色背景”位置涉及轮中的白色背景圆圈160。“黑色背景”位置涉及轮中的黑色背景圆圈170。无背景用于背光，而白色和黑色用于所有其他类型的照明，其他类型的照明取决于样品的性质。
在基本单元上方，有一个样品保持单元。样品保持单元可以包括可以滑入和滑出的抽屉，并且包括适于支撑培养皿的样品凹槽。另外，样品保持单元包括四个红色、绿色和蓝色水平照明源。四个照明源直线地(rectilinearly)定位在样品凹槽周围，并且可独立控制。在使用中，培养皿的顶部基本上与四个水平照明源的顶部成直线。水平照明源允许用水平或近水平光束照射培养皿。
应当注意，样品凹槽的底部是光学透射的，以在使用中允许背光照明来照射生物样品。样品保持单元还包括操作四个水平照明源所需的光学器件和控制器。
样品保持单元可以包括替代取向，生物样品以该取向被传送带传递到用于成像的位置。抽屉可以被具有样品保持区的传送带系统代替，每个样品保持区都是透明的，以允许使用背光。传送带系统可以将生物样品移动到适当的位置，并且然后可以拍摄必要的图像。然后传送带将下一个生物样品移动到用于成像的位置，并将第一个生物样品继续移动到下一个处理阶段。这使得能够在不同位置以及当生物样品移动时拍摄图像。
在另一替代方案中，成像系统可包括机械臂，该机械臂能够将培养皿装载到样品架中或传送带上。另外，机械臂可以在成像之前移除培养皿的盖子并且之后更换盖子。这可以通过倒置培养皿并使盖子脱落来完成。移除盖子确保当生物样品被某照明源照射时盖子不会产生反射。
除了移入和移出成像区之外，样品保持单元还可以包括改变生物样品相对于正常位置的位置的机构。例如，样品保持单元可以能够使样品定向成与特定光束成特定角度。生物样品的其他移动，例如旋转，也可以用适当的机构进行。结果，可以通过移动样品保持单元中的生物样品或照明源而实现生物样品和照明源的任何相对移动。变化无穷无尽。
成像系统114还包括位于样品保持单元上方的第一中间单元。第一中间单元包括四个直线地定位的红色、绿色和蓝色照明源。照明源在使用中适于向样品保持单元中的样品凹槽上产生环形照明，并且每个都是可独立控制的。可以调整环形照明以从任何适当的方向入射到样品上，包括横向、非横向或任何其它适当的取向。
成像系统114还包括第二中间单元。第二中间单元包括四个直线地定位的红色、绿色和蓝色照明源。照明源向上定向并从上面的单元反射，以产生反向环形照明，在使用中，该反向环形照明照射样品凹槽中的样品。每个照明源都是可独立控制的。
成像系统114的头部单元位于第二中间单元上方。头部单元包括白光照明源，每个白光照明源都是可独立控制的。在使用中，八个照明源布置成在样品凹槽上产生垂直照明。
头部单元还包括图像捕获设备254，诸如指向样品凹槽的照相机。来自任一个单元的照明源的任何组合的照明可以指向样品凹槽。然后，图像捕获设备可以捕获来自样品凹槽中的已经被照射的任何生物样品的图像。下面将更详细地解释图像的使用和进一步处理。
头部单元还可包括用于操作各种光源的控制板。除了每个单元中控制其功能的控制电路和光学器件之外，还可以存在整体控制系统。整体控制系统可以包括计算机、显示单元、处理模块和图像增强算法、图像处理以及任何其他过程或技术。
整体控制系统可用于控制哪些照明源用于特定应用。另外，整体控制系统可以针对不同应用来应用不同的图像增强技术和图像处理。图像增强技术是用于增强图像质量或使相关信息对专家可见以查看的方法和技术。下面更详细描述的实例包括：不同图像的融合，诸如垂直融合或对于溶血的融合、边缘照明校正、曝光时间校正等。图像处理是从图像中提取信息以便提供决策支持或自动决策。这不一定包括图像的修改，而是包括以自动方式确定更高级别的信息/解释。下面更详细描述的实例包括：皿环的检测、标记的检测、生长的检测(质量、分离的菌落、群集)、生长/无生长的全局决定等。
整体控制系统可用于执行任何其他功能和/或成像系统的控制操作。这些包括但不限于，
-将样品装载到样品凹槽中和卸载；
-检查并调整样品凹槽中样品的定位；
-控制亮度水平；
-控制红色、绿色和蓝色成分的平衡；
-控制曝光时间；
-控制照明组合；
-测试系统；
-校准系统；以及
-基于分析的用途和目的的任何其他适当的控制。
形成成像系统的单元中的每个能够相对于其他单元移动。当发生这种情况时，可需要某些光学调整以确保生物样品被所有光源照射。
现在将参考图3更详细地描述成像系统114的操作。
图3示出了成像系统114的示意图，以展示各种照明源以及它们如何作用到(impact)位于成像系统114中的生物样品上。样品可以由位于与含有生物样品的培养皿平面相同的平面中的近水平光束302、304照射。除了标识302和304所示的部件之外，近水平光束实际上还包括进出纸面的部件。近水平光束302、304由样品保持单元中的水平照明源产生。
样品也可以由背光光束306照射，所述背光光束306由基本单元生成并且在培养皿下方，以从成像系统114的底部朝向成像系统114的顶部的垂直方向上发射。
环形光束或底部环形光束308还可以照射生物样品，并且由位于培养皿上方的第一中间单元产生。底部环形光束308朝向培养皿以确定的角度发射。由位于培养皿上方的第二中间单元产生的反向环形光束或顶部环形光束310也可以照射培养皿。反向环形光束310以确定的角度朝向成像系统114的顶部发射，远离培养皿，并且然后朝向培养皿反射。
垂直光束312还可以照射培养皿并且由头部单元中的照明源生成。
垂直光束和背光照明在相对于培养皿中的生物样品基本垂直的方向上应用照明。因此，这些照明源中的每一个的光轴也垂直于生物样品。近水平照明、环形照明和反向环形照明不垂直于培养皿。因此，类似地，这些光源的光轴不垂直于生物样品。非垂直源提供了与用垂直源实现的这些图像相比不同范围的或替代的图像。这些非垂直源在用它们创建的任何图像中提供附加的和不同的光学特征。这确保了菌落的分离和检测得到改善。
