BG61594B1 - антивирусно средство - Google Patents

Abstract

Средството намира приложение, по-специално за профилактика и лечение на заболявания, причинени от ентеровируси. То е на основата на установена, неизвестна досега, много добра антивирусна активност с висок индекс на избирателност на познати алкалоиди, изолирани от растението Glaucium flavum Crantz, които могат да се получават синтетично като производни на главния алкалоид на растението глауцин.

Description

Област на техниката

Изобретението се отнася до областта на производството и приложението на антивирусни средства, по-специално предназначени за профилактика и лечение на заболявания, причинявани от ентеровируси.

Предшестващо състояние на техниката

Ролята на ентеровирусите като етиологични причинители на тежки заболявания на сърцето (дилатационна миокардиопатия), черния дроб хепатит А, очите увеит, хеморагичен кератоконюктивит и панкреаса инсулинозависим захарен диабет, както и отдавна известните остри инфекции на централната нервна система енцефалит, серозен менингит обуславя големия интерес към антивирусната химиотерапия на ентеровирусните инфекции.

Известни са редица вещества с антивирусно действие срещу ентеровируси, например гуанидин хидрохлорид, 2-(а -хидроксибензил)бензимидазол (НВВ), роданин, енвироксим, дизоксарил и др. (1 - 5).

Известните средства имат умерени стойности на избирателност, сравнително тесен антивирусен спектър, което създава непреодолими проблеми и неудобства при използването на химиотерапевтици при ентеровирусните инфекции поради големия брой на патогенните за човека ентеровируси, като всеки от тях може да причини различни клинични синдроми, бързо развитие на резистентност.

Това обяснява липсата на регистрирани за клинично приложение химиотерапевтици с противоентеровирусно действие и непрекъснатото търсене на нови средства.

Техническа същност на изобретението

Задача на изобретението е антивирусно средство, което съдържа като активна съставка вещества с обща формула в’

в която R¹ е нисш алкил и R² означава Н, ОН и връзката Х-У е проста или двойна при цикъл В, означаващ

или X - У е -С-С=О при цикъл В, означаващ о

Предложените като антивирусно средство вещества съгласно изобретението имат висока степен на избирателност, много добър антивирусен ефект и ниска токсичност.

Предложените вещества са известни алкалоиди, изолирани от растението Claucium flavum Crantz или синтетично получени от главния алкалоид на растението - глауцин (Б - 9), като са изследвани фармакологичните им свойства (10). Глауцинът представлява главна съставна част на редица препарати с антитусивно действие. Досега не е установена антивирусна активност.

Активността на предлаганото антивирусно средство се установява при изпитване чрез следните методи: а) агар-дифузионен плако-инхибиращ тест (11); б) плако-инхибиращтест на Herrmann-Siminoff (12, 13); в) многоциклов тест с инхибиране на цитопатичния ефект (ЦПЕ инхибиращ тест); г) постановка на едностьпен вирусен размножителен цикъл. Допълнително се изследва цитотоксичността на антивирусното средство съгласно изобретението.

При постановката на агар-дифузионния плако-инхибиращ тест монослойни култури от клетъчна линия FL в 90 mm петри се инокулират с вирусна доза, даваща полуконфлуиращи плаки след инкубация на 37°С в продължение на 48 h. Изпитваното антивирусно вещество в 0,5 %-ен разтвор в етанол се накапва в 6 ппп стъклено цилиндърче, фиксирано в агаровото покритие. Антивирусният ефект се отчита в зависимост от размера на диаметъра в mm на зоната на плаковата инхибиция (0_t) и на зоната на цитотоксичността (0_t).

Количественото изследване на възможния цитотоксичен ефект се осъществява чрез определяне на растежната крива на неинфектирани клетки FL в присъствие на различни концентрации на съединението. Намира се концентрацията, която инхибира растежа на 50 % от клетките (CGIC ) в сравнение с контро.тата (без вещество в растежната среда). Ефектът на съединението, включено в поддържаща среда в различни концентрации, върху монослойни култури на клетъчна линия FL в стационарна фаза се определя чрез ежедневно визуално проследяване на състоянието на клетъчния монослой и на морфологията на клетките. Определя се максимално поносимата концентрация (МТС), при която не се установяват морфологични промени.

При плако-редукционния тест монослойни култури от клетъчна линия FL в сцинтилационни флакони от 20 ml се инокулират с 50 60 плако-образуващи единици (ПОЕ) от използвания вирус. Изпитваното антивирусно вещество се включва в агаровото покритие в различни (намаляващи 0,5 lg) концентрации. Инокулираните култури се инкубират при 37°С в продължение на 48 h. След това се отчита броят на плаките и се изчислява процентът на инхибиране чрез сравняване с контролата (без вещество в агаровия слой).

При метода на ЦПЕ инхибиране се използват монослойни култури FL в 96-ямкови микроплаки. След вирусната инокулация (1 1000 CGID_J0 в последователни десеткратни падащи разреждания) тестваното вещество се прилага в поддържащата среда в различни (намаляващи 0,5 lg) концентрации. Инокулираните култури се инкубират в продължение на 4 дни при 37°С като вирусният ЦПЕ се отчита ежедневно. Определят се стойностите на минималната концентрация, инхибираща 50 % от величината на ЦПЕ (МИК₅₀) чрез сравняване с нетретираната контрола.

