JPH08308593A - 白血球の内因性ペルオキシダーゼ活性に基く、新鮮並びに時間を置いた全血試料についての白血球分画計数を実施するための改良された方法と試薬組成物 - Google Patents
白血球の内因性ペルオキシダーゼ活性に基く、新鮮並びに時間を置いた全血試料についての白血球分画計数を実施するための改良された方法と試薬組成物Info
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
-
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 新鮮及び時間をおいた血液試料を用いる、白
血細胞分画と分集団分析とを確度と精度を持って実行す
るため、改良された試薬組成物と方法とを提供する。 【解決手段】 自働血液学分析機および流通式サイトメ
トリーによる分析において、すすぎ液残余の悪影響を軽
減する特定のすすぎ溶液を使用する。
血細胞分画と分集団分析とを確度と精度を持って実行す
るため、改良された試薬組成物と方法とを提供する。 【解決手段】 自働血液学分析機および流通式サイトメ
トリーによる分析において、すすぎ液残余の悪影響を軽
減する特定のすすぎ溶液を使用する。
Description
【０００１】
【発明の分野】本発明は全血試料に関する、改良された
白血球（即ち、白血細胞）分画計数方法とその方法に用
いられる試薬組成物とに関する。本発明の白血球分画計
数法と試薬組成物とは白血球の内因性ペルオキシダーゼ
活性の測定に基いている。本発明の方法と組成物とは、
試料を光散乱および光吸収流通サイトメトリー（cytome
try)により電子−光学的に分析する際、新鮮血液試料お
よび、約４８時間室温あるいは冷下で貯蔵された、時間
をおいた試料について白血球分画計数を得ることの精度
と確度とを維持する。
白血球（即ち、白血細胞）分画計数方法とその方法に用
いられる試薬組成物とに関する。本発明の白血球分画計
数法と試薬組成物とは白血球の内因性ペルオキシダーゼ
活性の測定に基いている。本発明の方法と組成物とは、
試料を光散乱および光吸収流通サイトメトリー（cytome
try)により電子−光学的に分析する際、新鮮血液試料お
よび、約４８時間室温あるいは冷下で貯蔵された、時間
をおいた試料について白血球分画計数を得ることの精度
と確度とを維持する。
【０００２】
【発明の背景】全血試料中に通常見出される白血細胞即
ち白血球の５つの種類とは好中球とリンパ球と単核細胞
と好酸球と好塩基球とである。白血細胞のこれら５つの
正常型の相対的比率を測定するため、並びに全血試料中
の異常細胞の存在および濃度を検出するため、医学的診
断方法は因襲的に、顕微鏡スライド上の血液の乾燥し、
染色された塗抹標本の検査を実行する。この方法は白血
細胞分画と称せられ、Miale, J.B., "Laboratory Medic
ine-Hematology", (1967), C.V. Mosby Company,St. Lo
uis, Missouri, 822-830, 1126, 1127 および1130頁に
記載されている。血液試料中の白血球の前記の５種類に
加えて、白血細胞分画はまた巨大未染色細胞（large un
stained cell) （“ＬＵＣ”）も検出し、測定する。Ｌ
ＵＣは正常血液試料中の白血細胞の小部分を表わし、巨
大リンパ細胞と活性化されたリンパ細胞と血漿細胞と芽
細胞とペルオキシダーゼ陰性単核細胞と好中球と好酸球
とのような細胞型を包含する。
ち白血球の５つの種類とは好中球とリンパ球と単核細胞
と好酸球と好塩基球とである。白血細胞のこれら５つの
正常型の相対的比率を測定するため、並びに全血試料中
の異常細胞の存在および濃度を検出するため、医学的診
断方法は因襲的に、顕微鏡スライド上の血液の乾燥し、
染色された塗抹標本の検査を実行する。この方法は白血
細胞分画と称せられ、Miale, J.B., "Laboratory Medic
ine-Hematology", (1967), C.V. Mosby Company,St. Lo
uis, Missouri, 822-830, 1126, 1127 および1130頁に
記載されている。血液試料中の白血球の前記の５種類に
加えて、白血細胞分画はまた巨大未染色細胞（large un
stained cell) （“ＬＵＣ”）も検出し、測定する。Ｌ
ＵＣは正常血液試料中の白血細胞の小部分を表わし、巨
大リンパ細胞と活性化されたリンパ細胞と血漿細胞と芽
細胞とペルオキシダーゼ陰性単核細胞と好中球と好酸球
とのような細胞型を包含する。
【０００３】半自働化および完全自働化血液学方法およ
びそのための自働化流通システムは、Ansley等の米国特
許第３，７４１，８７５号とKim の米国特許第４，０９
９，９１７号とCrewins 等の米国特許第４，８０１，５
４９と４，９７８，６２４号中に記載の如く、白血細胞
分画と血液試料分析との負担を容易にするために開発さ
れた。その方法及びシステムは個別の細胞型を特異的に
検出、同定、定量および識別するために電子−光学的お
よび細胞化学的方法を用いる。その上、白血細胞分画の
ための手動の方法が技術で知られている。例えばMiale,
J.B. "Laboratory Medicine-Hematology", (1967), C.
V. Masby Company, St. Louis, Missouri.
びそのための自働化流通システムは、Ansley等の米国特
許第３，７４１，８７５号とKim の米国特許第４，０９
９，９１７号とCrewins 等の米国特許第４，８０１，５
４９と４，９７８，６２４号中に記載の如く、白血細胞
分画と血液試料分析との負担を容易にするために開発さ
れた。その方法及びシステムは個別の細胞型を特異的に
検出、同定、定量および識別するために電子−光学的お
よび細胞化学的方法を用いる。その上、白血細胞分画の
ための手動の方法が技術で知られている。例えばMiale,
J.B. "Laboratory Medicine-Hematology", (1967), C.
V. Masby Company, St. Louis, Missouri.
【０００４】Hamaguchi 等の米国特許第５，３８９，５
４９号は白血球の分類のために用いられる方法と試薬と
を記載していて、その方法は高周波数での電気的インピ
ーダンスの変化または粒子と流体媒質との間の導電率の
差の検出を包含し、試薬は、一分子当りオキシエチレン
繰返し単位１８〜３０を持つ特異型の陰イオン性並びに
非イオン性ポリオキシエチレン基礎の界面活性剤と、高
−あるいは低−浸透性薬剤と、溶解剤とを含有する１成
分または２成分溶液を必要とする。２成分試薬は第１希
釈流体と第２溶解試薬流体とを要する。
４９号は白血球の分類のために用いられる方法と試薬と
を記載していて、その方法は高周波数での電気的インピ
ーダンスの変化または粒子と流体媒質との間の導電率の
差の検出を包含し、試薬は、一分子当りオキシエチレン
繰返し単位１８〜３０を持つ特異型の陰イオン性並びに
非イオン性ポリオキシエチレン基礎の界面活性剤と、高
−あるいは低−浸透性薬剤と、溶解剤とを含有する１成
分または２成分溶液を必要とする。２成分試薬は第１希
釈流体と第２溶解試薬流体とを要する。
【０００５】Cremins 等の米国特許第４，８０１，５４
９および４，９７８，６２４号は、より速やかに実行さ
れ、白血細胞を損うことなく全血試料中の赤血細胞を溶
解し、細胞の最少限の細胞外沈澱あるいは凝集塊を起さ
せる方法および試薬を記載している。その様な沈澱また
は細胞凝集塊は方法の細胞検出および識別段階において
不明確さを生じさせる。記載されている方法（または
“ペルオキシダーゼ法”）は白血球類を染色し、そして
特別の細胞型を区別するために過酸化物（即ち過酸化水
素）と適当な色原体とを包含する混合物を包含する。
９および４，９７８，６２４号は、より速やかに実行さ
れ、白血細胞を損うことなく全血試料中の赤血細胞を溶
解し、細胞の最少限の細胞外沈澱あるいは凝集塊を起さ
せる方法および試薬を記載している。その様な沈澱また
は細胞凝集塊は方法の細胞検出および識別段階において
不明確さを生じさせる。記載されている方法（または
“ペルオキシダーゼ法”）は白血球類を染色し、そして
特別の細胞型を区別するために過酸化物（即ち過酸化水
素）と適当な色原体とを包含する混合物を包含する。
【０００６】これらの方法のどれにおいても、赤血細胞
が、正常血液においては約１，０００倍も白血細胞に数
では圧倒的であるから多くの赤血細胞を出来るだけ溶解
することが絶対に必要である。この故に、１％の赤血細
胞が残っていてさえ、確実な正確な白血細胞分画を達成
するのが困難である。
が、正常血液においては約１，０００倍も白血細胞に数
では圧倒的であるから多くの赤血細胞を出来るだけ溶解
することが絶対に必要である。この故に、１％の赤血細
胞が残っていてさえ、確実な正確な白血細胞分画を達成
するのが困難である。
【０００７】米国特許第４，８０１，５４９および４，
９７８，６２４号に開示されているペルオキシダーゼ法
においては、全血試料を、唯１つの界面活性剤と、パラ
ホルムアルデヒドまたはホルムアルデヒドの様な固定剤
と、糖または糖アルコールと、ほぼ中性のｐＨを維持す
るための緩衝剤とを包含する溶液と混合した後、赤血細
胞を溶解し、白血細胞を橋かけさせる。過酸化水素と電
子供与体色原体例えば４−クロロ−１−ナフトールと
は、ある白血細胞、即ち好中球と好塩基球と単核細胞と
の細胞質中にあるペルオキシダーゼ陽性顆粒中に暗紫色
の沈澱を形成する。沈澱は不溶性の反応生成物で、その
形成は細胞内顆粒中の内因性ペルオキシダーゼ酵素によ
り接触作用を受ける。細胞の型を区別することは、細胞
の大きさと染色の度合い（即ち前方散乱対吸光度）を細
胞１つずつ測定され、サイトグラムにプロットされ、そ
れから試料中の全白血細胞数と種々の型の白血細胞の分
画と両者を得るために分析するという電子−光学的分析
により行われる。その上、全白血細胞数は分画とは独立
して得ることができる。
９７８，６２４号に開示されているペルオキシダーゼ法
においては、全血試料を、唯１つの界面活性剤と、パラ
ホルムアルデヒドまたはホルムアルデヒドの様な固定剤
と、糖または糖アルコールと、ほぼ中性のｐＨを維持す
るための緩衝剤とを包含する溶液と混合した後、赤血細
胞を溶解し、白血細胞を橋かけさせる。過酸化水素と電
子供与体色原体例えば４−クロロ−１−ナフトールと
は、ある白血細胞、即ち好中球と好塩基球と単核細胞と
の細胞質中にあるペルオキシダーゼ陽性顆粒中に暗紫色
の沈澱を形成する。沈澱は不溶性の反応生成物で、その
形成は細胞内顆粒中の内因性ペルオキシダーゼ酵素によ
り接触作用を受ける。細胞の型を区別することは、細胞
の大きさと染色の度合い（即ち前方散乱対吸光度）を細
胞１つずつ測定され、サイトグラムにプロットされ、そ
れから試料中の全白血細胞数と種々の型の白血細胞の分
画と両者を得るために分析するという電子−光学的分析
により行われる。その上、全白血細胞数は分画とは独立
して得ることができる。
【０００８】本発明により提供される改良と有利さとの
以前に、アルカリ性ペルオキシダーゼ希釈剤が記載さ
れ、特にTechnicon H6000TM 自働化分析システムで行わ
れる白血細胞分類に関するアルカリ性ペルオキシダーゼ
法中に用いられていた。以前のアルカリ性ペルオキシダ
ーゼ希釈剤は主要な欠点例えば試薬成分の不安定性とそ
の結果として短い保存性と貯蔵性とを持っていた。その
上、利用者はアルカリ性ペルオキシダーゼ法実行のため
アルカリ性ペルオキシダーゼ希釈剤の均一な作業溶液を
調製する必要が要求された。このことは、利用者が高水
準（即ち４．５％）の硫酸ドデシルナトリウムを含有す
る溶液と高水準（即ち３０％）のBrijTM３５を含有する
溶液とを一緒に混合し、それによって２つの種類の高め
られた濃度を持つ作業アルカリ性ペルオキシダーゼ希釈
剤をもたらさなければないことにより達成されている。
その様な調製は得られる均一な作業アルカリ性ペルオキ
シダーゼ希釈剤が僅かに１週間だけしか安定でない故
に、刺激性の希釈試薬成分のみならず煩雑で何回も行わ
なければならなかった。後で明らかになる様に、アルカ
リ性ペルオキシダーゼ希釈剤の不安定性と短い貯蔵能力
と利用者の取扱い問題並びにそれに関連した商業的不利
はここに記載の本発明により非常に改良され、克服され
た。
以前に、アルカリ性ペルオキシダーゼ希釈剤が記載さ
れ、特にTechnicon H6000TM 自働化分析システムで行わ
れる白血細胞分類に関するアルカリ性ペルオキシダーゼ
法中に用いられていた。以前のアルカリ性ペルオキシダ
ーゼ希釈剤は主要な欠点例えば試薬成分の不安定性とそ
の結果として短い保存性と貯蔵性とを持っていた。その
上、利用者はアルカリ性ペルオキシダーゼ法実行のため
アルカリ性ペルオキシダーゼ希釈剤の均一な作業溶液を
調製する必要が要求された。このことは、利用者が高水
準（即ち４．５％）の硫酸ドデシルナトリウムを含有す
る溶液と高水準（即ち３０％）のBrijTM３５を含有する
溶液とを一緒に混合し、それによって２つの種類の高め
られた濃度を持つ作業アルカリ性ペルオキシダーゼ希釈
剤をもたらさなければないことにより達成されている。
その様な調製は得られる均一な作業アルカリ性ペルオキ
シダーゼ希釈剤が僅かに１週間だけしか安定でない故
に、刺激性の希釈試薬成分のみならず煩雑で何回も行わ
なければならなかった。後で明らかになる様に、アルカ
リ性ペルオキシダーゼ希釈剤の不安定性と短い貯蔵能力
と利用者の取扱い問題並びにそれに関連した商業的不利
はここに記載の本発明により非常に改良され、克服され
た。
【０００９】本発明以前、細胞分離並びに定量方法、特
に白血球分画のペルオキシダーゼ法の確度と信頼度とを
妨げる主要な欠点は方法においての一定しないすすぎ液
残余（rinse carryover)であった。すすぎ液残余がシス
テムからシステムに、分析から分析に変ることは知られ
ている。特にペルオキシダーゼ反応法に基づく白血球分
画分析（differential analysis)の確度と精度とは、方
法におけるそのような一定しないすすぎ液残余の影響を
蒙ることがしばしばである。技術に熟達した人達はすす
ぎ液残余は単に容積的希釈で方法に寄与し、すすぎ液残
余は方法の反応段階において活性なあるいは機能的役割
を演じないと推測していた。事実、本発明の創意に富む
発見までは、熟達した従集者はすすぎ液残余が血液試料
分析における単なる容積的効果以上のものであり、本発
明により提起され、ここに記載する問題に対して解答を
持たなかったこと悟らなかった。
に白血球分画のペルオキシダーゼ法の確度と信頼度とを
妨げる主要な欠点は方法においての一定しないすすぎ液
残余（rinse carryover)であった。すすぎ液残余がシス
テムからシステムに、分析から分析に変ることは知られ
ている。特にペルオキシダーゼ反応法に基づく白血球分
画分析（differential analysis)の確度と精度とは、方
法におけるそのような一定しないすすぎ液残余の影響を
蒙ることがしばしばである。技術に熟達した人達はすす
ぎ液残余は単に容積的希釈で方法に寄与し、すすぎ液残
余は方法の反応段階において活性なあるいは機能的役割
を演じないと推測していた。事実、本発明の創意に富む
発見までは、熟達した従集者はすすぎ液残余が血液試料
分析における単なる容積的効果以上のものであり、本発
明により提起され、ここに記載する問題に対して解答を
持たなかったこと悟らなかった。
【００１０】更に、新鮮（即ち採血後８時間乃至それ以
内）の血液試料と、また、約４８時間までの間室温に貯
蔵された時間をおいた血液試料とを分析し、それからの
有用な臨床的情報を抽出するための改良された試薬と方
法とを技術には必要としている。また一定しないすすぎ
液残余により生ずる新たに記載された問題を軽減し、特
に、それには限定されないが、いろいろな血液試料型、
例えば新鮮全血試料と時間をおいた全血試料と、異常全
血試料（例えば病院または患者源の）と、種々な方法
（例えば冷下または室温で）貯蔵された正常全血試料
（例えば非病院または“健康”な供給者源の）との電子
−光学分析業務において確度の高い、信頼性のある結果
を生む成分を包含している適当な試薬溶液と組成物とを
開発することも必要である。更に、非常に安定で、長い
寿命と貯蔵寿命（例えば１週間以上）を持ち、白血球分
画法を実施し、それからの結果を得るための使用に先立
ち、利用者または客の調製または処理を要しない試薬組
成物を技術において必要としている。また自働化分析機
を用いて室温貯蔵または時間をおいた血液試料に関する
分画を実施する場合、得られるサイトグラム源における
ノイズの受入れられる水準を達成しそして／または維持
することも必要である。
内）の血液試料と、また、約４８時間までの間室温に貯
蔵された時間をおいた血液試料とを分析し、それからの
有用な臨床的情報を抽出するための改良された試薬と方
法とを技術には必要としている。また一定しないすすぎ
液残余により生ずる新たに記載された問題を軽減し、特
に、それには限定されないが、いろいろな血液試料型、
例えば新鮮全血試料と時間をおいた全血試料と、異常全
血試料（例えば病院または患者源の）と、種々な方法
（例えば冷下または室温で）貯蔵された正常全血試料
（例えば非病院または“健康”な供給者源の）との電子
−光学分析業務において確度の高い、信頼性のある結果
を生む成分を包含している適当な試薬溶液と組成物とを
開発することも必要である。更に、非常に安定で、長い
寿命と貯蔵寿命（例えば１週間以上）を持ち、白血球分
画法を実施し、それからの結果を得るための使用に先立
ち、利用者または客の調製または処理を要しない試薬組
成物を技術において必要としている。また自働化分析機
を用いて室温貯蔵または時間をおいた血液試料に関する
分画を実施する場合、得られるサイトグラム源における
ノイズの受入れられる水準を達成しそして／または維持
することも必要である。
【００１１】
【発明の要約】本発明は電子−光学方法と流通式サイト
メトリー（cytometry)分析とを用い、新鮮並びに時間を
おいた全血試料両者における白血球を定量し、分画する
ための改良された試薬組成物と方法とを提供する。
メトリー（cytometry)分析とを用い、新鮮並びに時間を
おいた全血試料両者における白血球を定量し、分画する
ための改良された試薬組成物と方法とを提供する。
【００１２】本発明の目的は、１つの方法と他との間の
望ましからぬ反応成分の残余の問題を回避し、そうして
白血細胞分画を達成するのに用いる方法から得られるサ
イトグラム中の根源（origin）ノイズと細胞汚染との受
入れ難い水準なしに細胞の型の明瞭な分離と定量とを可
能にする。半−並びに完全−自働化システムに用いる、
最適で改良された試薬組成物と方法とを提供することで
ある。
望ましからぬ反応成分の残余の問題を回避し、そうして
白血細胞分画を達成するのに用いる方法から得られるサ
イトグラム中の根源（origin）ノイズと細胞汚染との受
入れ難い水準なしに細胞の型の明瞭な分離と定量とを可
能にする。半−並びに完全−自働化システムに用いる、
最適で改良された試薬組成物と方法とを提供することで
ある。
【００１３】更に本発明は、白血細胞分画法の反応段階
において何等機能的役割を演じず、特にペルオキシダー
ゼ法に関して方法の反応化学に関与しないすすぎ試薬溶
液を提供することにある。
