JPH09511997A - ベンザミド誘導体、該誘導体を含む組成物およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、式（Ｉ）(式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅の一つはＯＨを意味し、残りはＨを意味する)の新規化合物、該化合物を含む医薬組成物および抗寄生虫、抗菌、抗真菌、抗ウイルス剤としての該化合物の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ベンザミド誘導体、該誘導体を含む組成物およびその使用開示の概要 本発明は、式Ｉ (式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅の一つはＯＨを意味し、残りはＨを意味す る)の新規化合物、該化合物を含む医薬組成物および該化合物の抗寄生虫、抗菌 、抗真菌、抗ウイルス剤としての使用に関する。先行技術 ニトロチアゾール化合物ｐＨ５７７６(２−アセトイルオキシ)−Ｎ−(５−ニ トロ−２−チアゾイル)ベンザミドは下記式Ｉの化合物である 式中、 Ｒ₁＝Ｏ−ＣＯＣＨ₃ Ｒ₂＝Ｒ₃＝Ｒ₄＝Ｒ₅＝Ｈ この化合物(以下、化合物Ｂ−式II)の製造および使用はＵＳ３,９５０,３５１ に開示され、同様に出願人により公表されている。 ＵＳ３,９５０,３５１では、式IIの化合物Ｂは とを反応せしめることにより製造される。 この反応は下記式Ｉの純化合物の製造には適切でない。 (式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅の一つはＯＨを意味し、残りはＨを意味す る) さらに、先行技術から期待されうること、すなわち、アシルオキシ基の存在が 化合物に細菌、寄生虫等に対する活性および効力を付与するのに必要であったと のこと、に反して、式Ｉ、 (式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅の一つはＯＨを意味し、残りはＨを意味す る) の化合物は、アシルオキシ基を含んでいないにもかかわらず、寄生虫、細菌、真 菌、に対して優れた効力を有していた。この化合物Ｉは寄生虫、真菌、細菌に対 して実質的に即効作用があった。ウイルスに対しても活性であることも見出され た。 化合物Ｉを含む組成物は湿潤剤を含むのがよいことも見出された。最も好まし い組成物は湿潤剤とでんぷん誘導体とを含むものである。 出願人による試験では、発明化合物と湿潤剤とを併用して、化合物の効力が劇 的に増大し、そしてこの混合物を用いて、腸内感染(下痢)、胃腸感染、腸感染、 性的感染、腔感染および尿性器感染のような、下腹部感染を処置できることが示 された。 従って、本発明は下腹部の疾患に対処する組成物に関し、その組成物は、 ＊下記式Ｉの有効量 ＊および湿潤剤を含み、 好ましくはでんぷん誘導体をも含む。発明の概要 本発明は、式Ｉ (式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅の一つはＯＨを意味し、残りはＨを意味す る 好ましくは、Ｒ₁＝ＯＨ) の新規化合物Ｃに関する。 本発明はまた、上記の式Ｉの化合物、好ましくは式Ｉ中Ｒ₁＝ＯＨである化合 物(式III)を含む医薬組成物にも関する。 具体的には、組成物は、活性成分として、 式 (式中、Ｒ₁＝ＯＨおよびＲ₂＝Ｒ₃＝Ｒ₄＝Ｒ₅＝Ｈ) 化合物Ａおよび との混合物を含む。 かかる組成物は、寄生虫、真菌、細菌、ウイルスに対し実質的に即効的作用ま たは腸感染の実質的に即効的処置および何等かの遅効的作用または処置に関連し ている。 かかる組成物は、寄生虫感染、細菌感染、真菌感染など、下痢およびウイルス による感染などの他の腸感染のヒト感染症の処置および予防に適切である。 かかる組成物において、式III の化合物Ａの重量含量は、式III の化合物Ａおよび式 化合物Ｂの混合物の重量に対し、０.５−２０％であり、望ましくは０.５−１０ ％であり、最も望ましくは０.５−５％である。 本発明はまた、本発明による化合物の使用、特に抗寄生虫剤、抗菌剤、抗真菌 剤、抗ウイルス剤としての本発明による組成物に関する。 組成物は、駆虫剤、抗ウイルス剤等々の有効成分をさらに含有し得る。 組成物はまた、湿潤剤および／またはでんぷん誘導体および／または賦形剤を も含有し得る。 組成物は、望ましくは固体の組成物であって、下腹部の疾患または感染、特に 腸のおよび腟の状態に対処するための経口投与として、下記のものを含有する。 ＊式 の化合物Ｂの有効量 ＊湿潤剤そして場合により、望ましくは、 ＊少なくとも一つのでんぷん誘導体 後者の組成物はまた、他の有効成分、例えば、フェバンテル、プラジカンテル 、レバミソル、アルベンダゾル、オキシフェンダゾル、モキシデクチン、イベル メクチン、ミルベマイシンなどの駆虫剤を含有する。 化合物Ｂの製造および使用は、ＵＳ３,９５０,３５１およびＵＳ４,３１５,０ １８に開示されている。 