JPH09510780A - 質量分析法によるヌクレオチド、アミノ酸又は炭水化物の同定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ペプチドフラグメント質量スペクトルをデータベース由来のアミノ酸配列に相関させる方法を提供する。ペプチドをタンデム型質量分析計で分析してペプチドフラグメント質量スペクトルを得る。タンパク質配列データベース又はヌクレオチド配列データベースを用いて、実験的に導出したフラグメントスペクトルと比較するための一つ以上のフラグメントスペクトルを予測する。ある具体例では、タンデム型型質量分析計で分析したペプチドの質量と実質的に同等の質量を有するペプチドを規定するデータベース上の配列のサブ配列を候補配列として識別する。各候補配列毎に、配列の複数のフラグメントを識別し、これらフラグメントの質量及びｍ／ｚ比を予測し、予測質量スペクトルの形成に使用する。一致度測定値を用いて種々の予測質量スペクトルを実験的に導出したフラグメントスペクトルと比較する。一致度は、最高得点の予測スペクトルに関する予備得点の計算、相関関数の計算を含む二ステッププロセスで計算すいるのが好ましい。

Description

【発明の詳細な説明】 質量分析法によるヌクレオチド、アミノ酸又は炭水化物の同定政府の助成 本発明の特定の要素は、全国科学基金(National Science Foundation)認可番 号8809710及び国立衛生研究所(National Institutes of Health)認可番号RO1GM5 2095による部分的助成のもとになされたものである。米国政府は本発明に特定の 権利を有し得る。関連出願 本出願は1994年３月14日に出願された米国特許第08/212,433号の一部継続出願 である。発明の背景 質量分析法の分析力をペプチドに適用するために、これまで多くの手法が使用 されてきた。タンデム型質量分析（MS／MS）技術は特に有用なものであった。タ ンデム型質量分析法では、ペプチド又は他の入力（通常はクロマトグラフィー装 置から得たもの）を、ペプチド混合物から特定質量の目標ペプチドを選択するの に使用される第一の質量分析計にかける。次いで、目標ペプチドを活性化するか 又はフラグメントに分解して、「目標」又は親（parent）ペプチドと種々の成分 フラグメント、典型的には質量のより小さいペプチドとの混合物を生成する。次 いでこの混合物を、フラグメントスペクトルを記録する第二の質量分析計に送る 。このフラグメントスペクトルは、典型的には、複数のピークを有する棒グラフ の形態で表示される。各ピークは、検出されたフラグメントの質量／電荷数の比 （ｍ／ｚ）を示し、強度値を有する。 フラグメントスペクトルそのものも何らかの有用性を有し得るが、多くの場合 は、フラグメント混合物になったペプチド（又は親タンパク質）を同定するため にフラグメントスペクトルを使用するのが望ましい。従来の手法は典型的には、 一つ以上のアミノ酸配列候補を仮想するためのベースとしてフラグメントスペク トルを使用してきた。この方法では熟練した研究者により人を介する分析を行う のが典型であったが、自動化された方法も少なくとも一つ記述されている。John Yates，III、ら、“Computer Aided Interpretation of Low Energy MS／MS Ma ss Spectra of Peptides（コンピューターを使用するペプチドの低エネルギーMS ／MS質量スペクトルの解析）”、Techniques In Protein Chemistry II（1991） ，pp．477-485参照。この文献は本明細書に参考として包含される。候補配列は 次いで、タンパク質配列ライブラリーの種々のタンパク質の既知のアミノ酸配列 と比較し得る。 フラグメントスペクトルに基づいてアミノ酸配列候補を仮想する手法をとる方 法は多くの状況で有用であるが、問題もある。アミノ酸配列候補を得るためのフ ラグメントスペクトルの解読は時間がかかり、しばしば不正確であり、高度の技 術を必要とし、通常はタンデム型質量分析計を熟知している数箇所の研究所でし か実施できない。ヒトの解釈に頼るということはしばしば、分析速度が比較的遅 く、厳密な客観性を欠くことを意味する。ペプチド質量地図作成に基づく手法は 、特異的な公知のタンパク質分解開裂によって生じた完全な均一タンパク質に由 来するペプチド質量に限定されるため、タンパク質混合物に一般的に適用するこ とはできない。 従って、フラグメントスペクトルからアミノ酸配列候補を仮想又は推定する際 の遅延及び／又は主観を回避しながら、フラグメント スペクトルを既知のタンパク質配列と相関させるシステムを提供すれば、それは 有用なことであろう。発明の概要 本発明では、例えばタンパク質配列ライブラリーに含まれている既知のアミノ 酸配列を用いて、一つ以上のフラグメントスペクトル候補を計算又は予測する。 次いで、予測したフラグメントスペクトルを実験的に導出したフラグメントスペ クトルと比較して、最も良く一致するものを一つ以上決定する。フラグメントス ペクトルの導出源である親ペプチドは既知の質量を有しているのが好ましい。タ ンパク質配列ライブラリーの種々の配列のサブ配列(sub−sequence)を分析して 、フラグメントスペクトルで親ペプチドの質量に等しい（又は所与の許容差範囲 内にある）質量のペプチドに対応するサブ配列を識別する。適当な質量を有する 各サブ配列毎に、例えば候補ペプチドの種々のアミノ酸サブセットの質量を計算 することによって、予測フラグメントスペクトルを計算し得る。その結果、それ ぞれに予測フラグメントスペクトルを有する複数の候補ペプチドが得られる。予 測フラグメントスペクトルは次いで、実験的に導出したフラグメントスペクトル を与えたペプチドの配列と同じであると思われるサブ配列を有するタンパク質を 一つ以上同定するために、タンデム型質量分析計から導出されたフラグメントス ペクトルと比較し得る。図面の簡単な説明 第１図は、タンデム型質量分析計のデータをタンパク質配列ライブラリー由来 の配列と相関させるための従来の方法を説明するブロック図である。 第２図は、本発明の具体例に従ってタンデム型質量分析計のデータをタンパク 質配列ライブラリー由来の配列と相関させる方法を示すブロック図である。 第３図は、本発明の具体例に従ってタンデム型質量分析計のデータをアミノ酸 配列と相関させるステップを示す流れ図である。 第４図は、第３図のサブ配列候補を識別するステップの方法を詳細に示す流れ 図である。 第５図は、本発明で使用できる種類のペプチドのフラグメント質量スペクトル を示すグラフである。 第6A図〜第6D図は、本発明の具体例による分析方法を示す流れ図である。特定具体例の説明 本発明の具体例を説明する前に、先行技術の方法をより詳細に述べることが有 用であろう。第１図に示す先行技術の方法は、未知のペプチド12の分析に使用さ れる。典型的には、該ペプチドは、部分分別タンパク質の分離に使用したクロマ トグラフィーカラムからの出力である。タンパク質は、例えばゲル濾過クロマト グラフィー及び／又は高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によって分別し得る 。試料12は電気噴霧（electrospray）イオン化（ES）のような方法を介してタン デム型質量分析計14に導入する。第一の質量分析計でペプチドイオンが選択され 、その結果特定質量の目標成分が試料の残りから分離される14ａ。目標成分は次 いで活性化又は分解する。その結果、ペプチドの場合は、イオン化親ペプチド（ 「前駆体イオン」）と種々の状態にイオン化されたより小さい質量の成分ペプチ ドとの混合物が生成される。活性化方法としては、例えば中性ガスとの衝突（衝 突誘導溶解(collision induced dissolution)とも称 する）のような多くの方法を使用し得る。次いで、親ペプチド及びそのフラグメ ントを第二の質量分析計14ｃに送ると、フラグメント混合物中の複数のフラグメ ントの各々に関する強度及びｍ／ｚが出力される。この情報はフラグメント質量 スペクトル16として出力され得る。第５図はこのようなスペクトル16の具体例を 示している。スペクトル16では各フラグメントイオンが棒グラフとして表される 。グラフの横座標の値は質量／電荷数の比（ｍ／ｚ）を示し、縦座標の値は強度 を示す。先行技術の方法では、フラグメントスペクトルをタンパク質配列ライブ ラリーの配列と相関させるために、フラグメント配列を、フラグメントスペクト ルに対応すると判断される一つ以上のアミノ酸配列に転換した。