RO118293B1

RO118293B1 - Derivat de benzamida, compozitii continand acest derivat si utilizarea acestuia

Info

Publication number: RO118293B1
Application number: RO96-01970A
Authority: RO
Inventors: Jean Francois Rossignol
Original assignee: Jean Francois Rossignol
Priority date: 1994-04-13
Filing date: 1995-04-11
Publication date: 2003-04-30

Abstract

Prezenta inventie se refera la un derivat de benzamida cu formula I: in care unul dintre substituentii R1, R2, R3, R4 si R5 reprezinta OH, iar ceilalti reprezinta H; la compozitii care contin acest derivat si la utilizarea acestuia ca agent antiparazitar, antibacterian, antifungic si antiviral.

Description

Invenția se referă la un derivat de benzamidă cu formula I:

în care unul dintre substituenții R_v R₂, R₃, R₄ și R₅ reprezintă OH, iar ceilalți reprezintă H, la compoziții care conțin acest derivat și la utilizarea acestuia ca agent antiparazitar, antibacterian, antifungic și antiviral.

în US 3950351 și în publicațiile făcute de solicitant, se descriu prepararea compusului PH 5776 (2-(acetoliloxi)-N-(5-nitro-2-tiazolil)benzamidă), cu formula I:

în care R, = O-COCH₃

R₂ = R₃ = R₄ = R₅ = H precum și utilizările acestui compus.

în US 3950351, compusul cu formula I este preparat prin reacția:

cu

Hal = halogen

Din stadiul tehnicii se cunoaște faptul că pentru a fi activi și eficienți împotriva bacteriilor, paraziților, fungilor, virusurilor etc., este necesară prezența unei grupe aciloxi în molecula compușilor reprezentați prin fomula generală I.

Prezenta invenție se referă la un nou derivat de benzamidă, cu formula generală I:

RO 118293 Β1 ,ζ în care unul dintre substituenții R_n R₂, R₃, R₄ și R₅ reprezintă OH, iar ceilalți reprezintă H, care are o eficiență excelentă față de paraziți, fungi, bacterii, deși nu conține o grupare aciloxi. 50

Invenția se referă și la o compoziție farmaceutică care conține o cantitate eficientă farmaceutic de agent activ, constituit dintr-un amestec de derivat de benzamidă A, cu formula:

și un derivat de benzamidă B, cu formula:

în care conținutul în greutate de compus A, raportat la greutatea amestecului de compuși

A și B, este cuprins între 0,5 și 20%, preferabil între 0,5 și 10%, mai preferat între 0,5 și 5% 70 și, opțional, un agent de umectare și un derivat de amidon.

O astfel de compoziție prezintă o acțiune imediată față de paraziți, bacterii, fungi și virusuri. De asemenea, această compoziție poate fi utilizată pentru tratamentul imediat al afecțiunilor abdomenului inferior, precum diareea, infecțiile gastrointestinale, infecțiile enterice, infecțiile transmise pe cale sexuală, infecțiile vaginale și urogenitale. 75

O compoziție, de preferință o compoziție solidă, pentru administrare orală, pentru combaterea afecțiunilor sau infecțiilor abdomenului inferior, de preferință infecțiile intestinale și vaginale, conține:

- o cantitate eficientă de agent activ, constituit dintr-un amestec de compus A și compus B, în care conținutul în greutate de compus A, raportat la greutatea amestecului de 80 A și B, este cel definit mai sus;

- un agent de umectare și eventual, dar preferat;

- cel puțin un derivat de amidon.

Compoziția din urmă mai poate conține și alți agenți activi, de exemplu un agent antiparazitar, de exemplu un antihelmintic, cum ar fi febantel, praziquantel, levamisol, alben- 85 dazol, oxfendazol, moxidectin, ivermectin, milbemicin, un agent antibacterian, antifungic sau antiviral.

Prepararea și utilizarea compusului B sunt descrise în US 3950351 și 4315018.

Agentul de umectare prezent în compoziția conform invenției este, în mod avantajos, un agent de suprafață anionic și este, de preferință, ales din grupul constând din esteri zaha- 90 rici, polioxietilenă, polioxipropilenă, derivați de anhidrohexitol, alcanol amide grase, aminooxizi grași, sucroză, manitol, sorbitol, lecitine, polivinilpirolidone, esteri ai acizilor grași, gliceride ale sucrozei, esteri ai xilozei, polioxietilen-gliceride, esteri ai acizilor grași și polioxietilen-eter cu alcooli grași și esteri ai acizilor grași polioxietilenici ai sorbitanului, glicerid-poliglucide, esteri ai alcoolilor poliglucidici și amestecuri ale acestora.

R0118293 Β1

Agenții de umectare deosebit de adecvați sunt distearatul zaharozei, PVP (polivinilpirolidona) etc.

Compoziția conform invenției conține, de preferință, un derivat de amidon, în special un carboxi derivat, cum ar fi carboximetil amidonul, derivații sodați ai acestuia sau o sare a lor.

Compoziția conține, de exemplu, până la 20% în greutate, în mod avantajos, 1 până la 10% în greutate agent de suprafață, raportat la greutatea agenților activi, și până la 20% în greutate, în mod avantajos, 1 până la 10% în greutate derivat de amidon, raportat la greutatea agenților activi.

Invenția se referă, de asemenea, și la o formulare galenică destinată administrării orale, cu acțiune antivirală și/sau de combatere a afecțiunilor abdomenului inferior, precum afecțiunile intestinale, vaginale, sau urogenitale, precum și a afecțiunilor hepatice, conținând un miez format dintr-o compoziție care conține:

- o cantitate eficientă de compus A cu formula:

- în amestec cu un compus B, cu formula:

- până la 20% în greutate dintr-un agent de umectare, raportat la greutatea agenților activi;

- până la 20% în greutate dintr-un derivat de amidon, raportat la greutatea agenților activi;

conținutul în apă al respectivei compoziții fiind mai mic de 25% în greutate, respectivul miez fiind, de preferință, acoperit cu o membrană. Membrana poate fi o membrană insolubilă în mediul gastric acid, dar solubilă la nivelul intestinului.