При постановката на едностъпен вирусен размножителен цикъл монослойни култури на клетъчна линия FL в 20-ml сцинтилационни флакони се заразяват с използвания вирус при множественост на инфекцията > 90. След 60 min адсорбция на 4®С се добавя поддържащата среда, в която в подходящи концентрации е разтворено изпитваното съединение. Инфекциозният вирусен добив се отчита в ПОЕ/ml в различни интервали от време след вирусната инокулация (8-ми час най-късно) или единствено в края на едностъпния цикъл (8-ми час).

Пример 1. Антивирусната активност на глауцинон спрямо ентеровируси се илюстрира чрез следните данни на модел на полиомиелитен вирус тип 1, щам Mahoney в клетки

FL:

В постановка на агар-дифузионен тест резултатите демонстрират отчетлив ефект и са както следва: 0₁ = 43,5 mm, 0₍ = 14,0 mm, Δ 0 5 = 29,5 mm.

Чрез прецизните цитотоксични изследвания се установява, че CGIC_J0 = 73,5 mg/ml и МТС = 32 - 64 mg/ml.

При плако-инхибиращия тест в постанов10 ка доза-отговор се установява, че концентрацията, инхибираща 50 % плаковия брой (IC_j0) е 0,041 mg/ml. Установява се изключително високата антивирусна активност с индекс на избирателност (SI = МТС/1С₅₀), достигащ 1792,3. 15 При метода на ЦПЕ инхибиране се установява, че МИК₅₀ на тестваното съединение е 0,188 mg/ml с индекс на избирателност

390,1 (SI = CGIC_J0/MIC_J0).

Изследванията в постановка на едность20 пен вирусен размножителен цикъл показват, че концентрацията, инхибираща 99 % от броя на плаките (1С₉₉) е малко под 1 mg/ml. Отчетлива активност (над 80 % инхибиция) се намира и при концентрация 0,3 mg/ml. Данните са пред25 ставени на фиг. 1. Резултатите, получени при добавяне на веществото в различни етапи от едностъпния вирусен размножителен цикъл показват силна чувствителност на вирусната репликация през латентния период и спад в добива 30 на инфекциозни вирусни частици, дори когато съединението се добавя на 6-я час след инфекцията.

Антивирусната активност на 3-хидроглауцин спрямо ентеровируси на модел на по35 лиомиелитен вирус тип 1 щам Mahoney в клетки FL се илюстрира със следните данни: 0_; = 27,0 mm; 0_t = 14,5 mm; Δ0 = 12,5 mm.

Антивирусната активност на глауцин и дехидроглауцин в същата опитна постановка 40 се потвърждава чрез следните резултати съответно: 0; = 30,0 mm; 0₁ ⁼ 22,2 mm; Δ 0 = 7,8 mm и 0j = 23,5 mm; 0_t = 14,0 mm; Δ 0 = 9,5 mm.

Изследванията за цитотоксичност на дехидроглауцин показват, че максимално поно45 симата концентрация (МТС) е 10 - 32 mg/ml.

Claims (13)

1. Патентни претенции

   1. Антивирусно средство, характеризира-

   50 що се с това, че съдържа като активна съставка вещество с обща формула в която R’ е нисш алкил и R² означава Н, ОН и връзката X - У е проста или двойна Ιθ при цикъл В, означаващ или X - У е -С-С=О при цикъл В, озна чаващ

   Приложение: 1 фигура

   Литература

   1. Treanor, J. R., Dolin, рр. 369-397; J. F.

   Griffith, L. T.Ch’ian, pp. 399-432, in: G. J. Galasso 25 et al. (eds.) Antiviral Agents and Viral Diseases of Man, 2nd Edition, Raven Press, New York, 1984.
2. 2. Oxford, J. S., B. Oberg, Conquest of Viral Diseases, Elsevier, New York & Oxford, 1985.
3. 3. Came, P. E., L. A. Caliguiri (eds.), Handbook of Experimental Pharmacology, vol. 61, Springer-Verlag, Berlin & Heidelberg, 1982.
4. 4. Heinz, B. A., L. M. Vance, Journal of Virology, 69, 4189 - 4197, 1995.
5. 5. Zeichhardt, Η., M. J. Otto, M. A. McKinlay, P. Willingmann, K. O. Habermehl, Virology, 160, 281 - 195, 1987.
6. 6. BG 36 417.
7. 7. Mollov, N., S. Philipov, Chem. Ber. Ill, 554, 1988.
8. 8. Philipov, S., O. Petrov, N. Mollov, Arch. Pharm. (Wein-heim), 315, 498, 1982.
9. 9. Castedo, L., R. Suau, A. Mourino, Heterocycles, 3, 449, 1975.
10. 10. Rios, J. I., S. Simeon, Fitoterapia, 9, 387 - 412, 1989.
11. 11. Rada, B., J. Zavada, Neoplasma, 9, 57, 1962.
12. 12. Herrmann, Е. C., Poc. Soc. Exp. Biol. Med., 107, 142 - 145, 1961.
13. 13. Siminoff, P., Appl. Microbiol., 9, 66 72, 1961.