ある手法では、 各アミノ酸の重量を親イオンの分子量から引き算して、各アミノ酸が末端位置に あると個々に想定しながら、フラグメントの分子量を決定する。このフラグメン ト質量が実測フラグメントスペクトル内に存在するかどうかを決定する。各アミ ノ酸毎に得点を計算し、これらの得点を区分けして次の引き算サイクルのための 部分配列リストを作成する。サイクルは、アミノ酸の質量の引き算の差が0.5よ り小さく且つ−0.5より大きくなるまで続ける。その結果、一つ以上のアミノ酸 配列候補18が得られる。この操作は、例えば前出のYatesIII（1991）に記載のよ うに自動化できる。次いで、フラグメントスペクトル16を発生したペプチドに対 応すると考えられる配列と類似の又は同じサブ配列を有するタンパク質の同定を 試みるために、最高得点の配列候補のうちの一つ以上をタンパク質配列ライブラ リー20の配列と比較し得る21。 第２図は、本発明の方法の概要を示している。第２図の方法では、フラグメン トスペクトル16が、第１図のフラグメントスペクトルについて説明したものと類 似の方法で得られる。特定的には、試料 12をタンデム型質量分析計14に供給する。下記の操作はms／msデータを得るため に二ステッププロセスを使用する。しかしながら本発明は、ms／msの取得を単一 ステップに組み込む現在開発中の質量分析方法と一緒に使用することもできる。 ある具体例では、ms／msスペクトルを各質量毎に得る。第一のmsはイオンを質量 ／電荷数によって分離し、第二のmsはms／msスペクトルを記録する。第二のms／ ms段階では、第一のmsによって変換された各質量毎に例えば５〜10個のスペクト ルが得られる。 質量分析計としては、例えば三重−四重質量分析計、フーリエ変換サイクロト ロン共鳴質量分析計、タンデム型飛行時間質量分析計及び四重極イオントラップ 質量分析計など多くの分析計を使用し得る。しかしながら第２図の方法では、一 つ以上のアミノ酸配列を仮想するためのベースとしてフラグメントスペクトルを 使用する必要はない。第２図の方法では、例えば後で詳述する予測方法を用いて 複数の質量スペクトル22を予測するためのベースとして、タンパク質配列ライブ ラリー20に含まれているサブ配列を使用する。 例えばGenpeptデータベース、GenBankデータベース(Burksら、“GenBanK：Cur rent status and future directions in Methods in Enzymology(酵素学の方法 における現在の状況及び将来の方向)”，183：３(1990)に記載）、EMBLデータラ イブラリー（Kahnら、“EMBL Data Library”，Methods in Enzymology, 183：2 3(1990)に記載）、Protein Sequence Database（Barkerら、“Protein Sequence Database（タンパク質配列データベース）”，Methods in Enzymology, 1983： 31（1990）に記載）、SWISS-PROT（Bairochら、“The SWISS-PROT protein sequ ence date bank，recent deve lopments（SWISS-PROTタンパク質配列データバン ク、最近の展開）”，Nucleic Acids Res.，21：3093-3096（1993）に記載）及 びPI R-International(“Index of the Protein Sequence Database of the Internat ional Association of Protein Sequence Databanks(PIR-International)（国際 タンパク質配列データバンク協会タンパク質配列データベース索引）”，Protei n Seq Data Anal.，５：67-192（1993）に記載)のような多数の配列ライブラリ ーを使用し得る。 予測質量スペクトル22を実験的に導出したフラグメントスペクトル16と比較24 して、実験的に導出したフラグメントスペクトル16に最も近い予測質量スペクト ルを一つ以上識別する。この比較は、（実験的に導出したフラグメントスペクト ル16と比較した）複数の予測質量スペクトル22の各々について一致度測定値（cl oseness-of-fit measure）を計算することにより、自動的に行われるのが好まし い。通常は、タンデム型質量分析計で分析したペプチドは、実験的に導出したフ ラグメントスペクトル16に対して大きな一致度を示す予測質量スペクトル22を与 えたタンパク質配列ライブラリー20からのサブ配列の一つと同じアミノ酸配列を 有する確率が高いと考えられる。また、タンデム型質量分析計14で分析したペプ チドがタンパク質由来の場合には、親タンパク質が、次のようなタンパク質、即 ちタンパク質配列ライブラリー20内の配列が、フラグメントスペクトル16に対し て大きな一致度を有する予測質量スペクトル22を与えたサブ配列を含むようなタ ンパク質と同じか又は類似している確率が高いと考えられる。好ましくは、操作 全体を、例えば予測質量スペクトル22を計算する及び／又は予測質量スペクトル 22を実験的に導出したフラグメントスペクトル16と比較するコンピューターを用 いて自動的に実施し得る。 第３図は、質量スペクトル22を予測し比較24を実施するための方法の一つを示 す流れ図である。第３図の方法では、実験的に導出し たフラグメントスペクトル16をまず正規化する32。ある正規化方法では、実験的 に導出したフラグメントスペクトル16を質量及び強度リストに変換する。前駆体 イオンに関する値をファイルから除去する。総ての強度値の平方根を計算し、最 大強度100に正規化する。200個の最強イオンを10個の質量領域に分割し、各領域 内で最大強度を100に正規化する。両隣から3.0ドルトン以内の各イオンには、近 隣強度が自己の強度より大きければ、大きい方の強度値が与えられる。勿論、別 の正規化方法を使用することもでき、また、一般的には正規化することが好まし いが、正規化を行わずに分析を実施することもできる。例えば、100より大きい 値又は小さい値の最大強度を使用することが可能である。200個より多い又は少 ない最強イオンを選択することもできる。10個より多い又は少ない質量領域に分 割することもできる。近隣強度値を3.0ダルトンより大きい又は小さいと想定す るための窓を作成することもできる。 第３図の方法でタンパク質配列ライブラリーから予測質量スペクトルを形成す るためには、未知のペプチドの質量の許容差内の質量を有する各タンパク質配列 内のサブ配列を識別する。前述のように、未知のペプチドの質量はタンデム型質 量分析計によって知ることができる34。サブ配列候補の識別34は第４図により詳 細に示す。一般的に、サブ配列候補の識別プロセスでは、直鎖アミノ酸配列の質 量を、その合計が未知のペプチドの質量（「目標」質量）の許容差内に入るか、 又は目標質量（＋許容差）を超えるまで加算する。配列の質量が目標質量の許容 差内にあれば、該配列を候補としてマークする。直鎖配列の質量が未知のペプチ ドの質量を超えていれば、配列内の次のアミノ酸位置から開始してアルゴリズム を繰り返す。 第４図の方法では、配列内の出発アミノ酸を示す変数ｍが０に初期化され、１ だけインクリメントされる（36，38）。累計質量を表 す合計、及びこれまで加算されてきたアミノ酸の数を表す変数ｎは最初０にセッ トされ（40）、変数ｎがインクリメントされる42。タンパク質配列のサブ配列に 対応するペプチドの分子量は、ステップ44及び46により反復的に計算される。反 復毎に合計が、配列内の次の（ｎ番目の）アミノ酸のアミノ酸分子量だけインク リメントされる44。合計44の値は、後述のようにフラグメント質量スペクトルの 予測に使用するためのフラグメント質量の計算で使用するために記憶し得る。得 られた合計が許容差だけデクリメントされた目標質量より小さい場合には46，ｎ の値がインクリメントされ42、操作が繰り返される44。多数の許容差値を使用し 得る。ある具体例では、未知のペプチドの質量の±0.05％の許容差値を使用した 。新しい合計が目標質量より小さい許容範囲を下回らなくなれば、新しい合計が 目標質量＋許容差より大きいかどうかを調べる。新しい合計が目標質量より大き い許容範囲を超えていれば、この特定配列は候補配列とはみなされず、（出発点 の値ｍをインクリメントすることにより（38））配列内の新しい出発点から始ま って操作が繰り返される。