Invenția se referă și la o pomadă sau gel, cremă sau supozitoare pentru tratamentul organelor abdomenului inferior, cum ar fi tulburările sau afecțiunile vaginale sau urogenitale, afecțiunile rectale.

Pomada este, de preferință, sub formă de gel și conține o cantitate eficientă de compus A, în amestec cu un compus B, în care conținutul în greutate al agentului activ A raportat la greutatea amestecului este cuprins între 0,5 și 20%, până la 20% în greutate dintr-un agent de umectare, raportat la greutatea agenților activi, și până la 20% în greutate dintr-un derivat de amidon, raportat la greutatea agenților activi. Agentul de umectare este, de preferință, unul din cei menționați anterior la compoziția farmaceutică și/sau formularea galenică.

în plus, invenția se referă și la o compoziție antibacteriană conținând un compus A și/sau un compus B și un agent de umectare. O astfel de compoziție este activă atât față de bacteriile aerobe, cât și față de cele anaerobe, compoziția prezentând astfel un spectru de acțiune foarte larg.

150

RO 118293 Β1

Prepararea compusului pur, cu formula generală I:

în care unul dintre substituenții R_n R₂, R₃, R₄ și R_s reprezintă OH, iar ceilalți reprezintă H, se poate realiza din compuși cu formula generală I:

155

160 în care unul dintre substituenții R_1t R₂, R₃, R₄ și R₅ reprezintă o grupă aciloxi, iar ceilalți reprezintă H.

Respectivul compus este suspendat într-o soluție diluată de acid clorhidric. Compusul astfel tratat este apoi filtrat și spălat cu apă. Compusul spălat este apoi uscat.

Problema tehnică pe care o rezolvă invenția constă în găsirea unui nou compus cu

165

170

175 în care unul dintre substituenții R_1t R₂, R₃, R₄ și R₅ reprezintă OH, iar ceilalți reprezintă H, având o acțiune imediată, substanțială față de paraziți, fungi, bacterii; de asemenea, testele efectuate au arătat că prin folosirea simultană a derivatului de benzamidă conform invenției cu un agent de umectare eficiența acestui derivat crește foarte mult, permițând utilizarea compozițiilor care conțin acest derivat pentru tratamentul afecțiunilor abdomenului inferior, cum ar fi afecțiunile intestinale (diaree), infecțiile gastrointestinale, infecțiile enterice, infecțiile transmise pe cale sexuală, infecțiile vaginale și infecțiile urogenitale.

Se dau în continuare exemple de realizare a invenției.

Prepararea compusului A

Un exemplu caracteristic de preparare este dat în cele ce urmează.

Se suspendă în 20 ml soluție de acid clorhidric 37% 2g de 2-(acetoliloxi)-N-(5-nitro-2tiazol)benzamidă (PH 5776) - compus B preparat conform metodei descrise în US 3950351. Amestecul de reacție este menținut la 50°C timp de 24 h, cu agitare lentă.

După acest interval, amestecul de reacție s-a filtrat, obținându-se particule solide. Respectivele particule s-au spălat cu apă până la pH 7 și s-au uscat într-o etuvă, la 50°C.

Produsul rezultat se prezintă sub formă de ace microcristaline galbene, cu p.t. 254°C, (punctul de topire s-a determinat prin măsurători capilare pe un aparat Mettle FP).

180

185

190

RO 118293 Β1

Structura s-a identificat prin analiză centesimală, spectru UV, spectru IR și analiză gaz-cromatografică cuplată cu spectrometrie de masă. Rezultatele obținute sunt următoarele:

C10, H7, N3, 04, S1, 258

Calculat: C 46,51%; H2,71%; N 16,40%; S 12,40%

Determinat: C 45,98%; H 2,63%; N 16,71%; S 12,67%.

Ă_max = 350 nm (OD = 0,605).

TEST 1

Prepararea compusului O

S-a preparat o compoziție conform invenției prin amestecarea compusului PH 5776 cu compusul preparat anterior, conținutul în greutate al respectivului compus raportat la greutatea amestecului de compus PH 5776, respectivul compus fiind de 4%.

Compoziția A1

S-au amestecat 100 g nitazoxanidă (PH 5776) în 100 ml apă cu 10 g polivinilpirolidonă (agent de umectare) și 5 g carboximetilamidon. Amestecul s-a uscat în vid.

Respectiva compoziție poate fi utilizată ulterior, pentru obținerea granulelor, a prafurilor, tabletelor sau capsulelor pentru administrare orală.

Compozițiile B1, C1, D1, E1, F1, G1

S-au preparat compoziții similare cu compoziția A_n cu excepția faptului că s-au folosit numai 5 g și 2 g polivinilpirolidonă, și 2 g și 1 g carboximetilamidon.

în tabelul următor este dat conținutul, în grame, de nitazoxanidă “N”, polivinilpirolidonă “PVP” și carboximetilamidon “CS”, al compozițiilor respective.

Compoziția	N (q)	PVP (q)	CS (q)
B1	100	5	5
C1	100	2	2
D1	100	5	2
E1	100	5	1
F1	100	2	1
G1	100	5	0

Compozițiile H1,11, J1

S-au preparat compoziții care conțin nitazoxanidă, precum și alt agent activ, prin prepararea unui mediu apos conținând PVP și carboximetilamidon, la care s-a adăugat nitazoxanidă și alt agent activ. Mediul s-a uscat până la un conținut de apă sub 5%.