图3中所示并由适当单元产生的照明源可以是任何优选类型，诸如以红色、绿色和蓝色(RGB)频率工作的发光二极管(LED)；简单的白色光源；紫外线(UV)源或任何其他适当的发光源。照明源可以包括例如322个LED，包括64个白色LED、86个红色LED、86个绿色LED和86个蓝色LED。在任何位置的光源数量可以与本文所示和所述的不同。通过在每个相应频率工作的三个LED的三件套在每个位置提供RGB照明。对于不同的照明源，可能存在RGB LED的不同组合。通过包括LED的特定布置的特定插件板(card)提供每种类型的照明。基本单元借助于两个插件板产生背光光束306，每个插件板包括多于一个二极管，它们三个一组地布置。LED的每个三件套包括红色LED、绿色LED和蓝色LED。总共有45个三件套的LED位于每个插件板上并用于产生背光光束306。在每个三件套中，红色LED、绿色LED和蓝色LED可以一次被点亮一个以产生一个接一个的彩色照明。
在上述照明的所有情况下，生物样品的图像由图像捕获设备254从上方捕获。应当注意，图像捕获设备254可以在预定时间段内拍摄连续的图像集以测量菌落的生长和其他时间相关的影响。另外，图像捕获设备254可以是用于某些应用的摄像机，在这些应用中正在测量菌落的生长进度等。培养皿的移动也可以借助于合适的传送带或机械臂将培养皿移入和移出成像系统114来实现。
图像捕获设备254适于拍摄得自不同的照明源的不同类型的图像。通常，针对特定应用拍摄一系列图像。该系列包括以下步骤：以特定照明或照明组合照射样品，随后拍摄特定类型的图像，诸如单色、黑色和白色，或具有相关照明的RGB。然后用不同类型的照明或其组合拍摄下一个图像，并且该系列继续直到已经拍摄完所有所需图像。在系列内控制图像捕获设备254以拍摄适当类型的图像。
如前所述，成像系统114中的生物样品可以从多于一个不同的光源被照射，这些光源从不同的方向照射样品。在照射生物样品后，从上方拍摄生物样品的图像。每种照明突出了生物样品的不同方面。
背光照明显示培养皿的细节，包括其底部上的任何标记、边缘的形状和培养皿的盖子；以及生物样品中菌落的布局和密度的详细视图。该照明提供了可以分离菌落、确定相似菌落(例如α溶血物种和β溶血物种)之间差异的信息，并且通常给出样品内容物的视图。
近水平照明被样品及其内容物折射和反射，以形成可用于隔离和消除伪影的图像。另外，该图像可用于基于培养基对照明的吸收进行校正，如下面将进一步详细描述的。该图像也可以稍后用于确定菌落对培养皿的覆盖百分比，以提供菌落浓度的估计并确定非不透明培养基上的生长或不生长。
环形照明指向样品并被培养基和已形成的任何菌落反射或折射到图像捕获设备254。通过该照明产生的图像的目的是区分培养基和菌落的颜色的能力。鉴定颜色的能力通常是用于鉴定特定微生物的重要工具，因为一些微生物具有非常独特的颜色。总体结果是一种最接近生物学家对于特定类型微生物期望看到的视图，例如颜色、菌落外观等。这对于鉴定培养基和菌落周围颜色的细微变化尤为重要。此外，通过环形照明产生的图像允许检测显色培养基中细菌菌落下方和周围的颜色的细微变化。
侧向环形照明是四个直线定位的源中仅一个的照明。这给出了具有阴影的图像，该阴影可用于鉴定轮廓和地形(relief)。由于照明方向的不同，每个光源将产生不同的阴影效果。
反向环形照明从头部单元反射到样品上。然后样品将照明反射或折射到图像捕获设备254。由此捕获的图像给出了样品中不同菌落的对比度的细节。该图像还可以提供颜色信息。另外，该图像可以提供纹理信息；菌落的外观和颜色；有关群集极限的信息和有关菌落地形的某信息，诸如高度、形式和形状。
反向环形照明产生准垂直照明，这使得梯度变化可视化。这给出了纹理和粒度信息，并且可用于检测没有那么高但具有表面不规则性的菌落。在一个实施方案中，使用反向环形照明拍摄许多不同的图像并随后组合不同的图像以便处理图像饱和的可能性。
垂直照明源从上方照射生物样品。照明被生物样品和菌落反射，以给出提供详细轮廓信息的图像。这可用于鉴定生物样品的地形和菌落的高度。然后该信息可用于鉴定特定类型的微生物，因为菌落的地形通常非常特异。例如，某些菌落是圆顶形的，其他菌落是凹凸不平的，其他菌落是平坦的等等。
如上所述，照明源和方向中的每一个都可用于强调和增强不同的图像特性。在不脱离本发明的范围的情况下，可以通过使用来自不同源和方向的照明来改变或调整所描述的实例。
此外，不同波长的照明可用于不同的应用，例如红外线和紫外线。
成像系统114可以从照明源的组合创建图像以生成合成图像，该合成图像可以强调和增强生物样品的图像的多于一个特性。
可能对生成的图像有影响的另一个因素是用于使样品生长的培养基的类型。存在许多不同的培养基；这些包括CPS和COS，CPS是一种特别适于使用尿样鉴定大肠杆菌(E-coli)、变形杆菌属和KESC的培养基；COS是一种包括血液的培养基，可用于鉴定溶血能力。
不同的培养基，诸如CPS和COS在性质和颜色上有很大差异。因此，作用在其上的照明可以产生不同类型的图像。因此，不同的照明源和源的组合可以用于不同的培养基。
如前所述，系统100包括处理系统108和分析单元110。处理系统108包括第一处理单元116、第二处理单元118、计算单元120和特征提取单元122。
第一处理单元116能够操作第一处理，该处理是应用于诸如背光或底部环形视图并且由成像系统114提供的培养皿的原始图像的分割处理，用于获得显示与微生物菌落相关联的培养皿内容物和与培养基相关联的培养皿内容物之间的可见分隔线的二进制图像。因此，第一处理单元116提供第一处理图像，该第一处理图像是名为生长掩膜的二进制图像，该二进制图像包括仅涉及与微生物菌落相关联的像素的可见像素。
第一处理单元116还可以操作另外的处理，该另外的处理包括用于相对于培养皿边缘定位培养皿内容物的公知边缘检测处理以及用于在用于去除图像噪声的公知过程中组合两个原始图像的公知组合处理。