しかしながら、合計が目標質量＋許容差を超えていな ければ、合計が目標質量のある許容範囲内にあることがわかり、従って配列のｍ 番目のアミノから始まり（ｍ＋ｎ）番目のアミノ酸まで続くサブ配列が候補配列 であると判断する。候補配列は、例えばこのサブ配列を定義するｍ及びｎの値を 記憶することによってマークする。 第３図に戻って説明すると、複数のサブ配列候補が識別された後、フラグメン ト質量スペクトルが各候補配列毎に予測される52。フラグメント質量スペクトル は、アミノ酸配列についてｂ型及びｙ型イオンのフラグメントイオン質量を計算 することにより予測される。ペプチドがフラグメントに分解され、電荷がＮ末端 開裂フラグメント上に保持されると、発生したイオンがｂ型イオンとして標識さ れる。電荷がｃ型末端フラグメント上に保持されると、イオンはｙ型イオンとし て標識される。ｂ型イオンの質量は、アミノ酸質量を合計しプロトンの質量を加 えることにって計算した。ｙ型イオンは、ｃ末端からアミノ酸の質量を合計し、 水及びプロトンの質量を最初のアミノ酸に加えることによって計算した。このよ うにすれば、各フラグメント毎にｍ／ｚを計算することができる。しかしながら 、予測質量スペクトルを与えるためには、各フラグメント毎に強度値を付与する ことも必要である。理論的には、各フラグメント毎に強度値を予測することは可 能であり得る。しかしながら、この操作は難しい。強度は下記の方法で付与する と有用であることが判明した。各ｂ及びｙイオンに値50.0を付与する。フラグメ ントイオンの両側の１ドルトンの質量には25.0の強度を付与する。各ｂ及びｙイ オン位置から10.0並びにｍ／ｚ下−17.0及び−18.0ドルトンのピーク強度(NH₃及 びH₂O双方の損失）、そして各ｂ型イオン位置から10.0及び−28.0amuのピーク強 度（ａ型イオンの場合）。 第３図に戻って説明を続けると、予測ｍ／ｚ値の計算及び強度付与の後は、予 測質量スペクトル22と実験的に導出したフラグメントスペクトル16との間の一致 度の測定値を計算するのが好ましい。一致度の計算方法は多数存在する。第３図 に示す具体例では、二ステップ方法を使用する54。この二ステップ方法は、本明 細書中でＳ_pとして表す予備一致度得点(preliminary closencess-of-fit score) の計算56と、最高得点アミノ酸配列に関する相関関数の計算58とを含む。ある具 体例では、Ｓ_pを下記の式に従って計算する： Ｓ_p＝(Σｉ_m)*ｎ_i*(１＋β)*(１−ρ)／ｎτ （１） 前記式中、ｉ_mは一致した強度、ｎ_iは一致したフラグメントイオンの数、βはｂ 型及びｙ型イオンの連続性、ρはインモニウムイオン及び予測配列中のそれぞれ のアミノ酸の存在、ｎ_tはフラグメン トイオンの総数を表す。因子βは一連のフラグメントイオンの連続性を評価する 。現時点のｂ型又はｙ型イオンの直前のイオンに対してフラグメントイオンの一 致が存在していた場合には、βは0.075インクリメントされる（初期値0.0から） 。その結果、ｂ型及びｙ型イオンの連続的連なりに一致するペプチドの予備得点 が増加する。なぜなら、同じ型のイオンの長い連なりがMS／MSスペクトル中にし ばしば観察されるからである。因子ρは質量スペクトルの低質量末端におけるイ ンモニウムイオンの存在を評価する。インモニウムイオンは、配列中のある種の アミノ酸の存在を示すものである。インモニウムイオンが、40.0より大きい正規 化強度を有する未知のペプチドの処理データファイル中に、それぞれヒスチジン 、フェニルアラニン及びチロシンの存在を示す110.0，120.0又は136.0Da(±1.0D a)で存在すれば、評価中の配列は、インモニウムイオンによって示されるアミノ 酸の存在について検査される。ペプチドの予備得点Ｓ_pは因子（１−ρ）〔式中 、ρはその存在が低質量領域内に示されている３個のアミノ酸の各々に関するペ ナルティの総和である〕だけ増加又は減少する。個々のρは、対応する低質量ピ ークが存在し且つアミノ酸が配列中に存在しなければ値−0.15をとり、対応する 低質量ピークが存在し且つアミノ酸が配列中に存在すれば値＋0.15をとり、ある いは低質量ピークが存在しなければ値0.0をとる。総ペナルティは、−0.45（３ 個の低質量ピークの全部がスペクトル中に存在するが、３個のアミノ酸のいずれ も配列中に存在しない）から＋0.45（３個の低質量ピークの全部がスペクトル中 に存在し、３個のアミノ酸の全部が配列中に存在する）に及び得る。 予備一致度得点Ｓ_pの計算に続いて、最高Ｓ_p得点を有する予測質量スペクトル 候補を、相関関数を用いて更に分析するために選択する58。更に分析するために 選択する予測質量スペクトル候補の数 は、コンピューターリソースと使用できる時間とに大きく依存する。ある具体例 では、最高の予備得点を有する300個のペプチド配列候補を選択した。 相関関数を計算するために58、実験的に導出したフラグメントスペクトルを、 Ｓ_pの計算の前に使用した前処理32とは幾らか異なる方法で前処理する。相関関 数のために、前駆体イオンをスペクトルから除去し、スペクトルを10個のセクシ ョンに分割した。次いで、各セクションのイオンを50.0に正規化した。セクショ ン毎に正規化したスペクトル60を用いて相関関数を計算した。ある具体例では、 二つの関数の間の不連続相関（discrete correlation）を下記のように計算する ： 前記式中、τは遅延値である。不連続相関定理は、二つの実関数ｘ及びｙの不連 続相関が不連続フーリエ変換対（discrete Fourier transformpair） Ｒτ−ＸτＹ^*τ （３） の一員であると述べている。前記式中、Ｘ（ｔ）及びＹ（ｔ）はｘ（ｉ）及びｙ （ｉ）の不連続フーリエ変換であり、Ｙ^*は共役複素数を表す。従って、交差相 関(cross-correlation)は、高速フーリエ変換(FFT)アルゴリズムと、一つの変換 と他の変換の共役複素数との掛け算と、得られた積の逆変換とを用いて、二つの データセットのフーリエ変換により計算できる。ある具体例では、総ての予測ス ペクトル及び前処理した未知のスペクトルを4096個のデータポイントにゼロパッ ドした。なぜなら、MS／MSスペクトルは（相関定理が意図するように）周期的で はなく、FFTアルゴリズムはＮが２の整数の累乗であることを要求し、従って最 終結果の考慮が必要だか らである。各ペプチド配列候補に与えられる最終得点は、−75＜ｔ＜75の範囲に わたる交差相関関数の平均値をＲ（０）から引き算したものである。Powell及び Heiftje，Anal．Chim．Acta.，Vol．100，pp．313-327(1978)に記載されている この修正「相関パラメーター」は、単なるスペクトル相関関数Ｒ（０）より優れ た識別を示す。粗点は1.0に正規化する。ある具体例では、出力62は正規化した 粗点と、ペプチド質量候補と、非正規化相関関数と、予備得点と、フラグメント イオン連続性βと、インモニウムイオン因子ρと、フラグメントイオンの総数の うち一致したｂ型及びｙ型イオンの数と、これらイオンの一致した強度と、タン パク質受託番号と、ペプチド配列候補とを含む。 所望であれば、相関関数58を用いて、予測質量スペクトル22のうちの一つを、 実験的に導出したフラグメントスペクトル16に対応するものとして自動的に選択 することができる。しかしながら好ましくは、ライブラリー20由来の複数の配列 を出力し、単一配列の最終選択を熟練したオペレーターが実施する。 タンパク質配列ライブラリーからの質量スペクトルの予測以外に本発明はヌク レオチドデータベースに基づく質量スペクトルの予測も含む。この操作は、ヌク レオチド配列を循環する同じアルゴリズム手法を用いる。三塩基コドンをタンパ ク質配列に変換し、アミノ酸の質量を第４図の加算と類似の方法で合計する。ヌ クレオチド配列を循環するために、各サイクル毎に一塩基インクリメントを使用 する。このようにすると、一回のパスで、３個の読取り枠の各々に関するアミノ 酸配列の決定が可能になる。探索のための採点及び報告操作は、タンパク質デー タベースについて上述したものと同じであってよい。 使用できる計算及び時間リソースによっては、データ減少技術を 使用すると有利であり得る。これらの技術は、探索速度に余り作用せずに、スペ クトル中の最も情報豊かなイオンを重要視するのが好ましい。ある技術は、MS／ MSスペクトル中のフラグメントイオンの一部のみを考慮する。ペプチドのスペク トルは3,000個ものフラグメントイオンを含み得る。