式Ｉの化合物Ｃ(化合物Ａなど)および／または化合物Ｂを含有する組成物に存 在する湿潤剤は、アニオン系界面活性剤が優れており、糖エステル、ポリオキシ エチレン、ポリオキシプロピレン、アンヒドロヘキシトール誘導体、脂肪アルカ ノールアミド、脂肪アミンオキシド、スクロース、マンニトール、ソルビトール 、レシチン、ポリビニルピロリドン、脂肪酸エステル、スクロースのグリセリド 、キシロースのエステル、ポリオキシエチレングリセリド、脂肪酸のエステル、 脂肪アルコールのポリオキシエチレンエーテル、ソルビタンのポリオキシエチレ ン脂肪酸エステル、ソルビタンの脂肪酸のポリオキシエチレンエステル、グリセ リドポリグリセリド、アルコールポリグリセリドのエステルおよびこれらの混合 物からなる群から好ましくは選択される。 特に適当な湿潤剤はサッカローズジステアレート、ＰＶＰ(ポリビニルピロリ ドン)等である。本発明による組成物は、好ましくはでんぷん誘導体、特にカル ボキシメチルでんぷんなどのでんぷんカルボキシ誘導体、そのナトリウム誘導体 またはその塩を含有する。 組成物は、有効成分に対して、例えば２０重量％まで、有利には１−１０重量 ％の界面活性剤を含み、また、有効成分に対して２０重量％、有利には１−１０ ％のでんぷん誘導体を含有する。 本発明は、抗ウイルスに対する経口投与のための、および腸、腟または尿性器 の状態または障害などの下腹部疾患に対処するための製剤処方にも関し、該製剤 処方は、下記のものを含む組成物を含有する核からなる。 ＊化合物Ｃおよび／または化合物Ａおよび／または化合物Ｂの有効成分の効果量 ＊湿潤剤、場合により、望ましくは ＊でんぷん誘導体またはその塩 該組成物の水分含量は２５重量％以下であり、該核は好ましくは膜でコートされ ている。かかる膜は、胃酸では不溶で、腸内では可溶であり得る。 好ましい製剤処方の組成物、湿潤剤などは、本発明による組成物について上記 に開示されたものである。 本発明は、下痢の処置、肝障害の処置などのために組成物または製剤処方の使 用にも関する。 本発明はまた、膣または尿性器な症状または異常、直腸の異常などの下腹部の 器官の処置のための軟膏、ゲル、クリームまたは坐剤に関する。軟膏は、ゲル型 におけるのが望ましく、式Ｉの化合物および／または化合物Ｂ、湿潤剤および賦 形剤を含む。 湿潤剤は、望ましくは組成物および／または製剤処方について上記に掲げたも のの一つである。 さらに、本発明は、式Ｉの化合物Ｃおよび／または化合物Ｂ、および湿潤剤を 含む抗菌組成物に関する。かかる組成物は、広い活性スペクトルを有し、好気性 また嫌気性の菌に対して有効である。 本発明はまた、生息場所において殺菌したりまたは細菌の存在または生長を予 防する方法にも関する。この方法では、細菌または生息場所を本発明による殺菌 組成物で処置、例えば細菌に組成物を噴霧、生息場所に支持体を浸すなどする。 本発明は、動物、特にヒトの下痢疾患の処置方法にも関し、その場合、組成物 は、下記のものを含み、経口投与される。 ＊化合物Ｃおよび／または化合物Ｂの有効成分の効果量 ＊湿潤剤 ＊でんぷん誘導体 本発明はさらに、下記のものを保存剤として含有する食品パスタまたはヨーグ ルトなどの食品組成物に関する。 ＊式Ｉの化合物Ｃ(好ましくは化合物Ａ)および／または化合物Ｂの有効量 ＊場合により、有利に湿潤剤、および場合により、好ましくは湿潤剤と共に ＊でんぷん誘導体図面の記載 図１は式III の化合物ＡのＵＶスペクトルである 図２は式IIIの化合物ＡのＩＲスペクトルである。 図３は式IIIの化合物ＡのＨＰＬＣマス スペクトルである。発明の記載 式Ｉ (式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅の一つはＯＨを意味し、残りはＨを意味す る) の純化合物の製造は、 (式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅の一つはアシルオキシ基を意味し、残りは Ｈを意味する) の化合物からなされる。 この化合物は、塩酸と水の弱い混合物に懸濁する。このように処理された化合 物を濾過し、水で洗う。洗った化合物をできるだけ乾燥する。製造例 化合物Ａの製造 製造の特定の例を下記に示す。 ＵＳ３,９５０,３５１に開示された方法に従って製造された化合物Ｂ−２−( アセトリルオキシ)−Ｎ−(５−ニトロ−２−チアゾロリル)ベンザミド(すなわち ｐＨ５７７６)２ｇを３７％ＨＣｌ溶液２０mlに懸濁する。溶媒を２４時間５０ ℃に保ち、緩やかに撹拌する。 この処理後、溶媒を濾過して、固体の粒子を得る。この粒子を水でｐＨ７にな るまで洗い、炉で５０℃で乾燥する。 得た生成物は黄色の微針状結晶であり、その融点は２５４℃である(融点はＭe ttler ＦＰ器で毛細管法により測定)。 構造同定は、センテシマル分析、ＵＶスペクトル(図１参照)、ＩＲスペクトル( 図２参照)およびガス−クロマトグラフィーマス スペクトル(図３参照)によっ て行われた。この同定結果は次の通り ＣＩ０、Ｈ７、Ｎ３、Ｏ４、Ｓ１；２５８ 計算値 Ｃ４６.５１％ Ｈ２.７１％ Ｎ１６.４０％ Ｓ１２.４０％ 実測値 ４５.