第二处理单元118能够操作第二处理，该第二处理是应用于生长掩膜的膨胀处理，用于获得名为膨胀型(Dilated)(生长掩膜)的第二处理图像。膨胀型(生长掩膜)包括可见像素，其仅涉及与微生物菌落相关联的像素，并且还涉及与微生物菌落周围的周围区相关联的像素。定义膨胀参数，使得膨胀型(生长掩膜)包含周围区。膨胀参数由用户确定，如下所述。当与同一图像中的微生物的颜色相比时，周围区可以涉及显示另一种颜色的区。当与同一图像中的微生物的颜色相比时，周围区还可以涉及显示微生物颜色变色的区或显示新着色的区。
计算单元120能够操作涉及两个图像之间的差异计算的第三处理，以用于获得结果图像。因此，计算单元120能够计算培养皿的原始图像即器皿掩膜与生长掩膜之间的差异，以提供名为培养基掩膜的第三处理图像。培养基掩膜包括仅涉及与培养基相关联的像素的可见像素。
计算单元120还能够操作涉及膨胀型(生长掩膜)和生长掩膜之间的差异计算的第四处理，以提供名为光晕掩膜的第四处理图像。光晕掩膜包含仅涉及周围区的可见像素。
特征提取单元122能够操作用于确定光晕掩膜和培养基掩膜的特征值的特征提取处理。特征值涉及光晕掩膜和培养基掩膜的像素值。特征提取单元122针对至少三个红绿蓝(RGB)颜色通道计算第三处理图像的平均像素值和第四处理图像的平均像素值之间的差异。如上所述，术语“平均像素值”指像素值的算术平均值或像素值的中值。
分析单元110能够基于所确定的特征值操作分析处理以确定细菌的存在并鉴定所述细菌。更具体地，分析单元110确定指示符的值，以便将所述指示符的值与确定的阈值进行比较。根据比较结果，分析单元110确定培养皿内细菌的存在或细菌的不存在。
根据本发明，如图4所示，该方法包括步骤400，用于根据特定照明条件用成像系统114获得培养皿的原始图像。实际上，照明条件可根据待鉴定的细菌类型而变化。例如，可以处理原始图像以检测培养皿的边缘。
该方法然后包括步骤402，用于通过对原始图像应用第一处理即分割处理而获得第一处理图像，以获得名为生长掩膜的第一图像。然后，该方法包括步骤404，用于通过对第一处理图像应用第二处理即膨胀处理而获得第二处理图像，以获得名为膨胀型(生长掩膜)的第二图像。该方法包括另一步骤406，用于通过应用第三处理而获得第三处理图像，以获得名为培养基掩膜的第三图像。该方法还包括步骤408，用于通过应用第四处理而获得第四处理图像，以获得名为光晕掩膜的第四图像。该方法还包括步骤410，用于确定与第三处理图像和第四处理图像相关联的特征值，以确定第三处理图像和第四处理图像之间的色差。该方法还包括步骤412，用于通过对特征值进行分类而确定指示符的值。然后在步骤414中将指示符的值与阈值进行比较。该方法包括最终步骤416以确定细菌的存在并将培养皿中的所述细菌鉴定为确定的细菌。
在本发明的第一实施方案中，该方法涉及确定β-溶血性细菌的存在以鉴定溶血现象。第一实施方案的方法包括如图5所示的以下步骤。
在第一实施方案中，光晕掩膜涉及显示微生物菌落周围的变色区或褪色区的光晕区，这是溶血现象的特性。变色区源于同一图像中微生物的颜色。培养基是血琼脂。
在第一实施方案中，该方法包括步骤500，用于获得由图7a、图7b和图7c中所示的图像的组合构成的初始图像。通过用成像系统114使用RGB颜色通道的中间底部环形视图而获得初始图像。实际上，在用该视图拍摄的图像中，特别是在绿色通道和蓝色通道上，溶血现象不太可见。图7a显示了红色通道的原始图像。图7b显示了绿色通道的原始图像，并且图7c显示了蓝色通道的原始图像。
该方法然后包括步骤502，用于用公知的边缘检测方法确定培养皿的边缘，以及用于用公知的高斯滤波器去除图像噪声的步骤，其中σ＝1且k＝5×5。
该方法然后包括用于分离每个颜色通道的步骤504和用于将来自绿色通道和蓝色通道的图像与两个图像的像素的平均值组合以提供平均图像的步骤506。实际上，去除来自红色通道的图像避免了将光晕区视为微生物菌落。
该方法还包括分割处理，该分割处理包括以下步骤。分割处理包括在步骤508中基于绿色通道图像和蓝色通道图像的组合图像，根据公知的Otsu法确定阈值。实际上，Otsu法提供称为阈(Otsu)的阈值，以比较确定的图像上的位置(x，y)处的像素值的平均值。更具体地，Otsu法提供阈值，该阈值将与类内方差和类间方差相关的比率最小化，其中亮像素值涉及第一类，并且暗像素值涉及第二类。在目前情况下，亮像素涉及微生物菌落，并且暗像素涉及培养基。
该方法然后包括步骤510，用于通过应用以下分割公式(1)而分割中间底部环形图像：
(1)
其中
是绿色通道和蓝色通道的同一图像上的位置(x，y)处的相同像素的平均值。
Otsu法的应用提供了二进制图像。
该方法还包括任选步骤512，用于在二进制图像上应用基于公知的闭合运算符(closing operator)的形态学运算，以获得如图8所示的称为生长掩膜的二进制图像。
然后，根据第一实施方案的方法包括另一步骤514，用于通过使用具有成像系统114的背光视图而获得图6中所示的第二原始图像。实际上，在用该视图拍摄的图像中，溶血现象更加可见，其中与培养基相关的区是红色，变色区是透明的，颜色是白色或黄色，或者是由黄色和白色组成的复合颜色，并且与微生物相关的区是暗的，诸如黑色。
该方法包括步骤516，用于对生长掩膜应用公知的膨胀操作，所述膨胀操作基于诸如盘形元件的结构元件。膨胀操作用公知的函数诸如matlab函数imdilate和用特定膨胀参数d来操作，以获得称为膨胀型(生长掩膜)的生长掩膜的对应膨胀图像。
图9a中所示的光晕掩膜和图9b中所示的培养基掩膜可以从膨胀型(生长掩膜)推导出来，如下所示：
光晕掩膜＝膨胀型(生长掩膜)–生长掩膜
其中，从膨胀型(生长掩膜)中除去生长掩膜中显示的微生物菌落以提供光晕掩膜。
培养基掩膜＝器皿掩膜–膨胀型(生长掩膜)
其中从器皿掩膜中除去微生物菌落和与溶血现象相关的光晕区，以提供培养基掩膜。
光晕掩膜显示微生物菌落周围的颜色。
培养基掩膜显示培养基的原始颜色，即未受微生物生长影响的颜色。