あるデータ減少法では、イ オンを強度によってランキングし、最も強いイオンの一部（例えば上位200個の 最強イオン）を比較に使用する。別の手法は、スペクトルを例えば４又は５個の 領域に細分し、各領域の50個の最強イオンをデータセットの一部として使用する 。更に別の手法では、イオンがシーケンスイオンである確率に基づいてイオンを 選択する。例えば、17もしくは18ドルトンの損失(NH₃もしくはH₂O)又は28ドルト ンの損失（CO）のようなｂ型又はｙ型イオンを示す特徴を含む57〜186ドルトン の質量窓(GLYからTRPまでの20個の共通アミノ酸の質量インクリメント範囲)内に 存在するイオンを選択し得る。 上述の技術は一般的には、比較的短いアミノ酸配列を有するのが典型的な荷電 状態＋１又は＋２のペプチドのスペクトルに適用できる。より長いアミノ酸配列 を使用すると、タンパク質配列に対する唯一の一致（unique match）の確率が増 加する。しかしながら、より長いペプチド配列はベースのアミノ酸をより多く含 む可能性がより高く、従って電気噴霧イオン化条件下でより大きい荷電状態のイ オンを発生する。本発明は具体例の一つで、高電荷ペプチド（＋３，＋４，＋５ 等）のMS／MSスペクトルを用いてデータベースを探索するためのアルゴリズムを 提供する。ある手法では、探索プログラムが、MS／MS分析で使用される前駆体イ オンの荷電状態（Ｎ）に関する入力を含む。Ｎより小さい各荷電状態毎に予測フ ラグメントイオンが発生する。例えば、＋４のペプチドの場合には、荷電状態＋ １，＋２及び＋３が各フラグメントイオン毎に発生し、MS／MSスペ クトルと比較される。 多価スペクトルに使用するための第二の手法は、多価フラグメントイオンを電 荷数１に変換するための数学的デコンボリューションの使用である。デコンボリ ューションしたスペクトルは、多価フラグメントイオン用のフラグメントイオン と電荷数１のフラグメントイオンとを含む。 データベースの探索速度を高めるために、指示探索手法（directed-search ap proach）を使用し得る。実験を特定の生体又は特定種類のタンパク質について実 施する場合は、最初のパスでデータベース全体を探索する必要はない。代わりに 、ある種又はあるタンパク質類に特異的なタンパク質配列の探索を最初に実施し 得る。この探索で妥当な応答が得られなければ、データベース全体を探索する。 予備一致度又は相関性の決定には多くの異なる採点アルゴリズムを使用し得る 。一致したイオンの数に強度の合計を掛けた値に基づく採点以外に、スペクトル 内のシーケンスイオンによって表される連続シーケンスカバリッジ（continuous sequence coverage）の割合に基づく採点も可能である。例えば、10残基ペプチ ドは潜在的にｂ型及びｙ型シーケンスイオンを９個づつ含む。一組のイオンがＢ₁ からＢ₉まで存在していれば得点100が与えられるが、シーケンスの途中に不連 続が観察されれば、例えばＢ₅イオンが欠失していれば、ペナルティが課せられ る。最高得点は、ｂ方向及びｙ方向の両方に連続した一連のイオンを含むアミノ 酸配列に与えられる。 前述の採点操作で明確な応答が得られない場合は、分子量の値と縮小フラグメ ントイオンセットとを用いて最初にデータベースを探索する別のスペクトル比較 方法を使用し得る。データベースの最初のフィルタリングは、前述の方法のいず れかでシーケンスイオンを一致させ、得点を発生させることによって行う。その 結果得られた 一組の応答を、修正完全MS／MSスペクトルを用いてより厳密な検査プロセスにか ける。第二段階の分析には、スペクトルライブラリー探索用に開発された幾つか のスペクトル一致法の一つを使用する。そのためには、そのアミノ酸配列に関し て予測したシーケンスイオンに基づくペプチド配列の「ライブラリースペクトル 」を形成しなければならない。この「ライブラリースペクトル」のシーケンスイ オンの強度値は実験スペクトルから得られる。フラグメントイオンがｍ／ｚ256 に予測されれば、ｍ／ｚ＝256で実験スペクトル内の該イオンの強度値を、予測 スペクトル内のイオンの強度として使用する。従って、予測スペクトルが「未知 」のスペクトルと同じであれば、それは理想スペクトルを表す。次いで相関関数 を用いてスペクトルを比較する。一般的には、前記操作の計算時間の大半は反復 探索プロセスに費やされると考えられる。データベースの一回のパスにおける多 重MS／MSスペクトルの分析を多重化すれば、効率の全面的改善が実現される。ま た、後続ステップで分析する配列数を増加又は減少すれば、最初の予備フィルタ リングで使用する質量許容差が探索時間に作用し得る。探索速度を上げる別の手 法では、二進暗号化体系を使用する。即ち、ピークが特定の闘値より大きいかど うかに応じて、質量スペクトルを各質量毎にピーク／非ピークとしてコード化す るのである。タンパク質配列ライブラリーの集中的使用が考えられる場合には、 分析の少なくとも一部を計算ではなくテーブル索引によって実施できるように、 所定の質量範囲内の総てのサブ配列の予測質量値を計算し記憶することが可能で あり得る。 第6A図〜第6E図は、本発明の一具体例による分析方法を流れ図で示している。 前述のようにタンデム型質量分析計からデータを得た後602、データをファイル に保管し、ASCIIフォーマットに変換する604。この時点で前処理操作が開始され る606。ユーザーは、前 駆体イオン荷電状態のペプチド質量に関する情報を入力する608。質量／強度値 がASCIIファイルからロードされ、これらの値は単位質量に四捨五入される610。 このデータの予め識別された前駆体イオンの寄与を除去する612。残りのデータ を最大強度100に正規化する614。この時点から、異なる経路をとることができる 。ある経路では、インモニウムイオン（Ｈ，Ｆ及びＹ）の存在が示され616、ペ プチド質量及びインモニウムイオンの情報がデータファイルに記憶される618。 別のルートでは、200個の最強ピークが選択される620。二つのピークが相互間に 所定の距離(例えば２amu)をおいていれば、強度の低い方のピークがより大きい 強度と同等にセットされる622。この操作の後、データは予備採点のためにデー タファイルに記憶される624。別のルートでは、データが複数の窓、例えば10個 の窓に分割される626。各窓内で正規化が行われ、例えば最大強度50に正規化さ れる628。このデータは次いで最終相関採点のためにデータファイルに記憶され る630。これで、この具体例の前処理段階が終了する632。 データベース探索が開始され634、探索パラメーターと、前処理操作（第6A図 ）で得られたデータとがロードされる636。最初のバッチのデータベースシーケ ンスがロードされ638、探索操作が特定タンパク質について実施される640。探索 操作は第6C図に詳細に示す。バッチの最後に到達しない限りインデックスがイン クリメントされ642、探索ルーチンが繰り返される640。バッチの最後に到達した ことが確認されると644、データベースの最後に到達しない限り、第二のインデ ックス646がインクリメントされ、新しいデータベースシーケンスバッチがロー ドされる638。データベースの最後に到達すると628、相関分析が実施され630(第 6E図に詳細に示す)、結果が印字され632、操作が終了する634。 探索操作が開始されると638（第6C図）、インデックスI1がゼロにセットされ て646、探索中のアミノ酸内の候補ペプチドの開始位置が示される640。第二のイ ンデックスI2、即ち探索中のアミノ酸内の候補ペプチドの終結位置を示すインデ ックスは最初にI1と同等にセットされ、変数Pmass、即ち候補ペプチドの累積質 量を示す変数はゼロに初期化される648。所与の候補ペプチドについて操作を反 復する毎に650、位置I2のアミノ酸の質量がPmassに加算される652。次いで、こ れまで累積されてきた質量(Pmass)が入力質量（即ちペプチドの質量）と同等で あるかどうかが調べられる654。ある具体例では、この検査を、前述のように厳 密な同等を必要とするのではなく、±許容差として実施し得る。同等（任意に許 容範囲内で）であることが確認されれば、分析ルーチンが開始される656(第6D図 に詳細に示す)。そうでなければ、Pmassが入力質量より小さい（任意に許容範囲 内で）かどうかが調べられる。小さくなければ、インデックスI2がインクリメン トされ658、次の位置（インクリメントされたI2位置）のアミノ酸の質量がPmass に加算される652。Pmassが入力質量より大きければ(任意に許容差より大きい値 で660)、インデックスI1がタンパク質の末端にあるかどうかが調べられる662。 