Compoziția	N (q)	PVP (q)	CS (q)	Alt agent activ (q)	Conținut de apă(%)
H1	50	5	2	Praziquantel 50	2
11	75	5	2	Praziquantel 50	1
J1	75	5	2	Praziquantel 50	2

Compozițiile A2 - J2

S-au preparat compoziții similare cu compozițiile A1 - J1.

RO 118293 Β1

Compozițiile A2 - J2 diferă de compozițiile A1 - J1 numai prin aceea că acestea conțin un amestec de nitazoxanidă (PH 5776 - compus B) și compus A cu formula:

240

245 (spre deosebire de compozițiile A1 - J1, care conțin numai nitazoxanidă).

în tabelul următor sunt redate cantitățile de compus A și compus B, care s-au utilizat pentru prepararea compozițiilor A2 - J2.

250

Compoziția	Compus A (g)	Compus B (g)
A2-G2	4	96
H2	2	48
I2	3	72
J2	3	72

255

Prepararea formulărilor galenice

Formularea K1

500 g de nitazoxanidă sub formă de pulbere s-au amestecat cu 10 g polivinilpiroli- 260 donă, 20 g carboximetilamidon, 25 g amidon de porumb, 5 g stearat de magneziu și 50 g apă; amestecul astfel obținut s-a prelucratat în granule de 560 mg (adică, granule conținând 500 mg de agent activ). Granulele cu diametru de aproximativ 1 cm s-au uscat la aprox. 50°C. Microgranulele astfel obținute s-au acoperit prin pulverizarea unei soluții de zahăr fierbinte. Stratul de zahăr formează o membrană. 265

Formularea K2

Un amestec de pulbere formată din 480 g Nitazoxanidă (PH 5776) și 20 g compus A s-a amestecat cu 10 g polivinilpirolidonă, 20 g carboximetilamidon, 25 g amidon de porumb, 5 g stearat de magneziu și 50 g apă, iar amestecul obținut s-a prelucrat în granule de 560 mg (adică, granule conținând 500 mg de agent activ). Granulele cu diametru de 270 aprox. 1 cm s-au uscat la aprox. 50°C.

Microgranulele astfel obținute s-au acoperit prin pulverizarea unei soluții de zahăr fierbinte. Stratul de zahăr formează o membrană.

Este evident că microgranulele mai pot conține unul sau mai mulți excipienți, sau alți agenți activi, cum ar fi celuloza microcristalină (Avicelⁿ, FMC), metilceluloza, etilceluloza, car- 275 boximetilceluloza, hidroxietilceluloza, hidroxipropilceluloza, amidonul etc.

în același mod, membrana mai poate conține:

- un excipient acceptabil din punct de vedere farmaceutic, cum ar fi un plastifiant, un pigment, un agent de umplutură, un agent de umectare, un lubrifiant sau un amestec al acestora, și 280

- o compoziție care formează o peliculă filmată și care conține o substanță insolubilă in sucul gastric, dar solubilă în sucul intestinal (substanță polimerică sau nepolimerică, de exemplu, acetoftalat de celuloză, polivinilacetoftalat, hidroxipropilmetilceluloză,...).

TESTE

Testul 1 285 în timpul fazei I, studiile farmacocinetice s-au efectuat pe 6 voluntari care au primit o singură doză orală de 500 mg din compoziția O. S-au detectat aproximativ 3 pg/ml de

RO 118293 Β1

2-(hidroxi)-N-(5-nitro-2-tiazolil)benzamidă în sânge prin cromatografie lichidă de presiune înaltă. Acest produs a fost regăsit și în urină în timpul primelor 24 h după tratament. în sânge și în urină nu s-au regăsit urme de 2-(acetoliloxi)-N-(5-nitro-2-tiazolil)benzamidă.

în timpul fazei II, studiile clinice s-au efectuat pe un număr de 80 de pacienți, s-au examinat în mod repetat fecalele și/sau secrețiile vaginale, și s-a constatat că 500 mg de compoziție A1, administrată de două ori pe zi, timp de 3 până la 7 zile, este foarte eficientă (60-95%) față de Trichomonas vaginalis, Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Enterobius vermicularis, Ascaris lumbricoides, Necator americanus, Ancylostoma duodenale, Trichuris trichiura, Strongyloides stercoralis, Taenia saginata, Taenia solium, Diphylobottrium latum și Hymenolepis nana. Toleranța a fost bună și s-au observat numai câteva cazuri cu dureri epigastrice, vomă, greață și diaree, la aprox. 10% dintre pacienți, în funcție de durata tratamentului. Chimismul sângelui și hematologia au rămas neschimbate înainte și după tratamentul cu compoziția conform invenției.

Studiile in vitro efectuate împotriva Trichomonas vaginalis au arătat că în timp ce 2(acetoliloxi)-N-(5-nitro-2-tiazolil)benzamida a avut o concentrație minimă de inhibare de 0,5 până la 1,25 mcg/ml, în timp ce 2-(acetoliloxi)-N-(5-nitro-2-tiazolil)benzamidă în aceleași condiții experimentale, are o CMI de 1 până la 1,25 mcg/ml.

Aceste rezultate demonstrează că 2-(hidroxi)-N-(5-nitro-2-tiazolil)benzamida are o activitate antiparazitară similară cu cea a 2-(acetoliloxi)-N-(5-nitro-2-tiazolil)benzamidei.

Totuși, aceste studii arată că 2-(hidroxi)-N-(5-nitro-2-tiazolil)benzamida are o acțiune imediată, fapt care nu s-a întâmplat în cazul 2-(acetolil)-N-(5-nitro-2-tiazolil)benzamidei.