在下一步骤518中，将光晕掩膜和培养基掩膜各自分成像素块。图10a显示了光晕掩膜的像素块，并且图10b显示了培养基掩膜的像素块。在图10a和图10b中，每个像素块包括200×200个像素，并且膨胀的尺寸是50个像素。像素块的大小适于检测相关的中值。
光晕掩膜和培养基掩膜的划分以在用于光晕掩膜的两个相邻像素块和用于培养基掩膜的两个相邻像素块之间50％的重叠率进行处理。因此，优化了包括光晕像素和培养基像素二者的像素块的数量。
另外，为与光晕掩膜相关的像素块设置标准。对于该方法的后续步骤，不考虑其中光晕区包括含有小于100个像素的区域的像素块。
在进一步的步骤520中，针对每个像素块、针对RGB颜色空间的每个通道和针对灰度表示计算光晕掩膜和培养基掩膜的中值像素值。
基于膨胀参数d的递增值，对关于光晕掩膜和培养基掩膜的统计中值像素值的差异的计算进行多次处理。
然后在步骤522中处理要为后续步骤选择的膨胀参数d的确定。
膨胀参数d的确定是基于以下公式以确定膨胀参数d的值，该值最大化光晕掩膜的像素值和培养基掩膜的像素值之间的差值。下面的膨胀公式(2)适用于每个RGB颜色通道和灰度表示：
(2)
最大膨胀＝argmax|中值(光晕掩膜d)-中值(培养基掩膜d)|
对于d∈[10；60]
膨胀参数的递增值在从10个像素到60个像素的区间中选择，其中对于两个连续的d值，步长为10个像素。
步骤522提供称为膨胀型(生长掩膜)的多于一个二进制图像，并且因此提供多于一个光晕掩膜和培养基掩膜。
图11a、图12a和图13a分别显示了具有不同的膨胀参数d值的光晕掩膜的实例，其中图11a中的d＝10个像素，图12a中的d＝50个像素，并且图13a中的d＝60个像素。
图11b、图12b和图13b分别显示了具有不同的膨胀参数d值的培养基掩膜的实例，其中图11b中的d＝10个像素，图12b中的d＝50个像素，并且图13b中的d＝60个像素。
在当前情况下，确定的膨胀参数是d＝50个像素。
基于所确定的膨胀参数，在步骤524中通过应用以下特征公式(3)而计算光晕掩膜和培养基掩膜之间的相同通道的中值像素值的差异，该公式(3)提供关于RGB颜色通道的中值之间和关于灰度表示的中值之间的四个差值：
(3)特征块＝中值(光晕掩膜)-中值(培养基掩膜)
在进一步的步骤526中，分析单元110操作用于根据确定的规则对特征块值进行分类的步骤，该确定的规则设置用下面的期望公式(4)计算的阈值：
(4)
其中特征块是蓝色通道上的光晕掩膜和培养基掩膜之间的中值像素值的差值。
图14a显示分别与β-溶血性细菌、α-溶血性细菌和γ溶血性细菌相关的培养皿的图像，其具有在蓝色通道上的以块水平的特征值的表示。
与期望公式相关的一组值代表β溶血块和无β溶血块的分布，其中β溶血块包含代表溶血现象的光晕区，并且无β溶血块不包含代表溶血现象的光晕区。
在步骤528中，将无β溶血块的分布与基于平均值μ和标准偏差σ的高斯分布进行比较，如图14b所示。
图14b中所示并且基于下面的3σ规则(5)的阈值被设置以确定正态分布，如下所示：
(5)P(μ-3σ≤x≤μ+3σ)≈0.9973
这意指阈值等于μ+3σ。
在步骤530中，分析单元110确定β-溶血性细菌的存在或不存在。如果特征块值是高正值，则这些值指示存在β-溶血性细菌。
如果特征块值为负或接近0，则这些值指示其他现象，诸如α-溶血性细菌或γ-溶血性细菌的存在。
在另一个具体实施方案中，像素块的使用提供了一种用于以局部方式即在培养皿图像的特定区中确定溶血现象的存在的方法。
根据与确定变形杆菌属细菌存在相关的本发明的第二实施方案，该方法包括如图15所示的以下步骤。
在第二实施方案中，光晕掩膜涉及显示微生物菌落周围的着色区的光晕区，其中着色区的颜色是由同一图像中微生物的存在引起的。培养基涉及显色培养基，诸如CPS。
在第二实施方案中，该方法包括步骤1500，用于通过使用背光无背景视图和中间底部环形黑色背景视图获得培养皿的两个原始视图。中间底部环形黑色背景视图图像是四个底部环形侧视图像的中值图像。
图16a显示了通过使用背光无背景视图的培养皿的原始图像。实际上，图16a显示了与微生物菌落的存在相关的暗区，并且着色区涉及在暗区周围具有棕色的区。
该方法然后包括用公知的边缘检测方法确定培养皿边缘的步骤。
该方法还包括步骤1502，用于应用在参考文献[1]中公开的特定的基于图的区域分割处理。
基于图的区域分割处理提供包括称为背景的第一区域和称为前景的第二区域的图像，第一区域涉及培养基区，第二区域涉及培养皿的其余部分，并且还包括与绢印相关的绢印区。
此类分割处理在同一掩模内，即在同一前景区内，分割微生物菌落簇和分离的微生物菌落。另外，基于图的区域分割适应于培养基区的颜色的轻微变化，如在具有变形杆菌属光晕的存在的当前情况中。
分割处理还包括用于用公知的检测算法检测绢印区的步骤。
然后，分割处理提供称为生长掩膜的二进制图像，如图16b所示。
该方法包括另一步骤1504，用于将膨胀操作应用于生长掩膜，所述膨胀操作基于诸如盘形元件的结构化元件。膨胀操作由诸如matlab函数imdilate的公知函数操作，以产生膨胀型(生长掩膜)。
光晕掩膜涉及可包含微生物菌落周围的着色区的区，所述着色区代表变形杆菌属细菌的存在。培养基掩膜显示培养基的原始颜色，即未受着色区影响的颜色。
图17b中所示的光晕掩膜和图17c中所示的培养基掩膜可以从与图16a中所示的原始图像相关的膨胀型(生长掩膜)和器皿掩膜推导出，如下面的公式(6)和公式(7)所示：
(6)光晕掩膜＝膨胀型(生长掩膜)–生长掩膜–绢印掩膜(SerigraphyMask)
(7)培养基掩膜＝器皿掩膜–膨胀型(生长掩膜)–绢印掩膜
基于膨胀参数d的递增值，应用膨胀操作若干次。膨胀参数d的递增值在从10个像素到70个像素的区间中选择，对于两个连续的d值，步长为10个像素。步骤1504提供称为膨胀型(生长掩膜)的多于一个图像。
图18a显示了光晕掩膜的实例，其中膨胀参数d＝70个像素。
