FI120258B - Bentsamidijohdannainen, mainittua johdannaista sisältävät koostumukset ja sen käyttö - Google Patents

Description

Bentsamidijohdannainen, mainittua johdannaista sisältävät koostumukset ja sen käyttö

Tiivistelmä keksinnöstä 5 Tämä keksintö koskee uutta yhdistettä, jolla on

kaava I

1 ?! I i s / v.' NQ~——^-NH-C—/ )— 5 ¥ί r5 jossa yksi symboleista Ri, R2, R3, R4 ja R5 esittää OH-ryhmää, kun taas jäljellä olevat symbolit esittävät H-ato-10 mia; mainittua yhdistettä sisältävää farmaseuttista koostumusta ja mainitun yhdisteen käyttöä loisia, bakteereja, sieniä ja viruksia tuhoavana aineena.

Aikaisempi tekniikka

Nitrotiatsoliyhdiste PH 5776 [2-(asetolyylioksi)-N-15 (5-nitro-2-tiatsolyyli)bentsamidi] on yhdiste, jolla on kaava I

r5 n, jossa Ri = O-COCH3; R2 = R3 = R4 = Rs = H.

20 Tämän yhdisteen (jäljempänä yhdiste B - kaava II) valmistus ja käyttötavat on julkaistu US-patentissa 3 950 351 sekä patentin hakijan tekemässä julkaisussa.

US-patentin 3 950 351 mukaisesti kaavan II mukainen yhdiste B valmistetaan saattamalla reagoimaan yhdiste 2 R1 R2

o J____I

Hal - C -(/^Y- H3 V=f I ' Hal = halldi R5 4 yhdisteen kanssa

-N

N02 -Vc J- m2

Tämä reaktio ei ole sopiva puhtaan yhdisteen val-5 mistamiseksi, jolla on kaava I

R, R 2 I IL °l A_ N0 2 ,NH"C-( ) R 3 R5 n, jossa yksi symboleista Ri, R2, R3, R4 ja R5 esittää OH-ryhmää, jäljellä olevien symboleiden esittäessä H-ato-mia.

10 Lisäksi, päinvastoin kuin mitä olisi voitu odottaa

aikaisemman tekniikan perusteella eli että asyylioksiryhmän läsnäolo olisi välttämätöntä yhdisteen muuttamiseksi aktiiviseksi ja tehokkaaksi bakteereja, loisia jne. vastaan, nyt on havaittu, että yhdisteellä, jolla on kaava I

3 «I ?2

-N O

I II 11 N02-. J-NH-C-(S XV-S3

5 M

r5 r< jossa yksi symboleista Ri, R2, R3, R4 ja R5 esittää OH-ryhmää, kun taas jäljellä olevat symbolit esittävät H-ato-mia; on erinomainen tehokkuus loisia, bakteereja ja sientä 5 vastaan, vaikka se ei sisällä asyylioksiryhmää. Mainitulla yhdisteellä I on oleellisesti välitön vaikutus loista, sientä ja bakteereja vastaan. On myös havaittu, että mainittu yhdiste on aktiivinen viruksia vastaan.

On myös havaittu, että mainittua yhdistettä I si-10 sältävä koostumus sisältää edullisesti myös kostutusaineen. Edullisimpia koostumuksia ovat koostumukset, jotka sisältävät kostutusaineen ja tärkkelysjohdannaisen.

Patentin hakijan suorittamat kokeet ovat myös osoittaneet, että käyttämällä samanaikaisesti keksinnön yhdis-15 tettä ja kostutusainetta, yhdisteen tehokkuus lisääntyy voimakkaasti ja että käyttämällä tällaista seosta on mahdollista hoitaa alavatsan sairauksia, kuten suolen sairauksia (ripulia), gastrointestinaalisia infektioita, enteerisiä infektioita, sukupuoliyhdynnässä tarttuvia infektioita, emät-20 timen infektioita ja virtsa- ja sukupuolielinten infektioita .

Siten keksintö koskee myös koostumusta alavatsan sairauksien hoitamiseksi, jolloin mainittu koostumus sisältää:

25 tehokkaan määrän aktiivista ainetta, jolla on kaava I

4 R ^ R 7 --N o I Γ r5 r4 ja kostutusaineen, jolloin mainittu koostumus sisältää edullisesti myös tärkkelysjohdannaisen.

5 Keksinnön lyhyt kuvaus Tämä keksintö koskee uutta yhdistettä C, jolla on

kaava I

Ri «2

--N o I I

I ,,μ Λ (/ — 3 _

NOg—\ ^--^ \__/ J

5 I i R= R4 jossa yksi symboleista Ri, R2, R3, R4ja R5 esittää 10 OH-ryhmää, kun taas jäljellä olevat symbolit esittävät H-atomia.

Edullisesti Ri = OH.

Tämä keksintö koskee myös farmaseuttista koostumusta, joka sisältää aktiivisena aineena kaavan I mukaisen yh-15 disteen, kuten edellä on kuvattu, edullisesti yhdisteen, jolla on kaava I, jossa Ri = OH (kaava III).

Erään suoritusmuodon mukaisesti koostumus sisältää aktiivisena aineena seoksen, joka koostuu yhdisteestä A, jolla on kaava 5

Rl ?2

_N 0 M

I I l! N0 l'^ ^JJ NH-C-(( m3 r5 jossa Rj = OH ja R2 = R3 = R4 = 1¾ = H, ja OCOCH3

-N 0 I H

N02-^ -NH-C-(/ V-H

H H

Tällaisessa koostumuksessa yhdistyvät oleellisesti välitön vaikutus loista, sientä, bakteereja tai virusta vastaan tai oleellisesti välitön suolisairauden hoito ja 5 jonkin verran hidastunut vaikutus tai hoito.

Siten tällainen koostumus on sopiva ihmisen sairauksien hoitamiseksi tai ihmisen sairauksien estämiseksi, kuten loisinfektioiden, bakteeri-infektioiden, sieni-infektioiden, ripulin tai muiden suolisairauksien, kuten viruk-10 sista johtuvien sairauksien, hoitamiseksi tai estämiseksi.

Mainitussa koostumuksessa kaavan III mukaisen

OH H

-—N 0 I I

I n // \\

NO,— NH-C-( y—H

H H

yhdisteen A painosisältö koskien kaavan III mukaisen 6

OH H

-N O I t I II IJJX·.

N°2--' -"

H H

yhdisteen Aja seuraavan kaavan mukaisen OCOCHj

-N 0 I H

Il 11 /Ti

N02—k J NH-C-(f y—H

5 rf

H H

yhdisteen B seoksen painoa on 0,5 - 20 %, edulli-5 sesti 0,5 - 10 %, edullisemmin 0,5 - 5 %.

Keksintö koskee myös keksinnön mukaisen yhdisteen, erityisesti keksinnön mukaisen koostumuksen, käyttöä loisia, bakteereja, sieniä ja viruksia tuhoavana aineena.

Koostumus voi sisältää muita aktiivisia aineita, 10 kuten matolääkettä ja viruksia tuhoavaa ainetta jne.

Koostumus voi myös sisältää kostutusaineen ja/tai tärkkelysjohdannaisen ja/tai täyteaineen.

Koostumus, edullisesti kiinteä koostumus, suun kautta otettavakasi alavatsan sairauksien tai infektioiden, edul-15 lisesti suolen ja emättimen sairauksien, hoitamiseksi sisältää tehokkaan määrän yhdistettä B, jolla on kaava ococh3

-—N O I H

I II 11 /hi

NOr ^ -NH-C-H

H H

7 kostutusaineen ja mahdollisesti, kuitenkin edullisesti, vähintään yhden tärkkelysjohdannaisen.