において何等機能的役割を演じず、特にペルオキシダー
ゼ法に関して方法の反応化学に関与しないすすぎ試薬溶
液を提供することにある。
【００１４】本発明の他の目的は、種々な血液試料の型
例えば時間をおいた並びに新鮮な血液試料と異常および
正常血液試料と冷下および室温中に貯蔵された試料につ
いて正確で確実な結果を生む自働化ペルオキシダーゼ法
と試薬組成物とを提供することにある。
例えば時間をおいた並びに新鮮な血液試料と異常および
正常血液試料と冷下および室温中に貯蔵された試料につ
いて正確で確実な結果を生む自働化ペルオキシダーゼ法
と試薬組成物とを提供することにある。
【００１５】本発明の尚他の目的は、吸引流通式サイト
メトリーにより、全血試料中の白血細胞型を数え上げそ
して区別するペルオキシダーゼ法に使用の、改良された
試薬組成物を提供することにある。
メトリーにより、全血試料中の白血細胞型を数え上げそ
して区別するペルオキシダーゼ法に使用の、改良された
試薬組成物を提供することにある。
【００１６】本発明の尚他の目的は、自働化血液学分析
と流通式サイトメトリーと共に内因性ペルオキシダーゼ
染色を用いる、白血細胞分画と、全血試料の分集団分画
との速くて効率的定量測定のための最適化され、改良さ
れた方法と試薬組成物とを提供することにある。
と流通式サイトメトリーと共に内因性ペルオキシダーゼ
染色を用いる、白血細胞分画と、全血試料の分集団分画
との速くて効率的定量測定のための最適化され、改良さ
れた方法と試薬組成物とを提供することにある。
【００１７】本発明の他の目的は、白血細胞試料中の細
胞の好酸球分集団の分離を改善する試薬調製物を提供す
ることにある。
胞の好酸球分集団の分離を改善する試薬調製物を提供す
ることにある。
【００１８】本発明の他の目的は時間をおいた全血試料
のペルオキシダーゼ染色を包含する、白血細胞分画法の
反応段階を最適化し、方法におけるすすぎ液残余のどん
な負の影響も防止するためのバランスのとれた、安定な
試薬組成物を提供することにある。
のペルオキシダーゼ染色を包含する、白血細胞分画法の
反応段階を最適化し、方法におけるすすぎ液残余のどん
な負の影響も防止するためのバランスのとれた、安定な
試薬組成物を提供することにある。
【００１９】本発明の尚他の目的は、試薬組成物が便利
で使用し易く、使用前に使用者または客により付加的な
調製または混合を必要としない、安全で安定な試薬調製
物と方法とを提供することにある。本発明の試薬組成物
は安定であり、室温で長い貯蔵寿命および保存寿命（例
えば１週間以上で少なくとも約１年）を維持する。他の
目的は白血球分画法を能率的にし、方法の段階を実施す
るのに使用する必要のある試薬の数を減じることにあ
る。
で使用し易く、使用前に使用者または客により付加的な
調製または混合を必要としない、安全で安定な試薬調製
物と方法とを提供することにある。本発明の試薬組成物
は安定であり、室温で長い貯蔵寿命および保存寿命（例
えば１週間以上で少なくとも約１年）を維持する。他の
目的は白血球分画法を能率的にし、方法の段階を実施す
るのに使用する必要のある試薬の数を減じることにあ
る。
【００２０】本発明が提供する更にその上の目的および
有利さは以下の詳細な説明から明らかであろう。
有利さは以下の詳細な説明から明らかであろう。
【００２１】
【略語並びに術語】次の略語および術語を技術に熟達し
た人々の便宜のために定義または説明するが、どんな方
法ででも発明の範囲を限定しようとするものではない。
た人々の便宜のために定義または説明するが、どんな方
法ででも発明の範囲を限定しようとするものではない。
【００２２】ここに例示する自働化分析機で実施される
ようなペルオキシダーゼ法中の赤血細胞の溶解は細胞膜
に穴をあけ、ヘモグロビンの多くまたは全てを細胞外に
漏れ出させると定義する。得られる赤血細胞幻影（ghos
t)はペルオキシダーゼ法の組成物中に存在する固定剤に
より橋かけまたは固定される。赤血細胞幻影はサイトグ
ラムの根源領域におけるノイズとして検出することがで
き、それは流通式サイトメトリーを用いる、試料中の細
胞の電子−光学的検出から生ずる。
ようなペルオキシダーゼ法中の赤血細胞の溶解は細胞膜
に穴をあけ、ヘモグロビンの多くまたは全てを細胞外に
漏れ出させると定義する。得られる赤血細胞幻影（ghos
t)はペルオキシダーゼ法の組成物中に存在する固定剤に
より橋かけまたは固定される。赤血細胞幻影はサイトグ
ラムの根源領域におけるノイズとして検出することがで
き、それは流通式サイトメトリーを用いる、試料中の細
胞の電子−光学的検出から生ずる。
【００２３】ペルオキシダーゼは本明細書を通じて“Ｐ
ｘ”と省略される。
ｘ”と省略される。
【００２４】ここに用いる如く、術語水性試薬組成物と
試薬溶液と希釈剤とは同等である。
試薬溶液と希釈剤とは同等である。
【００２５】Ｒ１は白血細胞分画のＰｘ法の第１反応段
階である。より詳細に説明するごとくＰｘ法のＲ１段階
においては、全血試料を本発明に従って処方された第１
水性試薬組成物（“ＰｘＲ１試薬組成物”または“ペル
オキシダーゼＲ１試薬組成物”）と混合する。Ｐｘ法の
Ｒ１段階の間、試料の赤血細胞の全てあるいは多くは溶
解され、白血細胞は化学的に、Ｒ１試薬組成物中に存在
する固定剤により橋かけあるいは固定される。
階である。より詳細に説明するごとくＰｘ法のＲ１段階
においては、全血試料を本発明に従って処方された第１
水性試薬組成物（“ＰｘＲ１試薬組成物”または“ペル
オキシダーゼＲ１試薬組成物”）と混合する。Ｐｘ法の
Ｒ１段階の間、試料の赤血細胞の全てあるいは多くは溶
解され、白血細胞は化学的に、Ｒ１試薬組成物中に存在
する固定剤により橋かけあるいは固定される。
【００２６】新鮮血液試料は採血後８時間以内の分析に
用いられる血液試料である。術語“新鮮血液試料”はこ
こで用いる如く術語“ Day１試料”と同義である。
用いられる血液試料である。術語“新鮮血液試料”はこ
こで用いる如く術語“ Day１試料”と同義である。
【００２７】時間をおいた試料は採血後約４８時間まで
室温に貯蔵された血液試料である。術語“時間をおいた
試料”はここで用いる術語“ Day２血液試料”を包含す
ると考える。
室温に貯蔵された血液試料である。術語“時間をおいた
試料”はここで用いる術語“ Day２血液試料”を包含す
ると考える。
【００２８】
【本発明の詳細な説明】本発明は一般的に、白血細胞の
特別な型の内因性ペルオキシダーゼ活性の測定に依存す
るペルオキシダーゼ（Ｐｘ）法による白血細胞分画の測
定および定量化のための改良された方法と試薬組成物と
に関する。本発明は特に半自働−および自働流通式サイ
トメトリー分析機と、白血細胞測定と分集団測定とのた
めのペルオキシダーゼ法における改良とに関する。
特別な型の内因性ペルオキシダーゼ活性の測定に依存す
るペルオキシダーゼ（Ｐｘ）法による白血細胞分画の測
定および定量化のための改良された方法と試薬組成物と
に関する。本発明は特に半自働−および自働流通式サイ
トメトリー分析機と、白血細胞測定と分集団測定とのた
めのペルオキシダーゼ法における改良とに関する。
【００２９】本発明の理解を助けるために、白血球分画
の自働ペルオキシダーゼ法で起る細胞的および分子的事
象の要約を提供する。ペルオキシダーゼ法の第１即ちＲ
１段階において血液試料を水性第１試薬（Ｒ１）組成物
（即ち、Ｒ１溶液または希釈剤）と混合し、その混合物
を約１５〜２０秒間約７０℃に加熱する。その間赤血細
胞は溶解し、そのヘモグロビンは漏出し、得られる血色
細胞幻影は固定される。白血細胞は固定化合物例えばホ
ルムアルデヒドにより化学的に橋かけされ、あるいは固
定され、残りの反応の間の溶解に対する抵抗を提供す
る。一般に赤血細胞は白血細胞と血小板とより容易に溶
解される。しかし、溶解並びに固定は同じ試料反応混合
物中に起る過程と競合する故、方法の間に用いられる条
件の下で橋かけされるようになるのは赤血細胞幻影と血
小板とに関しては異常なことではない。この様にして、
ペルオキシダーゼ法は血液試料中の赤血細胞の溶解と白
血細胞の固定との間の微妙なバランスを要求する。もし
ＰｘＲ１試薬組成物の溶解力が強すぎると、赤血細胞と
白血細胞との両者が損障される。逆にもし固定剤の濃度
が大きすぎると、細胞の全てが赤色細胞溶解が起る前に
固定されることになる。それにも拘らず、白血細胞分画
は、特に本発明に従って開発されたような改良されたペ
ルオキシダーゼ法についての速さと最適な反応条件と試
薬処方との点から見て、細胞の型と細胞の数との高い水
準での確度の高い、信頼性のある測定で得られ、半自働
−および自働血液学システムを用いて現れる迅速な試料
分析が実施される。
の自働ペルオキシダーゼ法で起る細胞的および分子的事
象の要約を提供する。ペルオキシダーゼ法の第１即ちＲ
１段階において血液試料を水性第１試薬（Ｒ１）組成物
（即ち、Ｒ１溶液または希釈剤）と混合し、その混合物
を約１５〜２０秒間約７０℃に加熱する。その間赤血細
胞は溶解し、そのヘモグロビンは漏出し、得られる血色
細胞幻影は固定される。白血細胞は固定化合物例えばホ
ルムアルデヒドにより化学的に橋かけされ、あるいは固
定され、残りの反応の間の溶解に対する抵抗を提供す
る。一般に赤血細胞は白血細胞と血小板とより容易に溶
解される。しかし、溶解並びに固定は同じ試料反応混合
物中に起る過程と競合する故、方法の間に用いられる条
件の下で橋かけされるようになるのは赤血細胞幻影と血
小板とに関しては異常なことではない。この様にして、
ペルオキシダーゼ法は血液試料中の赤血細胞の溶解と白
血細胞の固定との間の微妙なバランスを要求する。もし
ＰｘＲ１試薬組成物の溶解力が強すぎると、赤血細胞と
白血細胞との両者が損障される。逆にもし固定剤の濃度
が大きすぎると、細胞の全てが赤色細胞溶解が起る前に
固定されることになる。それにも拘らず、白血細胞分画
は、特に本発明に従って開発されたような改良されたペ
ルオキシダーゼ法についての速さと最適な反応条件と試
薬処方との点から見て、細胞の型と細胞の数との高い水
準での確度の高い、信頼性のある測定で得られ、半自働
−および自働血液学システムを用いて現れる迅速な試料
分析が実施される。
【００３０】全血中においては赤血細胞対白血細胞の比
は約１，０００：１である。従って全血試料分析のため
の自働ペルオキシダーゼ法の最適な実施については、本
質的に全ての赤色細胞は分析の早期に試料アリコート中
で溶解されるべきことは明らかである。従ってＲ１希釈
剤を用いる第１の反応においては赤色細胞溶解と白色細
胞の橋かけとの間に競合がある。若し赤色細胞が元のヘ
モグロビンを持ったまま生き残ると、得られるサイトグ
ラムのリンパ球域の布置の理由で、リンパ球として正し
くなく検出されるので、それらは分画において妨害にな
るようである。しかし、血液試料アリコート中の白血細
胞がペルオキシダーゼ法のＲ１段階の間に溶液成分によ
り攻撃あるいは劣化されないことは至難なことである。
は約１，０００：１である。従って全血試料分析のため
の自働ペルオキシダーゼ法の最適な実施については、本
質的に全ての赤色細胞は分析の早期に試料アリコート中
で溶解されるべきことは明らかである。従ってＲ１希釈
剤を用いる第１の反応においては赤色細胞溶解と白色細
胞の橋かけとの間に競合がある。若し赤色細胞が元のヘ
モグロビンを持ったまま生き残ると、得られるサイトグ
ラムのリンパ球域の布置の理由で、リンパ球として正し
くなく検出されるので、それらは分画において妨害にな
るようである。しかし、血液試料アリコート中の白血細
胞がペルオキシダーゼ法のＲ１段階の間に溶液成分によ
り攻撃あるいは劣化されないことは至難なことである。
【００３１】ペルオキシダーゼ法のＲ１段階に引き続く
第２反応段階（またここでは“反応２”あるいは“Ｒ
２”と呼ぶ）の間、過酸化水素と電子供与体例えば４−
クロロ−１−ナフトールとの基質溶液をＲ１反応混合物
に添加する。これらの化合物は、単核細胞と好中球と好
酸球とを含む“染色する”白血細胞型中に差別的に存在
する内因性細胞ペルオキシダーゼの基質である。リンパ
球と巨大未染色細胞（ＬＵＣ）は内因性ペルオキシダー
ゼ酵素を含有せず、従ってその方法においては染色され
ない。内因性ペルオキシダーゼ酵素を含有していない、
赤色細胞幻影と血小板との組合せは染色されず、全血細
胞分析を包含する殆ど全ての方法について出合いそして
入れられる根源ノイズに寄与してもよい。ヘモグロビン
の幾らかあるいは全てが含有されている不完全に溶解さ
れた赤色細胞はＰｘ法から生ずるサイトグラムのリンパ
球域で検出され、その方法を妨害する。血小板と血小板
凝集塊もまたリンパ球域で検出され、妨害の付加的な源
である。
第２反応段階（またここでは“反応２”あるいは“Ｒ
２”と呼ぶ）の間、過酸化水素と電子供与体例えば４−
クロロ−１−ナフトールとの基質溶液をＲ１反応混合物
に添加する。これらの化合物は、単核細胞と好中球と好
酸球とを含む“染色する”白血細胞型中に差別的に存在
する内因性細胞ペルオキシダーゼの基質である。リンパ
球と巨大未染色細胞（ＬＵＣ）は内因性ペルオキシダー
ゼ酵素を含有せず、従ってその方法においては染色され
ない。内因性ペルオキシダーゼ酵素を含有していない、
赤色細胞幻影と血小板との組合せは染色されず、全血細
胞分析を包含する殆ど全ての方法について出合いそして
入れられる根源ノイズに寄与してもよい。ヘモグロビン
の幾らかあるいは全てが含有されている不完全に溶解さ
れた赤色細胞はＰｘ法から生ずるサイトグラムのリンパ
球域で検出され、その方法を妨害する。血小板と血小板
凝集塊もまたリンパ球域で検出され、妨害の付加的な源
である。
【００３２】ペルオキシダーゼ法においては、“染色”
は電子供与体基質例えば４−クロロ−１−ナフトールが
酸化され、細胞内に捕捉される深紫色反応生成物に重合
される複雑な化学反応の結果である。細胞内の顆粒が紫
色に染色され、それにより、もし顕微鏡下で検査（顕微
鏡検査を用いると染色された細胞は裸眼に黒く見える）
すると、細胞はペルオキシダーゼ反応混合物（“流出
液”）中に観察することができる。自働血液学的分析機
システム例えば商業的に商標TECHNICON Ｈ●１TM、Ｈ●
２TM、Ｈ●３TMなどの下に商業的に入手でき、この発明
の譲受人により販売されているＨ●TMシステムで例示さ
れるものでは、検出は光吸収（紫色反応生成物による）
と光散乱（細胞寸法による）との測定により電子−光学
的に行われる。
は電子供与体基質例えば４−クロロ−１−ナフトールが
酸化され、細胞内に捕捉される深紫色反応生成物に重合
される複雑な化学反応の結果である。細胞内の顆粒が紫
色に染色され、それにより、もし顕微鏡下で検査（顕微
鏡検査を用いると染色された細胞は裸眼に黒く見える）
すると、細胞はペルオキシダーゼ反応混合物（“流出
液”）中に観察することができる。自働血液学的分析機
システム例えば商業的に商標TECHNICON Ｈ●１TM、Ｈ●
２TM、Ｈ●３TMなどの下に商業的に入手でき、この発明
の譲受人により販売されているＨ●TMシステムで例示さ
れるものでは、検出は光吸収（紫色反応生成物による）
と光散乱（細胞寸法による）との測定により電子−光学
的に行われる。
【００３３】本発明は、総括的なペルオキシダーゼ法の
実施を改良し、最適化するため、試薬組成物への新たに
添加される成分の存在の成果として、ペルオキシダーゼ
法のＲ１段階においての使用のための単一の新試薬組成
物を提供する。その成分は溶血性の非イオン性界面活性
剤例えばBrijTM３５である。新試薬組成物中でのイオン
性界面活性剤と共にそのような非イオン性界面活性剤の
存在は前記して略述したペルオキシダーゼ法の引き続く
反応段階で他の試薬と共に用いて成功できる新規のＰｘ
１試薬または希釈剤を提供する。技術に熟達した人達は
Ｐｘ法のＲ１段階において界面活性剤の量並びに濃度が
決定的なものであること、即ち余り多くの界面活性剤は
試料中の白血細胞への攻撃を引き起し、余り少ない界面
活性剤は赤血細胞を適当な方法で溶解せず、それで得ら
れるサイトグラム中の根源ノイズの原因となることを認
めるであろう。
実施を改良し、最適化するため、試薬組成物への新たに
添加される成分の存在の成果として、ペルオキシダーゼ
法のＲ１段階においての使用のための単一の新試薬組成
物を提供する。その成分は溶血性の非イオン性界面活性
剤例えばBrijTM３５である。新試薬組成物中でのイオン
性界面活性剤と共にそのような非イオン性界面活性剤の
存在は前記して略述したペルオキシダーゼ法の引き続く
反応段階で他の試薬と共に用いて成功できる新規のＰｘ
１試薬または希釈剤を提供する。技術に熟達した人達は
Ｐｘ法のＲ１段階において界面活性剤の量並びに濃度が
決定的なものであること、即ち余り多くの界面活性剤は
試料中の白血細胞への攻撃を引き起し、余り少ない界面
活性剤は赤血細胞を適当な方法で溶解せず、それで得ら
れるサイトグラム中の根源ノイズの原因となることを認
めるであろう。
【００３４】発明の態様において本発明の新しいＲ１試
薬組成物は、すすぎ溶液が溶血性非イオン性界面活性剤
例えばBrijTM３５を含有していないという条件の下で、
水性すすぎ試薬を用いるすすぎのサイクルをペルオキシ
ダーゼ法において実施する場合にうまく用いることがで
きる。特に、本発明のＲ１組成物は、他の型の界面活性
剤の完全な不存在の下（即ち、イオン性界面活性剤例え
ばＳＤＳと非イオン性界面活性剤例えばBrijTM３５とな
しで）新しいすすぎ試薬組成物と一緒に用いることがで
きる。
薬組成物は、すすぎ溶液が溶血性非イオン性界面活性剤
例えばBrijTM３５を含有していないという条件の下で、
水性すすぎ試薬を用いるすすぎのサイクルをペルオキシ
ダーゼ法において実施する場合にうまく用いることがで
きる。特に、本発明のＲ１組成物は、他の型の界面活性
剤の完全な不存在の下（即ち、イオン性界面活性剤例え
ばＳＤＳと非イオン性界面活性剤例えばBrijTM３５とな
しで）新しいすすぎ試薬組成物と一緒に用いることがで
きる。
【００３５】本発明の試薬組成物は以下に与えられる説
明および実施例において明らかにされる次の問題を解決
する。自働分析システム例えば前記のＨ●TMシステムで
例示されるシステムで現今実施されているペルオキシダ
ーゼ法を実行して、ペルオキシダーゼ法の１つの試料サ
イクルの終りに日常的に約８μL のすすぎ溶液の残余が
存在することが本発明者によって確かめられた。この一
見少量のすすぎ液残余は次の試料サイクルの部分にな
る。この体積はどんな機能的流儀でもその方法には影響
しないということがその方法を実施する人達によって簡
単に認められていた。
明および実施例において明らかにされる次の問題を解決
する。自働分析システム例えば前記のＨ●TMシステムで
例示されるシステムで現今実施されているペルオキシダ
ーゼ法を実行して、ペルオキシダーゼ法の１つの試料サ
イクルの終りに日常的に約８μL のすすぎ溶液の残余が
存在することが本発明者によって確かめられた。この一
見少量のすすぎ液残余は次の試料サイクルの部分にな
る。この体積はどんな機能的流儀でもその方法には影響
しないということがその方法を実施する人達によって簡
単に認められていた。
【００３６】しかし、その様なすすぎ液残余が約１０μ
L の体積を越すと、ペルオキシダーゼ法の性能を低下す
ることが新たに発見された。また、すすぎ溶液中に存在
する（そして、Ｒ１試薬に持ち越される）非イオン性界
面活性剤例えばBrijTM３５は方法の低下を実際に引き起
すが、イオン性界面活性剤例えばＳＤＳはこれを引き起