９８％ ２.６３％ １６.７１％ １２.６７％ λ_max＝３５０nm(ＯＤ＝０.６０５)． 試験１ 組成物Ｏの製造 本発明による組成物はｐＨ５７７６と上記製造の化合物とを混合することによ り製造され、該化合物の重量含量は該化合物とｐＨ５７７６の合計に対して４％ である。組成物Ａ１ ニタゾキサニド(ｐＨ５７７６)１００ｇを水１００ml中でポリビニルピロリド ン(湿潤剤)１０ｇおよびカルボキシメチルでんぷん５ｇとを混合する。混合物を 減圧で乾燥する。 この組成物は、バッカルまた経口投与のために顆粒、末、錠またカプセルをつ くるのに用いられる。 組成物Ｂ１、Ｃ１、Ｄ１、Ｅ１、Ｆ１、Ｇ１ Ａ１の組成物において、ただポリビニルピロリドンを５ｇと２ｇおよびカルボ キシメチルでんぷんを２ｇと１ｇにした以外は同じ組成物を製造した。 下記表は、組成物におけるニタゾキサニド (Ｎ)、ポリビニルピロリドン(Ｐ ＶＰ)およびカルボキシメチルでんぷん(ＣＳ)の含量を示す。 組成物Ｈ１、Ｉ１、Ｊ１ ニタゾキサニド、同様に他の有効成分を含む組成物は、ＰＶＰとカルボキシメ チルでんぷんとを含む水性媒体をつくることおよびこの媒体にニタゾキサニドお よび他の有効成分を加えることにより製造されて来た。この媒体を乾燥されて、 ５％以下の水含量を得る。 組成物Ａ２からＪ２ 組成物Ａ１からＪ１に類似する組成物を製造した。 組成物Ａ２からＪ２は、組成物Ａ１−Ｊ１に比して、ニタゾキサニド(ｐＨ５ ７７６−化合物Ｂ)と下記式の化合物Ａ(組成物Ａ１−Ｊ１においてのみニタゾキ サニドの代わりに)との混合物を含有する点のみ異なっている。 下記の表は、組成物Ａ２−Ｊ２の製造に用いられる化合物ＡおよびＢの含量を 示す。 製剤処方の製造 処方Ｋ１ ニタゾキサニド末５００ｇをポリビニルピロリドン１０ｇ、カルボキシメチル でんぷんで２０ｇ、トウモロコシでんぷん２５ｇ、ステアリン酸マグネシウム５ ｇおよび水５０ｇと混合し、得た混合物は顆粒５６０mg(すなわち、有効成分５ ００mgを含有する顆粒)となる。長さ約１cmの顆粒を５０℃で乾燥する。 得た微顆粒は熱糖液の噴霧によるコーティングをして提供される。糖コーティ ングは膜を形成する。 処方Ｋ２ ニタゾキサニド(ｐＨ５７７６)４８０ｇおよび化合物Ａ２０ｇの粉末混合物を ポリビニルピロリドン１０ｇ、カルボキシメチルでんぷんで２０ｇ、トウモロコ シでんぷん２５ｇ、ステアリン酸マグネシウム５ｇおよび水５０ｇと混合し、得 た混合物は顆粒５６０mg(すなわち、有効成分５００mgを含有する顆粒)となる。 長さ約１cmの顆粒を５０℃で乾燥する。 得た微顆粒は熱糖液の噴霧によるコーティングをして提供される。糖コーティ ングは膜を形成する。 微顆粒は、微結晶性セルロース(Ａvicel(登録商標)ＦＭＣ)、メチルセルロー ス、エチルセルロース、カルボキシセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、 ヒドロキシプロピルセルロース、でんぷん等のまたは他の有効成分をも含み得る ことは明らかである。 同様に膜は下記のものをも含み得る。 ＊成形剤、色素、充填剤、湿潤剤、潤滑油等々およびその混合物などの製薬上 許容される賦形剤 ＊胃酸で不溶だが腸で可溶な物質を含むフィルムコーティング組成物(重合物 質またはなし、例えばセルロース、アセトフタレート、ポリビニルアセトフタレ ート、ヒドロキシプロピルメチルセルロース・・・・・) 試験 試験１ フェーズＩ中に、薬力学的試験を組成物Ｏの経口量１回５００mgを服用したボ ランティア６人について行った。約３mcg／mlの２−(ヒドロキシ)−Ｎ−(５−ニ トロ−２−チアゾリル)ベンザミドが高圧液体クロマトグラフィーで血中に検出 された。この物質は、投与後最初の２４時間で尿に未変化で排泄された。血中お よび尿中に２−(アセトリルオキシ)−Ｎ−(５−ニトロ２−チアゾリル)ベンズア ミドを認められなかった。 計８０名の患者についてのフェーズII臨床試験において、組成物Ａ１の５００ mgの連続３−７日、１日２回投与が、反復糞便検査および／または膣内容塗布で 、トリコモナス・バギナリス(Ｔrichomonas vaginalis)、エンタモエバ・ヒスト リチカ(Ｅntamoeba histolytica)、ガルディア・ランブリア(Ｇardia lamblia) 、エンテロビウス・バーミキュラリス(Ｅnterobius vermicularis)、アスカリス ・ランブリコイデス(Ａscaris lumbricoides)、ネカータ・アメリカナス(Ｎecat or americanus)、アンサイロストマ・デゥオデナール(Ａncylostoma duodenale) 、トリクリス・トリチウラ(Ｔrichuris trichiura)、ストロンギロイデス・ステ アコラリス(Strongyloides stercoralis)、タエニア・サギナタ(Ｔaenia sagina ta)、タエニア・ソリウム(Ｔaenia solium)、ディフィロボッタリウム・ラテゥ ム(Ｄiphylobottrium latum)、およびヒメノレピス・ナナ(Ｈymenolepis nana) に高い有効性(６０−９５％)を示した。