图18b显示了光晕掩膜的实例，其中膨胀参数d＝10个像素。
在以下步骤中，特征提取单元122确定光晕掩膜和培养基掩膜的特征。因此，特征提取单元122提取颜色特征。
该方法包括用于计算针对RGB颜色空间和HSV(色调、饱和度、明度)空间的像素值的统计中值的步骤(未示出)。在HSV空间中，值H由向量(cosH,sin H)代替，以便避免色调比例不连续，其中0和1对应于相同的色调值。因此，HSV空间包括四个通道。
为了计算统计中值，选择两个不同的图像。第一图像涉及背光无背景视图，并且第二图像涉及中间底部环形黑色背景视图。中间底部环形黑色背景视图图像是四个底部侧视图图像的中值图像。
该方法包括步骤1506，用于针对每个RGB颜色通道和HSV空间的每个通道操作以下特征公式(8)：
(8)特征＝|中值(光晕掩膜)-中值(培养基掩膜)|
对于RGB颜色空间，有3个RGB颜色通道，在该3个RGB颜色通道中，对2个不同的图像应用7个膨胀操作。因此，当应用上述公式时，提取了总共42个特征。
对于HSV空间，有4个通道，在该4个通道中，对2个不同的图像应用7个膨胀操作。因此，当应用上述公式时，提取了总共56个特征。
然后，提取的特征的全局总数为98。
然后，分析单元110通过基于用于现有技术中公知的监督学习过程的两种分类算法应用分类步骤1508和分类步骤1510而进行操作。
第一种分类算法涉及分类和回归树(CART)算法。例如，matlab类“分类树”用于对CART算法建模。第一种算法的应用提供了代表培养皿含有变形杆菌属细菌的可能性的第一得分值。
第二种分类算法涉及支持向量机(SVM)算法，并使用库“libSVM”生成。第二种算法的应用提供了代表培养皿含有变形杆菌属细菌的可能性的第二得分值。
由于第一得分和第二得分由两种不同的分类算法提供，因此第一得分和第二得分不是可比较的值，并且不能在同一计算中组合以确定最终得分。
分析单元110通过应用贝叶斯定理而操作以获得后验概率即p(光晕；X)的值，其中光晕(halo)是代表光晕的事件。
在第一种分类算法中，X代表由CART算法选择的特征的值。所选特征涉及一种特征，该特征是在98个现有特征中确定变形杆菌属细菌的存在的最有鉴别力的特征。
在第二种分类算法中，X代表最近的实例距离决策线的距离。最高距离X代表确定培养皿含有变形杆菌属细菌的可能性的可靠结果。
存在光晕的概率可以用下面的公式(9)计算：
(9)
-其中p(X；光晕)是假设培养皿含有光晕，则观察X的概率；
-p(光晕)是存在光晕的先验概率；
-以及p(光晕；X)是给定值X时光晕存在的概率。
如果培养皿不含变形杆菌属细菌，则预计具有光晕的概率为0。
然而，可能存在一些情况，其中培养皿含有没有可见光晕的变形杆菌属细菌，并且具有光晕的概率也等于0。因此，为了便于检测变形杆菌属细菌，上述公式(9)经修正，以避免考虑这种情况。下面的公式(10)考虑了对于所有变形杆菌属细菌的可见光晕的存在相关的假设。
然后，分析单元110运算下面的公式(10)：
(10)
-其中p(X；变形杆菌属)是假设培养皿含有变形杆菌属细菌，则具有X的概率；
-以及p(变形杆菌属)是变形杆菌属细菌存在的先验概率。
与概率p(X；变形杆菌属)相关的一组值在图19中表示为基于具有平均值μ和标准偏差σ的高斯分布的值的分布。
p(变形杆菌属)是先验概率，并且是默认设置为1/6的可调参数。实际上，CPS培养基可含有多达六类细菌。
p(X)是用下面的公式(11)计算的归一化因子的估计值，其中：
从用于监督学习过程的数据集已知p(变形杆菌属)、p(X；变形杆菌属)、p(无变形杆菌属)和P(X；无变形杆菌属)。
(11)
因此，在进一步的步骤1512中，用与第一分类算法，即CART算法相关的第一得分计算p(光晕；X)的第一值。
在进一步的步骤1514中，用与第二分类算法，即SVM算法相关的第二得分计算p(光晕；X)的第二值。
因此，p(光晕；X)的第一值和第二值涉及第一概率和第二概率，它们现在是相同类型的值，即可比较的值。
获得p(光晕；X)的第一值和第二值的最小值，并且在另一步骤1516中选择p(光晕；X)的第一值和第二值之间的最低最小值。
然后在步骤1516中获得存在变形杆菌属细菌的在0％和100％之间的最终概率。
通过在步骤1518中比较变形杆菌属细菌存在概率的值，用户可以在步骤1520中决定使用诸如50％的阈值来确定培养皿中存在变形杆菌属细菌的概率。
分别基于第一分类算法和第二分类算法的两种概率的使用提供了对由每个分类算法独立产生的误差的校正。
在与确定变形杆菌属细菌存在相关的另一个实施方案中，培养基可以是不透明培养基，诸如不透明CPS。
图20显示了含有不透明培养基诸如不透明CPS与变形杆菌属细菌的培养皿并且与背光视图相关的原始图像。
图21和图22显示了图20的培养皿的图像，其分别与左底部环形视图和顶部环形视图相关。
本发明的另一个实施方案涉及与检测变形杆菌属细菌相关的上述方法，其中培养基是不透明培养基。
与上述方法相关的步骤1500和步骤1504至步骤1520保持相同。与应用分割处理相关的步骤1502必须适应于考虑不透明培养基的存在。实际上，在存在不透明培养基的情况下，分割处理包括应用适应的基于图的区域分割算法，并且去除与检测和去除绢印区相关的步骤。
在该实施方案中，用作原始图像的图像基于背光视图和顶部环形视图。诸如组合所述原始图像的方式和与前景提取处理相关的阈值的其他参数适于允许与用不透明培养基检测变形杆菌属细菌相关的方法以有效的方式操作。
以下描述涉及本发明的方法在检测β-溶血性细菌和检测变形杆菌属细菌方面的应用。
与β-溶血性细菌检测相关的方法已应用于包含含有单一细菌菌落(mono-bacterial colony)和诸如COS和CAN培养基的血琼脂培养基的培养皿的第一数据集，所述培养皿已被孵育24小时。
第一数据集包括总共104个培养皿，其中根据基础事实参考(ground truthreference)，21个培养皿含有β-溶血性细菌，并且83个培养皿不含β-溶血性细菌，即包含除β-溶血性细菌之外的细菌。