こさないことが、本発明者により予期せられず発見され
た。判り易くいい、そして更に以下で説明するように、
本発明者は、ペルオキシダーゼ法に通常用いられている
BrijTM３５含有すすぎ液は非イオン性溶血性界面活性剤
を方法のＲ１段階に送達することであり、BrijTM３５を
方法の中で機能的であるが望ましくないやり方でその方
法に関与することを許すということを発見した。これら
の発見の結果として、本発見者は、ペルオキシダーゼ法
に用いるすすぎ液がＰｘ法のＲ１段階に必要な成分（即
ち非イオン性界面活性剤例えばBrijTM３５）を与えるこ
と、およびすすぎ液残余の体積がシステム間で変る場
合、ペルオキシダーゼ法は不利に影響することを発見し
た。ここに説明する発見の開発に従い、本発明者はすす
ぎ液残余はペルオキシダーゼ法の実行に伴う単なる害の
ない現象ではないことを最初に認識した。
L の体積を越すと、ペルオキシダーゼ法の性能を低下す
ることが新たに発見された。また、すすぎ溶液中に存在
する（そして、Ｒ１試薬に持ち越される）非イオン性界
面活性剤例えばBrijTM３５は方法の低下を実際に引き起
すが、イオン性界面活性剤例えばＳＤＳはこれを引き起
こさないことが、本発明者により予期せられず発見され
た。判り易くいい、そして更に以下で説明するように、
本発明者は、ペルオキシダーゼ法に通常用いられている
BrijTM３５含有すすぎ液は非イオン性溶血性界面活性剤
を方法のＲ１段階に送達することであり、BrijTM３５を
方法の中で機能的であるが望ましくないやり方でその方
法に関与することを許すということを発見した。これら
の発見の結果として、本発見者は、ペルオキシダーゼ法
に用いるすすぎ液がＰｘ法のＲ１段階に必要な成分（即
ち非イオン性界面活性剤例えばBrijTM３５）を与えるこ
と、およびすすぎ液残余の体積がシステム間で変る場
合、ペルオキシダーゼ法は不利に影響することを発見し
た。ここに説明する発見の開発に従い、本発明者はすす
ぎ液残余はペルオキシダーゼ法の実行に伴う単なる害の
ない現象ではないことを最初に認識した。
【００３７】この知識が本発明者をしてペルオキシダー
ゼ法のＲ１段階中に用いるための、非イオン性界面活性
剤とイオン性界面活性剤との両者を含有する前記の改良
されたＲ１試薬組成物を設計させた。その上、本発明者
は、すすぎサイクルによりその方法に用いることが出来
るすすぎ液から非イオン性界面活性剤例えばBrijTM３５
を除去することにより更に方法を改良した。その上、非
溶血性の非イオン性界面活性剤例えばPluronicを含有す
るすすぎ溶液が、Ｐｘ法における新Ｒ１試薬組成物と一
緒に用いて最も適当であることを見出した。すすぎ溶液
から溶血性の非イオン性界面活性質を除くことにより
（あるいはすすぎ液中の唯一の界面活性剤として非溶血
性のPluronicを用いることにより）、そして適当な非イ
オン性界面活性剤とイオン性界面活性剤との両者を含有
する新しいＰｘ１試薬組成物を処方することにより、Ｒ
１試薬中の非イオン性界面活性剤を、Ｐｘ法において制
御された速さで最適に送達できた。また、すすぎ液残余
体積の変動が新しい方法から得られる結果に影響が出来
ない。その結果、改良されたＲ１試薬とペルオキシダー
ゼ法とにおいて、方法のＲ１段階に用いる試薬組成物中
には、活性の非イオン性界面活性剤成分のみが存在し、
その機能活性は赤色細胞の溶解に必要である。更に、す
すぎ液を方法に用いる場合、BrijTM３５を除いたすすぎ
組成物（あるいは界面活性剤として非溶血性のPluronic
のみを含有する）は、すすぎ溶液の有害な成分により引
き起される受入れられないまたは利用できない結果が軽
減されるから、ペルオキシダーゼ法で積極的に関与でき
るどんな界面活性剤も欠いていて最適である。
ゼ法のＲ１段階中に用いるための、非イオン性界面活性
剤とイオン性界面活性剤との両者を含有する前記の改良
されたＲ１試薬組成物を設計させた。その上、本発明者
は、すすぎサイクルによりその方法に用いることが出来
るすすぎ液から非イオン性界面活性剤例えばBrijTM３５
を除去することにより更に方法を改良した。その上、非
溶血性の非イオン性界面活性剤例えばPluronicを含有す
るすすぎ溶液が、Ｐｘ法における新Ｒ１試薬組成物と一
緒に用いて最も適当であることを見出した。すすぎ溶液
から溶血性の非イオン性界面活性質を除くことにより
（あるいはすすぎ液中の唯一の界面活性剤として非溶血
性のPluronicを用いることにより）、そして適当な非イ
オン性界面活性剤とイオン性界面活性剤との両者を含有
する新しいＰｘ１試薬組成物を処方することにより、Ｒ
１試薬中の非イオン性界面活性剤を、Ｐｘ法において制
御された速さで最適に送達できた。また、すすぎ液残余
体積の変動が新しい方法から得られる結果に影響が出来
ない。その結果、改良されたＲ１試薬とペルオキシダー
ゼ法とにおいて、方法のＲ１段階に用いる試薬組成物中
には、活性の非イオン性界面活性剤成分のみが存在し、
その機能活性は赤色細胞の溶解に必要である。更に、す
すぎ液を方法に用いる場合、BrijTM３５を除いたすすぎ
組成物（あるいは界面活性剤として非溶血性のPluronic
のみを含有する）は、すすぎ溶液の有害な成分により引
き起される受入れられないまたは利用できない結果が軽
減されるから、ペルオキシダーゼ法で積極的に関与でき
るどんな界面活性剤も欠いていて最適である。
【００３８】自働血液学方法における、すすぎ液残余と
それに伴う問題の発生を更に以下で検討する。自働血液
学的分析機を用いる全血試料の分析においては、分析さ
れる血液試料の全てが試薬溶液と混合され通常の水力学
的通路（例えばチャンネル）を通って流れる。そのチャ
ンネルは多量のすすぎ液の導入により各試料サイクル間
で清浄あるいはすすがれる。この工程においてチャンネ
ルは決して完全にはすすぎ液はなくならないかあるいは
乾燥されない。すすぎ工程の結果としてすすぎ液は後に
残り、次の試料サイクルに入る。このことはすすぎ液残
余現象を説明する。
それに伴う問題の発生を更に以下で検討する。自働血液
学的分析機を用いる全血試料の分析においては、分析さ
れる血液試料の全てが試薬溶液と混合され通常の水力学
的通路（例えばチャンネル）を通って流れる。そのチャ
ンネルは多量のすすぎ液の導入により各試料サイクル間
で清浄あるいはすすがれる。この工程においてチャンネ
ルは決して完全にはすすぎ液はなくならないかあるいは
乾燥されない。すすぎ工程の結果としてすすぎ液は後に
残り、次の試料サイクルに入る。このことはすすぎ液残
余現象を説明する。
【００３９】こうして、すすぎ液残余は、ペルオキシダ
ーゼ法を実行するのに用いるシステムにおいて、１つの
試料サイクルから次の試料サイクルに一定しない量の反
応成分を与えてもよいことは明らかである。これは種々
なシステムを互いに他と比較した場合特に明らかであ
る。すすぎ液残余量のシステムからシステムへの変動は
鋭敏並びに著しい水準で変り得て自働分析機で実行され
る方法の結果に対し負に影響を与える。例えば後者の場
合においては、すすぎ液残余のより余計の総体量（例え
ば約１０μL より多い）はその方法において粗末な結果
を生じさせる。前者の場合には、すすぎ液残余量におけ
るシステムからシステムへのより鋭敏な変動（例えばシ
ステム間での体積例えば７．５μL 、８．０μL 、８．
３μL)は各システムに対しやや不同に行われる原因にな
る。記載の発明までは、すすぎ液残余体積の変動のこの
種の両者は不利に影響し、現行のペルオキシダーゼ分画
法における問題を引き起した。
ーゼ法を実行するのに用いるシステムにおいて、１つの
試料サイクルから次の試料サイクルに一定しない量の反
応成分を与えてもよいことは明らかである。これは種々
なシステムを互いに他と比較した場合特に明らかであ
る。すすぎ液残余量のシステムからシステムへの変動は
鋭敏並びに著しい水準で変り得て自働分析機で実行され
る方法の結果に対し負に影響を与える。例えば後者の場
合においては、すすぎ液残余のより余計の総体量（例え
ば約１０μL より多い）はその方法において粗末な結果
を生じさせる。前者の場合には、すすぎ液残余量におけ
るシステムからシステムへのより鋭敏な変動（例えばシ
ステム間での体積例えば７．５μL 、８．０μL 、８．
３μL)は各システムに対しやや不同に行われる原因にな
る。記載の発明までは、すすぎ液残余体積の変動のこの
種の両者は不利に影響し、現行のペルオキシダーゼ分画
法における問題を引き起した。
【００４０】前記に検討したごとく、本発明の以前は、
変動するすすぎ液残余は単に方法を実行するのに起る寛
大な体積残余であると、技術の人達により受入れられて
いた。しかし、ここに更に示すごとく、本発明者は残余
体種の定量測定と、方法の反応成分並びに段階の分析を
通して、すすぎ液残余（それがシステムからシステムへ
の、限定されているが種々な体積の形でより鋭敏である
がより潜行的に起るかどうか、あるいはシステムからシ
ステムへのより劇的な体積変化として起るかどうか）は
白血球の同定と定量とに関するペルオキシダーゼ法にお
いて方法に対し、単なる体積希釈以上のものを与え、現
行の方法において偏向と欠点とを引き起し、そして不活
発な役割というよりむしろ積極的な役割を演ずることに
より方法の性能を損うことを発見した。
変動するすすぎ液残余は単に方法を実行するのに起る寛
大な体積残余であると、技術の人達により受入れられて
いた。しかし、ここに更に示すごとく、本発明者は残余
体種の定量測定と、方法の反応成分並びに段階の分析を
通して、すすぎ液残余（それがシステムからシステムへ
の、限定されているが種々な体積の形でより鋭敏である
がより潜行的に起るかどうか、あるいはシステムからシ
ステムへのより劇的な体積変化として起るかどうか）は
白血球の同定と定量とに関するペルオキシダーゼ法にお
いて方法に対し、単なる体積希釈以上のものを与え、現
行の方法において偏向と欠点とを引き起し、そして不活
発な役割というよりむしろ積極的な役割を演ずることに
より方法の性能を損うことを発見した。
【００４１】特別な実施例として、方法のＲ１段階にお
ける活性な界面活性剤の特別な水準を超すことは、サイ
トグラム（図４Ａ−４Ｆ）の好中球域に集まり、生ずる
損障された好酸球により、並びに好中球の貧弱に染色さ
れた不規則の母集団により特徴づけられた、得られるサ
イトグラムのゆがみを引き起す。実施例５はすすぎ液残
余Ｐｘ法のＲ１段階（赤血細胞の溶解と白血細胞の橋か
けとを包含する）に種々な量の非イオン性界面活性剤Br
ijTM３５を与えることを示している。
ける活性な界面活性剤の特別な水準を超すことは、サイ
トグラム（図４Ａ−４Ｆ）の好中球域に集まり、生ずる
損障された好酸球により、並びに好中球の貧弱に染色さ
れた不規則の母集団により特徴づけられた、得られるサ
イトグラムのゆがみを引き起す。実施例５はすすぎ液残
余Ｐｘ法のＲ１段階（赤血細胞の溶解と白血細胞の橋か
けとを包含する）に種々な量の非イオン性界面活性剤Br
ijTM３５を与えることを示している。
【００４２】従って本発明はすすぎ液から界面活性剤成
分を除くことにより、Ｐｘ法中での、すすぎ液の界面活
性剤による積極的な関与を軽減するのに成功し、方法を
種々なすすぎ液残余の影響から解放した。このことは、
単にＰｘＲ１試薬組成物（その送達はＰｘ法のＲ１段階
において制御され、一定である）中にのみであって、す
すぎ溶液（すすぎ試薬成分の試料サイクルによる送達は
変動され、よりよくは制御されない）中には存在しない
“活性”な界面活性剤成分を持つ最終的成果のＰｘＲ１
試薬組成物の新しい処方を案出することにより達成され
た。従って、発明は正確な結果並びに、全体的方法にお
いての、適当な型の非イオン性界面活性剤例えばBrijTM
３５の一定濃度をもたらす。
分を除くことにより、Ｐｘ法中での、すすぎ液の界面活
性剤による積極的な関与を軽減するのに成功し、方法を
種々なすすぎ液残余の影響から解放した。このことは、
単にＰｘＲ１試薬組成物（その送達はＰｘ法のＲ１段階
において制御され、一定である）中にのみであって、す
すぎ溶液（すすぎ試薬成分の試料サイクルによる送達は
変動され、よりよくは制御されない）中には存在しない
“活性”な界面活性剤成分を持つ最終的成果のＰｘＲ１
試薬組成物の新しい処方を案出することにより達成され
た。従って、発明は正確な結果並びに、全体的方法にお
いての、適当な型の非イオン性界面活性剤例えばBrijTM
３５の一定濃度をもたらす。
【００４３】本発明の試薬組成物と改良されたペルオキ
シダーゼ法との開発の他の目的はペルオキシダーゼ法お
よび自働血液学的分析法を実行するのに現在使用されて
いる種々な型のすすぎ液の数を減少させることにより自
働分析機システムの設計を簡単にしようということであ
る。若し１つのすすぎ試薬を開発し、それが多くの異な
った血液分析法と自働システムに適合することが発見さ
れると、システム設計は最終的により簡単でより経済的
になるであろう。
シダーゼ法との開発の他の目的はペルオキシダーゼ法お
よび自働血液学的分析法を実行するのに現在使用されて
いる種々な型のすすぎ液の数を減少させることにより自
働分析機システムの設計を簡単にしようということであ
る。若し１つのすすぎ試薬を開発し、それが多くの異な
った血液分析法と自働システムに適合することが発見さ
れると、システム設計は最終的により簡単でより経済的
になるであろう。
【００４４】最も簡単なすすぎ組成物は溶血性の非イオ
ン性界面活性剤例えばBrijTM３５なしで処方され得る
が、単にどんな“BrijTM３５もない”すすぎ溶液は未
だ、ペルオキシダーゼ法での使用には受入れられないこ
とが見出された。例えば唯ＳＤＳのみを含有する水性す
すぎ溶液は、ＳＤＳが冷温で結晶化される故に、方法で
の使用には受入れられないことが判った。ＳＤＳの挙動
は、方法のすすぎ試薬組成物またはすすぎサイクルにお
いてその成分または操作性に不利な影響なしに長期間貯
蔵でなければならない、水性すすぎ組成物中への使用お
よび安定性を妨げるだろう。こうして、受入れられるす
すぎ試薬の処方には発見と工夫とが必要であった。従っ
て、本発明の１つの態様はＰｘ法における新規の使用の
ために、唯非溶血性の界面活性剤Pluronicのみを含有す
る水性すすぎ組成物の処方である。
ン性界面活性剤例えばBrijTM３５なしで処方され得る
が、単にどんな“BrijTM３５もない”すすぎ溶液は未
だ、ペルオキシダーゼ法での使用には受入れられないこ
とが見出された。例えば唯ＳＤＳのみを含有する水性す
すぎ溶液は、ＳＤＳが冷温で結晶化される故に、方法で
の使用には受入れられないことが判った。ＳＤＳの挙動
は、方法のすすぎ試薬組成物またはすすぎサイクルにお
いてその成分または操作性に不利な影響なしに長期間貯
蔵でなければならない、水性すすぎ組成物中への使用お
よび安定性を妨げるだろう。こうして、受入れられるす
すぎ試薬の処方には発見と工夫とが必要であった。従っ
て、本発明の１つの態様はＰｘ法における新規の使用の
ために、唯非溶血性の界面活性剤Pluronicのみを含有す
る水性すすぎ組成物の処方である。
【００４５】以下並びに実施例において詳細に述べる如
く、すすぎサイクルを実行する場合の、２界面活性剤を
含有するＰｘＲ１試薬組成物並びに適当なすすぎ溶液の
使用は、新鮮および時間をおいた血液試料の分析の場
合、受入れられる結果を与える改良されたペルオキシダ
ーゼ法をもたらした。反対に、在来のＲ１試薬組成物
（即ち、非イオン性界面活性剤例えばBrijTM３５不存在
で処方された）は、時間をおいた試料を分析する場合、
高い水準の根源ノイズ形成という受入れられない結果を
もたらした。新しいＰｘＲ１試薬組成物に用いられる非
イオン性界面活性剤の濃度は現行のペルオキシダーゼ法
におけるすすぎ液残余により、方法のＲ１段階に残ると
発見された非イオン性界面活性剤BrijTM３５の濃度に近
づけた。
く、すすぎサイクルを実行する場合の、２界面活性剤を
含有するＰｘＲ１試薬組成物並びに適当なすすぎ溶液の
使用は、新鮮および時間をおいた血液試料の分析の場
合、受入れられる結果を与える改良されたペルオキシダ
ーゼ法をもたらした。反対に、在来のＲ１試薬組成物
（即ち、非イオン性界面活性剤例えばBrijTM３５不存在
で処方された）は、時間をおいた試料を分析する場合、
高い水準の根源ノイズ形成という受入れられない結果を
もたらした。新しいＰｘＲ１試薬組成物に用いられる非
イオン性界面活性剤の濃度は現行のペルオキシダーゼ法
におけるすすぎ液残余により、方法のＲ１段階に残ると
発見された非イオン性界面活性剤BrijTM３５の濃度に近
づけた。
【００４６】本発明の改良されたＰｘ法に従うと、時間
をおいた血液試料のサイトグラムにおける根源ノイズの
受入れられる水準は、ＰｘＲ１反応混合物中に含まれる
適当な非イオン性界面活性剤例えばBrijTM３５の関数で
あることを発見した（図１Ａ−１Ｄおよび３Ａ−３
Ｄ）。溶血性界面活性剤を欠くすすぎ溶液（あるいは適
当な非溶血性界面活性剤例えばPluronicを含有する）の
使用は、白血球分画のペルオキシダーゼ法において時間
をおいた血液試料から有用な結果を達成し、根源ノイズ
の受入れられる水準を生む能力において助けになること
を発見した。
をおいた血液試料のサイトグラムにおける根源ノイズの
受入れられる水準は、ＰｘＲ１反応混合物中に含まれる
適当な非イオン性界面活性剤例えばBrijTM３５の関数で
あることを発見した（図１Ａ−１Ｄおよび３Ａ−３
Ｄ）。溶血性界面活性剤を欠くすすぎ溶液（あるいは適
当な非溶血性界面活性剤例えばPluronicを含有する）の
使用は、白血球分画のペルオキシダーゼ法において時間
をおいた血液試料から有用な結果を達成し、根源ノイズ
の受入れられる水準を生む能力において助けになること
を発見した。
【００４７】新しいＲ１試薬組成物はペルオキシダーゼ
法の好結果の実行と結果とに対し幾つかの有利さを達成
している。例えば上記のごとく、水性Ｒ１試薬組成物は
赤色細胞は溶解するが試料中の白色細胞母集団の分析に
は不利には影響しない充分な濃度で、非イオン性界面活
性剤およびイオン性界面活性剤の両者を含有するように
処方されている。改良されている白血球分画法で使用の
ためのすすぎ溶液は、改良されたペルオキシダーゼ法の
新規のＲ１希釈剤の操作性を改善することが発見された
界面活性剤とは異なる非溶血性の界面活性剤を含有す
る。前記のすすぎ試薬と組合せてＲ１希釈剤試薬を用い
ることは、すすぎ液残余による活性界面活性剤乗換え効
果と独立したペルオキシダーゼ法を提供する。かくし
て、すすぎ液残余は完全に除去あるいは軽減されないか
もしれないが、非イオン性溶血性界面活性剤（例えばBr
ijTM３５）のないすすぎ液の使用は、すすぎ液残余の不
利なまたは有害な効果を除去し、方法の実行におけるす
すぎ液残余によるシステム間の変動を取り去る。さら
に、前記の如き２つの界面活性剤を含有する様に処方さ
れた、本発明の新規の試薬組成物は、室温と冷下とで少
なくとも約４８時間貯蔵された時間をおいた血液試料を
分析する場合、分画分析（differential Analysis)の確
度を維持し、並びに根源ノイズの受入れられる水準を達
成するのに成功した。
法の好結果の実行と結果とに対し幾つかの有利さを達成
している。例えば上記のごとく、水性Ｒ１試薬組成物は
赤色細胞は溶解するが試料中の白色細胞母集団の分析に
は不利には影響しない充分な濃度で、非イオン性界面活
性剤およびイオン性界面活性剤の両者を含有するように