耐容性はよく、ただ少数の上腹部痛、吐 気、嘔吐および下痢が処置期間により約１０％の患者でみられた。投与の前後に 行った血液学的検査で組成物による影響はなかった。 トリコモナス・バギナリス(Ｔrichomonas vaginalis)に対するインビトロ試験 で２−(アセトリルオキシ)−Ｎ−(５−ニトロ−２−チアゾリル)ベンズアミドは 、最小阻止濃度０.５−１.２５mcｇ／mlであり、２−(ヒドロキシ)−Ｎ−(５− ニトロ−２−チアゾリル)ベンズアミドは同じ試験条件で１−１.２５mcg／mlで あった。これは、２−(ヒドロキシ)−Ｎ−(５−ニトロ−２−チアゾリル)ベンズ アミドが２−(アセトリルオキシ)−Ｎ−(５−ニトロ−２−チアゾリル)ベンズア ミドに匹敵する寄生虫効力を有していることを示す。しかし、これらの試験で、 ２−(ヒドロキシ)−Ｎ−(５−ニトロ−２−チアゾリル)ベンズアミドは２−(ア セトリルオキシ)−Ｎ−(５−ニトロ−２−チアゾリル)ベンズアミドの場合には ない実質的な速効作用を有する。 最後に、インビトロ試験で組成物はグラム陽性およびグラム陰性好気性菌、例 えばスタフィロコッカス・アウレウス(Ｓtaphylococcus aureus)、エシェリキア ・コリ(Ｅscherichia coli)、シゲラ・ソネイ(Ｓhigella sonei)、ヘリコバクタ ー・ピロリ(Ｈe1icobacter pylori)、嫌気性菌、例えばバクテロイデス・フラギ リス(Bacteroides fragilis)、フソバクテリウム・ウルセランス(Fusobacterium ulcerans)、ベイロネーラ・アルカデスセンス(Ｖeillonella alcadescens)、ガ ルドネレーラ・バジナリス(Ｇardnerella vaginalis)、酵母真菌の皮膚糸状菌、 例えばトリコフィトン・メンタグラフィテス(Ｔrichophyton mentographytes)、 ミクロスポラム・オードビニ(Ｍicrosporum audovini)、エピデルモフィトン・ フロコサム(Ｅpidermophyton Flocosum)、カンジダ・アルビカンズ(Ｃandida al bicans)、に対して有効であった。 式Ｉ (式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅の一つはＯＨを意味し、残りはＨを意味す る)の化合物、好ましくは化合物Ａを用いて、非常に低量でも、化合物Ｉ、特に 化合物ＰＨ５７７６、または化合物Ｂの効力を増加せしめ得た。 試験２および３ 本発明の組成物の効力を示すために５匹のマウス(４−８週令、１８−２０ｇ 体重)からなる２群をクリプトスポリジウム・パルブム(Ｃryptosporidium parvu m)に感染せしめた。 感染マウスは慢性下痢となった。 処置前において、糞便検査で慢性下痢になっていることは容易に判定できた。 上記したニタゾキサニドの組成物Ｄ１を用いて処置した。慢性下痢マウスに１ 週間１日約０.０１ｇのニタゾキサニド(すなわち約０．６ｇ／kgマウス)を経口 投与した。 １週間投与後、糞便検査でマウスに当初の下痢は認められなくなった。 また、感染マウスを組成物Ｄ２を用いて処置した。これらのマウスには、１週 間、１日約０.００９６ｇのニタゾキサニドおよび約０.０００４ｇの式IIIの化 合物Ａを経口投与した。 １週間の処置の終了前に、糞便検査でマウスに当初の下痢は認められなくなっ た。 試験４および５ 有効成分１０ｇを含む水性組成物(１００ｇ)を製造した。 組成物は、有効成分としてニタゾキサニドまたはニタゾキサニド(９.６ｇ)と 化合物Ａの混合物を含み、組成物はさらにサッカロースジステアレート０.５ｇ を含む。 組成物は種々の寄生虫、蠕虫、細菌および真菌を処置するために用いた。 組成物の効力を下記の表に示す。 試験５ 抗ウイルス効果および毒性の測定の一般的方法を以下に記載する。 抗ウイルス効果および毒性の測定の研究室法 Ａ．ヒト包皮線維芽細胞の製造 新生児ヒト包皮を包皮切断が行われたできるだけ直後に得、バンコマイシン、 フンギゾン、ペニシリンおよびゲンタマイシンを既知の濃度で含む最少必須培地 (ＭＥＭ)に４時間置いた。次いで、培地を除去し、包皮を小片に細かく刻み、赤 血球が存在しなくなるまで繰り返し洗浄した。次いで、組織を０.２５％トリプ シンを使用して、１５分間、撹拌しながら、３７℃でＣＯ₂インキュベーター中 でトリプシン処理した。各１５分間の最後に、組織をフラスコの底に入れた。細 胞含有上清を滅菌寒冷紗を通してＭＥＭおよび１０％ウシ胎児血清含有フラスコ に注いだ。培地含有フラスコをトリプシン処理工程中氷上に保った。細胞の各添 加後、寒冷紗を血清含有ＭＥＭ少量で洗浄した。新鮮トリプシンを包皮片に各時 間に添加し、工程を細胞が存在しなくなるまで繰り返した。次いで、細胞含有培 地を１０００rpm、４℃で１０分遠心した。上清液を傾捨し、細胞を１０％ＦＢ Ｓ(ウシ胎児血清)含有ＭＥＭ少量に再懸濁した。