în final, studiile in vitro arată că, respectiv, compoziția este eficientă față de bacteriile aerobe gram pozitive și gram negative, cum ar fi Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Shigella sonei, Helicobacter pylori; bacteriile anaerobe, cum ar fi Bacteroides fragilis, Fusobacterium ulcerans, Veillonella alcadescens, Gardnerella vaginalis, dermatofite ale fungilor din drojdie, cum ar fi Trichophyton mentographytes, Microsporum audovini, Epidermophyton flocosum și Candida albicans.

Prin utilizarea compusului cu formula I:

în care unul dintre substituenții R_1t R₂, R₃, R₄ și R₅ reprezintă OH, iar ceilalți substituenți reprezintă H, de preferință un compus A, chiar într-o cantitate foarte mică, există posibilitatea de a mări eficiența compușilor cu formula I, în special a compusului PH 5776, sau a compusului B.

Testele 2 și 3

Pentru a arăta eficiența compoziției, s-au testat două grupe a câte 5 șoareci (cu vârsta de 4-8 săptămâni; 18-20 g greutate fiecare), ambele grupe fiind infectate cu Cryptosporidium parvum.

Șoarecii infectați au suferit de diaree cronică.

înainte de tratament s-a determinat cu ușurință, prin analiza fecalelor, care dintre șoareci suferă de diaree cronică.

Tratamentul se efectuează cu compoziția D1 de nitazoxanidă descrisă anterior. Șoarecilor suferinzi de diaree cronică li s-a administrat pe cale orală, în fiecare zi, timp de o săptămână, aprox. 0,01 g de nitazoxanidă (adică aprox. 0,6 g/kg șoarece).

RO 118293 Β1

340

După o săptămână de tratament, nu a mai fost posibil să se determine, prin analiza fecalelor, ce grupă de șoareci a suferit inițial de diaree.

Șoarecii infectați au fost, de asemenea, tratați cu compoziția D2. Respectivilor șoareci li s-au administrat pe cale orală, în fiecare zi, timp de o săptămână, câte aprox. 0,0096 g nitazoxanidă și aprox. 0,0004 g compus A.

înainte de sfârșitul unei săptămâni de tratament, nu a mai fost posibil să se determine, prin analiza fecalelor, ce grup a suferit inițial de diaree.

Testele 4 și 5

S-au preparat compoziții apoase (100 g) conținând 10 g de agent activ.

Compoziția conține nitazoxanidă sau un amestec de nitazoxanidă (9.6 g) și compus A ca agent activ; compoziția mai conține și 0,5 g distearat de zaharoză.

Compozițiile se utilizează pentru tratarea diferiților paraziți, viermi, bacterii și fungi. Compozițiile se utilizează pentru tratamentul împotriva diferiților paraziți, helminți, bacterii și fungi.

în tabelul următor este prezentată activitatea compoziției.

345

350

	Activitatea
P1	P2	P3	P4	P5
Protozoare Trichomonas vaginalis	+	+	Nu	Nu	+
Trichomonas intestinalis	+	+	Nu	Nu	+
Entamoeba histolytiGa	+	+	Nu	Nu	+
Entamoeba dispar	+	+	Nu	Nu	+
Entamoeba coli	+	+	Nu	Nu	+
Endolimax nana	+	+	Nu	Nu	+
Balatidium coli	+	+	Nu	Nu	+
Dientamoeba fragilis	+	+	Nu	Nu	+
Giardia lamblia	+		Nu	Nu	+
Isospora belii	+	+	+/-	Nu	Nu
Cryptosporidium parvum	+	+	Nu	Nu	Nu
Bladtocystis hominis	+	+	Nu	Nu	Nu
Enterocytozoon bieneusi	+	+	Nu	Nu	Nu
Septata intestinalis	+	+	Nu	Nu	Nu
Helminți Enterobius vermicularis	+	+	+	+	Nu
Ascaris lumbricoides	+	+	+	+	Nu
Necator americanus	+	+	+	+	Nu
Ancylostoma duodenale	+	+	+	+	Nu
Trichuris trichiura	+	+	+	+	Nu
Strongyloides stercoralis	+	+	Nu	Nu	Nu
Taenia saginata	+	+	Nu	Nu	Nu
Taenia solium	+	+	Nu	Nu	Nu
Hymenolepis nana	+	+	Nu	Nu	Nu

P1 = Nitazoxanidă + distearat de zaharoză

P2 = Nitazoxanidă + compus A + distearat de zaharoză P3 = Albendazol

P4 = Mebendazol

P5 = Metronidazol

355

360

365

370

375

380

385

RO 118293 Β1

	ACTIVITATEA
P1	P2	P3	P4	P5
Bacterii aerobe Staphylococcus aureus	+	+	Nu	Nu	Nu
Escherichia coli	+	+	Nu	Nu	Nu
Proteus vulgaris	+	+	Nu	Nu	Nu
Bacterii anaerobe Clostridium sp.	+	+	Nu	Nu	+
Bacteroides sp.	+	+	Nu	Nu	+
Peptococcus sp.	+	+	Nu	Nu	+
Peptostreptococcus sp.	+	+	Nu	Nu	+
Fusobacterium sp.	+	+	Nu	Nu	+
Fungi Candida albicans	+	+	Nu	Nu	Nu
Trichophyton mentagrophytes	+	+	+	Nu	Nu
Microsporum audovini	+	+	+	Nu	Nu
Epidermophyton flocosum	+	+	+	Nu	Nu

Ρ1 = Nitazoxanidă + distearatde zaharoză

P2 = Nitazoxanidă + compus A + distearat de zaharoză P3 = Albendazol

P4 = Mebendazol

P5 = Metronidazol

Testul 5

Procedurile generale de determinare a eficienței antivirale și a toxicității sunt prezentate în continuare.