そうであれば、探索ルーチンが抜ける664。そうでなければ、インデックスI1が インクリメントされて666、ルーチンが候補ペプチドの新しい開始位置で開始で きるようになり、探索操作はブロック648に戻る。 分析操作が始まると670(第6D図)、候補ペプチドのｂイオン及びｙイオンを示 すデータが前述のように発生する672。ピークが上位200個のイオンの中にあるか どうかが調べられる674。ピーク強度が合計され、フラグメント化一致インデッ クスがインクリメントされる676。先行ｂイオン又はｙイオンが一致していれば6 78、βイ ンデックスがインクリメントされる680。そうでなければ、総てのフラグメント イオンが分析されたかどうかが調べられる。分析されていなければ、フラグメン トインデックスがインクリメントされ684、操作はブロック674に戻る。分析され ていれば、前述のＳ_pのような予備得点が計算される686。新たに計算されたＳ_p が最低得点より大きければ688、ペプチド配列は配列が既に記憶されていない限 り記憶され690、その場合は操作が抜ける692。 相関分析の始めに（第6E図）、記憶した候補ペプチドが選択される693。候補 ペプチドの理論的スペクトルが形成され694、実験データと相関され695、前述の ように最終相関得点が得られる696。総ての候補ペプチドが採点済みでない限り6 98、インデックスがインクリメントされ697、プロセスがブロック693から繰り返 される。総ての候補ペプチドが採点済みであれば、相関分析操作は抜ける699。 以下の実施例は本発明を明らかにするためのものであって、限定するものでは ない。実 験 実施例＃１ 抗体アフィニティクロマトグラフィーを用いて、HLA-DRB^*0401で形質転換した HS-EBV細胞からMHC複合体を分離した。結合ペプチドを解き放し、Centricon 10 スピンカラムでの濾過によって分離した。ヒト白血球に由来するグリコサパルギ ナーゼのＨ鎖が分離された。該タンパク質を10mM Ca⁺⁺含有50mM重炭酸アンモニ ウムpH8.6に溶解して、タンパク質分解消化を実施した。トリプシンを100／１の タンパク質／酵素比で加えた。 得られたペプチド混合物の分析を、LC−MS及びLC−MS／MSで実施した。要約す れば、HPLC勾配を通して300〜1600の質量範囲にわた り400Da／秒の速度でQ3又はQ1を走査することにより、ペプチドの分子量を記録 した。Ｑ₁内で６amu(FWHH)の広い窓を用いて前駆体イオンを選択し、アルゴンで 圧力３〜５mtorrまで満たされた衝突セル内にイオンを通すことにより、第二のH PLC分析時にペプチドの配列分析を行った。衝突エネルギーは20〜50eVのオーダ ーであった。Ｑ₂で発生したフラグメントイオンをＱ₃に送り、50Daから前駆体イ オンの分子量までの質量範囲を500Da／秒で走査してフラグメントイオンを記録 した。36個のペプチドの低エネルギースペクトルを記録し、ディスクに記憶した 。genpeptデータベースはヌクレオチド配列から翻訳されたタンパク質配列を含 んでいる。該データベースのテキスト探索を行って、分析に使用したペプチドア ミノ酸配列の配列がデータベース内に存在するかどうかを調べた。次いで、含ま れていないペプチドのアミノ酸配列を付加することにより、データベース全体か ら第二のデータベースを形成した。 スペクトルデータを質量及び強度リストに変換し、前駆体イオンに関する値を ファイルから除去した。総ての強度値の平方根を計算し、最大強度100.0に正規 化した。200個の最強イオンを除く総てのイオンをファイルから除去した。残り のイオンを10個の質量領域に分割し、各領域内で最大強度を100.0に正規化した 。両隣から3.0ドルトン以内の各イオンには、近隣の強度が自己の強度より大き ければ、大きい方の強度値が与えられた。この処理データを、データベース探索 から選択した配列候補と比較するために記憶した。MS／MSスペクトルを、相関関 数の計算のために異なる方法で修正した。前駆体イオンをスペクトルから除去し 、スペクトルを10個の同等セクションに分割した。次いで各セクションのイオン を50.0に正規化した。このスペクトルを用いて、データベースから検索した各ア ミノ酸配列の予測MS／MSスペクトルに対する相関係数を計算した。 アミノ酸の平均質量を用いてアミノ末端（ｎ）から直鎖アミノ酸配列の質量を 合計することにより、各タンパク質に由来するアミノ酸配列を形成した。直鎖配 列の質量が未知ペプチドの質量より大きい場合には、アルゴリズムがアミノ末端 アミノ酸に戻り、ｎ＋１位置からアミノ酸質量の加算が開始された。このプロセ スは、総ての直鎖アミノ酸配列の組合わせが評価されるまで繰り返された。アミ ノ酸配列の質量が未知ペプチドの質量の±0.05％（最低で±１ Da）の範囲内に ある時にはｂ型及びｙ型イオンの予測ｍ／ｚ値が発生し、未知配列のフラグメン トイオンと比較された。予備得点（Ｓ_p）が発生し、最高の予備得点を有する上 位300個のペプチド配列候補がランキングされ記憶された。上位300個のアミノ酸 配列候補の最終分析を相関関数を用いて実施した。この関数を用いて、候補配列 の理論的MS／MSスペクトルを修正実験MS／MSスペクトルと比較した。相関計数が 計算され、ランキングされ、報告された。最終結果を正規化相関係数に基づいて ランキングした。 第５図に示すスペクトルは、DRB^*0401MHCクラスII複合体に結合したペプチド のLC−MS／MS分析によって得たものである。74,938個のタンパク質配列を含むge npeptデータベースの探索で、このペプチドの分子量の±0.05％(最低で±1Da)の 質量許容差内のペプチドが384,398個識別された。これらのアミノ酸配列の各々 について予測されるフラグメントイオンパターンを前処理MS／MSスペクトルと比 較し、予備得点を計算することによって、候補配列の数を300で打ち切った。次 いで、これらの各配列の予測MS／MSスペクトルと修正実験MS／MSスペクトルとを 用いて相関分析を実施した。第５図のスペクトルを用いたgenpeptデータベース の探索の結果を表１に示す。類似の配列、DLRSWTAADAAQISK［配列番号１］、DLR SWTAADAAQISQ［配列番号２］を有する二つのペプチドは最高得点配列（Ｃ_n 値）であると認められた。これらの配列の相関係数は全く同じであり、従って 表１に示すこれらの配列のランキングは任意的なものである。アミノ酸配列DLRS WTAADAAQISK［配列番号１］はgenpeptデータベースの５個のタンパク質に見られ るが、配列DLRSWTAADAAQISQ［配列番号２］は１個のタンパク質にしか見られな い。上位３個の配列は免疫学的に相関したタンパク質に見られ、残りのタンパク 質は互いに相関していないと思われる。genpeptデータベースのホモサピエンス サブセットを用いて、同じMS／MSスペクトルを使用する第二の探索を実施し、結 果を比較した。これらのデータは表２に示す。どちらの探索でも、正しい配列は 互角でトップ位置にあった。どちらのアミノ酸配列も同じ相関係数Ｃ_nを有する が、配列はＣ末端のLys及びGlnで異なっている。これら二つのアミノ酸は同じ公 称質量を有しており、類似のMS／MSスペクトルを発生すると予想される。これら 二つのペプチドの一致したフラグメントイオンの正規化フラグメントイオン強度 の合計Ｉ_mは、大きい方の値を有する正しい配列では異なる。正しい配列は、前 処理スペクトル内でこのアミノ酸配列の予測フラグメントイオンの70％を識別す る予備採点操作で別のフラグメントイオンとも一致した。これらの一致は予備採 点操作の一部として調べられる。 実施例＃２ サッカロミセス セレビシエ(S．cerevisiae)細胞に由来する全タンパク質の タンパク質分解によって得たペプチド混合物の複合度を調べるために、10⁸個の 細胞を増殖し回収した。溶解後、約９mlの溶液中に全タンパク質が含まれていた 。0.5mlアリコートを採取して、酵素トリプシンでタンパク質分解した。この溶 液のうち２μｌをミクロ−LC（液体クロマトグラフィー）カラムに直接注入して MS分析を行った。ペプチドの複合混合物中には多種多様なペプチドイオンが同じ ｍ／ｚで存在し得、増加バックグラウンドに寄与し、MS／MS分析及び解読を複雑 にし得ると考えられる。これらのペプチド複合混合物からMS／MSによって配列情 報を得る能力を調べるために、オンラインMS／MS分析で前記混合物からイオンを 選択した。