次いで、細胞を好適な数の２５ cm²組織培養フラスコに置いた。細胞がコンフルエントになりトリプシン処理が 必要になるにつれ、大きいフラスコに順番に広げた。細胞をバンコマイシンおよ びフンギゾン上に保ち、４代継代した。 Ｂ．細胞変性効果阻害検定−ＨＳＶ、ＨＣＭＶ、ＶＺＶ 低継代ヒト包皮線維芽細胞を、１０％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)添加最少必須培地 (ＭＥＭ)０.１ml中に、２.５×１０⁴細胞／mlの細胞濃度で、使用２４時間前に ９６ウェル培養プレートに播種した。次いで、細胞をＣＯ₂インキュベーター中 、３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、培地を除去し 、２％ＦＢＳ含有ＭＥＭ１００μlを第１列以外、全て添加した。第１列には、 試験薬１２５μlをウェル３つずつ添加した。培地単独を細菌およびウイルス対 照ウェルの両方に添加した。第１列のウェル中の医薬を次いで、Ｃetus Ｌiquid Ｈandling Ｍachineを使用して２５μlを移すことにより、残りのウェルを通し て、連続して１：５に希釈した。医薬の希釈後、ＭＥＭ１００μlを投与した細 胞対照ウェル以外、好適なウイルス濃度１００μlを各ウェルに添加した。ＨＳ Ｖ−１およびＨＳＶ−２検定のために、使用するウイルス濃度は１０００ＰＦＵ ／ウェルである。ＣＭＺおよびＶＺＶ検定のために、添加するウイルス濃度は２ ５００ＰＦＵ／ウェルである。次いで、プレートをＣＯ₂インキュベーター中３ ７℃で、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２については３日間またはＶＺＶについては １０日間またはＣＭＶについては１４日間インキュベートした。インキュベーシ ョン期間の後、培地を吸引し、細胞を０.１％クリスタルバイオレット溶液で３ ０分染色した。次いで、染色を除き、プレートを水道水を使用して全ての過剰な 染色が除かれるまで濯いだ。プレートを２４時間乾燥させ、次いで、Ｓkatron Ｐlate Ｒeaderで６２０nmで読み取った。 Ｃ．半固体重層を使用したＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２のプラーク減少検定 使用２日前に、ＨＦＦ(ヒト包皮線維芽)細胞を６ウェルプレートに置き、５％ ＣＯ₂および９０％湿度、３７℃でインキュベートする。検定の日、医薬を２× ＭＥＭ中で所望の濃度の２倍に調整し、次いで２×ＭＥＭ中で１：５に連続希釈 し、次いで、医薬６濃度を使用して２×ＭＥＭ中で連続して１：５に希釈する。 最初の出発濃度は通常２００μgから０.０６μg／mlに減少する。使用するウイ ルスを、２０−３０プラーク／ウェルを与える濃度である所望の濃度に、１０％ ＦＢＳ含有ＭＥＭで希釈する。次いで、培地をウェルから吸引し、ウイルス０. ２mlを各ウェルに２個ずつ添加し、０.２mlの培地を医薬毒性ウェルに添加する 。次いで、プレートを１時間、１５分毎に振りながらインキュベートする。イン キュベーション期間の後、１％アガロース同量を各医薬希釈の同量に加える。こ れにより、１００μg／mlで始まった医薬最終濃度が０.０３μg／mlで終わるよ うにし、最終アガロース重層濃度を０.５％にする。医薬アガロース混合物を２m l量で各ウェルに加え、次いでプレートを３日間インキュベートし、その後細胞 をニュートラルレッド１.５％溶液で染色した。４−６時間のインキュベーショ ン期間の終わりに、染色を吸引し、プラークを１０×倍率の立体顕微鏡を使用し て計数する。 ＥＣ₅₀(５０％有効濃度)は、ウイルス細胞変性源性を５０％阻害するのに必要 な濃度である。 ＩＣ₅₀(５０％阻害濃度)は細胞増殖を５０％阻害するのに必要な濃度である。 選択指数(Ｓ.Ｉ.)＝ＩＣ₅₀／ＥＣ₅₀ Ｄ．ＶＺＶプラーク減少検定−半固体重層 方法は、上記のＨＳＶプラーク検定と実質的に同一であり、２カ所の例外があ る： １．医薬の添加後、プレートを１０日間インキュベートする。 ２．３日目および６日目に同量の２×ＭＥＭおよび１％アガロースの重層１ml を添加する。 Ｅ．ＣＭＶプラーク検定−半固体重層 方法は、再び、ＨＳＶについてと殆ど同じであり、幾つかの僅かな違いがある 。最初の重層および２回目の続く重層の両方に使用するアガロースは１％よりむ しろ０.８％である。検定は１４日間インキュベートし、４日目および８日目に 重層１mlを添加する。 Ｆ．液体培地重層を使用したプラーク減少検定 液体重層プラーク検定の方法は、アガロース重層を使用したものと類似である 。ウイルスの添加工程は、標準プラーク検定と類似である。医薬濃度は、２％Ｆ ＢＳ含有ＭＥＭ中で使用すべき範囲である。医薬は先記の検定でのように２×濃 度で作らず、所望の濃度で作る。ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２検定のために、Ｂ axter Ｈealth Ｃare Ｃorporationから得た抗体調製物を１：５００に希釈し、 医薬が希釈されている培地に添加する。