Jälkimmäinen koostumus voi sisältää myös muita aktiivisia aineita, esimerkiksi matolääkettä, kuten febante-5 lia, pratsikvantelia, levamisolia, albendatsolia, oksfendat-solia, moksidektiinia, ivermektiinia, milbemysiinejä jne.

Yhdisteen B valmistus ja käyttö on julkaistu US-patentissa 3 950 351 ja US-patentissa 4 315 018.

Kostutusaine, joka on läsnä koostumuksessa, joka 10 sisältää kaavan I mukaisen yhdisteen C (kuten yhdisteen A) ja/tai yhdisteen B, on edullisesti anioniaktiivinen pinta-aktiivinen aine ja edullisesti se on valittu ryhmästä, joka koostuu sokeriestereistä, polyoksieteenistä, polyoksipro-peenista, anhydroheksitolijohdannaisista, rasva-alkanoliami-15 deista, rasva-amiinioksideista, sakkaroosista, mannitolis- ta, sorbitolista, lesitiineistä, polyvinyylipyrrolidoneis-ta, rasvahappoestereistä, sakkaroosin glyserideistä, ksy-loosin estereistä, polyoksieteeniglyserideistä, rasvahappojen estereistä ja rasva-alkoholien polyoksieteenieetteristä 20 ja sorbitaanin polyoksieteenirasvahappoestereistä, sorbitaa- nin rasvahappojen polyoksieteeniestereistä, glyseridipoly-glysideistä, alkoholipolyglysidien estereistä ja edellä mainittujen seoksesta.

Erityisen sopivia kostutusaineita ovat sakkaroosi-25 distearaatti, PVP (polyvinyylipyrrolidoni), jne.

Keksinnön mukainen koostumus sisältää edullisesti tärkkelysjohdannaisen, erityisesti tärkkelyksen karboksijohdannaisen, kuten karboksimetyylitärkkelyksen, sen natriumjohdannaisen tai suolan.

30 Koostumus sisältää esimerkiksi enintään 20 paino-%, edullisesti 1-10 paino-%, pinta-aktiivista ainetta suhteessa aktiivisen aineen (aktiivisten aineiden) painoon ja enintään 20 paino-%, edullisesti 1-10 paino-%, tärkkelys-johdannaista suhteessa aktiivisen aineen (aktiivisten ai-35 neiden) painoon.

8

Keksintö koskee myös galeenista valmistetta otettavaksi suun kautta viruksia vastaan ja/tai alavatsan sairauksien, kuten suolen, emättimen tai virtsa- ja sukupuolielinten sairauksien tai häiriöiden, hoitamiseksi, jolloin 5 mainittu galeeninen valmiste käsittää ytimen, joka sisältää koostumuksen, joka sisältää: tehokkaan määrän yhdisteen C ja/tai yhdisteen A ja/tai yhdisteen B tehokasta ainetta; kostutusaineen ja mahdollisesti, kuitenkin edulli-10 sesti, tärkkelysjohdannaisen tai sen suolan, jolloin mainitun koostumuksen vesipitoisuus on alle 25 paino-% ja mainittu ydin on päällystetty edullisesti membraanilla. Tällainen membraani voi olla membraani, joka on liukenematon happamaan mahalaukun väliaineeseen, mutta 15 liukoinen suolessa.

Galeenisen valmisteen edulliset koostumukset, kos-tutusaineet jne. ovat aineita, jotka on julkaistu edellä keksinnön mukaisen koostumuksen yhteydessä.

Keksintö koskee vielä koostumuksen tai galeenisen 20 valmisteen käyttöä ripulin hoitamiseksi, maksaongelmien hoitamiseksi jne.

Keksintö koskee myös rasvaa tai geeliä, voidetta tai peräpuikkoja alavatsan elinten sairauksien, kuten emättimen tai virtsa- ja sukupuolielinten sairauksien tai häi-25 riöiden ja peräsuolen sairauksien, hoitamiseksi. Rasva, edullisesti geelin muodossa, sisältää kaavan I mukaisen yhdisteen ja/tai yhdisteen B, kostutusaineen sekä täyteaineen .

Kostutusaine on edullisesti yksi aineista, jotka on 30 lueteltu edellä koostumuksen ja/tai galeenisen valmisteen yhteydessä.

Lisäksi keksintö koskee bakteereja tuhoavaa koostumusta, joka sisältää kaavan I mukaisen yhdisteen C ja/tai yhdisteen B ja kostutusaineen. Tällainen koostumus on ak-35 tiivinen aerobisia sekä anaerobisia bakteereja vastaan, jolloin koostumuksella on hyvin laaja aktiivisuuskirjo.

9

Keksintö koskee näin ollen myös menetelmää bakteerien tuhoamiseksi tai bakteerien läsnäolon tai kasvun estämiseksi väliaineessa. Mainitussa menetelmässä bakteerit tai väliaine käsitellään keksinnön mukaisella bakterisidisellä 5 koostumuksella, esimerkiksi suihkuttamalla koostumusta bakteerien päälle, upottamalla alusta väliaineeseen jne.

Keksintö koskee myös menetelmää eläinten, erityisesti ihmisen, ripulitautien hoitamiseksi, jolloin menetelmässä koostumus, joka sisältää tehokkaan määrän yhdisteen C 10 ja/tai yhdisteen B aktiivista ainetta, kostutusaineen ja tärkkelysjohdannaisen, annetaan potilaalle suun kautta.

Keksintö koskee lisäksi ruokakoostumusta, kuten ruokapastaa tai jogurttia, joka sisältää säilöntäaineena tehokkaan määrän kaavan I mukaista yhdistettä C (edullises-15 ti yhdistettä A) ja/tai yhdistettä B; mahdollisesti, kuitenkin edullisesti, kostutusaineen ja mahdollisesti, kuitenkin edullisesti, yhdessä kostutusaineen kanssa tärkkelys j ohdannaisen.

Piirrosten kuvaus 2 0 Kuvio 1 on kaavan III mukaisen yhdisteen A UV- spektri.

OH H

I il " JA_

N O j—sL JJ NH-C-Γ X)—H

S ΐή

H H

Kuvio 2 on kaavan III mukaisen yhdisteen A IR-spektri ja 25 kuvio 3 on kaavan III mukaisen yhdisteen A HPLC- massaspektri.

10

Keksinnön kuvaus

Puhdasta yhdistettä, jolla on kaava I

R 1 R2

-N o [_J

no2——NH~C— R5 R, jossa yksi symboleista Ri, R2, R3, R4 ja R5 esittää 5 OH-ryhmää, kun taas jäljellä olevat symbolit esittävät

H-atomia, voidaan valmistaa yhdisteistä, joilla on kaava I

R1 R2 i II J“\_ no2-4^ -NH-C—r n— R3 r4 jossa yksi symboleista Ri, R2, R3, R4 ja R5 on asyy-lioksiryhmä, kun taas jäljellä olevat symbolit esittävät 10 vetyä.

Mainittu yhdiste suspendoidaan suolahapon ja veden laimeaan seokseen. Sitten näin käsitelty yhdiste suodatetaan ja pestään vedellä. Pesty yhdiste kuivataan sitten mahdollisesti.

15 Valmistusesimerkki

Yhdisteen A valmistus

Seuraavassa annetaan spesifinen esimerkki valmistuksesta:

Suspendoitiin 2 g 2-(asetolyylioksi)-N-(5-nitro-2-20 tiatsolyyli) bentsamidi (eli PH 5776) - yhdiste B, joka on valmistettu US-patentissa 3 950 351 julkaistun menetelmän mukaisesti - 20 ml:aan 37-%:ista HCl-liuosta. Väliainetta pidettiin 50 °C:n lämpötilassa 24 tunnin ajan ja sitä sekoitettiin hitaasti.