スペクトルが別のペプチド由来のフラグメントイオンで汚染されてい ることはなかった。識別された配列の部分リストを表３に示す。 表１に示したMS／MSスペクトルを、前述のデータベース探索方法を用いて解読 した。この方法は、MS／MSスペクトルを、予め決定したアミノ酸配列に一致させ るためのデータプレフィルターとして機能する。データをプレフィルタリングに かけると、解読努力を、予めわかっていないアミノ酸配列に集中させることがで きる。MS／MS スペクトルの一部に関する結果を表４に示す。探索の前にシーケンスイオンの予 備指定又は手動解読は必要ない。しかしながら、データベース内に配列が存在し ていなければならない。アルゴリズムはまずMS／MSデータを前処理し、次いで、 MS／MSスペクトルの前駆体イオンの質量の±１amu範囲にあるデータベース内の 総てのアミノ酸配列を比較した。質量許容差内のアミノ酸配列の予測フラグメン ト化パターンを実験スペクトルと比較した。アミノ酸配列が前記質量許容差内に あれば、MS／MSスペクトルを再構成し実験スペクトルに対する相関分析を実施す ることによって、最終一致度測定値が得られた。表４は該アルゴリズムの効率を 検査するために使用した多数のスペクトルを列挙している。 ホスホリル化ペプチドのMS／MSスペクトルを分析するために前述のコンピュー タープログラムを修正した。このアルゴリズムでは、Thr，Ser及びTyrのような 総ての種類のホスホリル化が考慮される。アミノ酸配列をデータベース内で走査 して、分析中のペプチドの質量より小さい80amuの倍率である配列直線長さを見 つける。この分析では、推定上の各ホスホリル化位置が考慮され、再構成MS／MS スペクトルを実験スペクトルに一致させる試みがなされる。 実施例＃３ ゲノムプロジェクトによって発生した情報の多くはヌクレオチド配列の形態を 有する。遺伝子に相関できるヌクレオチド配列長さをタンパク質配列に翻訳し、 特定データベース(genpept)に記憶する。非翻訳ヌクレオチド配列は、タンパク 質配列に関連し得る豊富なデータを表す。本発明は、タンパク質配列データベー スと同じ方法でヌクレオチドデータベースを探索することを可能にする。操作は 、ヌクレオチド配列を循環する同じアルゴリズム手法を使用する。三塩基コドン をタンパク質配列に変換し、アミノ酸の質量を合計する。ヌクレオチド配列を循 環するために、一塩基インクリメントを各サイクル毎に使用する。このようにす れば、一回のパスで三つの読取り枠の各々に関するアミノ酸配列の決定が可能に なる。例えば、配列ASP-Leu-Arg-Ser-Trp-Thr-Ala〔配列番号43〕(（Ｍ＋Ｈ）＋ ＝848)についてMS／MSスペクトルが発生する。アルゴリズムは下記の方法でヌク レオチド配列を探索する。 アミノ酸配列がペプチドの質量と一致しているため、予測シーケンスイオンをMS ／MSスペクトルと比較する。この時点以降は、探索の採点及び報告操作はタンパ ク質データベースの場合と同じである。 前述の説明から、本発明の多くの利点が知見される。本発明は、タンパク質、 ペプチド又はオリゴヌクレオチドの質量スペクトルを、比較的正確で高速で自動 化しやすい（即ちヒトの判断を行う必要のない操作が可能な）方法で、ヌクレオ チド又はタンパク質配列データベースに相関させることを可能にする。本発明は 、タンパク質混合物に由来するペプチドの分析に使用することができ、従って特 異的な公知のタンパク質分解開裂によって発生するような完全均一タンパク質の 分析に限定されない。 本発明の多くの変形及び改変実施態様も使用できる。本発明は、 多くの異なるタンパク質又はペプチド源について使用することができ、質量分析 法及びタンパク質を使用する任意の分析に適用できると考えられる。前述の実施 例以外に、本発明は例えば、細胞を回収し、細胞を溶解してタンパク質を得、タ ンパク質を例えば酵素反応器で消化し、前述のような質量分析法で分析すること によって発酵プロセスを監視する場合にも使用できる。この具体例では、生体デ ータベース（例えば酵母菌データベース）の探索を用いてデータを翻訳し得る。 別の具体例として、本発明はタンパク質の由来源である生体の種を決定するため に使用し得る。分析は、全タンパク質の消化に由来する一組のペプチドを使用す る。即ち、生体由来の細胞を溶解し、タンパク質を回収し、消化する。質量分析 データを、最も豊富なペプチドで集める。一群のスペクトル（例えば５〜10個の スペクトル）を使用してデータベース全体を探索する。スペクトルは種の既知タ ンパク質に適合するはずである。この方法は細胞内で最も豊富なタンパク質を使 用するため、これらの生体の配列が配列決定され、データベース内に存在する可 能性は高いと考えられる。ある具体例では、比較的少数の細胞を分析に使用し得 る（例えば10⁴〜10⁵個のオーダー）。 例えば、本発明の方法は微生物、細胞表面タンパク質等の同定に使用すること ができる。微生物を同定する場合には、操作は細胞タンパク質のタンパク質分解 消化によって生成したペプチドから得られるタンデム質量スペクトルを使用し得 る。生成されたペプチド複合混合物は、タンデム型質量分析計へのHPLCオンライ ンによって分離する。ペプチドがカラムから溶離される間に、第一の質量分析計 でペプチドイオンを選択し、これを衝突セルに送り、得られたフラグメントイオ ンの質量／電荷数（ｍ／ｚ）比を第二の質量分析計で記録することにより、タン デム質量スペクトルが得られる。このプ ロセスはHPLC分析の行程全体にわたって実施され、多数のスペクトルの集まり（ 例えば10〜200個以上）を発生する。各スペクトルは微生物のタンパク質（遺伝 子）プールに由来するペプチドを表すため、スペクトルの集まりは、随意に、微 生物の一つ以上の族、属、種、血清型又は株特異的マーカーの開発に使用できる 。 微生物の同定は、少なくとも三つのソフトウエア関連技術のうちの一つを用い て実施する。第一の技術、データベース探索では、タンデム質量スペクトルを用 いてタンパク質及びヌクレオチドデータベースを探索し、スペクトルによって表 されるアミノ酸配列を同定する。生体の同定は、質量分析で得られたスペクトル の圧倒的多数が、先に特定生体に由来すると同定されたタンパク質と一致した時 に達成される。この方法でデータベースを探索するための手段は前述の通りであ る。 第二の技術では、例えば前述のデータベース探索を用いて確実な一致が観察さ れなかった場合に、ライブラリー探索を実施し得る。この手法では、データセッ トを、既知の生体から得た所定スペクトルライブラリーと比較する。従って、最 初に既知の微生物からペプチドスペクトルライブラリーを形成する。微生物のタ ンデム質量スペクトルライブラリーは、LC−MS／MSを使用する幾つかの方法のい ずれかで構築できる。これらの方法は、細胞タンパク質が得られる場所と、LC− MS／MS分析の前に生成ペプチド混合物に使用される予備精製の量とを変えるため に使用できる。例えば、完全細胞をトリプシン、キモトリプシン、エンドプロテ イナーゼGlu−Ｃ、エンドプロテイナーゼLys−Ｃ、ペプシン等のようなタンパク 質分解酵素で処理して、細胞表面に露出しているタンパク質を消化し得る。一つ 以上のグリコシダーゼによる完全細胞の前処理は、細胞表面上の炭水化物の存在 によって発生し得る立体障害(steric interferenc e)を排除するために使用し得る。従って、グリコシダーゼによる前処理は、タン パク質分解ステップ時により大きいペプチド収率を得るために使用し得る。ペプ チドを形成する第二の方法は、細胞膜を破壊し（例えば超音波処理、低浸透圧衝 撃、凍結−解凍、ガラスビーズ等により）、例えばアセトン等を用いる沈殿によ り全タンパク質を回収する操作を含む。タンパク質は消化緩衝液に再懸濁し、ト リプシン、キモトリプシン、エンドプロテイナーゼglu−Ｃ、エンドプロテイナ ーゼlys−Ｃ等のようなプロテアーゼで処理して、ペプチド混合物を生成する。 このペプチド混合物を、例えば酸性画分及び塩基性画分に分離するか、又は強カ チオン交換クロマトグラフィーを用いて分離することにより部分的に単純化する と、幾つかのペプチドプールが得られ、これらのプールは次いで質量分析プロセ スで使用し得る。ペプチド混合物はLC−MS／MSで分析し、多数のスペクトルの集 合体を形成する。各スペクトルは生体又は細胞型の唯一のペプチドマーカーを表 す。 データは種々の手段のうちいずれかの手段でライブラリーに記憶するか、有利 には三つのセクションに記憶する。一つのセクションはスペクトルから決定した ペプチド質量であり、第二のセクションは生体、種、増殖条件等に関する情報で あり、第三のセクションは質量／強度データを含む。