処方されている。改良されている白血球分画法で使用の
ためのすすぎ溶液は、改良されたペルオキシダーゼ法の
新規のＲ１希釈剤の操作性を改善することが発見された
界面活性剤とは異なる非溶血性の界面活性剤を含有す
る。前記のすすぎ試薬と組合せてＲ１希釈剤試薬を用い
ることは、すすぎ液残余による活性界面活性剤乗換え効
果と独立したペルオキシダーゼ法を提供する。かくし
て、すすぎ液残余は完全に除去あるいは軽減されないか
もしれないが、非イオン性溶血性界面活性剤（例えばBr
ijTM３５）のないすすぎ液の使用は、すすぎ液残余の不
利なまたは有害な効果を除去し、方法の実行におけるす
すぎ液残余によるシステム間の変動を取り去る。さら
に、前記の如き２つの界面活性剤を含有する様に処方さ
れた、本発明の新規の試薬組成物は、室温と冷下とで少
なくとも約４８時間貯蔵された時間をおいた血液試料を
分析する場合、分画分析（differential Analysis)の確
度を維持し、並びに根源ノイズの受入れられる水準を達
成するのに成功した。
【００４８】本発明に従うと、好ましくは水性の、改良
された新規のＲ１試薬組成物は、少なくとも１つの非イ
オン性界面活性剤例えば長鎖アルキルエーテルポリエト
キシラート例えばポリオキシエチレン（２−２０）ラウ
リルとセチルとミリスチルとステアリルとオレイルエー
テル例えばBrijTM３５を、好ましくは炭素原子約１０〜
１６個を持つ硫酸アルキルのアルカリ金属塩の種類のイ
オン性界面活性剤例えば硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤ
Ｓ）少なくとも１つと組合せた、２つの溶血性成分を含
有している。ＰｘＲ１試薬組成物中に用いるのに適当な
イオン性界面活性剤にはまた、炭素原子約１０〜１６個
を持つ直鎖アルキル基を持つ双性イオン性スルホベタイ
ンの種類の界面活性剤例えばテトラデシルジメチルアン
モニオプロピルスルホナート即ち、ＴＤＡＰＳあるいは
ドデシルジメチルアンモニオプロパン−スルホナート即
ちＤＤＡＰＳを包含する。本発明のＰｘＲ１試薬混合物
中に処方されている界面活性剤の組合わされた作用と適
当な濃度とは、ここに記載の如く赤血細胞の適当な溶解
と、溶解された赤色細胞のヘモグロビン内容物の漏洩と
遺失とをもたらす。
された新規のＲ１試薬組成物は、少なくとも１つの非イ
オン性界面活性剤例えば長鎖アルキルエーテルポリエト
キシラート例えばポリオキシエチレン（２−２０）ラウ
リルとセチルとミリスチルとステアリルとオレイルエー
テル例えばBrijTM３５を、好ましくは炭素原子約１０〜
１６個を持つ硫酸アルキルのアルカリ金属塩の種類のイ
オン性界面活性剤例えば硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤ
Ｓ）少なくとも１つと組合せた、２つの溶血性成分を含
有している。ＰｘＲ１試薬組成物中に用いるのに適当な
イオン性界面活性剤にはまた、炭素原子約１０〜１６個
を持つ直鎖アルキル基を持つ双性イオン性スルホベタイ
ンの種類の界面活性剤例えばテトラデシルジメチルアン
モニオプロピルスルホナート即ち、ＴＤＡＰＳあるいは
ドデシルジメチルアンモニオプロパン−スルホナート即
ちＤＤＡＰＳを包含する。本発明のＰｘＲ１試薬混合物
中に処方されている界面活性剤の組合わされた作用と適
当な濃度とは、ここに記載の如く赤血細胞の適当な溶解
と、溶解された赤色細胞のヘモグロビン内容物の漏洩と
遺失とをもたらす。
【００４９】改良されたＰｘ試薬組成物はまた固定ある
いは橋かけ成分（例えばホルムアルデヒドまたはパラホ
ルムアルデヒド）と、糖または糖アルコールと、試薬の
ｐＨを中性または中性近くの範囲に維持するための緩衝
剤または緩衝剤混合物と、無機塩と、もし必要または所
望ならば多価金属イオンのキレート剤とを包含する。反
応のＲ１溶解段階における温度と反応時間とを含む、改
良された試薬組成物の成分と方法との全てが、方法にお
いて改良された結果を達成するためにバランスを取ら
れ、最適になっている。本発明により提供される改良は
方法の結果の臨床的有用性を改善する。
いは橋かけ成分（例えばホルムアルデヒドまたはパラホ
ルムアルデヒド）と、糖または糖アルコールと、試薬の
ｐＨを中性または中性近くの範囲に維持するための緩衝
剤または緩衝剤混合物と、無機塩と、もし必要または所
望ならば多価金属イオンのキレート剤とを包含する。反
応のＲ１溶解段階における温度と反応時間とを含む、改
良された試薬組成物の成分と方法との全てが、方法にお
いて改良された結果を達成するためにバランスを取ら
れ、最適になっている。本発明により提供される改良は
方法の結果の臨床的有用性を改善する。
【００５０】ペルオキシダーゼ法のＲ１段階に用いられ
るこの新しい２−界面活性剤含有試薬組成物は安定で長
い保存性を持っている。例えば試薬組成物の長期の耐久
性試験のため、新しいＲ１試薬組成物を調製し、６０℃
で３０日間貯蔵した〔即ち、当業者にとって理解できる
ように、室温（即ち約２２−３０℃）で最終的には１年
またはそれ以上の間安定であることを示す、促進安定試
験の条件下で貯蔵した〕。この“長期間”貯蔵試薬を前
記のペルオキシダーゼ法に用いた場合、得られた結果は
尚受入れられそして有用であった。
るこの新しい２−界面活性剤含有試薬組成物は安定で長
い保存性を持っている。例えば試薬組成物の長期の耐久
性試験のため、新しいＲ１試薬組成物を調製し、６０℃
で３０日間貯蔵した〔即ち、当業者にとって理解できる
ように、室温（即ち約２２−３０℃）で最終的には１年
またはそれ以上の間安定であることを示す、促進安定試
験の条件下で貯蔵した〕。この“長期間”貯蔵試薬を前
記のペルオキシダーゼ法に用いた場合、得られた結果は
尚受入れられそして有用であった。
【００５１】本発明の試薬の開発と処方とにおいて、試
験試薬は Day１および Day２血液試料、特に室温で時間
をおいた試料を用いて調製、検査された。本発明のＲ１
試薬組成物における非イオン性界面活性剤、特にポリエ
トキシラートの安定性の評価に用いられる化学的パラメ
ーターは親水性親油性比即ちＨＬＢ値として知られてい
る（ＨＬＢ値と分子式とに関しては、Michael and Iren
e Ash 編集、Encyclopedia of Surfactants, Chemical
Publishing Company, New York, New York, 1980および
McCutcheon's Emulsifiers and Defergents, McCutcheo
n Division, MCPublishing Company, Glen Rock, New J
ersey, 1987参照）。界面活性剤の界面活性はＨＬＢ値
に相関する。かくして、本発明の態様に従えば、与えら
れた界面活性剤のＨＬＢ値は、その界面活性剤が本発明
の試薬組成物の成分として適当であるかどうかの有用な
予報値として役立つ。特に、以下に説明の如く適当なＨ
ＬＢは、少なくとも約２日間古く、室温で貯蔵された全
血試料の分析と分画測定とにおける結果の改善に作用す
るであろうことを示している。
験試薬は Day１および Day２血液試料、特に室温で時間
をおいた試料を用いて調製、検査された。本発明のＲ１
試薬組成物における非イオン性界面活性剤、特にポリエ
トキシラートの安定性の評価に用いられる化学的パラメ
ーターは親水性親油性比即ちＨＬＢ値として知られてい
る（ＨＬＢ値と分子式とに関しては、Michael and Iren
e Ash 編集、Encyclopedia of Surfactants, Chemical
Publishing Company, New York, New York, 1980および
McCutcheon's Emulsifiers and Defergents, McCutcheo
n Division, MCPublishing Company, Glen Rock, New J
ersey, 1987参照）。界面活性剤の界面活性はＨＬＢ値
に相関する。かくして、本発明の態様に従えば、与えら
れた界面活性剤のＨＬＢ値は、その界面活性剤が本発明
の試薬組成物の成分として適当であるかどうかの有用な
予報値として役立つ。特に、以下に説明の如く適当なＨ
ＬＢは、少なくとも約２日間古く、室温で貯蔵された全
血試料の分析と分画測定とにおける結果の改善に作用す
るであろうことを示している。
【００５２】本発明の他の態様に従うと、余り大きすぎ
る親水性を示す、約１７．３〜１７．５より大きいＨＬ
Ｂ値を持つ非イオン性界面活性剤を含有する様に処方さ
れている試薬組成物は、方法の改良された実行には不適
当であった。本発明の試薬組成物に用いられて適当な界
面活性剤のＨＬＢ値は約８．９〜１７．５、好ましくは
約９．３〜１７．３、より好ましくは約９．５または
９．６〜１６．９の範囲である。本発明の試薬組成物中
の界面活性剤は、水不溶性油（即ち細胞膜からの脂質）
が水性溶剤中に存在する界面活性剤ミセルにより“溶
解”されている水中油型乳化適用に有用であるべきであ
る。水性溶液中においては、ミセルは楕円形または球形
であり、極性基が水溶剤に面し、疎水性の核が内部にあ
る界面活性剤分子の集団（例えば約１００分子を含有す
る）である（M.J. Rosen, 1978, "Surfactant and Inte
rfacial Phenomena" Wiley and Sons Interscience Pub
lications, New York, New York)。約９．５〜１７．５
のＨＬＢ値はその様な水中油型乳化における有用性を示
している。前記の如く、約１７．３〜１７．５、特に１
７．３より大きいＨＬＢ値は方法の性能を改良しない。
表９及び表１０は自働分析機に種々な異なる界面活性剤
を用いて行った本発明の白血球分画法の結果を示してい
る（実施例７）。同様に約９．３以下のＨＬＢ値を持つ
界面活性剤もまた一般的に、方法において有用ではなか
った。
る親水性を示す、約１７．３〜１７．５より大きいＨＬ
Ｂ値を持つ非イオン性界面活性剤を含有する様に処方さ
れている試薬組成物は、方法の改良された実行には不適
当であった。本発明の試薬組成物に用いられて適当な界
面活性剤のＨＬＢ値は約８．９〜１７．５、好ましくは
約９．３〜１７．３、より好ましくは約９．５または
９．６〜１６．９の範囲である。本発明の試薬組成物中
の界面活性剤は、水不溶性油（即ち細胞膜からの脂質）
が水性溶剤中に存在する界面活性剤ミセルにより“溶
解”されている水中油型乳化適用に有用であるべきであ
る。水性溶液中においては、ミセルは楕円形または球形
であり、極性基が水溶剤に面し、疎水性の核が内部にあ
る界面活性剤分子の集団（例えば約１００分子を含有す
る）である（M.J. Rosen, 1978, "Surfactant and Inte
rfacial Phenomena" Wiley and Sons Interscience Pub
lications, New York, New York)。約９．５〜１７．５
のＨＬＢ値はその様な水中油型乳化における有用性を示
している。前記の如く、約１７．３〜１７．５、特に１
７．３より大きいＨＬＢ値は方法の性能を改良しない。
表９及び表１０は自働分析機に種々な異なる界面活性剤
を用いて行った本発明の白血球分画法の結果を示してい
る（実施例７）。同様に約９．３以下のＨＬＢ値を持つ
界面活性剤もまた一般的に、方法において有用ではなか
った。
【００５３】炭素原子約１０〜１６個を持つ硫酸アルキ
ルのアルカリ金属塩のイオン性界面活性剤類について
は、本発明のＲ１試薬組成物の好ましいアルカリ金属陽
イオンはナトリウムとカリウムとリチウムとである。よ
り好ましいのは硫酸ドデシルアルカリ金属、最も好まし
いのは硫酸ドデシルナトリウムである。使用に適当な陰
イオン性界面活性剤の濃度範囲の例は約０．０３０〜
０．１５０g/L 、好ましくは約０．０５０〜０．１２５
g/L 、より好ましくは約０．０８５〜０．１０５g/L で
ある。また炭素原子約１０〜１８個を持つ陰イオン性ア
ルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムも使用に有用であ
る。本発明の使用に適当な他の陰イオン性界面活性剤の
例はＮ−アシル−ｎ−アルキルタウラート（例えばＲ−
Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ´）ＣＨ2 ＣＨ2 ＳＯ3-Ｍ+ 、ここにＲ
＝Ｃ10Ｈ23−Ｃ14Ｈ29；Ｒ1 ＝ＣＨ3またはＨ；Ｍ+ ＝
Ｌｉ+ 、Ｎａ+ またはＫ+)である。更に、双性イオン性
界面活性剤、例えば同族のＣ16およびＣ12の成員（memb
er）、例えばＴＤＡＰＳ（テトラデシルジメチルアンモ
ニオプロパンスルホナート）を含むスルホベタイン族の
成員は本発明における使用に適している（実施例８）。
本発明に使用できる双性イオン性界面活性剤の他の例
は、コール酸誘導体例えばＣＨＡＰＳＯ（３−〔（３−
コーラミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−２−ヒド
ロキシ−１−プロパンスルホナート）と、炭素原子約１
２〜１６個を持つ、Ｎ−オキシドと呼ばれるアルキル
Ｎ，Ｎ−ジメチル Ｎ−オキシドとである。Ｎ−オキシ
ドの特別な、しかし非限定的例はラウリルジメチルアミ
ン Ｎ−オキシド（ＬＯ）などである。ＴＤＡＰＳと類
似であるがより少ない炭素原子例えばＣ12を持つ界面活
性剤例えばＤＤＡＰＳ（Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチ
ル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホナート）もま
た本発明のペルオキシダーゼ法並びに試薬に用いられて
もよい。
ルのアルカリ金属塩のイオン性界面活性剤類について
は、本発明のＲ１試薬組成物の好ましいアルカリ金属陽
イオンはナトリウムとカリウムとリチウムとである。よ
り好ましいのは硫酸ドデシルアルカリ金属、最も好まし
いのは硫酸ドデシルナトリウムである。使用に適当な陰
イオン性界面活性剤の濃度範囲の例は約０．０３０〜
０．１５０g/L 、好ましくは約０．０５０〜０．１２５
g/L 、より好ましくは約０．０８５〜０．１０５g/L で
ある。また炭素原子約１０〜１８個を持つ陰イオン性ア
ルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムも使用に有用であ
る。本発明の使用に適当な他の陰イオン性界面活性剤の
例はＮ−アシル−ｎ−アルキルタウラート（例えばＲ−
Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ´）ＣＨ2 ＣＨ2 ＳＯ3-Ｍ+ 、ここにＲ
＝Ｃ10Ｈ23−Ｃ14Ｈ29；Ｒ1 ＝ＣＨ3またはＨ；Ｍ+ ＝
Ｌｉ+ 、Ｎａ+ またはＫ+)である。更に、双性イオン性
界面活性剤、例えば同族のＣ16およびＣ12の成員（memb
er）、例えばＴＤＡＰＳ（テトラデシルジメチルアンモ
ニオプロパンスルホナート）を含むスルホベタイン族の
成員は本発明における使用に適している（実施例８）。
本発明に使用できる双性イオン性界面活性剤の他の例
は、コール酸誘導体例えばＣＨＡＰＳＯ（３−〔（３−
コーラミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−２−ヒド
ロキシ−１−プロパンスルホナート）と、炭素原子約１
２〜１６個を持つ、Ｎ−オキシドと呼ばれるアルキル
Ｎ，Ｎ−ジメチル Ｎ−オキシドとである。Ｎ−オキシ
ドの特別な、しかし非限定的例はラウリルジメチルアミ
ン Ｎ−オキシド（ＬＯ）などである。ＴＤＡＰＳと類
似であるがより少ない炭素原子例えばＣ12を持つ界面活
性剤例えばＤＤＡＰＳ（Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチ
ル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホナート）もま
た本発明のペルオキシダーゼ法並びに試薬に用いられて
もよい。
【００５４】本発明の試薬組成物中の使用に適当な非イ
オン性界面活性剤の一族は（１）ポリエチレングリコー
ルまたはポリオキシエチレンエタノールにエーテル化さ
れている直鎖脂肪族疎水物を含むポリオキシエチレンア
ルキルまたはアリールエーテル（またポリエトキシラー
トとも呼ぶ）、例えばBrijTM３５と、（２）ポリエチレ
ングリコールにエーテル化されている分枝鎖脂肪族／芳
香族（例えばオクチルフェノール）疎水物、例えばTrit
onＸTM−１００と、（３）ポリエチレングリコールにエ
ーテル化されている直鎖脂肪族／芳香族（例えばｎ−ノ
ニルフェノール）疎水物、例えばIgepalTMＣ０８９７
と、（４）ポリエチレングリコールにエステル化されて
いる直鎖脂肪族（例えばカルボン酸）疎水物、例えばMy
rjTM５３である。これら４つの族の中、エステル型は水
性溶液中で加水分解を受け、エーテル型界面活性剤より
やや安定でないと予想される。
オン性界面活性剤の一族は（１）ポリエチレングリコー
ルまたはポリオキシエチレンエタノールにエーテル化さ
れている直鎖脂肪族疎水物を含むポリオキシエチレンア
ルキルまたはアリールエーテル（またポリエトキシラー
トとも呼ぶ）、例えばBrijTM３５と、（２）ポリエチレ
ングリコールにエーテル化されている分枝鎖脂肪族／芳
香族（例えばオクチルフェノール）疎水物、例えばTrit
onＸTM−１００と、（３）ポリエチレングリコールにエ
ーテル化されている直鎖脂肪族／芳香族（例えばｎ−ノ
ニルフェノール）疎水物、例えばIgepalTMＣ０８９７
と、（４）ポリエチレングリコールにエステル化されて
いる直鎖脂肪族（例えばカルボン酸）疎水物、例えばMy
rjTM５３である。これら４つの族の中、エステル型は水
性溶液中で加水分解を受け、エーテル型界面活性剤より
やや安定でないと予想される。
【００５５】第１の族の例は、それに限定する必要はな
いが、次のものが含まれる。ポリオキシエチレン（４）
ラウリルエーテル（BrijTM３０）、ポリオキシエチレン
（２３）ラウリルエーテル（BrijTM３５）、ポリオキシ
エチレン（２）セチルエーテル（BrijTM５２）、ポリオ
キシエチレン（２０）セチルエーテル（BrijTM５８）、
ポリオキシエチレン（２）ステアリルエーテル（BrijTM
７２）、ポリオキシエチレン（１０）ステアリルエーテ
ル（BrijTM７６）、ポリオキシエチレン（２０）ステア
リルエーテル（BrijTM７８）、ポリオキシエチレン
（２）オレイルエーテル（BrijTM９２）、ポリオキシエ
チレン（１０）オレイルエーテル（BrijTM９６）、ポリ
オキシエチレン（２０）オレイルエーテル（BrijTM９
８）、ポリオキシエチレン（２１）ステアリルエーテル
（BrijTM７２１）、ポリオキシエチレン（１００）ステ
アリルエーテル（BrijTM７００）。BrijTM界面活性剤の
中最も好ましいのはBrijTM３５である。本発明の組成物
中に使用が適しているが、ポリオキシエチエンオレイル
エーテルは、分子中での、酸化に対して感受性にする二
重結合の存在により、長期の貯蔵に対する安定が少ない
かもしれない。最も適当な非イオン性界面活性剤は本発
明に従うと前記の範囲内のＨＬＢ値を持つことになるこ
とを技術に熟達した人達により認められるだろう。第２