Proceduri de laborator pentru determinarea eficacității antivirale și a toxicității

A. Prepararea celulelor fibroblastice de prepuț uman

S-au obținut cât mai repede posibil după circumcizie, prepuțuri umane de nou-născuți, care s-au plasat într-un mediu esențial minimal (MEM) conținând vancomicină, fungizonă, penicilină și gentamicină, la concentrații uzuale, timp de patru ore. S-a îndepărtat apoi mediul și prepuțurile s-au mărunțit în bucăți mici și s-au spălat în mod repetat până nu au mai fost prezente celule roșii. Țesutul a fost apoi tripsinizat cu tripsină 0,25%, cu agitare continuă timp de 15 min la 37°C, într-un incubator cu CO₂. La sfârșitul fiecărei perioade de 15 min, țesutul s-a lăsat să se sedimenteze pe fundul balonului. Supernatantul conținând celule s-a turnat prin tifon steril într-un balon care conține MEM și 10% ser de fetus bovin. Balonul care conține mediul se menține în gheață pe toată durata procesului de tripsinizare. De fiecare dată, la bucățile de prepuț se adăugă tripsină proaspătă, și procedura se repetă până nu mai sunt celule accesibile. Mediul care conține celule se centrifughează la 1000 RPM la 4°C timp de zece minute. Lichidul supernatant se descarcă, iar celulele se resuspendă într-o cantitate mică de MEM cu 10% SFB (ser de fetus bovin). Celulele se plasează într-un număr adecvat de baloane de 25 cm² pentru cultura celulelor. Pe măsură ce celulele devin confluente și necesită tripsinizare, se trec treptat în baloane mai mari. Celulele se păstrează pe vancomicină și fungizonă la pasajul patru.

RO 118293 Β1

435

Z

B. Testarea inhibării efectului citopatic - HSV, HCMV, VZV

După un număr mic de pasaje, celulele fibroblaste de prepuț uman se însămânțează pe plăci de cultură cu 96 godeuri, cu 24 h înainte de utilizare, la o concentrație a celulelor de 2,5 x 10⁴ celule per ml în 0,1 ml mediu esențial minimal (MEM) suplimentat cu ser de fetus bovin 10% (SFB). Celulele se incubează apoi timp de 24 h la 37°C, într-un incubator cu CO₂. După incubare, se îndepărtează mediul și se adaugă 100 μΙ de MEM conținând 2% SFB, cu excepția primului șir. în primul șir se adaugă câte 125 μΙ de medicament experimental în godeuri în triplicat. Se adaugă numai mediu atât la godeurile cu celule, cât și la cele de control al virusului. Medicamentul din primul șir de godeuri se diluează apoi în serie 1:5, în restul godeurilor cu câte 25 μΙ, utilizând Cetus Liquid Handling Machine. După diluarea medicamentului, se adaugă câte 100 μΙ virus de concentrație adecvată la fiecare godeu, cu excepția celor de control, la care se adaugă 100 μΙ de MEM. Pentru probele HSV-1 și HSV-2, concentrația virusului utilizat poate fi 1000 PFU per godeu. Pentru probele CMZ și VZV, concentrația virusului per godeu poate fi 2500 PFU. Plăcile se incubează apoi la 37°C într-un incubator cu CO₂, timp de 3 zile pentru HSV-2 și 10 zile pentru VZV, sau 14 zile pentru CMV. După perioada de incubare, se aspiră mediul, iar celulele se colorează cu soluție de cristal violet 0,1%, timp de 30 min. Colorantul se îndepărtează, iar plăcile se spală cu apă curentă până la îndepărtarea completă a excesului de colorant. Plăcile se lasă să se usuce 24 h și apoi se citesc pe un Skatron Plate Reader la 620 nm.

C. Testul de reducere a plăcii pentru HSV-1 și HSV-2 utilizând acoperirea semi-solidă

Cu două zile înainte de utilizare, celulele FPU (fibroblaști de prepuț uman) sunt plasate pe plăci cu 6 godeuri și se incubează la 37°C cu 5% CO₂ și 90% umiditate. în ziua probei, medicamentul se folosește la o concentrație dublă față de cea dorită în 2 x MEM și apoi se diluează 1:5 în 2 x MEM folosind 6 concentrații de medicament. Concentrația inițială este în mod uzual de 200 pg/ml până la 0,06 pg/ml. Virusul care urmează a fi utilizat se diluează cu MEM conținând 10% FBS până la concentrația dorită, care conduce la 20-30 plăci per godeu. Mediul este apoi aspirat din godeuri, și la fiecare godeu se adaugă câte 0,2 ml virus în duplicat și câte 0,2 ml mediu la godeurile de toxicitate a medicamentului. Plăcile se incubează o oră cu agitare la fiecare 15 min. După incubare, se adaugă o cantitate egală de agaroză 1%, în volume egale la fiecare diluare a medicamentului. Se obțin concentrații ale medicamentului începând cu 100 pg/ml și terminând cu 0,03 pg/ml, și o concentrație finală a stratului de agaroză de 0,5%. Amestecul de medicament agaroză se aplică în fiecare godeu într-un volum de 2 ml, și plăcile se incubează timp de 3 zile, după care se colorează cu soluție 1,5% roșu neutru. La sfârșitul celor 4-6 h de incubare, colorantul se aspiră, iar plăcile se numără utilizând un stereomicroscop cu o mărire de 10x.

ECgo (concentrație cu eficiență 50%) este concentrația necesară pentru a inhiba cu 50% citopatogenia virală.

ICjo (concentrația de inhibare 50%) este concentrația necesară pentru a inhiba proliferarea celulelor cu 50%.