ＣＭＶおよびＶＺＶについては、重層中 に抗体のないものを使用する。ＣＭＶ検定については、新医薬なしの付加培地を ５日目に添加し、全部で１０日間インキュベートする。ＶＺＶについては、付加 培地を５日目に添加し、全部で１０日間インキュベートする。検定の総て、イン キュベート期間の最後に貯蔵中和の１：１０希釈２mlを各ウェルに添加し、６時 間インキュベートする。次いで、液体を吸引し、プラークを立体顕微鏡を使用し て計数する。 Ｇ．ＥＢＶのスクリーニングおよび確認検定 １．ウイルス 感染性ＥＢＶの２つの原形がある。１つはＰ３ＨＲ−１細胞系の上清液由来の ウイルスにより例示される。この細胞系は、初期感染またはＢ細胞系超感染後の 初期抗原(ＥＡ)の産生をもたらす非形質転換ウイルスを産生する。他方の原形は 、Ｂ−９５−８ウイルスにより例示される。このウイルスは、キヌザルにおいて 、索血液リンパ球を非動化し、癌を誘発する。しかしながら、細胞系がＥＢＶゲ ノムコピーを保持していてさえ、流産生産性感染は誘発しない。我々の検定に使 用したウイルスはＰ３ＨＲ−１である。 ２．細胞系 ラモス(Ｒamos)はバーキットリンパ腫癌由来の異常Ｂ細胞系であるが、検出可 能なＥＢＶゲノムコピーを含まず、ＥＢＮＡ陰性である。ラモス／ＡＷはラモス のＰ３ＨＲ−１ウイルス感染によりインビトロで得、一つの活性化されていない ＥＢＶゲノムコピー／細胞を含む。ラジ(Ｒaji)は、６０ＥＢＶゲノム細胞を含 むバーキットリンパ腫細胞系であり、ＥＢＶ ＥＡ発現に対する抗ウイルス活性 のスクリーニングに使用される初期細胞である。ダウディ(Ｄaudi)は、１５２Ｅ ＢＶゲノムコピー／細胞を含む、低レベル生産体である。０.２５％−０.５％の 細胞中で本質的にＥＢＶ ＥＡが発現される。追跡研究に使用し、活性を確認す る。これらの細胞系はＥＢＶの超感染に、ＥＡ(Ｄ)、ＥＡ(Ｒ)およびＶＣＡを発 現することにより応答する。総ての細胞系を、１０％ＦＣＳ、Ｌ−グルタミンお よび１００μg／mlゲンタマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地に維持する 。培養物を１週間に２回餌を与え、細胞濃度を３×１０⁵／mlに調製する。細胞 を５％ＣＯ₂、湿らせた雰囲気で、３７℃に保つ。 ３．モノクローナル抗体による免疫蛍光検定 細胞を、ＥＢＶのＰ３ＨＲ１−１株で感染させ、試験する試薬を細胞培養物の 吸着(３７℃で４５分)および洗浄後に添加する。培養物を２日間完全培地で成育 させ、ウイルス遺伝子発現をさせる。４８時間のインキュベーション期間に続き 、各サンプルの細胞数を計数し、塗抹を行う。次いで、異なるＥＡ成分およびＶ Ｃ Ａに対するモノクローナル抗体を、インキュベートおよび洗浄細胞に添加する。 これは、フルオレセイン接合ウサギ抗マウスＩｇ抗体により追跡する：および塗 抹中のフルオレセイン陽性細胞の数を計数する。次いで、ＥＡまたはＶＣＡに陽 性な培養物中の全細胞数を計算し、比較する。 Ｈ．細胞増殖検定−毒性 検定２４時間前、ＨＦＦ細胞を１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭ中２.５×１０⁴細胞／ ウェルの濃度で、６−ウェルプレートに播種する。検定の日、医薬を１０％ＦＢ Ｓ含有ＭＥＭで、連続して、１：５の増加で希釈し、１００μg／mlから０.０５ μg／mlの範囲を覆う。ＤＭＳＯに溶解すべき医薬について、対照ウェルは１０ ％ＤＭＳＯ含有ＭＥＭを入れる。次いで、ウェル由来の培地を吸引し、各医薬濃 度２mlを各ウェルに添加する。次いで、細胞を３７℃、７２時間、ＣＯ₂インキ ュベーター中でインキュベートする。この期間の最後に、培地−医薬溶液を回収 し、細胞を洗浄する。０.２５％トリプシン１mlを各ウェルに添加し、細胞がプ レートから取れ始めるまでインキュベートする。次いで、細胞−培地混合物を、 細胞懸濁液を破壊するために激しくピペットで吸入排出し、混合物０.２mlをイ ソトンIII(Ｉsoton III)９.８mlに添加し、Ｃoulter Ｃounterを使用して計数す る。各サンプルを、３回、サンプル当たり３つずつのウェルで計数する。 Ｉ．細胞細胞毒性のＭＴＴ検定 検定２４時間前、ＨＦＦ細胞を２.５×１０⁴細胞／ウェルの濃度で９６ウェル プレートに置く。２４時間後、培地を吸引し、医薬１２５μlをウェルの第１列 目に添加し、次いで自動Ｃetus Ｌiquid Ｈandling Ｓystenを使用して、ＣＰＥ 検定で使用したのと同様の方法で、１：５に連続希釈する。次いで、プレートを ３７℃で７日間、ＣＯ₂インキュベーターでインキュベートする。この期間、各 ウェルに、Ｄulbecco's Ｐhosphate Ｂuffered Ｓaline中のＭＴＴ １μg／ml の溶液５０μlを投与する。次いで、プレートを更に４時間インキュベートする 。この期間、培地を除去し、イソプロパノール中の０.０４Ｎ 塩酸１００μlで 置き換える。短く振盪した後、次いでプレートをプレート読み取り器で５５０nm で読む。 