11

Mainitun käsittelyn jälkeen väliaine suodatettiin siten, että saatiin kiinteitä hiukkasia. Mainittuja hiukkasia pestiin sitten vedellä, kunnes pH-arvo 7 saavutettiin, ja pestyt hiukkaset kuivattiin uunissa 50 °C:n lämpö-5 tilassa.

Tulokseksi saatu tuote näytti keltaisilta mikroki-teisiltä neulasilta, joiden sulamispiste oli 254 °C (sulamispiste mitattiin kapillaarimäärityksen mukaisesti Mettler FP -laitteella).

10 Rakenteen identifioiminen toteutettiin käyttämällä sadasosa-analyysiä, UV-spektriä (katso kuvio 1), IR-spektriä (katso kuvio 2) ja kaasukromatografia-massaspektriä (katso kuvio 3). Tämän identifioinnin tulokset ovat: CIO, H7, N3, 04, SI; 258 15 Laskettu: C 46,51 %, H 2,71 %, N 16,40 %, S 12,40 %

Havaittu: C 45,98 %, H 2,63 %, N 16,71 %, S

12,67 %.

Ämax = 350 nm (OD = 0, 605).

Koe 1 20 Koostumuksen O valmistus

Keksinnön mukainen koostumus valmistettiin sekoittamalla PH 5776 ja edellä valmistettu yhdiste, jolloin mainitun yhdisteen painosisältö koskien mainitun yhdisteen ja PH 5776 -yhdisteen painoa oli 4 %.

25 Koostumus AI

Sekoitettiin 100 g nitatsoksanidia (PH 5776) 100 ml:aan vettä yhdessä 10 g:n kanssa polyvinyylipyrroli-donia (kostutusaine) ja 5 g:n kanssa karboksimetyylitärkke-lystä. Seos kuivattiin tyhjössä.

30 Sitten mainittua yhdistettä voidaan käyttää rakei den, pussien, tablettien tai kapseleiden valmistamiseksi otettavaksi suuontelon kautta tai suun kautta.

Koostumukset Bl, Cl, Dl, El, Fl, G1

Valmistettiin koostumusta AI vastaavat koostumukset 35 paitsi, että käytettiin vain 5 g ja 2 g polyvinyylipyrroly-donia ja 2 g ja 1 g karboksimetyylitärkkelystä.

12

Seuraavassa taulukossa esitetään koostumuksen ni-tatsoksanidin "N", polyvinyylipyrrolidonin "PVP" ja karbok-simetyylitärkkelyksen "CS" pitoisuus (g).

Koostu- N PVP CS

mus (g) (g) (g) B1 100 5 5

Cl 100 2 2

Dl 100 5 2

El 100 5 1 F1 100 2 1 G1 100 5 0 5

Koostumukset Hl, II, J1

Koostumukset, jotka sisälsivät nitatsoksanidia sekä muuta aktiivista ainetta, valmistettiin valmistamalla vesipitoinen väliaine, joka sisälsi PVP:n ja karboksimetyyli-10 tärkkelyksen, ja lisäämällä mainittuun väliaineeseen nitatsoksanidia ja muuta aktiivista ainetta. Sitten väliaine kuivattiin siten, että vesipitoisuudeksi saatiin alle 5 %.

13

Koos- N PVC CS Muu aktiivi- Vesi- tumus g g g nen aine pitoi- g suus %

Hl 50 5 2 Praziquantel 2 50

Il 75 5 2 Praziquantel 1 50 J1 75 5 2 Praziquantel 2 50

Koostumukset A2 - J2

Valmistettiin koostumuksia AI - J1 vastaavat koostumukset .

5 Koostumukset A2 - J2 eroavat koostumuksista AI - J1 vain siinä, että ne sisältävät nitatsoksanidin (PH 5776 -yhdiste B) ja kaavan

OH H

i-N η ΛΛ

NO, -NH-C-y—H

H H

mukaisen yhdisteen A seoksen (pelkän nitatsoksani-10 din sijasta koostumuksissa AI - Jl).

Seuraavassa taulukossa annetaan yhdisteiden A ja B määrät, joita käytettiin koostumusten A2 - J2 valmistamiseksi .

Rl ?2 --N o ! I II II /lv .

HO,—NH-C-/'}--3 n

Rc R4 14

Koostumus Yhdiste A (g) Yhdiste B (g) A2 - G2 4 96 H2 2 48 12 3 72 J2 3 72

Galeenisten valmisteiden valmistus

Valmiste K1

Sekoitettiin 500 g nitatsoksanidia jauheena ja 10 g 5 polyvinyylipyrrolidonia, 20 g karboksimetyylitärkkelystä, 25 g maissitärkkelystä, 5 g magnesiumstearaattia ja 50 g vettä ja näin saadusta seoksesta muodostettiin sitten 560 mg:n rakeita (eli rakeita, jotka sisälsivät 500 mg aktiivista ainetta). Rakeet, joiden halkaisija oli noin 1 cm, 10 kuivattiin sitten noin 50 °C:n lämpötilassa.

Näin saadut mikrorakeet varustettiin sitten päällysteellä, joka saatiin suihkuttamalla kuumaa sokeriliuosta. Sokeripäällyste muodosti membraanin.

Valmiste K2 15 Jauheseos, joka sisälsi 480 g nitatsoksanidia (PH 5 776) ja 20 g yhdistettä A, ja 10 g polyvinyylipyrrolidonia, 20 g karboksimetyylitärkkelystä, 25 g maissitärkkelystä, 5 g magnesiumstearaattia ja 50 g vettä sekoitettiin ja näin saadusta seoksesta muodostettiin sitten 560 mg:n 20 rakeita (eli rakeita, jotka sisälsivät 500 mg aktiivista ainetta). Rakeet, joiden halkaisija oli noin 1 cm, kuivattiin sitten noin 50 °C:n lämpötilassa.

Näin saadut mikrorakeet varustettiin sitten päällysteellä, joka saatiin suihkuttamalla kuumaa sokeriliuos-25 ta. Sokeripäällyste muodosti membraanin.

On ilmeistä, että mikrorakeet voivat sisältää myös yhden tai useampia täyteaineita tai muita aktiivisia aineita, kuten mikrokiteistä selluloosaa (Avicel® FMC), metyyli-selluloosaa, etyyliselluloosaa, karboksimetyyliselluloosaa, 15 hydroksietyyliselluloosaa, hydroksipropyyliselluloosaa, tärkkelystä jne.

Samalla tavalla membraani voi myös sisältää: farmakologisen hyväksyttävän täyteaineen, kuten peh-5 mitteen, pigmentin, täyteaineen, kostutusaineen, voiteluai neen jne. tai edellä mainittujen seoksen ja kalvon muodostavan koostumuksen, joka sisältää aineen, joka on liukenematon mahahappoon, mutta liukenee suolessa (polymeerinen aine tai ei, esimerkiksi selluloosa-10 asetoftalaatti, polyvinyyliasetoftalaatti, hydroksipropyy- limetyyliselluloosa jne.).

Kokeet Kokeet 1

Vaiheen 1 aikana farmakokineettinen tutkimus toteu-15 tettiin 6 vapaaehtoisella henkilöllä, jotka saivat yhden 500 mg:n annoksen koostumusta O suun kautta. Verestä voitiin määrittää noin 3 pg/ml 2-(hydroksi)-N-(5-nitro-2-tiatsolyyli)bentsamidia suuren erotuskyvyn nestekromatogra-fian avulla. Tämä tuote erittyi myös muuttumattomana virt-20 saan ensimmäisten 24 tunnin aikana käsittelyn jälkeen. Verestä ja virtsasta ei havaittu jälkiä 2-(asetolyylioksi)-N-(5-nitro-2-tiatsolyyli)bentsamidista.