Indicele de selectivitate (I.S.) = IC₅₀/EC₅₀.

D. Testul de reducere a plăcilor VZV folosind acoperirea semisolidă

Procedura este practic aceeași ca pentru testarea plăcilor HSV descrisă mai sus, cu două excepții:

1. După adăugarea medicamentului, plăcile sunt incubate 10 zile.

2. în zilele a 3-a și a 6-a se adaugă un strat suplimentar de acoperire, de 1 ml, cu conținut egal de 2 x MEM și agaroză 1%.

440

445

450

455

460

465

470

475

RO 118293 Β1

E. Testarea plăcilor CMV - acoperire semisolidă

Procedura este aproape aceeași cu cea pentru testarea HSV, cu câteva diferențe minore. Agaroza utilizată atât pentru stratul de acoperire inițial, cât și pentru celelalte două straturi de acoperire, are o concentrație de 0,8% în loc de 1%. Proba se incubează 14 zile, iar stratul de acoperire suplimentar se aplică în zilele a 4-a și a 8-a.

F. Testarea reducerii plăcilor folosind strat de acoperire din mediu lichid Procedura pentru testarea plăcilor cu strat de acoperire lichid este similară cu cea care folosește strat de acoperire de agaroză. Procedura de adăugare a virusului este similară cu cea pentru evaluarea obișnuită a plăcilor. Concentrația de medicament este obținută în MEM cu 2% SFB, dar nu la concentrații de 2 x ca în evaluările precedente, ci la concentrația dorită. Pentru testele HSV-1 și HSV-2, un preparat anticorp obținut de la Baxter Health Care Corporation se diluează la 1:500 și se adaugă la mediul de diluție al medicamentului. Pentru CMV și VZV nu se utilizează anticorp în stratul de acoperire. Pentru testarea CMV se adaugă mediu fără medicament nou în ziua a 5-a și se lasă la incubare în total 10 zile. Pentru VZV se adaugă mediu suplimentar în ziua a 5-a și se incubează în total 10 zile. La sfârșitul perioadei de incubare, pentru toate testările, se adaugă la fiecare godeu 2 ml, cu diluție 1:10, soluție stoc neutră, și se incubează 6 h. Se aspiră lichidul, și plăcile se numără la un stereomicroscop.

G. Teste de căutare și confirmare pentru EBV

1. Virus

Există două prototipuri de EBV infecțios. Unul este exemplificat de virusul derivat din fluidele supernatante ale liniei de celule P3HR-1. Această linie de celule produce virusuri netransformabile, care determină producerea unui antigen inițial (EA), după o infecție primară sau o suprainfecție a liniei de celule B. Un alt prototip este exemplificat prin virusul B-95-8. Acest virus fixează limfocitele din sângele de la nivelul cordului și induce tumori la maimuțe. El nu induce totuși o infecție prematură abundentă în liniile de celule care conțin copii ale genomului EBV. Virusul utilizat în test este P3HR-1.

2. Linii de celule

Ramos este o linie de celule B excepțională, derivată din limfomul lui Burkitt, dar care nu conține copii detectabile ale genomului EBV, și este EBNA negativ. Ramos/AW se obține prin infectarea in vitro a celulelor Ramos cu virusul P3HR-1 și conține o copie a genomului EBV/celulă. Raji este o linie de celule a limfomului lui Burkitt conținând 60 genomi EBV /celulă și este celula primară utilizată pentru screening-ul activității antivirale împotriva expresiei EBV EA. Celulele Daudi reprezintă un producător de nivel scăzut, conținând 152 copii ale genomului EBV/celulă. Aceste celule exprimă în mod spontan EBV EA în cazul a 0,25...0,5% din celule. Se folosește în următoarele studii, pentru confirmarea activității. Aceste linii de celule răspund la suprainfecția cu EBV, prin expresia EA (D), EA (R) și VCA. Toate liniile de celule se mențin în mediu de RPMI-1640 suplimentat cu 10% SFB, L-glutamină și 100 pg/ml gentamicină. Culturile se alimentează de două ori pe săptămână, iar concentrația celulelor se ajustează la 3 x 10⁵/ml. Celulele se mențin la 37°C într-o atmosferă umectată cu 5% CO₂.

3. Testarea imunofluorescenței cu anticorpi monoclonali

Celulele se infectează cu tulpina P3HR-1 de EBV, iar medicamentele care urmează să fie testate se adaugă după absorbția (45 min la 37°C) și spălarea culturilor celulare. Culturile se incubează timp de două zile în mediu complet, pentru a permite expresia genei virale. După 48 h de incubare, numărul celulelor din fiecare probă se numără și se fac frotiuri. Anticorpii monoclonali cu specificitate pentru diferitele componente EA și VCA se adaugă apoi la celulele incubate și spălate. Apoi se adaugă un anticorp de iepure, anti-lg de șoarece, conjugat cu fluoresceină, și se numără celulele cu fluorescență pozitivă din frotiuri. Celulele din culturile pozitive pentru EA sau VCA sunt apoi calculate și comparate.

RO 118293 Β1

H. Testarea proliferării celulare - Toxicitate

Cu 24 h înainte de testare, celulele HFF se însămânțează pe plăci cu 6 godeuri la o concentrație de 2,5 x 10⁴ celule per godeu în MEM conținând 10% SFB. în ziua testării, medicamentele se diluează treptat în MEM conținând 10% SFB cu incremente de 1:5 acoperind un interval între 100 pg/ml până la 0,03 pg/ml. Pentru medicamentele care se dizolvă în DMSO, godeurile de control primesc MEM conținând 10% DMSO. Mediul din godeuri se aspiră apoi și se adaugă câte 2 ml din fiecare concentrație de medicament în fiecare godeu. Celulele se incubează apoi într-un incubator cu CO₂ la 37°C timp de 72 h. La sfârșitul acestei perioade, soluția mediu-medicament este îndepărtată, iar celulele se spală. Se adaugă 1 ml de tripsină 0,25% în fiecare godeu și se incubează până când celulele încep să iasă din placă. Amestecul celule-mediu se pipetează apoi viguros, în sus și în jos, pentru a sparge suspensia de celule, și apoi 0,2 ml de amestec se adaugă la 9,8 ml de Isoton III și se numără, utilizând un numărător Coulter. Fiecare probă se numără de trei ori cu trei copii ale godeurilor per probă.