Ｊ．ニュートラルレッド取り込み検定−毒性 細胞の平板培養および医薬の添加は、ＭＴＴ検定と同様である。 医薬添加後、プレートを７日間、３７℃でＣＯ₂インキュベーターでインキュ ベートする。この期間、培地／医薬を吸引し、ＤＰＢＳ中の０.０１％ニュート ラルレッド２００μl／ウェルを添加する。これをＣＯ₂インキュベーターで１時 間インキュベートする。色素を吸引し、細胞をＮunc Ｐlate Ｗasherを使用して 洗浄する。ＤＰＢＳ洗浄液の除去後、５０％ＥＴＯＨ(エタノール)／１％氷酢酸 (Ｈ₂Ｏ中)２００μg／ウェルを添加する。プレートを１５分間rpmさせ、光学密 度をプレート読み取り器で５５０nmで読み取る。試験５ａ：ＨＢＶ複製に対する培養中の抗ウイルス活性 (Ｂ型肝炎) ２.２.１５細胞の培養における抗−ＨＢＶ化合物の検定法は、以下のように簡 単に要約できる(ＫorbaおよびＭilman，1991，Ａntiviral Ｒes．217:217)： ＊慢性ＨＢＶ−産生ヒト肝細胞(Ａcs，et al.，1987，ＰＮＡＳ 84:4641)を２ ４ウェル組織培養プレートに播種し、コンフルエントになるまで成育させる。 ＊次いで、試験化合物を毎日連続９日間添加する。培養培地(処置期間中毎日 変える)を処置後０、３、６および９日に回収し、細胞外(ビリオン)ＨＢＶ Ｄ ＮＡを分析するために貯蔵する。 ＊処置細胞を９日目の処置の後２４時間融解し、細胞内ＨＢＶゲノム形を分析 する。 ＊次いで、ＨＢＶ ＤＮＡを定量的および定質的方法で、ＨＢＶ ＤＮＡの全 レベル(細胞外および細胞内ＤＮＡの両方)およびＨＢＶ複製の相対的比率(細胞 内ＤＮＡ)について分析する。 ２.２.１５細胞の培養における化合物の毒性の決定法は、簡単には下記のよう に要約できる(ＫorbaおよびＧerin、発表のために提出)： ＊２.２.１５細胞を９６ウェル平底組織培養プレートでコンフルエントになる まで成育させ、上記のように化合物(０.２ml培養培地／ウェル)で処理した。各 化合物の４つの濃度をそれぞれ３つづつ、３−１０倍工程で検定した。 ＊未処理対照培養を各９６ウェルプレートに維持した。各９６ウェルプレート において、細胞を含まないウェルを光分散を補正するために使用した。 ＊毒性を、ニュートラルレッド色素の取り込み阻害により測定し、９日目の処 理２４時間後に、５１０nmの吸光度を未処理細胞の吸光度を対応させて測定した (Ｆinter et al.，1969，Ｊ．Ｍed．Ｃhem．5:419)。 化合物Ａの抗ウイルス活性をザルシタビンのものと比較する。 化合物Ａを使用して、ウイルス細胞変性源性の５０％阻害を有する有効濃度は １.８±０.１マイクログラム／ml(μg／ml)有効濃度(ＥＣ₅₀)が１.８±０.１μg ／mlであるが、一方細胞毒性濃度(細胞増殖の５０％阻害を有する)は１０００μ g／mlより大きいことが判明した。したがって、化合物Ａの選択指数は＞１００ ０／１.８と等しく、すなわち、指数は５００より高かった。 ザルシタビンについて、試験は以下の結果を示した： ＥＣ₅₀ ：１.８±０.２μg／ml ＣＣ₅₀ ：２６１±２４μg／ml すなわち、選択指数は２６１／１.８、すなわち約１４５である。 この試験から見られるように、化合物Ａはザルシタビンより毒性が低く、それ により少ない副作用でのより適切な処置を、ＨＢＶ複製に対して得ることができ る。試験５ｂ：ＶＺＶに対する抗ウイルス活性 ニタゾキサニド(９６％)および混合物Ａ(４％)の混合物もまた水痘帯状庖疹ウ イルス(Ｖaricella Ｚoster Ｖirus)(標準研究室株)に対する活性の測定に使用 した。 水痘帯状庖疹ウイルスに対して、ＥＣ₅₀が４μg／mlおよびＣＣ₅₀が３４μg／ ml、すなわちＳ.Ｉ.指数が約８.５であることが判明した。 混合物の低毒性および効果の観点から、混合物はアシクロビルのような抗ウイ ルス剤に対して耐性であることが知られている水痘帯状庖疹ウイルスの処置に特 に適していた。 本発明による化合物Ａおよび組成物は、例えば錠剤によって経口投与できる。 本発明の組成物、特にＰＨ５７７６および／または更なる抗ウイルス剤を含む 物は： １型単純ヘルペスウイルス(ＨＳＶ−１、アシクロビルに耐性のＨＳＶ−１)； ２型単純ヘルペスウイルス(ＨＳＶ−Ｓ、アシクロビルに耐性のＨＳＶ−２)； ヒトサイトメガロウイルス(ＨＣＭＶ、ガンシクロビルに耐性のＨＣＭＶ)； 水痘帯状庖疹ウイルス(ＶＺＶ、アシクロビルに耐性のＶＺＶ)； エプスタイン・バーウイルス(ＥＢＶ)； マウスサイトメガロウイルス(ＭＣＭＶ) のようなヘルペスウイルスに対する広い活性スペクトルを有する組成物である。 本組成物は、経口投与に好適な形を製剤する目的のために既知のような賦形剤 を含むことができる。 本組成物は、有利には湿潤剤および、場合によりでんぷん誘導体を含有する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 31/425 ＡＤＺ Ａ６１Ｋ 31/425 ＡＥＡ ＡＥＡ 7329−4Ｃ 9/14 Ｌ (31)優先権主張番号 ０８／３８３，８５５ (32)優先日 1995年２月６日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．