Vaiheen II aikana kliiniset tutkimukset, jotka toteutettiin yhteensä 80 potilaalla, käsittelyn jälkeen tois-25 tuvat ulostetutkimukset ja/tai emätinsivelyt paljastivat, että 500 mg koostumusta AI annettuna kahdesti päivässä 3-7 peräkkäisen päivän ajan, oli erittäin tehokas (60 - 95 %) mikro-organismeja Trichomonas vaginalis, Entamoeba histolytica, Gardia lamblia, Enterobius vermicularis, Ascaris lum-30 bricoides, Necator americanus, Ancylostoma duodenale, Trichuris trichiura, Strongyloides stercoralis, Taenia sa-ginata, Taenia solium, Diphylobottrium latum ja Hymenolepis nana vastaan. Siedettävyys oli hyvä ja vain vähän ylävatsan keskiosan kipuja, pahoinvointia, oksentamista ja ripulia 35 havaittiin noin 10 %:lla potilaista riippuen hoidon kestos- 16 ta. Verikemiaan ja hematologiaan, jotka toteutettiin ennen käsittelyä ja sen jälkeen, koostumus ei vaikuttanut.

In vitro -tutkimukset Trichomonas vaginalis -mikro-organismia vastaan osoittivat, että vaikka 2-(asetolyyli-5 oksi)-N-(5-nitro-2-tiatsolyyli)bentsamidin pienin estävä kon- sentraatio oli 0,5 - 1,25 pg/ml, 2-(hydroksi)-N-(5-nitro-2-tiatsolyyli)bentsamidi osoitti samoissa koeolosuhteissa arvoa 1 - 1,25 pg/ml. Tämä osoittaa, että 2-(hydroksi)-N-(5-nitro-2-tiatsolyyli)bentsamidin loisia tuhoava aktiivisuus 10 vastaa 2-(asetolyylioksi)-N-(5-nitro-2-tiatsolyyli)bentsami- din vastaavaa aktiivisuutta. Kuitenkin nämä tutkimukset osoittivat, että 2-(hydroksi)-N-(5-nitro-2-tiatsolyylil-lä) oli oleellisesti välitön vaikutus, mikä ei ole asianlaita 2-(asetolyylioksi)-N-(5-nitro-2-tiatsolyyli)bentsami-15 din tapauksessa.

Lopuksi in vitro -tutkimukset osoittivat, että koostumus oli tehokas gram-positiivisia ja gram-negatiivisia aerobisia bakteereja vastaan, esimerkkinä bakteerit Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Shigella sonei, Helico-20 bacter pylori, anaerobisia bakteereja vastaan, esimerkkinä bakteerit Bacteroides fragilis, Fusobacterium ulcerans, Veillonella alcadescens, Gardnerella vaginalis, hiivasienten dermatofyyttejä vastaan, esimerkkinä Trichopyton mento-graphytes, Microsporum audovini, Epidermophyton Flocosum ja 25 Candida albicans.

Käyttäen yhdistettä, jolla on kaava I

R1

-0 II

11 HO - J-N H - C-(/ Λ—R „ s W '

Rs «4 jossa yksi symboleista Ri, R2, R3, R4 ja R5 esittää OH-ryhmää, kun taas jäljellä olevat symbolit esittävät H-ato-30 mia, edullisesti yhdistettä A, jopa hyvin pientä määrää, 17 oli mahdollista lisätä kaavan I mukaisten yhdisteiden, erityisesti yhdisteen PH 5776 tai yhdisteen B tehokkuutta.

Kokeet 2 ja 3

Keksinnön mukaisen koostumuksen tehokkuuden osoit-5 tamiseksi tutkittiin kaksi hiiriryhmää, joissa kummassakin oli 5 hiirtä (iältään 4-8 viikkoa, paino 18 - 20 g), jolloin molempiin ryhmiin tartutettiin Cryptosporidium parvum.

Tartunnan saaneet hiiret kärsivät kroonisesta ripulista.

10 Ennen käsittelyä oli helppo määrittää kroonista ri pulia sairastavat hiiret ulosteanalyysin avulla.

Käsittely tapahtui käyttämällä edellä julkaistua nitatsoksanidin koostumusta Dl. Kroonista ripulia sairastavat hiiret saivat suun kautta letkulla yhden viikon aikana 15 joka päivä noin 0,01 g nitatsoksanidia (eli noin 0,6 g/kg).

Yhden viikon käsittelyn jälkeen ei ollut enää mahdollista määrittää ulosteanalyysin avulla, mikä hiirten ryhmä sairasti ensiksi ripulia.

Tartunnan saaneet hiiret käsiteltiin myös käyttä-20 mällä koostumusta D2. Mainitut hiiret saivat suun kautta letkulla yhden viikon aikana joka päivä noin 0,0096 g nitatsoksanidia ja noin 0,0004 g kaavan III mukaista yhdistettä A.

Ennen yhden viikon käsittelyn päättymistä ei enää 25 ollut mahdollista määrittää ulosteanalyysin avulla, mikä hiirten ryhmä sairasti ensiksi ripulia.

Kokeet 4 ja 5

Valmistettiin vesipitoiset koostumukset (100 g) , jotka sisälsivät 10 g aktiivista ainetta.

30 Kun kysymyksessä oli koostumus, joka sisälsi nitat soksanidia tai nitatsoksanidin (9,6 g) ja yhdisteen A seosta aktiivisena aineena, koostumus sisälsi lisäksi 0,5 g sakkaroosidistearaattia.

Koostumuksia käytettiin erilaisten loisten, mato-35 jen, bakteerien ja sienten käsittelemiseksi.

18

Koostumusten aktiivisuus on annettu seuraavassa taulukossa:

Aktiivisuus _ P1 | P2 P3 I P4__P5 I Alkueläimet Trichomonas vaginalis + + Ei Ei +

Trichomonas inces- emails 4* + Ei Ei

Entamoeba histolytica 4· + Ei Ei +

Encamoeba dispar + + Ei Ei +

Entamoeba coli + + Ei Ei +

Endolimax nana + + Ei Ei +

Balantidium coli + + Ei Ei +

Diencamoeba fragilis > + Ei Ei +

Giarda lamblia + + Ei Ei +

Isospara belli + + +/- Ei +

Cryptosporidium parvum + + Ei si Ei

Bladcocystis hominis + + el Ei Ei

Enterocytozoon Ei Ei bianeusi + + ei el ei

Septata intestinalis + + Ei Ei Ei

Loismadot

Enterobiua vermicularis + + + +

Ascaris lumbricoides + + + +

Necator americanus + + + +

Anycylosloma duodenal e ·** + + +

Trichuris trichiura + + + +

Strcngyloides stercoralis + + Ei Ei Ei

Taenia saginata + + Ei Ei ei

Taenia solium + + Ei Ei Ei

Hymenolepis nana + + Ei Ei Ei

Pl = nitatsoksanidi + sakkaroosidistearaatti 5 P2 = nitatsoksanidi + yhdiste A + sakkaroosidistearaatti P3 = albendatsoli P4 = mebendatsoli P5 = metronidatsoli.