の族の非イオン性界面活性剤の他の限定しない例にはTr
itonＸTM−１００（non-reduced 又はreduced)と、Trit
onTMＸ−１１４（non-reduced 又はreduced)とTritonＸ
TM−１６５と、TritonＸTM−３０５（non-reduced 又は
reduced)とが含まれる。非イオン性界面活性剤は本発明
の試薬組成物中に濃度約０．１０〜０．２０g/L 、より
好ましくは濃度範囲約０．１０〜０．１６g/L 、最も好
ましくは濃度範囲約０．１２〜０．１４g/L で存在すべ
きである。
いが、次のものが含まれる。ポリオキシエチレン（４）
ラウリルエーテル（BrijTM３０）、ポリオキシエチレン
（２３）ラウリルエーテル（BrijTM３５）、ポリオキシ
エチレン（２）セチルエーテル（BrijTM５２）、ポリオ
キシエチレン（２０）セチルエーテル（BrijTM５８）、
ポリオキシエチレン（２）ステアリルエーテル（BrijTM
７２）、ポリオキシエチレン（１０）ステアリルエーテ
ル（BrijTM７６）、ポリオキシエチレン（２０）ステア
リルエーテル（BrijTM７８）、ポリオキシエチレン
（２）オレイルエーテル（BrijTM９２）、ポリオキシエ
チレン（１０）オレイルエーテル（BrijTM９６）、ポリ
オキシエチレン（２０）オレイルエーテル（BrijTM９
８）、ポリオキシエチレン（２１）ステアリルエーテル
（BrijTM７２１）、ポリオキシエチレン（１００）ステ
アリルエーテル（BrijTM７００）。BrijTM界面活性剤の
中最も好ましいのはBrijTM３５である。本発明の組成物
中に使用が適しているが、ポリオキシエチエンオレイル
エーテルは、分子中での、酸化に対して感受性にする二
重結合の存在により、長期の貯蔵に対する安定が少ない
かもしれない。最も適当な非イオン性界面活性剤は本発
明に従うと前記の範囲内のＨＬＢ値を持つことになるこ
とを技術に熟達した人達により認められるだろう。第２
の族の非イオン性界面活性剤の他の限定しない例にはTr
itonＸTM−１００（non-reduced 又はreduced)と、Trit
onTMＸ−１１４（non-reduced 又はreduced)とTritonＸ
TM−１６５と、TritonＸTM−３０５（non-reduced 又は
reduced)とが含まれる。非イオン性界面活性剤は本発明
の試薬組成物中に濃度約０．１０〜０．２０g/L 、より
好ましくは濃度範囲約０．１０〜０．１６g/L 、最も好
ましくは濃度範囲約０．１２〜０．１４g/L で存在すべ
きである。
【００５６】組成物の糖または糖アルコールにはスクロ
ースとフルクトースとデキストロースとソルビトールと
マンニトールとが含まれる。デキストロースは試薬組成
物中に用いられる好ましい糖である。しかし、糖アルコ
ール例えばソルビトールがより好ましい。糖アルコール
は糖アルコールの空気酸化不能性により時間に亘りより
安定な試薬溶液を与える。糖または糖アルコールは試薬
組成物中理想的には約１１０．０〜１２０．０g/L 、よ
り好ましくは１１３．０g/L の濃度で存在する。もしデ
キストロース以外の糖あるいはソルビトール以外の糖ア
ルコールが用いられるとすれば、その量は、代りの糖ま
たは糖アルコールがデキストロースまたはソルビトース
とほぼ同じ濃度で（g/L)存在する様に調節すべきであ
る。糖または糖アルコールは試薬溶液中に存在してノイ
ズ（即ち、赤色細胞幻影と血小板）を越えてリンパ球の
検出性を増大させる。糖あるいは糖アルコールの何れ
も、分析の本性と必要条件とによって用いられてもよ
い。
ースとフルクトースとデキストロースとソルビトールと
マンニトールとが含まれる。デキストロースは試薬組成
物中に用いられる好ましい糖である。しかし、糖アルコ
ール例えばソルビトールがより好ましい。糖アルコール
は糖アルコールの空気酸化不能性により時間に亘りより
安定な試薬溶液を与える。糖または糖アルコールは試薬
組成物中理想的には約１１０．０〜１２０．０g/L 、よ
り好ましくは１１３．０g/L の濃度で存在する。もしデ
キストロース以外の糖あるいはソルビトール以外の糖ア
ルコールが用いられるとすれば、その量は、代りの糖ま
たは糖アルコールがデキストロースまたはソルビトース
とほぼ同じ濃度で（g/L)存在する様に調節すべきであ
る。糖または糖アルコールは試薬溶液中に存在してノイ
ズ（即ち、赤色細胞幻影と血小板）を越えてリンパ球の
検出性を増大させる。糖あるいは糖アルコールの何れ
も、分析の本性と必要条件とによって用いられてもよ
い。
【００５７】ホルムアルデヒドまたはパラアルデヒドは
本発明の試薬溶液中に白血細胞用の固定剤（即ち、化学
的橋かけ化合物）として用いられる。もしホルムアルデ
ヒドが用いられるとそれはその溶液中約５０〜６０g/L
の量で存在する。より好ましくはホルムアルデヒドは約
５２〜５８g/L の濃度で存在する。還元する糖例えばグ
ルコースよりむしろ糖アルコールを用いた場合の、試薬
溶液の増大する安定性は時間に亘るグルコース（糖アル
コールではない）の、グルコン酸を形成する空気酸化の
現象に関係する。例えばNishikido 等日本特許公報第８
０４０，６０６号、Chem. Abst. 93: 22120d, (1950)お
よび米国特許第４，８０１，５４９号参照。グルコン酸
の存在は溶液のｐＨを低下させる。ｐＨが本発明の範囲
の外に落ちる場合は、ここに説明した如く、方法は、試
料中の赤血細胞の非溶解による妨害をうける。さらに、
空気酸化され得ない糖アルコールはホルムアルデヒドと
化学的に結合しポリアセタールを形成してもよく、それ
により、若し生成されると試薬溶液のｐＨをも低下させ
るギ酸へのホルムアルデヒドの酸化を防止する（米国特
許第４，８０１，５４９号）。
本発明の試薬溶液中に白血細胞用の固定剤（即ち、化学
的橋かけ化合物）として用いられる。もしホルムアルデ
ヒドが用いられるとそれはその溶液中約５０〜６０g/L
の量で存在する。より好ましくはホルムアルデヒドは約
５２〜５８g/L の濃度で存在する。還元する糖例えばグ
ルコースよりむしろ糖アルコールを用いた場合の、試薬
溶液の増大する安定性は時間に亘るグルコース（糖アル
コールではない）の、グルコン酸を形成する空気酸化の
現象に関係する。例えばNishikido 等日本特許公報第８
０４０，６０６号、Chem. Abst. 93: 22120d, (1950)お
よび米国特許第４，８０１，５４９号参照。グルコン酸
の存在は溶液のｐＨを低下させる。ｐＨが本発明の範囲
の外に落ちる場合は、ここに説明した如く、方法は、試
料中の赤血細胞の非溶解による妨害をうける。さらに、
空気酸化され得ない糖アルコールはホルムアルデヒドと
化学的に結合しポリアセタールを形成してもよく、それ
により、若し生成されると試薬溶液のｐＨをも低下させ
るギ酸へのホルムアルデヒドの酸化を防止する（米国特
許第４，８０１，５４９号）。
【００５８】無機塩もまた試薬溶液中に含まれていても
よい。本発明中に用いるに適当な塩はアルカリ金属塩化
物例えばＮａＣｌとＫＣｌとＬｉＣｌとであってもよ
い。塩化ナトリウムＮａＣｌが好ましい塩である。その
様な塩は、光散乱／吸収光学を用いるペルオキシダーゼ
染色強度の差異を引き起すことにより好中球の好酸球か
らの識別を助けてもよい故に、随意に存在していてもよ
い。他のハロゲン塩（即ち、弗化物と臭化物と沃化物）
は好中球のペルオキシダーゼ活性を過度に抑制し、それ
により他の染色していない白血細胞（ＷＢＣ）からの好
中球の識別を妨げる。用いる場合、塩例えばＮａＣｌは
好ましくは約６．８〜１０．３mM（あるいは約０．４〜
０．６g/L)の量で存在させるべきである。
よい。本発明中に用いるに適当な塩はアルカリ金属塩化
物例えばＮａＣｌとＫＣｌとＬｉＣｌとであってもよ
い。塩化ナトリウムＮａＣｌが好ましい塩である。その
様な塩は、光散乱／吸収光学を用いるペルオキシダーゼ
染色強度の差異を引き起すことにより好中球の好酸球か
らの識別を助けてもよい故に、随意に存在していてもよ
い。他のハロゲン塩（即ち、弗化物と臭化物と沃化物）
は好中球のペルオキシダーゼ活性を過度に抑制し、それ
により他の染色していない白血細胞（ＷＢＣ）からの好
中球の識別を妨げる。用いる場合、塩例えばＮａＣｌは
好ましくは約６．８〜１０．３mM（あるいは約０．４〜
０．６g/L)の量で存在させるべきである。
【００５９】本発明で有用な緩衝剤または緩衝剤混合物
は試薬溶液のｐＨを約６．８〜８．０、好ましくは約
６．９〜７．６、より好ましくは約７．０〜７．３に維
持するために適当なものである。ｐＨが低すぎる、即ち
約６．８以下の場合、赤血細胞の妨害がサイトグラム中
に観察される。適当な緩衝剤にはリン酸ナトリウムまた
はカリウム、マロン酸ジエチル、３−（Ｎ−モルホリ
ノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−２−アセタ
ミド−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）および
４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジン−エタ
ンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）が含まれる。Ｎａ2 ＨＰＯ
4(リン酸水素二ナトリウム）とＮａＨ2 ＰＯ4(リン酸二
水素ナトリウム）との混合物が好ましい。示す如く、緩
衝剤はこの発明の試薬溶液中溶液のｐＨをほぼ中性に維
持するのに適当な量存在させるべきである。例えばＮａ
2 ＨＰＯ4 とＮａＨ2 ＰＯ4 との混合物を用いる場合、
ｐＨ範囲約６．９〜７．６、好ましくは約７．０〜７．
３の一連の溶液を生成させるために、その混合物は、約
２．０４：１〜０．８１：１のＮａ2 ＨＰＯ4 対ＮａＨ
2 ＰＯ4 モル比を含有すべきである。本発明の試薬溶液
中のそのような混合物の緩衝剤濃度は約７５〜１２５mM
である。約１２５mM以上は得られるサイトグラム中で赤
血細胞妨害を引き起してもよい。
は試薬溶液のｐＨを約６．８〜８．０、好ましくは約
６．９〜７．６、より好ましくは約７．０〜７．３に維
持するために適当なものである。ｐＨが低すぎる、即ち
約６．８以下の場合、赤血細胞の妨害がサイトグラム中
に観察される。適当な緩衝剤にはリン酸ナトリウムまた
はカリウム、マロン酸ジエチル、３−（Ｎ−モルホリ
ノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−２−アセタ
ミド−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）および
４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジン−エタ
ンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）が含まれる。Ｎａ2 ＨＰＯ
4(リン酸水素二ナトリウム）とＮａＨ2 ＰＯ4(リン酸二
水素ナトリウム）との混合物が好ましい。示す如く、緩
衝剤はこの発明の試薬溶液中溶液のｐＨをほぼ中性に維
持するのに適当な量存在させるべきである。例えばＮａ
2 ＨＰＯ4 とＮａＨ2 ＰＯ4 との混合物を用いる場合、
ｐＨ範囲約６．９〜７．６、好ましくは約７．０〜７．
３の一連の溶液を生成させるために、その混合物は、約
２．０４：１〜０．８１：１のＮａ2 ＨＰＯ4 対ＮａＨ
2 ＰＯ4 モル比を含有すべきである。本発明の試薬溶液
中のそのような混合物の緩衝剤濃度は約７５〜１２５mM
である。約１２５mM以上は得られるサイトグラム中で赤
血細胞妨害を引き起してもよい。
【００６０】本発明の実行に有用な試薬溶液は水性溶液
で、好ましくは脱イオン水を用いる。溶液は水中で成分
を混合して組合わせることにより調製する。溶液のｐＨ
が所望の範囲内にあることを確かめるため、ｐＨに精密
な監視をしつづけるべきである。技術に熟達した人達は
また、所望の試薬溶液中に他の添加物を含めてもよい。
特に、金属キレート剤例えばエチレンジアミン四酢酸
（ＥＤＴＡ）とエチレンビス−（オキシエチレンニトリ
ロ）−四酢酸（ＥＧＴＡ）とのジナトリウムまたはトリ
ナトリウム塩は、組成物の他の成分を、多価金属イオン
接触自働酸化から防護するために、試薬組成物中に約１
〜５mMの濃度で含めるのは価値のあることである。ＥＤ
ＴＡに加えて、ＥＤＴＡまたはＥＤＴＡのジナトリウム
とトリナトリウムとテトラナトリウムを、二水和物が好
ましいが、ＥＤＴＡジナトリウムと共に組成物中に用い
るのが適当である。例えばホルムアルデヒドとソルビト
ールとＳＤＳとBrijTM３５とは全て自動酸化に敏感であ
る。多価金属イオン触媒、例えばＣｕ+2とＦｅ+3とは処
方溶剤として用いる水中に ppb濃度でしばしば存在する
（"Polymer Stabilization", 1972, Ed., W.L. Hawkin
s, Wiley-Interscience, New York, New York）。
で、好ましくは脱イオン水を用いる。溶液は水中で成分
を混合して組合わせることにより調製する。溶液のｐＨ
が所望の範囲内にあることを確かめるため、ｐＨに精密
な監視をしつづけるべきである。技術に熟達した人達は
また、所望の試薬溶液中に他の添加物を含めてもよい。
特に、金属キレート剤例えばエチレンジアミン四酢酸
（ＥＤＴＡ）とエチレンビス−（オキシエチレンニトリ
ロ）−四酢酸（ＥＧＴＡ）とのジナトリウムまたはトリ
ナトリウム塩は、組成物の他の成分を、多価金属イオン
接触自働酸化から防護するために、試薬組成物中に約１
〜５mMの濃度で含めるのは価値のあることである。ＥＤ
ＴＡに加えて、ＥＤＴＡまたはＥＤＴＡのジナトリウム
とトリナトリウムとテトラナトリウムを、二水和物が好
ましいが、ＥＤＴＡジナトリウムと共に組成物中に用い
るのが適当である。例えばホルムアルデヒドとソルビト
ールとＳＤＳとBrijTM３５とは全て自動酸化に敏感であ
る。多価金属イオン触媒、例えばＣｕ+2とＦｅ+3とは処
方溶剤として用いる水中に ppb濃度でしばしば存在する
（"Polymer Stabilization", 1972, Ed., W.L. Hawkin
s, Wiley-Interscience, New York, New York）。
【００６１】ペルオキシダーゼ法のＲ１段階に用いる不
適当な試薬組成物の共通様式を次のように例示する、３
３より大きいパーセント根源ノイズと、人為的に高めら
れた白血細胞分画と、ゆがめられたパーセント好中球と
パーセントリンパ球。新鮮および時間をおいた試料に対
しての種々な界面活性剤を含有する多くの試薬処方物の
検査およびその性能の評価に基づき、本発明の改良され
た試薬組成物と方法との適当な成分を決定した。
適当な試薬組成物の共通様式を次のように例示する、３
３より大きいパーセント根源ノイズと、人為的に高めら
れた白血細胞分画と、ゆがめられたパーセント好中球と
パーセントリンパ球。新鮮および時間をおいた試料に対
しての種々な界面活性剤を含有する多くの試薬処方物の
検査およびその性能の評価に基づき、本発明の改良され
た試薬組成物と方法との適当な成分を決定した。
【００６２】表１は本発明の２界面活性剤含有水性試薬
組成物における好ましい成分と最適濃度とを与えてい
る。技術における人達によって、掲げられている試薬成
分それぞれの濃度と範囲とは組成物または方法における
使用を不利益に影響することなく、約±５〜１０％逸脱
してもよいことが認められよう。更に、表１に掲げられ
ているような新しいＰｘＲ１試薬組成物の各成分につい
ては括弧内に好ましい１L 当りの量が与えられている
が、限定を意図してはいない。
組成物における好ましい成分と最適濃度とを与えてい
る。技術における人達によって、掲げられている試薬成
分それぞれの濃度と範囲とは組成物または方法における
使用を不利益に影響することなく、約±５〜１０％逸脱
してもよいことが認められよう。更に、表１に掲げられ
ているような新しいＰｘＲ１試薬組成物の各成分につい
ては括弧内に好ましい１L 当りの量が与えられている
が、限定を意図してはいない。
【００６３】
【表１】
【００６４】本発明の他の態様は方法へのすすぎサイク
ルの編入と適当な水性すすぎ試薬組成物の使用の結果と
してのペルオキシダーゼ法の分析結果のさらなる改良に
関する。改良された方法のすすぎサイクルへ用いるすす
ぎ試薬は、白血細胞分画のペルオキシダーゼ法を迅速に
行う半自働および完全自働システム、特にTECHNICONＨ
●１TMと●１２TMと●１３TMシステムなどにおいて特に
有利であり、有用である。そのすすぎ試薬は、“全血試
料の血液学的分析に用いる万能すすぎ試薬組成物”と題
する、１９９５年５月１６日に、これと同時に提出さ
れ、本発明の譲受人に譲渡される同時係属米国特許出願
番号第０８／４４２，３６３号に記載の発明の主題であ
る。
ルの編入と適当な水性すすぎ試薬組成物の使用の結果と
してのペルオキシダーゼ法の分析結果のさらなる改良に
関する。改良された方法のすすぎサイクルへ用いるすす
ぎ試薬は、白血細胞分画のペルオキシダーゼ法を迅速に
行う半自働および完全自働システム、特にTECHNICONＨ
●１TMと●１２TMと●１３TMシステムなどにおいて特に
有利であり、有用である。そのすすぎ試薬は、“全血試
料の血液学的分析に用いる万能すすぎ試薬組成物”と題
する、１９９５年５月１６日に、これと同時に提出さ
れ、本発明の譲受人に譲渡される同時係属米国特許出願
番号第０８／４４２，３６３号に記載の発明の主題であ
る。
【００６５】改良された白血球分画法に用いることがで
きるすすぎ試薬溶液は、生理学的値に近いｐＨと重量モ
ル浸透圧濃度とを、例えばpH約６．９〜７．６、好まし
くはpH約７．０〜７．３と重量モル浸透圧濃度値約３０
０mOsmol/kg を与えるための、１つまたはそれ以上の緩
衝剤または化合物あるいはそれらの混合物、例えばリン
酸水素二ナトリウムとリン酸二水素ナトリウムと、微生
物増殖を妨げるための抗微生物化合物と、非溶血性界面
活性剤例えばpluronics 例えばＰ８４とＰ８５とＰ１０
３とＰ１０４とＰ１０５とＰ１２３（Ｐ１０５はすすぎ
溶液中に用いられる量で非溶解性により好ましく、分子
量約３，０００を持ち、約５０wt% ポリオキシエチレン
を包含する）と、アルカリ金属塩化物例えばＮａＣｌ、
ＫＣｌ、ＬｉＣｌなどとを包含する。適当な抗微生物剤
の限定しない例にはProclin １５０（２−メチル−４−
イソチアゾリン−３−オン）とProclin ３００（５−ク
ロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン）
（Rohm & Haas)と、Germall１１５（Ｎ，Ｎ´−メチレ
ンビス〔Ｎ´−（１−ヒドロキシメチル）−２，５−ジ
オキソ−４−イミダゾリジニル〕尿素）（Sutton Labor
atories)と、Dowacil２００〔１−（３−クロロアリ
ル）−３，５，７−トリアザ−１−アゾニアアダマンタ
ンクロリド〕（Dow Chemical）と、Bronopol(Angus Che
mical Company)とが含まれる。すすぎ組成物における使
用にはProclin １５０が好ましい。
きるすすぎ試薬溶液は、生理学的値に近いｐＨと重量モ
ル浸透圧濃度とを、例えばpH約６．９〜７．６、好まし
くはpH約７．０〜７．３と重量モル浸透圧濃度値約３０