式 (式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅の１つはＯＨであり、残りはＨである) の化合物。 ２．式 (式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅の１つはＯＨであり、残りはＨである) の化合物を有効成分として含有する医薬組成物。 ３．式 (式中、Ｒ₁＝ＯＨおよびＲ₂＝Ｒ₃＝Ｒ₄＝Ｒ₅＝Ｈである) の化合物Ａおよび式 の化合物Ｂの混合物を有効成分として含有する、請求項２の医薬組成物。 ４．湿潤剤をさらに含有する経口投与用の請求項２または３の医薬組成物。 ５．少なくとも１つの湿潤剤がアニオン界面活性剤からなる群から選ばれる、 請求項４の医薬組成物。 ６．湿潤剤が糖エステル、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、アン ヒドロヘキシトール誘導体、脂肪アルカノールアミド、脂肪アミンオキシド、ス クロース、マンニトール、ソルビトール、レシチン、ポリビニルピロリドン、脂 肪酸エステル、スクロースのグリセリド、キシロースのエステル、ポリオキシエ チレングリセリド、脂肪酸のエステル、脂肪アルコールのポリオキシエチレンエ ーテル、ソルビタンのポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタンの脂肪酸 のポリオキシエチレンエステル、アルコールポリグリセリドのグリセリド−ポリ グリセリドエステルおよびこれらの混合物からなる群から選択される請求項４の 医薬組成物。 ７．でんぷん誘導体を含有する、請求項１−６のいずれかの医薬組成物。 ８．カルボキシメチルでんぷんまたはその塩を含有する、請求項７の医薬組成 物。 ９．有効成分の重量に対し２０重量％までの界面活性剤および有効成分の重量 に対し２０重量％までのでんぷん誘導体を含む、請求項４の組成物。 １０．＊式Ｉ (式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅の１つはＯＨであり、残りはＨである) の化合物の有効量、それと場合により混合された式 の化合物Ｂ ＊湿潤剤および ＊でんぷん誘導体 を含む組成物を含む核からなり、その組成物の水含量が２５重量％以下である、 経口投与用の製剤処方。 １１．カルボキシメチルでんぷんまたはその塩を含有する請求項１０の処方。 １２．＊式Ｉ (式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅の１つはＯＨであり、残りはＨである) の化合物の有効量、それと場合により混合される式 の化合物Ｂおよび ＊湿潤剤 を含有する、下腹部の感染に対する処置のための軟膏。 １３．でんぷん誘導体を含む請求項１２の軟膏。 １４．式 (式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅の１つはＯＨであり、残りはＨである) の化合物の抗寄生虫剤としての使用。 １５．式 (式中、Ｒ₁＝ＯＨおよびＲ₂＝Ｒ₃＝Ｒ₄＝Ｒ₅＝Ｈである) の化合物Ａおよび式 の化合物Ｂの混合物の抗寄生虫剤としての使用。 １６．式Ｉ (式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅の１つはＯＨであり、残りはＨである) の化合物の抗菌剤としての使用。 １７．式 (式中、Ｒ₁＝ＯＨおよびＲ₂＝Ｒ₃＝Ｒ₄＝Ｒ₅＝Ｈである) の化合物Ａおよび式 の化合物Ｂの混合物の抗菌剤としての使用。 １８．式Ｉ (式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅の１つはＯＨであり、残りはＨである) の化合物の抗真菌剤としての使用。 １９．式 (式中、Ｒ₁＝ＯＨおよびＲ₂＝Ｒ₃＝Ｒ₄＝Ｒ₅＝Ｈである) の化合物Ａおよび式 の化合物の混合物の抗真菌剤としての使用。 ２０．式Ｉ (式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅の１つはＯＨであり、残りはＨである) の化合物の抗ウイルス剤としての使用。 ２１．式 (式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅の１つはＯＨであり、残りはＨである) の化合物の抗ウイルス剤としての使用。 ２２．式 (式中、Ｒ₁＝ＯＨおよびＲ₂＝Ｒ₃＝Ｒ₄＝Ｒ₅＝Ｈである) の化合物Ａおよび式 の化合物の混合物の抗ウイルス剤としての使用。 ２３．＊式Ｉ (式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅の１つはＯＨであり、残りはＨである) の有効成分の有効量 ＊場合により式 の化合物Ｂ ＊場合によりでんぷん誘導体 を保存剤として含有する食品組成物。