下表1显示了在所述第一数据集上的应用该方法的结果，其中总共21个培养皿中的14个培养皿已被鉴定为含有β-溶血性细菌，并且总共83个培养皿中的83个培养皿已被鉴定为不含β-溶血性细菌：
表1
从表1可以看出，当应用根据本发明的方法时，含有β-溶血性细菌的7个培养皿未被检测和鉴定到。实际上，这些对应培养皿内的光晕区不是清晰可见的，因此对于所述培养皿的光晕区和培养基区之间的颜色差异无法提供足以确定溶血性细菌存在的对比度水平。
下表2使用百分比作为指示符和95％的置信区间显示了与表1中所示相同的结果：
表2
根据上表2，整体准确率百分比高于93％。
还已将与β-溶血性细菌检测相关的方法应用于第二数据集，该数据集包括含有单一细菌菌落和诸如COS和CAN培养基的血琼脂培养基的培养皿，所述培养皿已被孵育24小时。
第二数据集包括总共70个培养皿，其中根据基础事实参考，24个培养皿含有β-溶血性细菌，并且46个培养皿不含β-溶血性细菌，即含有除β-溶血性细菌之外的细菌。
下表3显示了在所述第二数据集上应用该方法的结果，其中总共24个培养皿中的23个培养皿已被鉴定为含有β-溶血性细菌，并且总共46个培养皿中的43个培养皿已被鉴定为不含β-溶血性细菌：
表3
从表3可以看出，当应用根据本发明的方法时，含有β-溶血性细菌的1个培养皿未被检测和鉴定到。实际上，该培养皿只含有一个微生物菌落，且分割处理没有提供正确的培养基掩膜和正确的光晕掩膜。
从表3中还可以看出，发生了β-溶血性细菌的3次错误检测。这些错误检测可能是因γ溶血性细菌菌落周围的光晕区的存在，或者因绢印区的存在，或者因培养皿边缘的存在而生成。然而，可以在该方法涉及根据Otsu法确定阈值的步骤中检索此类错误检测。
下表4使用百分比作为指示符和95％的置信区间显示了与表1中所示结果相同的结果：
表4
根据上表4，整体准确性百分比高于94％。
表1、表2、表3和表4中显示的结果指示本发明用于检测β-溶血性细菌的方法具有95％的高水平准确度。
与检测变形杆菌属细菌相关的方法已应用于涉及含有单一细菌菌落和来自两种不同类别细菌的细菌混合物以及半透明显色培养基的培养皿的第一数据集，所述培养皿已被孵育24小时。
第一数据集包括具有光晕区的变形杆菌属细菌和不具有光晕区的变形杆菌属细菌。
如上所述，根据本发明的用于检测变形杆菌属细菌的方法包括用于通过使用两个监督模型算法将特征数据分类成两个不同的类别而对特征分类的步骤，所述两个不同的类别是光晕区的存在或光晕区的不存在。每个监督模型算法使用相同的数据集。
对结果的分析基于下表5，该分析是确定所用监督模型的混淆程度的混淆矩阵：
表5
在目前情况下，可用的基础事实是变形杆菌属细菌的存在或变形杆菌属细菌的不存在，而该方法提供与光晕区的存在或不存在相关的预测。
在考虑与分类和回归树相关的学习模型时，获得如下表6中所示的结果：
表6
表6指示准确度为99％，这是一个非常好的水平。灵敏度为78/％，这也是一个良好的水平。如上所述，数据集包括含有不具有光晕区的变形杆菌属细菌的培养皿。对表6中提到的22％的培养皿的目视检查指示，所述培养皿的大多数含有不具有光晕区的变形杆菌属细菌。似乎监督模型算法错误地将菌落的边界检测为光晕区。但是，统计学中值像素值的使用克服了该问题。
在考虑与SVM相关的学习模型时，获得下表7中所示的结果：
表7
具有光晕区且不含变形杆菌属细菌的培养皿的百分比不同于表6中针对分类和回归树检索的对应百分比。
当考虑不透明培养基时，与变形杆菌属细菌检测相关的结果与用半透明培养基检索的结果非常相似。此外，由于光晕区在包含不透明培养基的培养皿中更为可见，因此该方法提供较少的假阴性即归类为无光晕的变形杆菌属细菌的检测。
从公开内容来看：CART保留其独特的节点，其中相同的特征被选择，其中独特的膨胀尺寸等于10个像素。
下表8显示了对于应用SVM算法的混淆矩阵的实例：
表8
如上面提及检测变形杆菌属细菌的实施方案所解释的，置信度指示符是通过使用由两个监督模型算法CART和SVM提供的后验概率用贝叶斯定理计算的百分比。置信度指示符的值属于区间[0；100]，其中0％意指没有光晕区，并且100％意指培养皿中存在光晕区。
如上所述，
-其中p(X；变形杆菌属)是假设培养皿中含有变形杆菌属细菌时具有X的概率，其中X是到边缘的距离；
-以及p(变形杆菌属)是变形杆菌属细菌存在的先验概率。
图23显示了两种监督模型算法CART和SVM的所得概率的分布，显示了含有变形杆菌属细菌的培养皿和不含变形杆菌属细菌的培养皿在这两种情况下具有半透明培养基的概率。
圆圈指示检测到表6和表7中所示的假阳性结果。
图23还显示了最终概率的分布，其代表对于两种监督模型算法CART和SVM的最低概率Ptree和Psvm的合并值Pf。
选择50％的阈值，诸如：
下表9评估了置信度指示符的结果：
表9
上表9显示准确度水平高于99％，这是一个非常好的水平。实际上，两个监督模型算法提供的结果的合并避免了假阳性的检测。
此外，灵敏度水平为71％，这也是一个良好的水平，因为一些培养皿含有不具有光晕区的变形杆菌属细菌。
图24显示了两种监督模型算法CART和SVM的所得概率的分布，显示了对于含有变形杆菌属细菌和不透明培养基的培养皿，以及对于不含变形杆菌属细菌和不透明培养基的培养皿在这两种情况下的概率。
图24还显示了最终概率的分布，其代表对于两种监督模型算法CART和SVM的最低概率Ptree和Psvm的合并值Pf。
表10
在培养皿已被孵育18小时的另一种情况下，对于半透明培养基获得了下表11中所示的结果：
表11
对于不透明培养基的对应结果如下表12所示：
表12
如上表11和表12所示，对于含有半透明或不透明培养基的培养皿获得的对于18小时和24小时持续时间的结果是稳定的。
根据本申请的实施方式，还包括以下方面：