19

Aktiivisuus PI I P2 F3 P4 P5 I Aerobiset bakteerit Staphylococcus aursus + + Ei Ei Ei

Escr.erichia coli ++ Ei Ei Ei

Prccens vulgaris ++ Ei Ei Ei

Anaerobiset bakteerit

Clcstridum species + + Ei Ei +

Bacteroides species + + Ei Ei +

Peptococcus species + :+ Ei Ei +

PepcostreptO" coccus SPP

Fusobacterium SPP + + Ei Ei + + + Ei Ei +

Sienet

Candida Albicans ++ Ei Ei Ei

Trychophyton

Mencagrophyces ++ + Bi Ei

Microsporum audovini ++ + Ei Ei

Epidermophycon floCOSUm + + + Ei Ei PI = nitatsoksanidi + sakkaroosidistearaatti P2 = nitatsoksanidi + yhdiste A + sakkaroosidistearaatti P3 = albendatsoli 5 P4 = mebendatsoli P5 = metronidatsoli.

Koe 5

Yleiset menetelmät viruksia tuhoavan tehokkuuden ja 10 myrkyllisyyden määrittämiseksi on annettu seuraavassa.

20

Laboratoriomenetelmät viruksia tuhoavan tehokkuuden ja myrkyllisyyden määrittämiseksi A. Ihmisen esinahan fibroblastisolujen valmistus

Vastasyntyneiden poikalasten esinahat saatiin mah-5 dollisimman pian sen jälkeen kun ympärileikkaus oli toteutettu ja ne pantiin neljän tunnin ajaksi minimaaliseen oleelliseen elatusaineeseen (MEM), joka sisälsi vankomysii-niä, fungitsonia, penisilliiniä ja gentamysiiniä, joiden konsentraatiot olivat tavanomaiset. Sitten elatusaine pois-10 tettiin, esinahat paloiteltiin pieniksi kappaleiksi ja niitä pestiin toistuvasti, kunnes punasoluja ei enää ollut läsnä. Sitten kudos käsiteltiin trypsiinillä käyttäen tryp-siinikonsentraatiota 0,25 % sekoittaen jatkuvasti 15 minuutin ajan 37 °C: n lämpötilassa C02_inkubaattorissa. Kunkin 15 15 minuutin jakson lopussa kudoksen annettiin laskeutua pullon pohjalle. Soluja sisältävä päällysneste kaadettiin steriilin juustokankaan läpi pulloon, joka sisälsi MEM-ela-tusainetta ja 10 % nautasikiön seerumia. Elatusainetta sisältävää pulloa pidettiin jään päällä koko trypsiinikäsit-20 telyn ajan. Jokaisen solulisäyksen jälkeen juustokangas pestiin pienellä määrällä seerumia sisältävää MEM-ela-tusainetta. Joka kerta lisättiin tuoretta trypsiiniä etunahan kappaleisiin ja menetelmää toistettiin, kunnes soluja ei enää saatu käyttöön. Soluja sisältävää elatusainetta 25 sentrifugoitiin sitten kierrosnopeudella 1 000 rpm 4 °C:n lämpötilassa 10 minuutin ajan. Päällysneste kaadettiin pois ja solut suspendoitiin uudelleen pieneen määrään MEM-ela-tusainetta, joka sisälsi 10 % nautasikiön seerumia (FBS). Sitten solut pantiin sopivaan määrään 25 cm2:n kudosviljel-30 mäpulloja. Kun solut kasvoivat yhtenäiseksi levyksi ja tarvitsivat trypsiinikäsittelyä, ne laajennettiin vähitellen isompiin pulloihin. Soluja pidettiin vankomysiinin ja fun-gitsonin päällä siirtoon (passage) neljä.

21

B. Sytopaattisen vaikutuksen estämismääritys - HSV, HCMV, VZV

Vähän siirretyt (low passage) ihmisen etunahan fib-roblastisolut saatettiin viljeltäväksi 96-kuoppaisille ku-5 dosviljelmämaljoille 24 tuntia ennen käyttöä niiden kon- sentraation ollessa 2,5 x 104 solua/ml 0,1 ml:ssa minimaalista oleellista elatusainetta (MEM), joka oli täydennetty 10 %:lla nautasikiön seerumia (FBS). Sitten soluja inkuboi-tiin 24 tunnin ajan 37 °C:n lämpötilassa CC>2-inkubaat-10 torissa. Inkuboinnin jälkeen elatusaine poistettiin ja 100 μΐ MEM-elatusainetta, joka sisälsi 2 % nautasikiön seerumia, lisättiin kaikkiin muihin, paitsi ei ensimmäiseen riviin. Ensimmäisessä rivissä 125 μΐ tutkittavaa lääkettä lisättiin kuoppiin kolmena kerranteena. Pelkästään ela-15 tusainetta lisättiin sekä solujen että viruksen kontrolli-kuoppiin. Lääke kuoppien ensimmäisessä rivissä laimennettiin sitten sarjassa 1:5 kaikkialla jäljellä olevissa kuopissa siirtämällä 25 μΐ käyttäen Cetus Liquid Handling Machine -konetta. Lääkkeen laimentamisen jälkeen jokaiseen 20 kuoppaan lisättiin 100 μΐ sopivaa viruskonsentraatiota, lukuun ottamatta solujen kontrollikuoppia, jotka saivat 100 μΐ MEM-elatusainetta. HSV-1- ja HSV-2-määrityksissä käytettävä viruksen konsentraatio voi olla 1 000 PFU/kuoppa. CMZ- ja VZV-määrityksissä lisätty viruskonsentraatio voi olla 2 500 25 PFU/kuoppa. Sitten maljoja inkuboitiin 37 °C:n lämpötilassa CC>2-inkubaattorissa kolmen päivän ajan HSV-1 :n ja HSV-2:n tapauksessa tai 10 päivän ajan VZV:n tapauksessa tai 14 päivän ajan CMV:n tapauksessa. Inkubointijakson jälkeen ela-tusaineet imettiin pois ja soluja värjättiin 0,l-%:isella 30 kiteisen violetin liuoksella 30 minuutin ajan. Sitten väriaine poistettiin ja maljoja huuhdottiin vesijohtovedellä, kunnes kaikki ylimääräinen väri oli poistunut. Maljojen annettiin kuivaa 24 tunnin ajan ja sitten suoritettiin luenta Skatron Plate -lukijalla aallonpituudella 620 nm.

22 C. HSV-l:n ja HSV-2:n plakin vähenemismääritys käyttäen puolikiinteätä peitettä (Semi-Solid Overlay)

Kaksi päivää ennen käyttöä ihmisen etunahan fibro-blastisolut (HFF-solut) saatettiin kuusikuoppaisille mal-5 joille ja niitä inkuboitiin 37 °C:n lämpötilassa hiilidioksidipitoisuuden ollessa 5 % ja kosteuden 90 %. Määrityspäi-vänä lääke muodostetaan kaksinkertaisesti haluttuun kon-sentraatioon 2 x MEM -elatusaineeseen ja sitten se laimennetaan sarjassa 1:5 2 x MEM -elatusaineeseen ja sitten sar-10 jassa 1:5 2 x MEM -elatusaineeseen käyttäen lääkkeen kuutta konsentraatiota. Alussa lähtökonsentraatio on tavallisesti 200 pg/ml 0,06 pg:aan/ml. Käytettävä virus laimennetaan MEM-elatusaineeseen, joka sisältää 10 % nautasikiön seerumia, haluttuun konsentraatioon, joka antaa 20 - 30 plak- 15 kia/kuoppa. Sitten elatusaine imetään pois kuopista ja jokaiseen kuoppaan lisätään 0,2 ml virusta kahtena kerrantee-na, jolloin 0,2 ml elatusainetta lisättiin lääkkeen myrkyl-lisyyskuoppiin. Sitten maljoja inkuboidaan yhden tunnin ajan ravistaen joka 15. minuutti. Inkubointijakson jälkeen 20 yhtä suuri määrä l-%:ista agaroosia lisättiin yhtä suureen tilavuuteen kutakin lääkelaimennosta. Tämä tuottaa lopulliset lääkekonsentraatiot, joka alkavat 100 pg:sta/ml ja päättyvät 0,03 pg:aan/ml, ja lopullisen agaroosipeitekon-sentraation, joka on 0,5 %. Lääke-agaroosiseos levitetään 25 sitten kuhunkin kuoppaan tilavuuden ollessa 2 ml ja maljoja inkuboidaan sitten kolmen päivän ajan, jonka jälkeen solut värjätään l,5-%:isella neutraalipunaisen liuoksella. Sitten 6-8 tunnin inkubointijakson jälkeen väri imetään pois ja plakit lasketaan käyttäen stereomikroskooppia 10-kertaisel-30 la suurennuksella.