０mOsmol/kg を与えるための、１つまたはそれ以上の緩
衝剤または化合物あるいはそれらの混合物、例えばリン
酸水素二ナトリウムとリン酸二水素ナトリウムと、微生
物増殖を妨げるための抗微生物化合物と、非溶血性界面
活性剤例えばpluronics 例えばＰ８４とＰ８５とＰ１０
３とＰ１０４とＰ１０５とＰ１２３（Ｐ１０５はすすぎ
溶液中に用いられる量で非溶解性により好ましく、分子
量約３，０００を持ち、約５０wt% ポリオキシエチレン
を包含する）と、アルカリ金属塩化物例えばＮａＣｌ、
ＫＣｌ、ＬｉＣｌなどとを包含する。適当な抗微生物剤
の限定しない例にはProclin １５０（２−メチル−４−
イソチアゾリン−３−オン）とProclin ３００（５−ク
ロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン）
（Rohm & Haas)と、Germall１１５（Ｎ，Ｎ´−メチレ
ンビス〔Ｎ´−（１−ヒドロキシメチル）−２，５−ジ
オキソ−４−イミダゾリジニル〕尿素）（Sutton Labor
atories)と、Dowacil２００〔１−（３−クロロアリ
ル）−３，５，７−トリアザ−１−アゾニアアダマンタ
ンクロリド〕（Dow Chemical）と、Bronopol(Angus Che
mical Company)とが含まれる。すすぎ組成物における使
用にはProclin １５０が好ましい。
【００６６】水溶性酸化防止剤例えば３，３´−チオシ
プロピオン酸と、３，３´−ジチオ酢酸と、Trolox
TM（即ち水溶性ビタミンＥ、Hoffman-LaRoche)と、ＢＨ
Ｔ、ブチル化ヒドロキシトルエンまたは（２，６−ジ−
tert−ブチル−４−メチルフェノール）と、ＢＨＡ、ブ
チルヒドロキシアニソールまたは（２−tert−４−メト
キシフェノール）と、ＭＥＨＱ（ｐ−メトキシフェノー
ル）、あるいはそれらの混合物もまたすすぎ試薬組成物
中の非溶血性界面活性剤の安定化のために用いてもよ
い。組成物中の使用には３，３´−チオジプロピオン酸
が好ましい。すすぎ溶液の最終的な重量モル浸透圧濃度
は約２８５〜３０５mOsm/kg である。
プロピオン酸と、３，３´−ジチオ酢酸と、Trolox
TM（即ち水溶性ビタミンＥ、Hoffman-LaRoche)と、ＢＨ
Ｔ、ブチル化ヒドロキシトルエンまたは（２，６−ジ−
tert−ブチル−４−メチルフェノール）と、ＢＨＡ、ブ
チルヒドロキシアニソールまたは（２−tert−４−メト
キシフェノール）と、ＭＥＨＱ（ｐ−メトキシフェノー
ル）、あるいはそれらの混合物もまたすすぎ試薬組成物
中の非溶血性界面活性剤の安定化のために用いてもよ
い。組成物中の使用には３，３´−チオジプロピオン酸
が好ましい。すすぎ溶液の最終的な重量モル浸透圧濃度
は約２８５〜３０５mOsm/kg である。
【００６７】最も簡単な処方においては、すすぎ試薬は
リン酸塩緩衝剤（例えばリン酸塩緩衝食塩水、pH６．８
〜７．８）とPluronic族または界面活性剤類の非イオン
性で非溶血性の界面活性剤を包含していてもよい。Plur
onicはポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンと
の、構造式（ＥＯ）x−（ＰＯ）y−（ＥＯ）xのブロッ
ク共重合体（Pluronic & Tetronic Surfactants, BASF
Corporation, Parsippany, New Jersey, 1987 参照）
で、プロピレンオキシドの制御された重合により、プロ
ピレングリコール単位（ＰＯ)yを合成して形成される。
Pluronicは分子量が９５０〜４，０００g/mol で変化で
き、（ＰＯ）は約２０〜９０wt% 包含できる故、“ｙ”
は約３〜６２単位の範囲であり得る。次にＥＯ重合鎖は
ポリ（ＰＯ）単位の両側に形成され、Pluronic共重合体
を与える。技術の人達は、“ｘ”はPluronic各側または
終端において本質的には同じであるように、ＥＯ重合を
対称的に制御できることを知っている。一般的なすすぎ
組成物中の使用に適当なPluronicに関する“ｘ”と
“ｙ”との値の非限定的な例は、“ｘ”が１〜３６単
位、より好ましくは約７〜２７で、“ｙ”は好ましくは
約１４〜４８単位である。
リン酸塩緩衝剤（例えばリン酸塩緩衝食塩水、pH６．８
〜７．８）とPluronic族または界面活性剤類の非イオン
性で非溶血性の界面活性剤を包含していてもよい。Plur
onicはポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンと
の、構造式（ＥＯ）x−（ＰＯ）y−（ＥＯ）xのブロッ
ク共重合体（Pluronic & Tetronic Surfactants, BASF
Corporation, Parsippany, New Jersey, 1987 参照）
で、プロピレンオキシドの制御された重合により、プロ
ピレングリコール単位（ＰＯ)yを合成して形成される。
Pluronicは分子量が９５０〜４，０００g/mol で変化で
き、（ＰＯ）は約２０〜９０wt% 包含できる故、“ｙ”
は約３〜６２単位の範囲であり得る。次にＥＯ重合鎖は
ポリ（ＰＯ）単位の両側に形成され、Pluronic共重合体
を与える。技術の人達は、“ｘ”はPluronic各側または
終端において本質的には同じであるように、ＥＯ重合を
対称的に制御できることを知っている。一般的なすすぎ
組成物中の使用に適当なPluronicに関する“ｘ”と
“ｙ”との値の非限定的な例は、“ｘ”が１〜３６単
位、より好ましくは約７〜２７で、“ｙ”は好ましくは
約１４〜４８単位である。
【００６８】すすぎ試薬中の使用に適当なPluronicは、
約２，０００〜４，０００の分子量範囲と共に約２０〜
８０wt％の範囲のwt％ＥＯ値を持つ。分子量約３，００
０〜３，６００の範囲と共に約３０〜７０wt％範囲のwt
％ＥＯ値がより好ましい。例えばPluronicＰ１０５とＰ
８５とは％ＥＯ値約５０wt％、PluronicＰ１０４とＰ８
４とは約４０wt％の％ＥＯ値を持つ。
約２，０００〜４，０００の分子量範囲と共に約２０〜
８０wt％の範囲のwt％ＥＯ値を持つ。分子量約３，００
０〜３，６００の範囲と共に約３０〜７０wt％範囲のwt
％ＥＯ値がより好ましい。例えばPluronicＰ１０５とＰ
８５とは％ＥＯ値約５０wt％、PluronicＰ１０４とＰ８
４とは約４０wt％の％ＥＯ値を持つ。
【００６９】表２は、ペルオキシダーゼ法を更に改良す
るために用いてもよいすすぎ試薬の例示的処方を示し、
最終的試薬溶液の適当で有効なｐＨと重量モル浸透圧濃
度とを与えるための各成分の好ましい量を含んでいる。
技術の人達によって、掲げられているすすぎ溶液成分の
各々の濃度と範囲とは改良された方法における組成物と
その使用に対し不利益に影響することなく±約５〜１０
％遍移してもよいことは認められるであろう。その上、
前記の如く、表２に掲げられているすすぎ試薬組成物の
各成分に関しては、１L 当りの好ましい量が括弧内に与
えられているが、限定する意図はない。
るために用いてもよいすすぎ試薬の例示的処方を示し、
最終的試薬溶液の適当で有効なｐＨと重量モル浸透圧濃
度とを与えるための各成分の好ましい量を含んでいる。
技術の人達によって、掲げられているすすぎ溶液成分の
各々の濃度と範囲とは改良された方法における組成物と
その使用に対し不利益に影響することなく±約５〜１０
％遍移してもよいことは認められるであろう。その上、
前記の如く、表２に掲げられているすすぎ試薬組成物の
各成分に関しては、１L 当りの好ましい量が括弧内に与
えられているが、限定する意図はない。
【００７０】
【表２】
【００７１】すすぎサイクルも用いるＰｘ法における改
良された試薬の重要な有利さは、本発明の試薬組成物
が、すすぎ液の界面活性剤成分が方法において望ましか
らぬそして受入れられない機能的役割を演ずる、一定し
ないすすぎ液残余に帰せられる不利な効果を除去するた
めに設計され、最適化されているところにある。試薬処
方物と方法とは、室温で２日間まで貯蔵した、時間をお
いた血液試料を用い、受入れられない根源ノイズによ
る、結果の確度と精度と信頼性とを犠牲にすることな
く、白血細胞分画の測定を可能にする。また本発明に従
い処方された試薬組成物を、本発明に従うすすぎ溶液処
方物と組合わせて使用すると、すすぎ溶液は、分画法の
ペルオキシダーゼ化学に関与することはない。
良された試薬の重要な有利さは、本発明の試薬組成物
が、すすぎ液の界面活性剤成分が方法において望ましか
らぬそして受入れられない機能的役割を演ずる、一定し
ないすすぎ液残余に帰せられる不利な効果を除去するた
めに設計され、最適化されているところにある。試薬処
方物と方法とは、室温で２日間まで貯蔵した、時間をお
いた血液試料を用い、受入れられない根源ノイズによ
る、結果の確度と精度と信頼性とを犠牲にすることな
く、白血細胞分画の測定を可能にする。また本発明に従
い処方された試薬組成物を、本発明に従うすすぎ溶液処
方物と組合わせて使用すると、すすぎ溶液は、分画法の
ペルオキシダーゼ化学に関与することはない。
【００７２】本発明により取り囲まれた方法を実行する
には、試薬溶液を分析される試料と迅速に混合し、方法
のＲ１段階の反応混合物を形成する。均一な混合物は試
薬溶液と血液試料と互いに接触した時間約５秒以内に発
生させるべきである。もしその２つを速やかに、そして
均一に混合させないと、赤血細胞の固定水準の不均一が
起り、それは赤血細胞の溶解を妨げ、それにより方法の
実施から得られる白血細胞分画（differential ＷＢ
Ｃ）の確度が損われる。
には、試薬溶液を分析される試料と迅速に混合し、方法
のＲ１段階の反応混合物を形成する。均一な混合物は試
薬溶液と血液試料と互いに接触した時間約５秒以内に発
生させるべきである。もしその２つを速やかに、そして
均一に混合させないと、赤血細胞の固定水準の不均一が
起り、それは赤血細胞の溶解を妨げ、それにより方法の
実施から得られる白血細胞分画（differential ＷＢ
Ｃ）の確度が損われる。
【００７３】混合する時、試薬溶液と血液試料とは室温
（例えば約５℃）よりやや温かである。それから反応混
合物（血液試料を含んでいる）を、好ましくは、適当に
高められた温度に維持されている、自働血液学的分析機
の適当な室に注入することにより、急速に約６２〜７６
℃、理想的には約７０〜７５℃に加熱する。反応混合物
の加熱は約１５秒以内、好ましくは２０秒以内にすべき
で、そうでないと赤血細胞の固定が起る。固定された赤
色細胞は溶解せず、リンパ球として間違って検出され、
それにより白血細胞分画の確度を妨害する。
（例えば約５℃）よりやや温かである。それから反応混
合物（血液試料を含んでいる）を、好ましくは、適当に
高められた温度に維持されている、自働血液学的分析機
の適当な室に注入することにより、急速に約６２〜７６
℃、理想的には約７０〜７５℃に加熱する。反応混合物
の加熱は約１５秒以内、好ましくは２０秒以内にすべき
で、そうでないと赤血細胞の固定が起る。固定された赤
色細胞は溶解せず、リンパ球として間違って検出され、
それにより白血細胞分画の確度を妨害する。
【００７４】その直後、過酸化水素と適当な色原体例え
ば４−クロロ−１−ナフトールとを包含する染色混合物
を反応混合物と混合する。染色混合物の最初の温度は室
温であってもよいが、理想的には、しかし必要ではない
が、ペルオキシダーゼ活性である好中球と単核細胞と好
酸球とを染色するために、染色混合物を反応混合物と混
合後の温度を約３０秒以内、好ましくは約８〜１５秒以
内に、約６２〜７２℃、好ましくは約６５〜７０℃に上
げる。
ば４−クロロ−１−ナフトールとを包含する染色混合物
を反応混合物と混合する。染色混合物の最初の温度は室
温であってもよいが、理想的には、しかし必要ではない
が、ペルオキシダーゼ活性である好中球と単核細胞と好
酸球とを染色するために、染色混合物を反応混合物と混
合後の温度を約３０秒以内、好ましくは約８〜１５秒以
内に、約６２〜７２℃、好ましくは約６５〜７０℃に上
げる。
【００７５】実行において、反応は次の通り進行しても
よい。自働血液学分析機反応室を約７２℃の温度に維持
する。全血１２．０μL と本発明のＲ１試薬組成物２５
０μL とを室温にあるシステム中に同時に注入し、それ
により２つを迅速に混合し、反応混合物を形成させ、そ
れを約３０秒以内、好ましくは１６秒まで温置し、その
間混合物の温度を約６２℃から約７２℃に上げる。温置
時間の終りに赤血細胞は最適に溶解され、白血細胞は固
定（即ち橋かけ）される。
よい。自働血液学分析機反応室を約７２℃の温度に維持
する。全血１２．０μL と本発明のＲ１試薬組成物２５
０μL とを室温にあるシステム中に同時に注入し、それ
により２つを迅速に混合し、反応混合物を形成させ、そ
れを約３０秒以内、好ましくは１６秒まで温置し、その
間混合物の温度を約６２℃から約７２℃に上げる。温置
時間の終りに赤血細胞は最適に溶解され、白血細胞は固
定（即ち橋かけ）される。
【００７６】その直後、色原体混合物（例えばオキシジ
エタノール中の４−クロロ−１−ナフトール７０g/L)１
２５μL を、過酸化水素３．０g/L 包含する過酸化水素
溶液２５０μL と同時に注入する。両試薬は初め室温で
あるが、反応室の温度により、染色混合物温度は約３０
秒以内に約６３℃から６９℃に上昇され、その時間に好
中球と好酸球のペルオキシダーゼ染色は完結する。反応
室とシステムハードウエアは、１つの試料分析サイクル
から次への試薬および溶液の残余の軽減と、反応室中の
汚染試薬存在によるゆがめられた結果を避けるために、
開示したすすぎ溶液ですすぐ。自働反応法に関連したそ
の他の事項は実施例６で説明する。
エタノール中の４−クロロ−１−ナフトール７０g/L)１
２５μL を、過酸化水素３．０g/L 包含する過酸化水素
溶液２５０μL と同時に注入する。両試薬は初め室温で
あるが、反応室の温度により、染色混合物温度は約３０
秒以内に約６３℃から６９℃に上昇され、その時間に好
中球と好酸球のペルオキシダーゼ染色は完結する。反応
室とシステムハードウエアは、１つの試料分析サイクル
から次への試薬および溶液の残余の軽減と、反応室中の
汚染試薬存在によるゆがめられた結果を避けるために、
開示したすすぎ溶液ですすぐ。自働反応法に関連したそ
の他の事項は実施例６で説明する。
【００７７】本発明の主題の試薬組成物と方法とを自働
化装置を用いて説明したが、技術に熟達した人達には、
本発明の内容は手動方法および半自働または完全自働法
と組合わせての手動法にも適用できてもよいことは容易
に明らかである。更に本発明の試薬組成物と方法とは全
血を用いて説明し、白血細胞分画に帰着させた。本発明
は特別に調製した血液細胞のストックカリブレーター
（stock calibrator）と対照と他の溶液とを用いてもよ
く、校正および装置の確度維持のために商業的に役立っ
てもよいことは技術に熟達した人達によって認められよ
う。ここに用いられたように他の修飾語なしの術語“試
料”はとりわけ、全血あるいは血液細胞を含有する他の
溶液いずれをも包含する意図である。
化装置を用いて説明したが、技術に熟達した人達には、
本発明の内容は手動方法および半自働または完全自働法
と組合わせての手動法にも適用できてもよいことは容易
に明らかである。更に本発明の試薬組成物と方法とは全
血を用いて説明し、白血細胞分画に帰着させた。本発明
は特別に調製した血液細胞のストックカリブレーター
（stock calibrator）と対照と他の溶液とを用いてもよ
く、校正および装置の確度維持のために商業的に役立っ
てもよいことは技術に熟達した人達によって認められよ
う。ここに用いられたように他の修飾語なしの術語“試
料”はとりわけ、全血あるいは血液細胞を含有する他の
溶液いずれをも包含する意図である。
【００７８】
【実施例】次の実施例は本発明を説明する。それらは発
明の概念の理解を容易にするが、いかなる方法ででも本
発明を限定すると解釈されるべきではない。
明の概念の理解を容易にするが、いかなる方法ででも本
発明を限定すると解釈されるべきではない。
【００７９】〔実施例１〕非イオン性界面活性剤を含有
せず、イオン性界面活性剤だけを含有する（例えばＳＤ
Ｓだけで、BrijTM３５なし）ペルオキシダーゼＲ１希釈
試薬組成物の処方と試験 実験はペルオキシダーゼ法のＲ１段階での使用のため
の、ペルオキシダーゼ希釈溶液に対する最適処方の決定
のために設計され、実施された。
せず、イオン性界面活性剤だけを含有する（例えばＳＤ
Ｓだけで、BrijTM３５なし）ペルオキシダーゼＲ１希釈
試薬組成物の処方と試験 実験はペルオキシダーゼ法のＲ１段階での使用のため
の、ペルオキシダーゼ希釈溶液に対する最適処方の決定
のために設計され、実施された。
【００８０】受け入れられるそして有効であるＲ１組成
物または希釈剤を処方する最初の方法は試薬組成にイオ
ン性界面活性剤即ち陰イオン界面活性剤ＳＤＳを含有
し、非イオン性界面活性剤即ちBrijTM３５の存在しない
試薬溶液の調製と試験とを包含する。Ｒ１試薬溶液はＳ
ＤＳ濃度を約０．１０５g/L から約０．１７〜０．２０
g/L に増大させることに基づいて調製した。幾つかの研
究は自働システムにより、処理量１０２個試料／時間と
１２０個試料／時間で、高水準のＳＤＳを含有する“試
験”試薬の性能の検査を完成させた。
物または希釈剤を処方する最初の方法は試薬組成にイオ
ン性界面活性剤即ち陰イオン界面活性剤ＳＤＳを含有
し、非イオン性界面活性剤即ちBrijTM３５の存在しない
試薬溶液の調製と試験とを包含する。Ｒ１試薬溶液はＳ
ＤＳ濃度を約０．１０５g/L から約０．１７〜０．２０
g/L に増大させることに基づいて調製した。幾つかの研
究は自働システムにより、処理量１０２個試料／時間と
１２０個試料／時間で、高水準のＳＤＳを含有する“試
験”試薬の性能の検査を完成させた。
【００８１】特に、自働血液学分析機を用い、ＳＤＳ
０．１６〜０．２０g/L(例えば０．１６と０．１７と
０．１８と０．１９と０．２０g/L)含有する試験Ｒ１試
薬溶液を調製し、指示したように Day１と Day２血液試
料について試験した。ＳＤＳ試験Ｒ１希釈剤はBrijTM３
５（例えば０．０g/L)含んでいない。この実験分析に用
いられた血液試料はＫ3 ＥＤＴＡ存在のVacutainerTM管
に集められた。その上、この試験を行うに当り、すすぎ
サイクルに用いられたすすぎ溶液にはBrijTM３５が含有
されていない。記載の如く、非溶血性界面活性剤Pluron
icＰ１０５を含有するすすぎ溶液もまた用いた。これら
の分析の結果は表３に呈示されていて、それは Day２血
液試料に関し、全ての試験試薬によって、受入れられな
い結果が得られたことを示している。％好中球と％リン
パ球とのパラメーターに関するデータが示されていて、
すすぎ溶液がBrijTM３５を濃度３．０g/L で、ＳＤＳを
濃度２．０g/L で含有する標準方法と比較されている。
Day２血液試料に関しては、これら２つのパラメーター
のリカバリ（recovery）はＳＤＳ ０．２０g/L の標準
に近似する。しかし、濃度０．１６〜０．１９g/L のＳ
ＤＳを用いると、確度はＰｘ法の受入れられない根源ノ
イズのために不充分であった。特殊な試料についての反
復吸引（aspiration）間の差異が判る。
０．１６〜０．２０g/L(例えば０．１６と０．１７と