1)一种用于确定至少一种确定的微生物在培养皿中的存在的方法，所述培养皿包含一种或更多种微生物菌落和培养基，所述培养基适于允许所述一种或更多种微生物菌落和所述至少一种确定的微生物，如果存在所述至少一种确定的微生物的话，在合适的生长条件下生长，所述方法包括：
-获得所述培养皿的至少一个初始图像，其中第一初始图像包括一个或更多个可见像素，每个像素与像素值相关联；
-通过对所述至少一个初始图像应用第一处理获得所述培养皿的第一处理图像，其中所述第一处理图像的可见像素仅涉及与所述一种或更多种微生物菌落相关联的像素；
-通过对所述第一处理图像应用第二处理获得所述培养皿的多于一个第二处理图像，其中所述多于一个第二处理图像的可见像素仅涉及与所述一种或更多种微生物菌落和所述一种或更多种微生物菌落周围的周围区相关联的像素；
-通过计算所述至少一个初始图像和所述多于一个第二处理图像之间的差异获得所述培养皿的多于一个第三处理图像，其中所述多于一个第三处理图像包括仅涉及与所述培养基相关联的像素的可见像素；
-通过计算所述多于一个第二处理图像和所述第一处理图像之间的差异获得所述培养皿的多于一个第四处理图像，其中所述多于一个第四处理图像的可见像素仅涉及与所述周围区相关联的像素；
-通过针对红绿蓝(RGB)颜色通道的至少每个颜色通道计算所述多于一个第三处理图像的平均像素值和所述多于一个第四处理图像的平均像素值之间的差值，确定与所述多于一个第三处理图像和所述多于一个第四处理图像相关联的特征值；
-通过对所确定的特征值进行分类来确定所述至少一种确定的微生物在所述培养皿中的所述周围区内的存在的指示符的值；
-将所述指示符的值与阈值进行比较；
-根据比较的结果来确定所述至少一种确定的微生物在所述培养皿中的所述周围区内的存在。
2)如1)所述的方法，其中所述第一处理是分割处理。
3)如2)所述的方法，其中所述分割处理包括所述阈值的确定以及像素值与所述阈值的比较。
4)如2)所述的方法，其中所述分割处理是基于图的区域分割处理。
5)如1)所述的方法，其中所述第二处理是与具有多于一个定义值的膨胀标准相关联的膨胀处理。
6)如1)所述的方法，其中确定特征值的步骤包括将所述多于一个第三处理图像和所述多于一个第四处理图像分成像素块。
7)如6)所述的方法，还包括针对每个像素块计算所述多于一个第三处理图像和所述多于一个第四处理图像的像素值之间的最大像素值差。
8)如7)所述的方法，其中确定特征值的步骤包括计算针对灰度图像的像素值的最大差异。
9)如1)所述的方法，其中确定特征值的步骤包括计算多于一个所述第一处理图像的中值像素值和所述多于一个所述第一处理图像针对HSV空间的中值像素值。
10)如1)所述的方法，其中对特征值分类的步骤包括将特征值的分布与高斯分布进行比较。
11)如1)所述的方法，其中对特征值分类的步骤包括应用分类和回归树算法以及支持向量算法以提供对应的第一得分和第二得分。
12)如11)所述的方法，其中对特征值分类的步骤还包括将贝叶斯定理应用于所述第一得分和所述第二得分。
13)如12)所述的方法，其中对特征值分类的步骤还包括获得所述周围区的存在的组合可能性。
14)如1)所述的方法，其中将所述指示符的值与阈值进行比较的步骤包括基于高斯分布的平均值和标准偏差σ确定阈值。
15)如1)、2)、3)、5)、6)、7)、8)、10)或14中任一项所述的方法，其中确定所述至少一种确定的微生物的存在的步骤包括确定为β-溶血性细菌的细菌的存在。
16)如1)、4)、9)、11)、12)或13)中任一项所述的方法，其中确定所述至少一种确定的微生物的存在的步骤包括确定为变形杆菌属细菌的细菌的存在。
17)一种用于确定至少一种确定的微生物在培养皿中的存在的系统，所述培养皿包含一种或更多种微生物菌落和培养基，所述培养基适于允许所述一种或更多种微生物菌落和所述至少一种确定的微生物，如果存在所述至少一种确定的微生物的话，在合适的生长条件下生长，其中所述系统包括用于获得所述培养皿的至少一个初始图像的成像系统，以及处理系统，所述处理系统包括：
-第一处理单元，用于获得所述培养皿的所述至少一个初始图像的第一处理图像，其中所述第一处理图像的可见像素仅涉及与所述一种或更多种微生物菌落相关联的像素；
-第二处理单元，用于获得所述培养皿的所述第一处理图像的多于一个第二处理图像，其中所述第二处理图像的可见像素仅涉及与所述一种或更多种微生物菌落和所述一种或更多种微生物菌落周围的周围区相关联的像素；
-计算单元，用于通过计算所述至少一个初始图像和所述第二处理图像之间的差异获得所述培养皿的多于一个第三处理图像，其中所述多于一个第三处理图像的可见像素仅涉及与所述培养基相关联的像素，并且所述计算单元用于通过计算所述第二处理图像和所述第一处理图像之间的差异获得所述培养皿的多于一个第四处理图像，其中所述多于一个第四处理图像的可见像素仅涉及与所述周围区相关联的像素；
-特征提取单元，用于通过针对RGB颜色通道的至少每个颜色通道计算所述多于一个第三处理图像的平均像素值和所述多于一个第四处理图像的平均像素值之间的差值来确定与所述多于一个第三处理图像和所述多于一个第四处理图像相关联的特征值；
-以及分析单元，用于确定所述至少一种确定的微生物在所述培养皿中的所述周围区内的存在的指示符的值，将所述指示符的值与阈值进行比较；以及根据所述比较的结果确定所述至少一种确定的微生物在所述培养皿中的所述周围区内的存在。
18)一种计算机程序产品，包括指令，所述指令在被执行时使得可编程数据处理装置执行根据1)至16)中任一项所述的方法的步骤。
参考文献
[1]Pedro F.Felzenszwalb，Daniel P.Huttenlocher，“Efficient Graph-BasedImage Segmentation”；International Journal of Computer Vision，September 2004，Volume 59，lssue 2，pages 167-181