データは種々のフォーマッ トに記憶することができ、有利にはASCIIフォーマット又は二進フォーマットに 記憶できる。 ライブラリー探索を実施するために、まずペプチドの質量がライブラリースペ クトルの所定の質量許容差(典型的には約±１〜３amu)内にあるかどうかを決定 することによって、スペクトルを比較する。二つのスペクトルの類似性又は一致 度の定量値を得るために、前述の交差相関関数を使用する。このプロセスはデー タベース探索 アルゴリズムに類似しているが、スペクトルがアミノ酸配列に関して再構築され ない点が異なる。一組の比較スペクトルを与えるために、タンデム質量スペクト ルを用いて小さい（例えば約100タンパク質配列）ランダムに形成された配列デ ータベースを探索し得る。これによって、類似性を比較し正規化得点を発生する ためのバックグラウンドが与えられる。 微生物又は細胞を同定するための第三の関連技術は、スペクトルによって表さ れるペプチドと同じ質量を有する一組のアミノ酸配列を決定するための翻訳を新 たに使用する。この一組のアミノ酸配列は、配列をランキングするために、前述 のスペクトル前処理方程式１を用いて制限する。この一組のアミノ酸配列は次い で、前述の探索方法で使用するためのデータベースとして機能する。それによっ て、編成されたデータベース内に含まれていないタンデン質量スペクトルについ てアミノ酸配列が導出される。決定されたアミノ酸配列の系統発生的分析を使用 することにより、これらの配列を種、属又は族内に配置することができ、それに よって微生物の分類が達成される。 前述の方法は微生物の同定以外の用途も有する。例えば、特定の細胞系、組織 型又は微生物で発現される遺伝子の部分配列を得るために、一般的手段を用いて cDNA配列決定を行うことができる。この情報は次いでサブ配列分析用のデータベ ースとして機能する。細胞表面に露出しているタンパク質の酵素消化による消化 について前述した手法を用いて、LC−MS／MS分析用の一群のペプチドを形成する ことができる。得られたスペクトルは、アミノ酸配列をMS／MSスペクトルに一致 させるために、６個の読取り枠の総てにおいてヌクレオチド配列を探索するのに 使用される。同定されたアミノ酸配列は、細胞外スペースに露出された細胞表面 タンパク質の領域を表す。 この方法は、cDNA配列決定から直接得ることができない少なくとも二つの別の情 報を提供する。第一に、スペクトルは細胞膜上に存在するタンパク質を同定する 。第二に、細胞表面におけるタンパク質の折り畳みに関してサイデッドネス(sid edness)情報が得られる。ヌクレオチド配列情報に一致したペプチド配列は、細 胞外に露出されたタンパク質配列セグメントを同定する。 これらの方法は、炭水化物のMS／MSスペクトルの解読にも使用できる。この方 法では、該当する炭水化物をペプチドの場会と同様にタンデム型質量分析計への HPLCオンラインによって分離する。炭水化物は炭水化物複合混合物から得ること ができ、又は化学的もしくは酵素的遊離によってタンパク質、細胞等から得るこ とができる。第一の質量分析器で炭水化物イオンを選択し、これを衝突セルに送 り、得られたフラグメントイオンの質量／電荷数（ｍ／ｚ）比を第二の質量分析 器で記録することによりタンデム質量スペクトルが得られる。このプロセスはHP LC分析の行程全体にわたって実施され、多くのスペクトル（例えば10〜200個以 上）の集まりを発生する。データベースに含まれている炭水化物構造のフラグメ ント化パターンは予測可能であり、前述の方法を用いてスペクトルの理論的表示 をタンデム質量スペクトル内のパターンと比較することができる。それによって 、タンデム型質量分析計で分析された炭水化物を同定することができる。従って これらの方法は、タンパク質、細胞表面等に存在する炭水化物構造の特徴決定に 使用し得る。 本発明は、前述の、また実施例２でも述べたような診断用途に使用できる。別 の具体例は、ウイルス感染細胞の同定を含む。この種の手法の成功は、少なくと も現在の装置を用いた場合には、細胞タンパク質と比べてウイルスタンパク質の 方が多いかどうかに依存すると考えられる。ある病原体に共通のタンパク質の特 定領域に対し て抗体が形成されれば、材料をイムノアフィニティカラムに通すことによってタ ンパク質混合物を部分的に分別することができる。結合タンパク質を溶離し消化 する。質量分析によってデータベース探索用のデータが発生する。一つの重要な 要素は、細胞からタンパク質を引き出すための普遍的ハンドルを見つけることに ある。この手法は、特定の特徴的（diagnostic）タンパク質の分析にも使用でき る。例えば、あるタンパク質変異体が何らかの癌又は遺伝子疾患の形態で存在す ることがわかっていれば、変化しないタンパク質の領域に対して抗体を産生し得 る。他の総ての細胞タンパク質から該タンパク質を分離するために、抗体を用い てイムノアフィニティカラムを構成し得る。該タンパク質を消化し、タンデム型 質量分析法で分析する。該タンパク質中の総ての可能な突然変異のデータベース を維持し、実験データをこのデータベースに対して分析し得る。 可能な具体例の一つは嚢胞性繊維症である。この疾患はCFTRタンパク質の多数 の突然変異を特徴とする。一つの突然変異が症例の約70％に関与し、症例の残り の30％は様々な突然変異に起因する。これらの突然変異を遺伝子検査によって分 析するためには多くの異なる分析及びプローブが必要であろう。前述のアッセイ では、タンパク質を分離し、タンデム型質量分析計によって分析する。タンパク 質の総ての突然変異は構造情報に基づくアッセイで確認し得る。使用するデータ ベースは既知の突然変異を総て記述するのが好ましい。この手法の実施には大き な問題が伴うと考えられる。必要とされるタンパク質量が多すぎるため、これを 患者から得ることができない。この問題は、質量分析計の感度が将来改善されれ ば解決され得る。CFTRのようなタンパク質はトランスメンブランタンパク質であ り、この種のタンパク質は典型的には操作及び消化が極めて難しい。記載の手法 は任意の特徴的タンパク質に使用し得る。データは極 めて特異的であり、データ分析は本質的に自動化される。 本発明は任意の大きさのペプチドに使用し得ると考えられる。操作にはペプチ ドのフラグメント化が必要であるが、極めて大きいタンパク質をフラグメント化 する方法は幾つか存在する。この種の方法の一部は、Smithら、“Collisional A ctivation and Collision−Activated Dissociation of Large Multiply Charge d Polypeptides and Proteins Produced by Electrospray Ionization（電気噴 霧イオン化によって生じた大きい多価ポリペプチド及びタンパク質の衝突活性化 及び衝突活性化解離）”，J．Amer．Soc．Mass Spect．Ｉ：53-65(1990)に記載 されている。本発明の方法は、本発明で分析できるペプチドの大きさには理論的 又は絶対的な実際上の制限がないため、完全タンパク質に由来するデータの分析 に使用できる。本発明を使用する分析は、少なくとも約400amu（４残基）〜約25 00amu（26残基）の範囲の大きさのペプチドについて実施された。 記載の具体例では、分析実施時にサブ配列候補が識別され、フラグメントスペ クトルが必要に応じて予測される。配列候補の識別に必要な計算（例えばサブ配 列質量の計算）及び／又はスペクトル予測に必要な計算（例えばフラグメント質 量の計算）を実施するのに十分なコンピューターリソースと記憶容量とがあれば 、これらのアイテムを必要とするたびに計算する代わりにその一部又は全部をル ックアップできるように、これらのアイテムをデータベースに記憶することがで きる。 好ましい具体例、特定の変形例及び改変例を挙げて本発明を説明してきたが、 本発明は他の変形及び改変も可能であり、「請求の範囲」によって明確にされる ものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/68 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/68 // Ｈ０１Ｊ 49/34 9508−2Ｇ Ｈ０１Ｊ 49/34 (72)発明者 エング，ジェームス ケー. アメリカ合衆国，ワシントン 98188，シ ータック，サウス ワンハンドレットセブ ンティーセンブンス コート 4860 (72)発明者 リンク，アンドリュー ジェイ. アメリカ合衆国，ワシントン 98107，シ アトル，サーティーセカンド アベニュ ノース ウエスト ＃104，5501