０．１８と０．１９と０．２０g/L)含有する試験Ｒ１試
薬溶液を調製し、指示したように Day１と Day２血液試
料について試験した。ＳＤＳ試験Ｒ１希釈剤はBrijTM３
５（例えば０．０g/L)含んでいない。この実験分析に用
いられた血液試料はＫ3 ＥＤＴＡ存在のVacutainerTM管
に集められた。その上、この試験を行うに当り、すすぎ
サイクルに用いられたすすぎ溶液にはBrijTM３５が含有
されていない。記載の如く、非溶血性界面活性剤Pluron
icＰ１０５を含有するすすぎ溶液もまた用いた。これら
の分析の結果は表３に呈示されていて、それは Day２血
液試料に関し、全ての試験試薬によって、受入れられな
い結果が得られたことを示している。％好中球と％リン
パ球とのパラメーターに関するデータが示されていて、
すすぎ溶液がBrijTM３５を濃度３．０g/L で、ＳＤＳを
濃度２．０g/L で含有する標準方法と比較されている。
Day２血液試料に関しては、これら２つのパラメーター
のリカバリ（recovery）はＳＤＳ ０．２０g/L の標準
に近似する。しかし、濃度０．１６〜０．１９g/L のＳ
ＤＳを用いると、確度はＰｘ法の受入れられない根源ノ
イズのために不充分であった。特殊な試料についての反
復吸引（aspiration）間の差異が判る。
【００８２】図１Ａ−１Ｄにおいて示される如く、 Day
１血液試料を、ＳＤＳ（０．１０５g/L)を包含し、Brij
TM３５を包含しない標準ペルオキシダーゼ試薬溶液を用
い、そしてBrijTM３５を濃度３．０g/L と、ＳＤＳを濃
度２．０g/L で包含するすすぎ溶液を使用するペルオキ
シダーゼ法で分析した場合、サイトグラムの結果は拡散
せず、きれいに分離された細胞母集団と最低の根源ノイ
ズとを示す（図１Ａ参照）。図１Ｂは Day２血液試料に
ついての、図１Ａの結果について述べたと同じＰｘＲ１
試薬溶液とすすぎ溶液とを用いた分析結果を示してい
る。しかし、図１Ａの結果と対称的に、 Day２血液試料
のサイトグラムは細胞母集団の拡散とより高い根源ノイ
ズを示した。図１Ｃは、唯一つのイオン性界面活性剤
を、ＳＤＳ０．１０５g/L の形で含有するＲ１試験溶液
を用い、リン酸塩緩衝食塩水中非溶血性界面活性剤Ｐ１
０５を含有するすすぎ試薬溶液を用いるすすぎサイクル
を含む Day２血液試料の分析結果を示す。図１Ｃサイト
グラムの結果は根源において受入れられないノイズを示
す。受入れられない根源ノイズについての同じ問題はDa
y２血液試料分析のために、より高い量のイオン性界面
活性剤（即ち、ＳＤＳ０．１７g/L)を含有し、BrijTMは
含有しない試験試薬溶液を用い（図１Ｄ参照）、そして
図１Ｃで記載の同じすすぎ溶液を用いても生ずる。かく
して、イオン性界面活性剤（例えば陰イオン性界面活性
剤ＳＤＳ）のみを含有するペルオキシダーゼＲ１組成物
は、“BrijTMのない”すすぎ液と一緒に、記載のリンパ
球分画法に用いるには次善のものであると決定された。
１血液試料を、ＳＤＳ（０．１０５g/L)を包含し、Brij
TM３５を包含しない標準ペルオキシダーゼ試薬溶液を用
い、そしてBrijTM３５を濃度３．０g/L と、ＳＤＳを濃
度２．０g/L で包含するすすぎ溶液を使用するペルオキ
シダーゼ法で分析した場合、サイトグラムの結果は拡散
せず、きれいに分離された細胞母集団と最低の根源ノイ
ズとを示す（図１Ａ参照）。図１Ｂは Day２血液試料に
ついての、図１Ａの結果について述べたと同じＰｘＲ１
試薬溶液とすすぎ溶液とを用いた分析結果を示してい
る。しかし、図１Ａの結果と対称的に、 Day２血液試料
のサイトグラムは細胞母集団の拡散とより高い根源ノイ
ズを示した。図１Ｃは、唯一つのイオン性界面活性剤
を、ＳＤＳ０．１０５g/L の形で含有するＲ１試験溶液
を用い、リン酸塩緩衝食塩水中非溶血性界面活性剤Ｐ１
０５を含有するすすぎ試薬溶液を用いるすすぎサイクル
を含む Day２血液試料の分析結果を示す。図１Ｃサイト
グラムの結果は根源において受入れられないノイズを示
す。受入れられない根源ノイズについての同じ問題はDa
y２血液試料分析のために、より高い量のイオン性界面
活性剤（即ち、ＳＤＳ０．１７g/L)を含有し、BrijTMは
含有しない試験試薬溶液を用い（図１Ｄ参照）、そして
図１Ｃで記載の同じすすぎ溶液を用いても生ずる。かく
して、イオン性界面活性剤（例えば陰イオン性界面活性
剤ＳＤＳ）のみを含有するペルオキシダーゼＲ１組成物
は、“BrijTMのない”すすぎ液と一緒に、記載のリンパ
球分画法に用いるには次善のものであると決定された。
【００８３】
【表３】
【００８４】〔実施例２〕非イオン性界面活性剤のみを
含有し、イオン性界面活性剤を含有しない（例えば、Br
ijTM３５のみでＳＤＳのない）ペルオキシダーゼＲ１希
釈試薬組成物の処方と試験
含有し、イオン性界面活性剤を含有しない（例えば、Br
ijTM３５のみでＳＤＳのない）ペルオキシダーゼＲ１希
釈試薬組成物の処方と試験
【００８５】実施例１に記載の如く、ＳＤＳだけを含有
し、非イオン性界面活性剤不存在のように処方された試
験Ｒ１希釈組成物に加え、イオン性界面活性剤、例えば
陰イオン性界面活性剤ＳＤＳ不存在の下に、非イオン性
界面活性剤即ちBrijTM３５のみの存在を試験するため試
薬組成物も設計された。従ってBrijTM３５を濃度０．０
g/L と０．１４g/L と０．２８g/L と０．４２g/L とを
含有する幾つかの試験Ｒ１希釈試薬組成物が調製され、
検定された。BrijTM３５のみをＲ１希釈溶液に用いた試
験分析については、すすぎサイクルに用いたすすぎ溶液
は実施例１に記載の検定に用いられた非溶血性界面活性
剤PluronicＰ１０５を含有する。
し、非イオン性界面活性剤不存在のように処方された試
験Ｒ１希釈組成物に加え、イオン性界面活性剤、例えば
陰イオン性界面活性剤ＳＤＳ不存在の下に、非イオン性
界面活性剤即ちBrijTM３５のみの存在を試験するため試
薬組成物も設計された。従ってBrijTM３５を濃度０．０
g/L と０．１４g/L と０．２８g/L と０．４２g/L とを
含有する幾つかの試験Ｒ１希釈試薬組成物が調製され、
検定された。BrijTM３５のみをＲ１希釈溶液に用いた試
験分析については、すすぎサイクルに用いたすすぎ溶液
は実施例１に記載の検定に用いられた非溶血性界面活性
剤PluronicＰ１０５を含有する。
【００８６】種々なBrijTM３５含有Ｒ１試験溶液は次の
如く処方された。BrijTM３５の３０．０g/L 原液を蒸留
水中に調製する。ペルオキシダーゼＲ１組成物（非イオ
ン性界面活性剤なし）５０mLアリコートには、BrijTM３
５原液の次の体積を添加する。最終濃度０．０g/L のBr
ijTM３５を含有するＲ１希釈剤調製にはBrijTM３５原液
０．０mL；最終濃度０．１４g/L のBrijTM３５を含有す
るＲ１希釈剤調製には原液０．２３３mL；最終濃度０．
２８g/L のBrijTM３５を含有するＲ１希釈剤調製には原
液０．４６６mL；最終濃度０．４２g/L のBrijTM３５を
含有するＲ１希釈剤調製には原液０．６９９mL。溶液は
混合され、ポリプロピレンねじ栓試験管に貯蔵される。
如く処方された。BrijTM３５の３０．０g/L 原液を蒸留
水中に調製する。ペルオキシダーゼＲ１組成物（非イオ
ン性界面活性剤なし）５０mLアリコートには、BrijTM３
５原液の次の体積を添加する。最終濃度０．０g/L のBr
ijTM３５を含有するＲ１希釈剤調製にはBrijTM３５原液
０．０mL；最終濃度０．１４g/L のBrijTM３５を含有す
るＲ１希釈剤調製には原液０．２３３mL；最終濃度０．
２８g/L のBrijTM３５を含有するＲ１希釈剤調製には原
液０．４６６mL；最終濃度０．４２g/L のBrijTM３５を
含有するＲ１希釈剤調製には原液０．６９９mL。溶液は
混合され、ポリプロピレンねじ栓試験管に貯蔵される。
【００８７】試験運転に関し、正常血液試料はVacutain
erTM管中に採り、Ｋ3 ＥＤＴＡにより非凝固化する。試
料は開栓管様式（open tubu mode）で検定する。同じ提
供者セットからの開栓されていない試料を一夜室温で貯
蔵し、 day２について（即ち、 Day２試料）検定する。
データは自働血液学分析機を用い手動吸引で採る。標準
的運転は１０２試料／時であり、試験運転は１２０試料
／時である。重複の５組を含む運転について、標準偏差
ＳＤ（複数の提供者に亘ってはよくないＳＤ）は次の
式：ＳＤ＝〔Sum(d2)/2N〕1/2 、ここでｄは特別な試薬
で得られた重複値間の差、Ｎはセットの試料の数、を用
い、ペルオキシダーゼチャネル（channel）パラメータ
ーについて計算する。
erTM管中に採り、Ｋ3 ＥＤＴＡにより非凝固化する。試
料は開栓管様式（open tubu mode）で検定する。同じ提
供者セットからの開栓されていない試料を一夜室温で貯
蔵し、 day２について（即ち、 Day２試料）検定する。
データは自働血液学分析機を用い手動吸引で採る。標準
的運転は１０２試料／時であり、試験運転は１２０試料
／時である。重複の５組を含む運転について、標準偏差
ＳＤ（複数の提供者に亘ってはよくないＳＤ）は次の
式：ＳＤ＝〔Sum(d2)/2N〕1/2 、ここでｄは特別な試薬
で得られた重複値間の差、Ｎはセットの試料の数、を用
い、ペルオキシダーゼチャネル（channel）パラメータ
ーについて計算する。
【００８８】表４はこれらの実験から得られた数値デー
タの要約である。ペルオキシダーゼ法試薬１−４の性能
を、ペルオキシダーゼ法の標準Ｒ１試薬（即ち、ＳＤＳ
濃度０．１０５g/L で含有する標準Ｒ１試薬）を用いた
性能で比較した。 Day１血液試料分析に関しては試験試
薬は一般に受入れられない結果を与える。試薬１（即
ち、BrijTMもＳＤＳも包含していないペルオキシダーゼ
Ｒ１試薬）については溶解されない赤色細胞により引き
起されるひどい妨害の結果として分画データは得られな
かった。試験ＰｘＲ１試薬２〜４（即ち、試薬２：Brij
TM３５濃度＝０．１４、ＳＤＳなし；試薬３：BrijTM３
５濃度＝０．２８、ＳＤＳなし；試薬４：BrijTM３５濃
度＝０．４２g/L 、ＳＤＳなし）に関しては、方法規格
と比較して、有意の数の確度と不正確の欠点（※印によ
り示す）があった。試薬１と２と３については、パーセ
ントノイズは高い（即ち＞３４％）。 Day２血液試料に
ついては、BrijTM３５を包含し、ＳＤＳを包含していな
い試験試薬を用いると、数値データはまた受け入れられ
ない。かくして、数値データは、BrijTM３５含有のペル
オキシダーゼ法Ｒ１試薬（０．１４〜０．４２g/L でＳ
ＤＳを含まず）を含めた試験試薬セットは受け入れられ
ない性能を与えることを示している。
タの要約である。ペルオキシダーゼ法試薬１−４の性能
を、ペルオキシダーゼ法の標準Ｒ１試薬（即ち、ＳＤＳ
濃度０．１０５g/L で含有する標準Ｒ１試薬）を用いた
性能で比較した。 Day１血液試料分析に関しては試験試
薬は一般に受入れられない結果を与える。試薬１（即
ち、BrijTMもＳＤＳも包含していないペルオキシダーゼ
Ｒ１試薬）については溶解されない赤色細胞により引き
起されるひどい妨害の結果として分画データは得られな
かった。試験ＰｘＲ１試薬２〜４（即ち、試薬２：Brij
TM３５濃度＝０．１４、ＳＤＳなし；試薬３：BrijTM３
５濃度＝０．２８、ＳＤＳなし；試薬４：BrijTM３５濃
度＝０．４２g/L 、ＳＤＳなし）に関しては、方法規格
と比較して、有意の数の確度と不正確の欠点（※印によ
り示す）があった。試薬１と２と３については、パーセ
ントノイズは高い（即ち＞３４％）。 Day２血液試料に
ついては、BrijTM３５を包含し、ＳＤＳを包含していな
い試験試薬を用いると、数値データはまた受け入れられ
ない。かくして、数値データは、BrijTM３５含有のペル
オキシダーゼ法Ｒ１試薬（０．１４〜０．４２g/L でＳ
ＤＳを含まず）を含めた試験試薬セットは受け入れられ
ない性能を与えることを示している。
【００８９】
【表４】
【００９０】表４において※印は得られた値が方法を行
うのに用いられた自働分析機の確度規格 ("acc spe")を
越えたことを示している。“ＮＤ”は受入れられるまた
は有用なデータが得られなかったことを示している。
“ＷＢＣＰ”はペルオキシダーゼ法から測定された白血
細胞数を示し、“％Ｎｅｕｔ”はパーセント好中球を示
し、“％Ｌｙ”はパーセントリンパ球を示し、“％Ｍ”
はパーセント単核細胞を示し、“％Ｅｏｓ”はパーセン
ト好酸球を示し、“％ＬＵＣ”パーセント巨大未染色細
胞を示し、“％Ｎｏｉｓ”はパーセント根源ノイズを示
している。実施例２で記載の、 Day１および Day２血液
試料分析からのサイトグラムの代表的セットを図２Ａ−
２Ｊに示されている。図２Ａ−２Ｅは Day１血液試料分
析を表わしている。図２Ｆ−Ｊは Day２血液試料分析を
表わしている。記載の如く、血液試料はＫ3 ＥＤＴＡを
含有するVacutainerTM管に引き取る。これらの分析に用
いた試薬は次の如く得られたサイトグラムに対応する。
図２Ａ（ Day１血液試料）と図２Ｆ（ Day２血液試
料）：BrijTM３５ ０．１２g/L とＳＤＳ ０．１０５
g/L とを含むＲ１標準試薬と、図２Ｂ（ Day１血液試
料）と図２Ｇ（ Day２血液試料）：BrijTM３５ ０．０
g/L とＳＤＳ ０．０g/L とを包含するＳＤＳのない試
験試薬と、図２Ｃ（ Day１血液試料）と図２Ｈ（ Day２
血液試料）：BrijTM３５ ０．１４g/L とＳＤＳ ０．
０g/L とを包含するＳＤＳのない試験試薬と、図２Ｄ
（ Day１血液試料）と図２Ｉ（ Day２血液試料）：Brij
TM３５ ０．２８g/L とＳＤＳ ０．０g/L とを包含す
るＳＤＳのない試験試薬と、図２Ｅ（ Day１血液試料）
と図２Ｊ（ Day２血液試料）：BrijTM３５ ０．４２g/
L とＳＤＳ０．０g/L とを包含するＳＤＳのない試験試
薬。
うのに用いられた自働分析機の確度規格 ("acc spe")を
越えたことを示している。“ＮＤ”は受入れられるまた
は有用なデータが得られなかったことを示している。
“ＷＢＣＰ”はペルオキシダーゼ法から測定された白血
細胞数を示し、“％Ｎｅｕｔ”はパーセント好中球を示
し、“％Ｌｙ”はパーセントリンパ球を示し、“％Ｍ”
はパーセント単核細胞を示し、“％Ｅｏｓ”はパーセン
ト好酸球を示し、“％ＬＵＣ”パーセント巨大未染色細
胞を示し、“％Ｎｏｉｓ”はパーセント根源ノイズを示
している。実施例２で記載の、 Day１および Day２血液
試料分析からのサイトグラムの代表的セットを図２Ａ−
２Ｊに示されている。図２Ａ−２Ｅは Day１血液試料分
析を表わしている。図２Ｆ−Ｊは Day２血液試料分析を
表わしている。記載の如く、血液試料はＫ3 ＥＤＴＡを
含有するVacutainerTM管に引き取る。これらの分析に用
いた試薬は次の如く得られたサイトグラムに対応する。
図２Ａ（ Day１血液試料）と図２Ｆ（ Day２血液試
料）：BrijTM３５ ０．１２g/L とＳＤＳ ０．１０５
g/L とを含むＲ１標準試薬と、図２Ｂ（ Day１血液試
料）と図２Ｇ（ Day２血液試料）：BrijTM３５ ０．０
g/L とＳＤＳ ０．０g/L とを包含するＳＤＳのない試
験試薬と、図２Ｃ（ Day１血液試料）と図２Ｈ（ Day２
血液試料）：BrijTM３５ ０．１４g/L とＳＤＳ ０．
０g/L とを包含するＳＤＳのない試験試薬と、図２Ｄ
（ Day１血液試料）と図２Ｉ（ Day２血液試料）：Brij
TM３５ ０．２８g/L とＳＤＳ ０．０g/L とを包含す
るＳＤＳのない試験試薬と、図２Ｅ（ Day１血液試料）
と図２Ｊ（ Day２血液試料）：BrijTM３５ ０．４２g/
L とＳＤＳ０．０g/L とを包含するＳＤＳのない試験試
薬。
【００９１】Day１血液試料の分析において、BrijTM３
５ ０．１２g/L とＳＤＳ ０．１０５g/L とを包含す
るＰｘＲ１試薬組成物を用いて得られたサイトグラムは
受入れられる。しかし、BrijTMもＳＤＳも存在しない場
合（例えば試薬１）、その結果は方法の全般的失敗であ
り、分画情報は得られなかった。サイトグラムは非常に
密なノイズ領域を示し非常に少しの白血細胞しか検出し
なかった（図２Ｂ）。試薬１を用いる方法の失敗は、橋
かけされ、高水準の根源ノイズに寄与する多数の溶解し
てない赤色細胞に帰着する界面活性剤不存在に帰せられ
る。高ノイズ水準についての考えられる理由は、ペルオ
キシダーゼ基質への白色細胞の透過性増加に界面活性剤
が要求されるらしいことであってもよい。界面活性剤の
不存在は白血細胞内部で起る染色反応の効果的妨害であ
るらしい。
５ ０．１２g/L とＳＤＳ ０．１０５g/L とを包含す
るＰｘＲ１試薬組成物を用いて得られたサイトグラムは
受入れられる。しかし、BrijTMもＳＤＳも存在しない場
合（例えば試薬１）、その結果は方法の全般的失敗であ
り、分画情報は得られなかった。サイトグラムは非常に
密なノイズ領域を示し非常に少しの白血細胞しか検出し
なかった（図２Ｂ）。試薬１を用いる方法の失敗は、橋
かけされ、高水準の根源ノイズに寄与する多数の溶解し
てない赤色細胞に帰着する界面活性剤不存在に帰せられ
る。高ノイズ水準についての考えられる理由は、ペルオ
キシダーゼ基質への白色細胞の透過性増加に界面活性剤
が要求されるらしいことであってもよい。界面活性剤の
不存在は白血細胞内部で起る染色反応の効果的妨害であ
るらしい。
【００９２】試薬２（図２Ｃ）と３（図２Ｄ）と４（図
２Ｅ）とは試薬１について記載と同じ受入れられないサ
イトグラム結果を与えた。これらの場合において、サイ
トグラムはリンパ球とノイズとの間に“谷”（valley）
（即ち、密な地域間のきれいな地域）を示さず、散漫な
細胞集団と幅広い“本体（trunk)”（即ち、ノイズとリ
ンパ球との両方を含む大雑把にいって垂直なカラム）と
を示す。BrijTM濃度が増大するに従い本体の密度は減ず
るが、細胞母集団の散漫さは増大する。
２Ｅ）とは試薬１について記載と同じ受入れられないサ
イトグラム結果を与えた。これらの場合において、サイ
トグラムはリンパ球とノイズとの間に“谷”（valley）
（即ち、密な地域間のきれいな地域）を示さず、散漫な
細胞集団と幅広い“本体（trunk)”（即ち、ノイズとリ
ンパ球との両方を含む大雑把にいって垂直なカラム）と
を示す。BrijTM濃度が増大するに従い本体の密度は減ず
るが、細胞母集団の散漫さは増大する。
【００９３】一般に Day２或は時間をおいた試料は、新
鮮血液に関する対応する結果に比較して、サイトグラム
の悪化を示す。そのような Day２試料の分析において細
胞は、細胞の個別的母集団のサイトグラム描写はより散
漫になるように漏れ易く（leaky)なる。このことは特に
好中球に関して目立たせられる。 Day１試料はどうかと
いえば、試薬１は方法の全般的失敗を与える（図２
Ｇ）。本体の密度はＰｘＲ１試薬溶液におけるBrijTM濃
度増大につれて減少する傾向がある（図２Ｈ−２Ｊ）。
試薬２と３と４とはサイトグラム中に谷を示さず、試薬
２（図２Ｈ）と４（図２Ｊ）とを用いて得られる分画に
おいて強いゆがみが存在する。
鮮血液に関する対応する結果に比較して、サイトグラム
の悪化を示す。そのような Day２試料の分析において細
胞は、細胞の個別的母集団のサイトグラム描写はより散