Claims (15)
1.一种用于确定至少一种确定的微生物在培养皿中的存在的方法，所述培养皿包含一种或更多种微生物菌落和培养基，其中，所述至少一种确定的微生物为β-溶血性细菌和具有光晕的变形杆菌属细菌中的至少一种，所述培养基适于允许所述一种或更多种微生物菌落和所述至少一种确定的微生物，如果存在所述至少一种确定的微生物的话，在合适的生长条件下生长，所述方法包括：
-获得所述培养皿的至少一个初始图像，其中第一初始图像包括一个或更多个可见像素，每个像素与像素值相关联；
-通过对所述至少一个初始图像应用第一处理获得所述培养皿的第一处理图像，其中所述第一处理图像的可见像素仅涉及与所述一种或更多种微生物菌落相关联的像素；
-通过对所述第一处理图像应用第二处理获得所述培养皿的多于一个第二处理图像，其中所述多于一个第二处理图像的可见像素仅涉及与所述一种或更多种微生物菌落和所述一种或更多种微生物菌落周围的周围区相关联的像素；
-通过计算所述至少一个初始图像和所述多于一个第二处理图像之间的差异获得所述培养皿的多于一个第三处理图像，其中所述多于一个第三处理图像包括仅涉及与所述培养基相关联的像素的可见像素；
-通过计算所述多于一个第二处理图像和所述第一处理图像之间的差异获得所述培养皿的多于一个第四处理图像，其中所述多于一个第四处理图像的可见像素仅涉及与所述周围区相关联的像素；
-通过针对红绿蓝(RGB)颜色通道的至少每个颜色通道计算所述多于一个第三处理图像的平均像素值和所述多于一个第四处理图像的平均像素值之间的差值，确定与所述多于一个第三处理图像和所述多于一个第四处理图像相关联的特征值；
-通过对所确定的特征值进行分类来确定所述至少一种确定的微生物在所述培养皿中的所述周围区内的存在的指示符的值；
-将所述指示符的值与阈值进行比较；
-根据比较的结果来确定所述至少一种确定的微生物在所述培养皿中的所述周围区内的存在。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一处理是分割处理。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述分割处理包括所述阈值的确定以及像素值与所述阈值的比较。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述分割处理是基于图的区域分割处理。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述第二处理是与具有多于一个定义值的膨胀参数相关联的膨胀处理。
6.如权利要求1所述的方法，其中确定特征值的步骤包括将所述多于一个第三处理图像和所述多于一个第四处理图像分成像素块。
7.如权利要求6所述的方法，还包括针对每个像素块计算所述多于一个第三处理图像和所述多于一个第四处理图像的像素值之间的最大像素值差。
8.如权利要求7所述的方法，其中确定特征值的步骤包括计算针对灰度图像的像素值的最大差异。
9.如权利要求1所述的方法，其中确定特征值的步骤包括计算多于一个所述第一处理图像的中值像素值和所述多于一个所述第一处理图像针对HSV空间的中值像素值。
10.如权利要求1所述的方法，其中对特征值分类的步骤包括将特征值的分布与高斯分布进行比较。
11.如权利要求1所述的方法，其中对特征值分类的步骤包括应用分类和回归树算法以及支持向量算法以提供对应的第一得分和第二得分。
12.如权利要求11所述的方法，其中对特征值分类的步骤还包括将贝叶斯定理应用于所述第一得分和所述第二得分。
13.如权利要求1所述的方法，其中将所述指示符的值与阈值进行比较的步骤包括基于高斯分布的平均值和标准偏差σ确定阈值。
14.一种用于确定至少一种确定的微生物在培养皿中的存在的系统(100)，所述培养皿包含一种或更多种微生物菌落和培养基，其中，所述至少一种确定的微生物为β-溶血性细菌和具有光晕的变形杆菌属细菌中的至少一种，所述培养基适于允许所述一种或更多种微生物菌落和所述至少一种确定的微生物，如果存在所述至少一种确定的微生物的话，在合适的生长条件下生长，其中所述系统包括用于获得所述培养皿的至少一个初始图像的成像系统，以及处理系统(108)，所述处理系统(108)包括：
-第一处理单元(116)，用于获得所述培养皿的所述至少一个初始图像的第一处理图像，其中所述第一处理图像的可见像素仅涉及与所述一种或更多种微生物菌落相关联的像素；
-第二处理单元(118)，用于获得所述培养皿的所述第一处理图像的多于一个第二处理图像，其中所述第二处理图像的可见像素仅涉及与所述一种或更多种微生物菌落和所述一种或更多种微生物菌落周围的周围区相关联的像素；
-计算单元(120)，用于通过计算所述至少一个初始图像和所述第二处理图像之间的差异获得所述培养皿的多于一个第三处理图像，其中所述多于一个第三处理图像的可见像素仅涉及与所述培养基相关联的像素，并且所述计算单元用于通过计算所述第二处理图像和所述第一处理图像之间的差异获得所述培养皿的多于一个第四处理图像，其中所述多于一个第四处理图像的可见像素仅涉及与所述周围区相关联的像素；
-特征提取单元(122)，用于通过针对RGB颜色通道的至少每个颜色通道计算所述多于一个第三处理图像的平均像素值和所述多于一个第四处理图像的平均像素值之间的差值来确定与所述多于一个第三处理图像和所述多于一个第四处理图像相关联的特征值；
-以及分析单元(110)，用于确定所述至少一种确定的微生物在所述培养皿中的所述周围区内的存在的指示符的值，将所述指示符的值与阈值进行比较；以及根据所述比较的结果确定所述至少一种确定的微生物在所述培养皿中的所述周围区内的存在。
15.一种计算机可读介质，包括指令，所述指令在被执行时使得可编程数据处理装置执行根据权利要求1至13中任一项所述的方法的步骤。
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