EC50 (50-%:inen tehokas konsentraatio) on konsent- raatio, joka tarvitaan viruksen sytopatogeenisyyden estämi seksi 50 %:lla.

IC50 (50-%:inen estävä konsentraatio) on konsentraa-35 tio, joka tarvitaan solujen lisääntymisen estämiseksi 50 %:11a.

23

Selektiivisyysindeksi (S. I.) = IC50/EC50.

D. VZV-plakin vähenemismääritys - puolikiinteä peite

Menetelmä on oleellisesti sama kuin edellä kuvattu 5 HSV-plakkimääritys, lukuun ottamatta kahta poikkeusta: 1. Lääkkeen lisäämisen jälkeen maljoja inkuboidaan 10 päivän ajan.

2. Päivinä kolme ja kuusi lisätään ylimääräinen 1 ml: n peite yhtä suurien määrien kanssa 2 x MEM -ela- 10 tusainetta ja l-%:ista agaroosia.

E. CMV-plakkimääritys - puolikiinteä peite

Menetelmä on jälleen melkein sama kuin HSV-mää- rityksessä muutamin vähäisin muutoksin. Agaroosi, jota käytetään sekä ensimmäiseen peitteeseen että kahteen seuraa-15 vaan peitteeseen, on 0,8-%:ista l-%:isen sijasta. Määritystä inkuboidaan 14 päivän ajan levittäen ylimääräiset 1 ml:n peitteet päivinä neljä ja kahdeksan.

F. Plakin vähenemismääritykset käyttäen nestemäistä elatusainepeitettä 20 Menetelmä, jota käytetään nestemäisen peitteen plak- kimäärityksessä, on samanlainen kuin menetelmä, jossa käytettiin agaroosipeitettä. Menetelmä viruksen lisäämiseksi on sama kuin tavallisessa plakkimäärityksessä. Lääkkeet ovat käytettävässä konsentraatiossa MEM-elatusaineessa, 25 jossa on 2 % nautasikiön seerumia. Lääkkeitä ei valmisteta kaksinkertaisesti haluttuun konsentraatioon, kuten edellisissä määrityksissä, vaan ne valmistetaan haluttuun konsentraatioon. HSV-1- ja HSV-2-määrityksissä vasta-aineval-miste, joka saatiin yhtiöltä Baxter Health Care Corporati-30 on, laimennetaan suhteessa 1:500 ja lisätään elatusainee-seen, johon lääke on laimennettu. CMV- ja VZV-määrityksissä ei käytetä vasta-ainetta peitteessä. CMV-määrityksessä lisätään vielä uutta elatusainetta ilman uutta lääkettä päivänä 5 ja inkuboidaan yhteensä 10 päivän ajan. VZV-määri-35 tyksessä uutta elatusainetta lisätään päivänä 5 ja inkuboidaan yhteensä 10 päivän ajan. Kaikissa määrityksissä 24 inkubointijakson lopussa lisätään 2 ml 1:10-laimennosta va-rastoneutraalia ainetta (stock neutral) kuhunkin kuoppaan ja inkuboidaan kuuden tunnin ajan. Sitten neste imetään pois ja plakit lasketaan käyttäen stereomikroskooppia.

5 G. EBV:n seulonta- ja vahvistusmääritykset 1. Virus

On olemassa kaksi tarttuvan EBV:n prototyyppiä. Toisesta on esimerkkinä virus, joka on peräisin P3HR-1-solulinjan päällysnesteistä. Tämä solulinja tuottaa ei-10 transformoivaa virusta, joka aiheuttaa varhaisen antigeenin (EA) tuotannon B-solulinjojen primaarisen infektion tai su-perinfektion jälkeen. Toisesta prototyypistä on esimerkkinä B-95-8-virus. Tämä virus teki kuolemattomiksi napanuoran (cord) veren imusolut ja aiheutti kasvaimia silkkiapinoil-15 la. Se ei kuitenkaan aiheuta abortiivista tuottavaa infektiota edes solulinjoissa, jotka majoittavat EBV:n genomin kopioita. Määrityksissämme käytetty virus on P3HR-1.

2. Solulinjat

Ramos on poikkeuksellinen B-solulinja, joka on pe-20 räisin Burkittiin lymfoomakasvaimesta, mutta ei sisällä havaittavia EBV:n genomin kopioita ja EBNA-negatiivinen. Ra-mos/AW saatiin tartuttamalla in vitro Ramos P3HR-l-viruk-sella ja se sisältää yhden residentin EBV-genomin kopi-on/solun. Raji on Burkittin lymfoomasolulinja, joka sisäl-25 tää 60 EBV-genomia/solu ja on primaarinen solu, jota käytettiin viruksia tuhoavan aktiivisuuden seulomiseksi EBV EA:n ilmentymistä vastaan. Daudi on pienen määrän tuottaja, joka sisältää 152 EBV-genomin kopiota/solu. Se ilmentää luonnostaan EBV EA:n 0,25 - 0,5 %:ssa soluista. Sitä käyte-30 tään seurantatutkimuksissa aktiivisuuden vahvistamiseksi. Nämä solulinjat reagoivat EBV:n superinfektioon ilmentämällä EA(D):n, EA(R):n ja VCA:n. Kaikkia solulinjoja ylläpidetään RPMI-1640-elatusaineessa, joka on täydennetty 10 %:lla nautasikiön seerumia, L-glutamiinilla ja 100 pg:lla/ml 35 gentamisiinia. Viljelmät ravitaan kaksi kertaa viikossa ja solujen konsentraatio säädetään määrään 3 x 105 solua/ml.

25

Soluja pidetään 37 °C:n lämpötilassa kostutetussa ilmakehässä, jossa on 5 % CCkta.

3. Immunofluoresenssimääritykset käyttäen monoklo-naalisia vasta-aineita 5 Soluihin tartutetaan EBV:n P3HR-l-kanta ja tutkit tavat lääkkeet lisätään soluviljelmien adsorboitumisen (45 min 37 °C:ssa) ja pesun jälkeen. Viljelmiä inkuboidaan kahden päivän ajan täydellisessä elatusaineessa viruksen geenin ilmentymisen sallimiseksi. Sitten 48 tunnin inkuboin-10 tijakson jälkeen kunkin näytteen solujen lukumäärä lasketaan ja tehdään sivelyt. Erilaisten EA-komponenttien ja VCA:n monoklonaaliset vasta-aineet lisätään sitten inkuboi-tuihin ja pestyihin soluihin. Tätä seuraa fluoreseiinikon-jugoitu kaniinin anti-hiiri-Ig-vasta-aine; ja fluoresenssi-15 positiivisten solujen lukumäärä sivelyissä lasketaan. Solujen kokonaismäärä viljelmissä, jotka ovat positiivisia EA:n ja VCA:n suhteen, lasketaan sitten ja suoritetaan vertailu.