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ペプチドフラグメント質量スペクトルを配列データベース由来のアミノ酸 配列に相関させるための方法であって： 少なくとも第一のペプチドの複数のフラグメントの第一の質量スペクトルを表 すデータを記憶し； 前記配列データベース内の複数の前記配列の少なくとも一部の複数の予測質量 スペクトルを計算し；そして 前記複数の予測質量スペクトルの各々について少なくとも第一の測定値を計算 することからなり、前記第一の測定値が前記第一の質量スペクトルと前記複数の 質量スペクトルの各々との間の一致度を示すものであるような方法。 ２．前記第一の質量スペクトルが、タンデム型質量分析計装置から与えられる 、請求項１に記載の方法。 ３．タンデム型質量分析計が、三重−四重質量分析計、フーリエ変換サイクロ トロン共鳴質量分析計、タンデム型飛行時間質量分析計及び四重極イオントラッ プ質量分析計のうちの一つである、請求項２に記載の方法。 ４．前記配列データベースが、複数のタンパク質のアミノ酸配列のデータベー スである、請求項１に記載の方法。 ５．前記配列データベースが、ヌクレオチドデーである、請求項１に記載の方 法。 ６．更に、前記配列データベースから第一の複数のサブ配列を選択するステッ プも含み、複数の予測質量スペクトルを計算する前記ステップが、選択した前記 第一の複数ののサブ配列の各々について少なくとも一つの予測質量スペクトルを 計算する操作を含む、請求項１に記載の方法。 ７．第一の測定値を計算する前記ステップが、所定の閾値より大きい強度を有 する値を前記第一の質量スペクトルから選択する操作を含む、請求項１に記載の 方法。 ８．更に、少なくとも第一の測定値を計算する前記ステップの前に前記第一の スペクトルを正規化するステップも含む、請求項１に記載の方法。 ９．複数の予測質量スペクトルを計算する前記ステップが、前記配列データベ ースの一部のみについて予測質量スペクトルを計算する操作を含む、請求項１に 記載の方法。 10．前記第一のペプチドが、第一の生体から得たタンパク質に由来し、前記配 列データベースの前記タンパク質が、前記第一の生体に存在するタンパク質の配 列を含む部分である、請求項９に記載の方法。 11．前記タンデム型質量分析計装置の第一の質量分析計を第一の質量を有する 成分の分離に使用し、前記質量分析計装置の活性化装置を前記第一の成分のフラ グメント化に使用し、前記タンデム型質量分析計装置の第二の質量分析計を前記 第一の質量スペクトルを与えるために使用する、請求項２に記載の方法。 12．前記第一のペプチドをクロマトグラフィーによって分離する、請求項１に 記載の方法。 13．前記第一の質量スペクトルを表す前記データが複数の質量／電荷数対を含 む、請求項１に記載の方法。 14．予測質量スペクトルを計算する前記ステップが： 前記複数の配列の部分から複数の質量を導出し、但し各質量は前記複数の配列 内のある配列の一部に対応するペプチドフラグメントの質量に等しく； 前記複数の質量から、前記第一のペプチドの質量の所定の質量許 容差内にある質量を選択し、選択した前記質量の各々がどの配列のどの部分に対 応するかという指示を記憶して、複数の候補配列部分を与え；そして 前記候補配列部分の各々について複数の質量／電荷数対を計算し、前記質量／ 電荷数対の各々が前記候補配列部分のうちの一つの一部に対応するペプチドフラ グメントの質量に実質的に等しい質量を有する；ことから成る請求項１に記載の 方法。 15．前記第一の測定値が相関係数からなる、請求項１に記載の方法。 16．第一の測定値を計算する前記ステップが： 前記複数の候補配列部分の各々について予備得点を計算し； 主候補部分として識別されない少なくとも一つの候補配列より大きい予備得点 を有する複数の主候補部分を識別し；そして 前記主候補部分の各々について相関係数を計算する、ことからなる請求項１に 記載の方法。 17．前記複数の質量スペクトル及び前記第一の質量スペクトルの各々が複数の 質量／電荷数対を含んでおり、各質量／電荷数対が強度値を有し、更に、前記複 数の質量スペクトルの各々について、前記第一の質量スペクトル内で対応するフ ラグメントから所定の差より小さい差を有する一組の一致フラグメントを識別す るステップも含み、前記予備得点が前記一組の一致フラグメントの中で予測質量 スペクトルを有するフラグメントの数に、前記一致フラグメントに対応する質量 ／電荷数対の強度値の合計を掛けたものである請求項８に記載の方法。 18．オリゴヌクレオチドの質量スペクトルを解読するための方法であって： ヌクレオチド配列ライブラリーを提供し； 前記ライブラリーからの複数のヌクレオチドサブ配列、即ちｎ量体より小さい 配列を総て含むヌクレオチドサブ配列をデータベース内に記憶し； 前記オリゴヌクレオチドの複数のフラグメントの第一の質量スペクトルを表す データを記憶し； 前記複数のヌクレオチドサブ配列の各々について予測質量スペクトルを計算し ；そして 前記予測質量スペクトルの各々について、前記第一の質量スペクトルに対し、 少なくとも第一の一致度測定値を計算する、ことからなる方法。 19．ｎが１０である請求項１８に記載の方法。 20．タンパク質混合物中のペプチドが配列データベース内のアミノ酸配列によ って特定される複数のタンパク質のうちのいづれかの一部に相応するかどうかを 調べるための方法であって： タンデム型質量分析計を用いて、前記タンパク質混合物から得られた複数ペプ チドを受容し、前記ペプチド混合物から少なくとも第一のペプチドを選択し、前 記第一のペプチドをフラグメント化し、ペプチドフラグメント質量スペクトルを 形成し； 前記第一の質量スペクトルを表すデータを記憶し；そして 前記質量スペクトルを前記配列データベース内のアミノ酸配列と相関させて、 前記配列データベース内で特定されたタンパク質と前記タンパク質混合物中のタ ンパク質との相似を調べる、ことからなる前記方法。 21．前記相関ステップが、前記アミノ酸配列から少なくとも一つの質量スペク トルを予測する操作を含む請求項20に記載の方法。 22．タンパク質混合物を、同定すべき細胞又は微生物から得る請求項20に記載 の方法。 23．タンパク質混合物を、細胞タンパク質のタンパク質分解消化によって得る 請求項22に記載の方法。 24．細胞タンパク質が細胞外タンパク質である請求項23に記載の方法。 25．同定すべき生体又はその成分から得たペプチドの一つ又は複数の質量スペ クトルが既知の生体のスペクトルライブラリーに含まれているかどうかを調べる ことにより所期の生体を同定する方法であって： タンデム型質量分析計を用いて、同定すべき前記生体から得たタンパク質混合 物から得られた複数のペプチドを受容し、前記複数のペプチドから少なくとも第 一のペプチドを選択し、前記第一のペプチドをフラグメント化し、ペプチドフラ グメント質量スペクトルを形成し； 前記第一の質量スペクトルを表すデータを記憶し；そして 前記質量スペクトルを既知の生体の前記スペクトルライブラリー内の質量スペ クトルに相関させて、前記スペクトルと、同定すべき生体から得たペプチドから 得られたスペクトルとの相似を調べ、それによって前記生体を同定することから なる方法。 26．同定すべき生体が細菌、真菌又はウイルスである請求項25に記載の方法。 27．タンパク質混合物を生体のタンパク質の酵素消化によって得る請求項25に 記載の方法。 28．炭水化物混合物から所期の炭水化物構造の特徴を決定するための方法であ って： タンデム型質量分析計を用いて、炭水化物混合物から得た複数の炭水化物を受 容し、タンデム型質量分析計の第一の質量分析計で炭水化物混合物から少なくと も第一の炭水化物を選択し、前記第一の 炭水化物をフラグメント化し、炭水化物フラグメント質量スペクトルを形成し； 前記第一の質量スペクトルを表すデータを記憶し；そして 前記質量スペクトルを既知の炭水化物のスペクトルデータベースと相関させて 、前記炭水化物データベース内で特定された炭水化物と、前記炭水化物混合物中 の炭水化物との相似を調べ、それによって所期の炭水化物の構造の特徴を決定す ることからなる方法。 29．炭水化物混合物を所期のグリコシル化タンパク質から得る請求項28に記載 の方法。 30．炭水化物混合物をタンパク質からの化学的又は酵素的遊離によって所期の グリコシル化タンパク質か得る請求項29に記載の方法。