/. Testarea MTT pentru citotoxicitatea celulelor

Cu 24 h înainte de testare, celulele HFF se incubează pe plăcuțe cu 96 de godeuri la o concentrație de 2,5 x 10⁴ celule per godeu. După 24 h mediul este aspirat și se adaugă 125 μΙ medicament la primul șir de godeuri și apoi se diluează treptat 1:5,utilizând un sistem automat Cetus Liquid Handling System într-un mod similar cu cel utilizat la testarea CPE. Plăcile se incubează într-un incubator cu CO₂ la 37°C,timp de șapte zile. în acest moment, în fiecare godeu se adaugă 50 μΙ de soluție 1 μg/ml de MTT în fosfatul bazic al lui Dulbecco tamponat. Plăcile se incubează apoi încă 4 h în acest moment, mediul se îndepărtează și se înlocuiește cu 100 μΙ de acid clorhidric 0,04 N în izpropanol. La scurt timp, plăcile se citesc apoi pe un dispozitiv de citire a plăcilor,la 550 nm.

J. Testarea consumului de roșu neutru - Toxicitate

Procedura de depunere a plăcilor și de adăugare a medicamentului este aceeași cu cea pentru testarea MTT.

După adăugarea medicamentului, plăcile se incubează timp de 7 zile într-un incubator cu CO₂, la 37°C. Apoi mediul/medicament se aspiră și se adaugă 200 μΙ/godeu de roșu neutru 0,01% în DPBS. Acesta se incubează într-un incubator cu CO₂ timp de o oră. Vopseaua se aspiră, iar celulele se spală folosind un Nune Plate Washer. După îndepărtarea DPBS, se adaugă 200 pg/godeu de EtOH (etanol) 50% /1% acid acetic glacial (în H₂O). Plăcile se rotesc 15 min și se citesc densitățile optice la 550 nm, cu un dispozitiv de citire a plăcilor.

Testul 5a: Activitatea antivirală față de replicarea HBV în culturi (hepatită B)

Protocolul de testare a compușilor anti-HBV în culturi de celule 2.2.15 poate fi rezumat pe scurt, după cum urmează (Korba și Milman, Antiviral Res., 1991,217, 217):

- se însămânțează celule hepatice umane, producătoare în mod cronic de HBV - producător de celule hepatice umane (Acs.et.al., PNAS, 1987, 84, 4641) - pe plăci de cultură a țesutului cu 24 de godeuri, și se lasă să crească până la confluență;

- compușii testați se adaugă zilnic timp de 9 zile. Mediul de cultură (schimbat zilnic pe perioada tratamentului) este colectat și depozitat pentru analiza ADN-ului HBV extracelular (după 0, 3, 6 și 9 zile de tratament);

- după ziua a 9-a de tratament, celulele sunt lizate 24 h, pentru analiza formelor genomice de HBV intracelular;

- ADN-ul HBV este apoi analizat la toate nivelele, din punct de vedere cantitativ și calitativ (atât ADN-ul extracelular, cât și intracelular) și viteza relativă de replicare a HBV (ADN intracelular).

530

535

540

545

550

555

560

565

570

575

RO 118293 Β1

Protocolul pentru determinarea toxicității compușilor în culturile de celule 2.2.15 poate fi rezumat după cum urmează (Korba și Gerin, trimis spre publicare):

- celulele 2.2.15 se lasă să crească până la confluență pe plăci de cultură a țesutului, cu fund plat cu 96 de godeuri și tratate cu compuși (în 0,2 ml mediu de cultură/ godeu) în modul descris anterior. S-au testat 4 concentrații pentru fiecare compus, fiecare în culturi triple, în 3 până la 10-etape;

- culturile de control netratate s-au menținut pe fiecare placă cu 96 de godeuri. Pe fiecare placă cu 96 de godeuri, godeurile fără celule se folosesc pentru corecția difuziei luminii;

- toxicitatea se determină prin inhibarea absorbției colorantului roșu neutru, determinând absorbanța la 510 nm raportată la absorbanța celulelor netratate (Finter et.al., J.Med.Chem., 1969, 5, 419), la 24 h după cea de-a 9-a zi de tratament.

Activitatea antivirală a compului A se compară cu cea a zalcitabinei.

S-a găsit că atunci când se utilizează compusul A, concentrația efectivă (EC₅₀) este

1,8 ± 0,1 pg/ml pentru a obține o inhibare de 50% a citopatogenicității virale, în timp ce concentrația citotoxică (pentru a obține o inhibare de 50% a proliferării celulare) este peste 1000 pg/ml. Indicele de selectivitate pentru compusul A este astfel egal cu >1000/1,8, adică, un indice peste 500.

Pentru zalcitabină, testele indică următoarele rezultate:

EC^: 1,8 ±0,1 pg/ml

CC₅₀: 261 ± 24 pg/ml adică un indice de selectivitate SI de 261/1,8, adică aproximativ 145.

După cum se observă, compusul A este mai puțin toxic decât zalcitabina și se poate realiza un tratament adecvat împotriva replicării HBV.