H. Solujen proliferaatiomääritys - myrkyllisyys

Saatetaan 24 tuntia ennen määritystä HFF-solut vil-20 jeltäväksi 6-kuoppaisille maljoille konsentraation ollessa 2,5 x 104 solua/kuoppa MEM-elatusaineessa, joka sisältää 10 % nautasikiön seerumia. Määrityspäivänä lääkkeet laimennetaan sarjassa MEM-elatusaineeseen, joka sisältää 10 % nautasikiön seerumia, suhteessa 1:5, kattaen vaihtelualueen 25 100 pg/ml - 0,03 pg/ml. Lääkkeiden tapauksessa, jotka on liuotettava DMSOriin, kontrollikuoppa saa MEM-elatusai-netta, joka sisältää 10 % DMSO:a. Sitten elatusaineet imetään kuopista ja 2 ml kutakin lääkekonsentraatiota lisätään kuhunkin kuoppaan. Sitten soluja inkuboidaan C02-inkubaat-30 torissa 37 °C:n lämpötilassa 72 tunnin ajan. Tämän ajan lopussa elatusaine-lääkeliuos poistetaan ja solut pestään. Yksi ml 0,25-%:ista trypsiiniä lisätään jokaiseen kuoppaan ja inkuboidaan, kunnes solut alkavat tulla ulos maljasta. Sitten solu-elatusaineseosta pipetoidaan ylös ja alas voi-35 makkaasti solususpension rikkomiseksi ja 0,2 ml seosta lisätään 9,8 ml:aan Isoton III:a ja laskenta suoritetaan 26 käyttäen Coulter-laskinta. Kukin näyte lasketaan kolme kertaa kolmesta kerrannekuopasta/näyte.

I. Solujen sytotoksisuuden MTT-määritys

Saatetaan 24 tuntia ennen määritystä HFF-solut vil-5 jeltäväksi 96-kuoppaisille maljoille konsentraation ollessa 2,5 x 104 solua/kuoppa. Sitten 24 tunnin kuluttua elatusai-ne imetään pois ja lisätään 125 mikrolitraa lääkettä ensimmäiseen kuoppariviin ja sitten laimennetaan sarjassa suhteessa 1:5 käyttäen automatisoitua Cetus Liquid Handling 10 System -järjestelmää samalla tavalla kuten CPE-määri- tyksessä. Sitten maljoja inkuboidaan C02-inkubaattorissa 37 °C:n lämpötilassa 7 päivän ajan. Tällöin kuhunkin kuoppaan lisätään 50 mikrolitraa MTT:n 1 pg/ml -liuosta Dulbec-co' s Phospate Buffered Saline -liuoksessa. Sitten maljoja 15 inkuboidaan vielä neljän tunnin ajan. Tällöin elatusaine poistetaan ja korvataan 100 pl:lla 0,04 N suolahappoa iso-propanolissa. Maljoja ravistetaan lyhyen aikaa, minkä jälkeen niistä suoritetaan luenta maljalukijalla aallonpituudella 550 nm.

20 J. Neutraalin punaisen ottomääritys - myrkyllisyys

Menetelmä solujen saattamiseksi viljelyyn ja lääkkeen lisäämiseksi on sama kuin MTT-määrityksessä.

Lääkkeen lisäämisen jälkeen maljoja inkuboidaan 7 päivän ajan CCb-inkubaattorissa 37 °C:n lämpötilassa. Täl-25 löin elatusaine/lääke imetään pois ja lisätään 200 μΐ/ kuoppa 0,01-%:ista neutraalia punaista DPBS-liuoksessa. Tätä inkuboidaan CC>2-inkubaattorissa yhden tunnin ajan. Väriaine imetään pois ja solut pestään käyttäen Nunc Plate -pesulaitetta. DPBS-pesunesteen poistamisen jälkeen lisätään 30 200 pg/kuoppa 50-%:ista EtOH:a (etanolia)/1-%:ista jääetik- kaa (vedessä). Maljoja pyöritetään 15 minuutin ajan ja optiset tiheydet luetaan aallonpituudella 550 nm maljaluku-laitteella.

27

Koe 5 a: Viruksia tuhoava aktiivisuus HBV:n repli-kaatiota vastaan viljelmissä (hepatiitti B)

Menetelmästä anti-HBV-yhdisteiden määrittämiseksi 2.2.15-solujen viljelmissä voidaan esittää lyhyesti yhteen-5 veto seuraavasti [Korba ja Milman, Antiviral Res., 217:217 (1991)]:

Kroonisesti HBV:tä tuottavat ihmisen maksasolut [Acs et ai., PNAS, 84:4641 (1987)] saatetaan viljeltäväksi 24-kuoppaisille kudosviljelymaljoille ja ne kasvatetaan yh-10 tenäiseksi levyksi.

Sitten tutkittavia yhdisteitä lisätään päivittäin keskeytymättömän 9 päivän jakson ajan. Viljelmän elatusaine (vaihdettiin päivittäin käsittelyjakson ajan) kerätään talteen ja sitä varastoidaan ekstrasellulaarisen (virionin) 15 HBV DNA:n analysoimiseksi 0, 3, 6 ja 9 päivän kuluttua käsittelystä .

Käsiteltyjä soluja liuotetaan 24 tuntia käsittelyn 9. päivän jälkeen intrasellulaarisen HBV:n genomisten muotojen analysoimiseksi.

20 HBV DNA analysoidaan sitten kvantitatiivisesti ja kvalitatiivisesti HBV DNA:n kokonaismäärien saamiseksi (sekä ekstrasellulaarinen että intrasellulaarinen DNA) ja HBV:n replikaation suhteellisen määrän saamiseksi (intrasellulaarinen DNA) .

25 Menetelmästä yhdisteiden myrkyllisyyden määrittämi seksi 2.2.15-solujen viljelmissä voidaan esittää lyhyesti yhteenveto seuraavasti (Korba ja Gerin, annettu julkaistavaksi) : 2.2.15-solut kasvatettiin yhtenäiseksi levyksi 30 96-kuoppaisilla, litteäpohjaisilla kudosviljelmämaljoilla ja ne käsiteltiin yhdisteillä (0,2 ml:ssa viljelmän ela-tusainetta/kuoppa), kuten edellä on kuvattu. Määritettiin kunkin yhdisteen neljä konsentraatiota, kukin kolmen ker-ranteen viljelmistä, 2 - 10-kertaisissa vaiheissa.

35 Käsittelemättömiä kontrolliviljelmiä ylläpidettiin kullakin 96-kuoppaisella maljalla. Kullakin 96-kuoppaisella 28 maljalla kuoppia, jotka eivät sisältäneet lainkaan soluja, käytettiin valon sironnan korjaamiseksi.

Myrkyllisyys määritettiin estämällä neutraalin punaisen väriaineen otto, mikä määritettiin absorbanssilla 5 aallonpituudella 510 nanometriä suhteessa käsittelemättömi en solujen absorbanssiin [Finter et ai., J. Med. Chem., 5:419 (1969)] 24 tunnin kuluttua käsittelyn päivän 9 jälkeen .

Yhdisteen A viruksia tuhoavaa aktiivisuutta verrat-10 tiin zalkitabiinin vastaavaan aktiivisuuteen.

Havaittiin, että käytettäessä yhdistettä A tehokas konsentraatio (EC 50) oli 1,8 ± 0,1 mikrogrammaa/ml (pg/ ml) estäen 50 %:lla viruksen sytopatogeenisyyttä, kun taas sy-totoksinen konsentraatio (esti 50 %:lla solujen proliferaa-15 tiota) oli yli 1 000 pg/ml. Yhdisteen A selektiivisyysin-deksi SI oli siten > 1 000/1, 8 eli indeksi oli suurempi kuin 500.

Zalkitabiinin osalta kokeet osoittivat seuraavia tuloksia: 20 EC 50 1,810,2 pg/ml CC 50 261 ± 24 pg/ml eli selektiivisyysindeksi SI on 261/1,8 eli noin 145.