Testul 5b: Activitatea antivirală față de VZV

Pentru determinarea activității față de virusul Varicella Zoster (o tulpină standard de laborator), se utilizează, de asemenea, un amestec de nitazoxanidă (96%) și compus A (4%).

Pentru respectivul amestec împotriva virusului Varicella Zoster: o valoare de 4 pg/ml pentru EC₅₀ și 34 pg/ml pentru CC₅₀, adică, un indice SI de aproximativ 8,5.

Având în vedere toxicitatea redusă și eficiența amestecului, acesta este adecvat pentru tratamentul împotriva virusului Varicella Zoster, cunoscut ca rezistent la aciclovir.

Compui A și compoziția conform invenției se pot administra oral, de exemplu sub formă de tablete.

Compozițiile prezentei invenții, în special cele care conțin PH 5776 și/sau un alt agent antiviral, sunt compoziții cu spectru larg de acțiune asupra virușilor herpetici, cum ar fi:

Virus HERPES SIMPLEX TIP 1 (HSV-1, HSV-1 rezistent la aciclovir);

Virus HERPES SIMPLEX TIP 2 (HSV-2, HSV-2 rezistent la aciclovir);

Virus CITOMEGALIC UMAN (HCMV, HCMV rezistent la aciclovir);

Virus VARICELLA ZOSTER (VZV, VZV rezistent la aciclovir);

Virus EPSTEIN BARR (EBV);

Virus CITOMEGALIC AL ROZăTOARELOR (MCMV).

Compoziția poate să conțină excipienți uzuali pentru prepararea formelor pentru administrare orală.

Compoziția conține în mod avantajos un agent de umectare și eventual un derivat de amidon.

Claims

Revendicări

625

1. Derivat de benzamidă cu formula generală:

630 caracterizat prin aceea că R, reprezintă OH, iar restul substituenților Rg la Rg reprezintă H.
2. Compoziție farmaceutică, caracterizată prin aceea că aceasta conține o cantitate 635 eficientă din punct de vedere farmaceutic de agent activ, constituit dintr-un amestec de derivat de benzamidă, A, cu formula:

640 în care R₁ = OH, iar R₂=R₃ = R₄= R₅ = H, și un derivat de benzamidă, B, cu formula: 645

H în care conținutul, în greutate, de compus A, raportat la greutatea amestecului de compuși A și B, este cuprins între 0,5 și 20%, și, opțional, un agent de umectare și un derivat de amidon. 655
3. Compoziție farmaceutică, conform revendicării 2, caracterizată prin aceea că se administrează oral respectiva compoziție, conținând până la 20% în greutate agent de umectare, raportat la greutatea agenților activi.
4. Compoziție farmaceutică, conform revendicării 3, caracterizată prin aceea că agentul de umectare este ales din grupa formată din agenți de suprafață anionici. 660
5. Compoziție farmaceutică, conform revendicării 3, caracterizată prin aceea că agentul de umectare este ales din grupa formată din esteri zaharați, polioxietilenă, polioxipropilenă, derivați de anhidrohexitol, amide de alcanoli grași, oxizi de amine alifatice, zaharoză, manitol, sorbitol, lecitine, polivinilpirolidone, esteri ai acizilor grași, gliceride ale zaharo- zei, esteri ai xilozei, polioxietilen gliceride, esteri ai acizilor grași și polioxietilen eter al alcoo- 665 Iilor grași și esteri ai sorbitanului cu acizi grași polioxietilenici, esteri polioxietilenici ai acizilor grași ai sorbitanului, esteri de glicerid-poliglicide ai alcool poliglicidelor și amestecuri ale acestora.
6. Compoziție farmaceutică, conform oricăreia din revendicările 2...5, caracterizată prin aceea că aceasta conține până la 20% în greutate, un derivat de amidon, raportat la 670 greutatea agenților activi.

RO 118293 Β1
7. Compoziție farmaceutică conform revendicării 6, caracterizată prin aceea că aceasta conține, ca derivat de amidon, carboximetil amidon sau o sare a acestuia.
8. Formulare galenică pentru administrare orală, caracterizată prin aceea că respectiva formulare galenică conține un miez format dintr-o compoziție care conține:

* o cantitate eficientă de compus A cu formula generală:

în care R, reprezintă OH, iar restul substituenților R₂ la R_s reprezintă H, amestecată cu un compus B cu formula:

* până la 20% în greutate dintr-un agent de umectare, raportat la greutatea agenților activi, * până la 20% în greutate dintr-un derivat de amidon, raportat la greutatea agenților activi, conținutul de apă al respectivei compoziții fiind mai mic de 25% în greutate.
9. Formulare conform revendicării 8, caracterizată prin aceea că aceasta conține carboximetil amidon, sau o sare a acestuia, ca derivat de amidon.
10. Alifie pentru tratamentul afecțiunilor abdomenului inferior, caracterizată prin aceea că aceasta conține:

* o cantitate eficientă de compus A cu formula generală: în care R, reprezintă OH, iar restul substituenților R₂ la R_s reprezintă H, în amestec cu un compus B cu formula:

în care conținutul în greutate de agent activ A, raportat la greutatea amestecului de compuși A și B este cuprins între 0,5 și 20%

Și * până la 20% în greutate dintr-un agent de umectare, raportat la greutatea agenților activi.

RO 118293 Β1

725
11. Alifie conform revendicării 10, caracterizată prin aceea că aceasta conține până la 20% în greutate dintr-un derivat de amidon, raportat la greutatea agenților activi.
12. Derivat de benzamidă, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că este utilizat ca agent antiparazitar.
13. Compoziție farmaceutică, conform oricăreia din revendicările 2... 8, caracterizată prin aceea că este utilizată ca agent antiparazitar.
14. Derivat de benzamidă, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că este utilizat ca agent antibacterian.