Kuten tästä tekstistä voidaan nähdä, yhdiste A oli 25 vähemmän myrkyllinen kuin zalkitabiini, jolloin voidaan saada sopivampi käsittely sekundaaristen vaikutusten ollessa vähäisempiä HBV:n replikaatiota vastaan.

Koe 5 b: Viruksia tuhoava aktiivisuus VZV:tä vastaan 30 Käytettiin myös nitatsoksanidin (96 %) ja yhdisteen A (4 %) seosta sen aktiivisuuden määrittämiseksi Varicella Zoster -virusta vastaan (standardimainen laboratoriokanta).

Havaittiin, että mainitun seoksen EC 50 oli 4 pg/ml ja CC 50 34 pg/ml mainittua Varicella Zoster -virusta vas-35 taan, eli SI-indeksi oli noin 8,5.

29

Ottaen huomioon seoksen pieni myrkyllisyys ja tehokkuus, se on erityisen sopiva Varicella Zoster -viruksen käsittelemiseksi, jonka tiedetään olevan resistentti virusta tuhoavaa ainetta, kuten asikloviiria vastaan.

5 Keksinnön mukainen yhdiste A ja koostumus voidaan antaa potilaalle suun kautta esimerkiksi tabletteina.

Keksinnön koostumukset, erityisesti koostumukset, jotka sisältävät PH 5776 -yhdistettä ja/tai muuta viruksia tuhoavaa ainetta, ovat koostumuksia, joilla on laaja vaiku-10 tuskirjo Herpes-viruksia vastaan, esimerkkinä:

Herpes Simplex -virustyyppi 1 (HSV-1, asikloviiria vastaan resistentti HSV-1);

Herpes Simples - virustyyppi 2 (HSV-S, asikloviiria vastaan resistentti HSV-2); 15 Ihmisen sytomegalovirus (HCMV, gansikloviiria vas taan resistentti HCMV);

Varicella Zoster -virus (VZV, asikloviiria vastaan resistentti VZV);

Epstein Barr Biruss (EBV); 20 Rottaeläimen sytomegalovirus (MCMV).

Koostumukset voivat sisältää täyteaineita, jotka ovat tunnettuja sinänsä sopivien muotojen valmistamiseksi lääkkeen ottamiseksi suun kautta.

Koostumukset sisältävät edullisesti kostutusaineen 25 ja mahdollisesti tärkkelysjohdannaisen.

Claims (16)

1. H Ä no,—. JJ—NH_C—( )—4 5 ΓΊ H H jossa Ri = OH ja R2 = R3 = R4 = Rs = H; ja yhdiste B, jolla on kaava ococh3 --N o 1_ H no,—^JL_NH-€-χΖ/-” H H

1. Yhdiste, jolla on kaava (I) ... r5 r< 5 jossa symboli Ri esittää OH-ryhmää, kun taas jäljellä olevat symbolit esittävät H-atomia.

2. Farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, 10 että se sisältää aktiivisena aineena yhdisteen, jolla on kaava (I) r5 r< jossa symboli Ri esittää OH-ryhmää, kun taas jäljellä olevat symbolit esittävät H-atomia.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että se sisältää aktiivisena aineena seoksen, jonka muodostavat yhdiste A, jolla on kaava OH H

4. Patenttivaatimuksen 2 tai 3 mukainen farmaseut tinen koostumus annettavaksi potilaalle suun kautta, tunnettu siitä, että se sisältää lisäksi kostutusaineen.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että ainakin yksi kostutus- 10 aine on valittu ryhmästä, joka koostuu anioniaktiivisista pinta-aktiivisista aineista.

6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että kostutusaine on valittu ryhmästä, joka koostuu sokeriestereistä, polyoksieteenistä, 15 polyoksipropeenista, anhydroheksitolijohdannaisista, rasva-alkanoliamideista, rasva-amiinioksideista, sakkaroosista, mannitolista, sorbitolista, lesitiineistä, polyvinyylipyrro-lidoneista, rasvahappoestereistä, sakkaroosin glyserideis-tä, ksyloosin estereistä, polyoksieteeniglyserideistä, ras- 20 vahappojen estereistä ja rasva-alkoholien polyoksieteenieet- teristä ja sorbitaanin polyoksieteenirasvahappoestereistä, sorbitaanin rasvahappojen polyoksieteeniestereistä, glyse-ridipolyglysideistä, alkoholipolyglysidien estereistä ja edellä mainittujen seoksista.

7. Minkä tahansa edellä esitetyistä patenttivaati muksista mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että se sisältää tärkkelysjohdannaisen.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että se sisältää karboksime- 30 tyylitärkkelyksen tai sen suolan.

9. Patenttivaatimuksen 4 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että se sisältää enintään 20 paino-% pinta-aktiivista ainetta suhteessa aktiivisen aineen (aktiivisten aineiden) painoon ja enintään 20 paino-% tärkkelysjohdan- 5 naista suhteessa aktiviisen aineen tai aktiivisten aineiden painoon.

10. Galeeninen valmiste annettavaksi potilaalle suun kautta, tunnettu siitä, että se sisältää ytimen, joka käsittää koostumuksen, joka sisältää: 10 tehokkaan määrän yhdistettä, jolla on kaava (I) ,J3U4·' Rg fl4 jossa symboli Ri esittää OH-ryhmää, kun taas jäljellä olevat symbolit esittävät H-atomia; mahdollisesti sekoitettuna yhdisteen B kanssa, jol-15 la on kaava QCOCHj -N O I H I II 11 N02—^-NH-C—\_y~H H H kostutusaineen ja tärkkelysj ohdannaisen, jolloin mainitun koostumuksen vesipitoisuus on alle 20 25 paino-%.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen valmiste, tunnettu siitä, että se sisältää karboksimetyylitärkkelyksen tai sen suolan.

12. Voide alavatsan sairauksien hoitamiseksi, tunnettu siitä, että se sisältää: tehokkaan määrän aktiivista ainetta, jolla on kaava (I) ... r5 r. o jossa symboli Ri esittää OH-ryhmää, kun taas jäljellä olevat symbolit esittävät H-atomia; mahdollisesti sekoitettuna yhdisteen B kanssa, jolla on kaava OCOCHj -N 0 I H N02—1 J NH-C h 5 w H H 10 ja kostutusaineen.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen voide, tunnettu siitä, että se sisältää tärkkelysjohdannaisen.

14. Yhdiste, jolla on kaava (I) .J3L,.LgU R5 R„ 15 5 * jossa symboli Ri esittää OH-ryhmää, kun taas jäljellä olevat symbolit esittävät H-atomia, käytettäväksi loi- siä tuhoavana aineena, bakteereja tuhoavana aineena, sieniä tuhoavana aineena tai viruksia tuhoavana aineena.

15. Seos, jonka muodostavat yhdiste A, jolla on kaava (I) ... 5 jossa Ri = OH ja R2 = R3 = R4 = Rs = H; ja yhdiste B, jolla on kaava OCOCHj -N O I H H H käytettäväksi loisia tuhoavana aineena, bakteereja 10 tuhoavana aineena, sieniä tuhoavana aineena tai viruksia tuhoavana aineena.

16. Ruokakoostumus, tunnettu siitä, että se sisältää säilöntäaineena tehokkaan määrän aktiivista ainetta, jolla on kaava 15 (I) ... Rg R, jossa symboli Ri esittää OH-ryhmää, kun taas jäljellä olevat symbolit esittävät H-atomia, mahdollisesti yhdisteen B, jolla on kaava QCOCHj -N 0 I H I I 11 /v_ NOz—h^ -,NH-C-CJ/ H H H 5 ja mahdollisesti tärkkelysjohdannaisen.