漫になるように漏れ易く（leaky)なる。このことは特に
好中球に関して目立たせられる。 Day１試料はどうかと
いえば、試薬１は方法の全般的失敗を与える（図２
Ｇ）。本体の密度はＰｘＲ１試薬溶液におけるBrijTM濃
度増大につれて減少する傾向がある（図２Ｈ−２Ｊ）。
試薬２と３と４とはサイトグラム中に谷を示さず、試薬
２（図２Ｈ）と４（図２Ｊ）とを用いて得られる分画に
おいて強いゆがみが存在する。
【００９４】これらの実験の結果は、非イオン性界面活
性剤、即ちBrijTM３５のみを濃度０．１４−０．４２g/
L で含有し、ＳＤＳを含有しない試験ペルオキシダーゼ
Ｒ１試薬組成物は、すすぎサイクルにBrijTMのないすす
ぎ溶液を用いた場合、受入れられない数値データとサイ
トグラムとを与えることを示す。同様に、実施例１で測
定した如く、ＳＤＳのみ（０．１６−０．２０g/L)を含
有し、BrijTM３５を含有しないＰｘＲ１希釈剤は、Brij
TMを含有しないすすぎ液（例えばBrijTMのないすすぎ
液）を用いた場合、有効な試薬ではない。かくして、イ
オン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤いずれか
を含有するＰｘＲ１希釈剤はＰｘ法において受入れられ
る結果を与えないであろうと結論される。事実、本発見
は、イオン性界面活性剤（例えばＳＤＳ）および非イオ
ン性界面活性剤（例えばBrijTM３５）の両者が、方法に
おいて確度と精度とのある結果を達成するためにはＰｘ
Ｒ１試薬組成物中に処方されなければならないことを示
している。本発明はまた、その様なペルオキシダーゼＲ
１試薬組成物は、非イオン性界面活性剤例えばBrijTM３
５を、以下実施例３で更に詳しく記載するごとく、含有
していないすすぎ溶液を包含するすすぎ試料サイクルと
共に用いる場合、特に重要であるという知識と発見とを
与えている。
性剤、即ちBrijTM３５のみを濃度０．１４−０．４２g/
L で含有し、ＳＤＳを含有しない試験ペルオキシダーゼ
Ｒ１試薬組成物は、すすぎサイクルにBrijTMのないすす
ぎ溶液を用いた場合、受入れられない数値データとサイ
トグラムとを与えることを示す。同様に、実施例１で測
定した如く、ＳＤＳのみ（０．１６−０．２０g/L)を含
有し、BrijTM３５を含有しないＰｘＲ１希釈剤は、Brij
TMを含有しないすすぎ液（例えばBrijTMのないすすぎ
液）を用いた場合、有効な試薬ではない。かくして、イ
オン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤いずれか
を含有するＰｘＲ１希釈剤はＰｘ法において受入れられ
る結果を与えないであろうと結論される。事実、本発見
は、イオン性界面活性剤（例えばＳＤＳ）および非イオ
ン性界面活性剤（例えばBrijTM３５）の両者が、方法に
おいて確度と精度とのある結果を達成するためにはＰｘ
Ｒ１試薬組成物中に処方されなければならないことを示
している。本発明はまた、その様なペルオキシダーゼＲ
１試薬組成物は、非イオン性界面活性剤例えばBrijTM３
５を、以下実施例３で更に詳しく記載するごとく、含有
していないすすぎ溶液を包含するすすぎ試料サイクルと
共に用いる場合、特に重要であるという知識と発見とを
与えている。
【００９５】〔実施例３〕非イオン性界面活性剤とイオ
ン性界面活性剤とを含有するペルオキシダーゼＲ１希釈
試薬組成物の処方と試験
ン性界面活性剤とを含有するペルオキシダーゼＲ１希釈
試薬組成物の処方と試験
【００９６】第３の型のＲ１試薬組成物を、非イオン性
界面活性剤とイオン性界面活性剤との処方を、ペルオキ
シダーゼ組成物と方法とで試験するために調製した。２
つの界面活性剤を含有するＲ１希釈剤処方のために、Ｓ
ＤＳを０．１０５g/L で含有するＲ１希釈組成物中に、
BrijTM３５を０．０８０g/L と０．１２g/L と０．１６
g/L との濃度で処方した。その２界面活性剤含有試薬組
成物を、白血球分画のペルオキシダーゼ法を用い、 Day
１と Day２血液試料との両者の試験のために使用した。
界面活性剤とイオン性界面活性剤との処方を、ペルオキ
シダーゼ組成物と方法とで試験するために調製した。２
つの界面活性剤を含有するＲ１希釈剤処方のために、Ｓ
ＤＳを０．１０５g/L で含有するＲ１希釈組成物中に、
BrijTM３５を０．０８０g/L と０．１２g/L と０．１６
g/L との濃度で処方した。その２界面活性剤含有試薬組
成物を、白血球分画のペルオキシダーゼ法を用い、 Day
１と Day２血液試料との両者の試験のために使用した。
【００９７】実験は、Ｋ3 ＥＤＴＡを含有するVacutain
erTM管に採られた５つの血液試料セットについてこのＲ
１試薬処方物を試験するために行った。 Day１および D
ay２試料両者自働分析機を用い１０２個試料／時で標準
試薬を使って検定更にその上、ＳＤＳ ０．１０５g/L
と、BrijTM３５ ０．０８０と０．１２と０．１６g/L
とを含有する試験ＰｘＲ１試薬を用い、１２０個試料／
時で Day１および Day２試料を検定した。 Day２試料に
関しては、試験Ｒ１試薬処方物との比較のために、標準
ＰｘＲ１試薬はＳＤＳ ０．１０５g/L 含有し、BrijTM
３５は含まず、そしてリン酸塩緩衝食塩水中界面活性剤
PluronicＰ１０５含有すすぎ溶液と共に用いられた。
erTM管に採られた５つの血液試料セットについてこのＲ
１試薬処方物を試験するために行った。 Day１および D
ay２試料両者自働分析機を用い１０２個試料／時で標準
試薬を使って検定更にその上、ＳＤＳ ０．１０５g/L
と、BrijTM３５ ０．０８０と０．１２と０．１６g/L
とを含有する試験ＰｘＲ１試薬を用い、１２０個試料／
時で Day１および Day２試料を検定した。 Day２試料に
関しては、試験Ｒ１試薬処方物との比較のために、標準
ＰｘＲ１試薬はＳＤＳ ０．１０５g/L 含有し、BrijTM
３５は含まず、そしてリン酸塩緩衝食塩水中界面活性剤
PluronicＰ１０５含有すすぎ溶液と共に用いられた。
【００９８】確度あり、精度のあるデータが得られた
（表５および図３Ａ−３Ｄ）。 Day１試料については、
精度と確度とは全てのペルオキシダーゼチャネル（chan
nel)パラメーターに関し方法規格内にある。 Day２試料
については、確度（対 Day１試料および標準）はＳＤＳ
とBrijTM３５を０．１２g/L と０．１６g/L で含有する
試験試薬については受入れられる。ＳＤＳと０．０８０
g/L のBrijTM３５とを用いると、％好中球は確度規格外
にある。前記の標準Ｐｘ試薬とすすぎ液とは１２０個試
料／時において、高められたＷＢＣＰと％リンパ球そし
て低められた％好中球による知られたパターンの、受入
れられない確度結果を与える。
（表５および図３Ａ−３Ｄ）。 Day１試料については、
精度と確度とは全てのペルオキシダーゼチャネル（chan
nel)パラメーターに関し方法規格内にある。 Day２試料
については、確度（対 Day１試料および標準）はＳＤＳ
とBrijTM３５を０．１２g/L と０．１６g/L で含有する
試験試薬については受入れられる。ＳＤＳと０．０８０
g/L のBrijTM３５とを用いると、％好中球は確度規格外
にある。前記の標準Ｐｘ試薬とすすぎ液とは１２０個試
料／時において、高められたＷＢＣＰと％リンパ球そし
て低められた％好中球による知られたパターンの、受入
れられない確度結果を与える。
【００９９】この実験は、ＳＤＳを濃度０．１０５g/L
、BrijTM３５を濃度０．１２〜０．１６g/L の範囲で
含有する試験ＰｘＲ１試薬溶液を用い、 Day１と Day２
との試料について受入れられる精度と確度とが得られる
ことを説明している。
、BrijTM３５を濃度０．１２〜０．１６g/L の範囲で
含有する試験ＰｘＲ１試薬溶液を用い、 Day１と Day２
との試料について受入れられる精度と確度とが得られる
ことを説明している。
【０１００】図３Ａはペルオキシダーゼ法を用いる、 D
ay１血液試料についての白血球分画分析の受入れられる
結果を描写している。図３Ａに示す分析のためのＲ１試
薬組成物は標準物で、ＳＤＳ ０．１０５g/L 含有す
る。標準すすぎ試薬はBrijTM３５ ３．０g/L とＳＤＳ
２．０g/L とを含有する。図３Ｂは、ＰｘＲ１試薬組
成物がＳＤＳ ０．１０５g/L 含有し、すすぎ試薬がＳ
ＤＳ ２．０g/L 含有し、BrijTM３５を含有しない、 D
ay１血液試料を用いる試験Ｐｘ法の実行結果を描写して
いる。図３ＣはＰｘＲ１試薬組成物がＳＤＳ ０．１０
５g/L 含有し、すすぎ試薬がＳＤＳ ２．０g/L 含有し
て、BrijTM３５を含有しない、 Day２血液試料を用いる
試験Ｐｘ法の実行結果を描写している。図３Ｄは、Ｐｘ
Ｒ１試薬組成物がBrijTM３５ ０．１２g/L とＳＤＳ
０．１０５g/L とを含有し、すすぎ試薬がＳＤＳとBrij
TM３５とを含有しないが、その代りにここで記載（表
２）され、非溶血性界面活性剤PluronicＰ１０５を包含
するすすぎ試薬組成物を含有する、 Day２試料を用いる
試験Ｐｘ法の実行結果を描写する。図３Ｃと図３Ｄとの
比較から判るように、Ｒ１試薬組成物に非イオン性界面
活性剤BrijTM３５が存在する場合、ノイズ領域の濃度に
有意の減少がある。
ay１血液試料についての白血球分画分析の受入れられる
結果を描写している。図３Ａに示す分析のためのＲ１試
薬組成物は標準物で、ＳＤＳ ０．１０５g/L 含有す
る。標準すすぎ試薬はBrijTM３５ ３．０g/L とＳＤＳ
２．０g/L とを含有する。図３Ｂは、ＰｘＲ１試薬組
成物がＳＤＳ ０．１０５g/L 含有し、すすぎ試薬がＳ
ＤＳ ２．０g/L 含有し、BrijTM３５を含有しない、 D
ay１血液試料を用いる試験Ｐｘ法の実行結果を描写して
いる。図３ＣはＰｘＲ１試薬組成物がＳＤＳ ０．１０
５g/L 含有し、すすぎ試薬がＳＤＳ ２．０g/L 含有し
て、BrijTM３５を含有しない、 Day２血液試料を用いる
試験Ｐｘ法の実行結果を描写している。図３Ｄは、Ｐｘ
Ｒ１試薬組成物がBrijTM３５ ０．１２g/L とＳＤＳ
０．１０５g/L とを含有し、すすぎ試薬がＳＤＳとBrij
TM３５とを含有しないが、その代りにここで記載（表
２）され、非溶血性界面活性剤PluronicＰ１０５を包含
するすすぎ試薬組成物を含有する、 Day２試料を用いる
試験Ｐｘ法の実行結果を描写する。図３Ｃと図３Ｄとの
比較から判るように、Ｒ１試薬組成物に非イオン性界面
活性剤BrijTM３５が存在する場合、ノイズ領域の濃度に
有意の減少がある。
【０１０１】
【表５】
【０１０２】図３Ａと３Ｂとから決定されるように、 D
ay１血液試料に関して、イオン性界面活性剤（即ちＳＤ
Ｓ）のみを含有するＰｘＲ１試薬組成物と、BrijTMを持
つあるいは持たないすすぎ試薬処方物とを用いると、根
源ノイズは正常で、受入れられるものと思われる。しか
し、室温で時間をおいた Day２試料を分析した場合、違
った結果が観察される。その様な時間をおいた血液試料
分析については、Brij TM３５は包含せず、ＳＤＳ ２．
０g/L を包含するすすぎ試薬と組合せた、ＳＤＳ ０．
１０５g/L 包含するＰｘＲ１試薬は受入れられない根源
ノイズを示すサイトグラムを作る（図３Ｃ）。興味あ
り、ここの発明の発見に従うと、 Day２試料についての
ノイズ問題は、Ｐｘ法におけるペルオキシダーゼＲ１試
薬への非イオン性界面活性剤（例えばBrijTM３５）の添
加により軽減される（図３Ｄ）。更に特別には、図３Ｄ
に用いたＰｘＲ１試薬組成物はBrijTM３５ ０．１２g/
L とＳＤＳ ０．１０５g/L を包含し、使用したすすぎ
試薬はBrijTMもＳＤＳも含有しないが、非溶血性界面活
性剤PluronicＰ１０５を含有している。それ故、ペルオ
キシダーゼＲ１試薬組成物に用いるための非イオン性お
よびイオン性界面活性剤の適当な濃度と、試料すすぎサ
イクルの最適な使用と、非溶血性界面活性剤例えばPlur
onicＰ１０５を、最終非イオン性界面活性剤濃度が血液
試料の条件と体積とについて適当である様に包含する対
応するすすぎ試薬とは、ペルオキシダーゼ分画法の実施
並びにそれから得られる結果の確度と精度と容認可能性
において相当な改良をもたらす。
ay１血液試料に関して、イオン性界面活性剤（即ちＳＤ
Ｓ）のみを含有するＰｘＲ１試薬組成物と、BrijTMを持
つあるいは持たないすすぎ試薬処方物とを用いると、根
源ノイズは正常で、受入れられるものと思われる。しか
し、室温で時間をおいた Day２試料を分析した場合、違
った結果が観察される。その様な時間をおいた血液試料
分析については、Brij TM３５は包含せず、ＳＤＳ ２．
０g/L を包含するすすぎ試薬と組合せた、ＳＤＳ ０．
１０５g/L 包含するＰｘＲ１試薬は受入れられない根源
ノイズを示すサイトグラムを作る（図３Ｃ）。興味あ
り、ここの発明の発見に従うと、 Day２試料についての
ノイズ問題は、Ｐｘ法におけるペルオキシダーゼＲ１試
薬への非イオン性界面活性剤（例えばBrijTM３５）の添
加により軽減される（図３Ｄ）。更に特別には、図３Ｄ
に用いたＰｘＲ１試薬組成物はBrijTM３５ ０．１２g/
L とＳＤＳ ０．１０５g/L を包含し、使用したすすぎ
試薬はBrijTMもＳＤＳも含有しないが、非溶血性界面活
性剤PluronicＰ１０５を含有している。それ故、ペルオ
キシダーゼＲ１試薬組成物に用いるための非イオン性お
よびイオン性界面活性剤の適当な濃度と、試料すすぎサ
イクルの最適な使用と、非溶血性界面活性剤例えばPlur
onicＰ１０５を、最終非イオン性界面活性剤濃度が血液
試料の条件と体積とについて適当である様に包含する対
応するすすぎ試薬とは、ペルオキシダーゼ分画法の実施
並びにそれから得られる結果の確度と精度と容認可能性
において相当な改良をもたらす。
【０１０３】〔実施例４〕試料すすぎサイクルと溶解性
非イオン性界面活性剤例えばBrijTM３５を持たないすす
ぎ溶液とを採用する、Ｐｘ法に使用のためのＲ１試薬組
成物中の非イオン性界面活性剤についての最適濃度範囲
の選定
非イオン性界面活性剤例えばBrijTM３５を持たないすす
ぎ溶液とを採用する、Ｐｘ法に使用のためのＲ１試薬組
成物中の非イオン性界面活性剤についての最適濃度範囲
の選定
【０１０４】実験は典型的非イオン性界面活性剤として
BrijTM３５を用い、非イオン性界面活性剤例えばBrijTM
３５のないすすぎ液（表４）を含む試薬配置を用い、ペ
ルオキシダーゼＲ１試薬組成物中の非イオン性界面活性
剤についての最適の濃度範囲を選択するために行われ
た。
BrijTM３５を用い、非イオン性界面活性剤例えばBrijTM
３５のないすすぎ液（表４）を含む試薬配置を用い、ペ
ルオキシダーゼＲ１試薬組成物中の非イオン性界面活性
剤についての最適の濃度範囲を選択するために行われ
た。
【０１０５】実施データは、２つの試料セット：１）非
病院試料２６個と２）病院試料１４個とについて、Brij
TM３５を最終濃度０．１０と０．１２と０．１４g/L で
用いた実験で得られた。データは、採集し、抗凝固剤と
してＫ3 ＥＤＴＡの存在するVacutainerTM管中に貯蔵し
た Day１と Day２試料との両者について得られた。数値
データとサイトグラムとが考察される。
病院試料２６個と２）病院試料１４個とについて、Brij
TM３５を最終濃度０．１０と０．１２と０．１４g/L で
用いた実験で得られた。データは、採集し、抗凝固剤と
してＫ3 ＥＤＴＡの存在するVacutainerTM管中に貯蔵し
た Day１と Day２試料との両者について得られた。数値
データとサイトグラムとが考察される。
【０１０６】BrijTM３５を０．１０と０．１２と０．１
４g/L 含有するＰｘＲ１試験試薬溶液はペルオキシダー
ゼＲ１試薬混合物（界面活性剤はなし）のアリコートに
BrijTM３５ ３０g/L をそれぞれ０．０８５と１．０２
と１．１９mLとを加えることにより得られる。ここに記
載の非溶解性Pluronic界面活性剤を含有するすすぎ溶液
を、種々なＲ１試験試薬セットを用いるペルオキシダー
ゼ法の段階の実行につづいて採用した試料すすぎサイク
ルに用いた。標準または対照試薬配置に関しては、非イ
オン性界面活性剤不存在の下で、イオン性界面活性剤Ｓ
ＤＳ ０．１０５g/L 含有するＲ１希釈剤を用い、Brij
TM３５とＳＤＳとの両者を包含するすすぎ試薬溶液を用
いた。非病院試料は当然正常な篤志家から得られ、病院
試料はWestchester County Medical Center, New York
の患者から得られた。
４g/L 含有するＰｘＲ１試験試薬溶液はペルオキシダー
ゼＲ１試薬混合物（界面活性剤はなし）のアリコートに
BrijTM３５ ３０g/L をそれぞれ０．０８５と１．０２
と１．１９mLとを加えることにより得られる。ここに記
載の非溶解性Pluronic界面活性剤を含有するすすぎ溶液
を、種々なＲ１試験試薬セットを用いるペルオキシダー
ゼ法の段階の実行につづいて採用した試料すすぎサイク
ルに用いた。標準または対照試薬配置に関しては、非イ
オン性界面活性剤不存在の下で、イオン性界面活性剤Ｓ
ＤＳ ０．１０５g/L 含有するＲ１希釈剤を用い、Brij
TM３５とＳＤＳとの両者を包含するすすぎ試薬溶液を用
いた。非病院試料は当然正常な篤志家から得られ、病院
試料はWestchester County Medical Center, New York
の患者から得られた。
【０１０７】データは、手動の開栓管（open-tube)吸引
を用いる、自働血液学分析機（例えばTECHNICON Ｈ●TM
シリーズ）を用いて集めた。重複 Day１試料が各試薬セ
ットより検定された。同じ提供者セットからの非開栓試
料は室温で一夜貯蔵され、 Day２に開栓管吸引で、手動
で検定された。標準運転のソフトウエアは１０２個試料
／時（s/h)である。試験試料は１２０s/h で運転され
た。自働システムは、User's Manual 中に述べてある一
般的保持指示に従い試料運転に先立って毎日洗浄され
た。システムの不正確さは試験試薬の評価の前後に、ソ
フトウエアと試薬との標準配置を用いて決定された。１
つの新鮮非病院血液試料が１０回吸引され、全てのＣＢ
Ｃパラメーターについて、平均と標準偏差（ＳＤ）が決
定（システムにより自働的に）された。ＳＤは、新鮮非
病院血液について、システムの不正確さの規格と比較さ
れた。この手続きはこの研究の毎日続けられた。試験法
の不正確さは、次の式：ＳＤ＝〔Sum(d2)/2N〕1/2 、こ
こにｄは特別な試薬を用いて得られた重複値間の差であ
り、Ｎはセット中の試料数、を用い、ペルオキシダーゼ
チャネルパラメーターについてのＳＤ（多数の提供者に
亘ってのためられたＳＤ）を計算することによりオフラ
インで決められた。
を用いる、自働血液学分析機（例えばTECHNICON Ｈ●TM
シリーズ）を用いて集めた。重複 Day１試料が各試薬セ
ットより検定された。同じ提供者セットからの非開栓試
料は室温で一夜貯蔵され、 Day２に開栓管吸引で、手動
で検定された。標準運転のソフトウエアは１０２個試料
／時（s/h)である。試験試料は１２０s/h で運転され
た。自働システムは、User's Manual 中に述べてある一
般的保持指示に従い試料運転に先立って毎日洗浄され
た。システムの不正確さは試験試薬の評価の前後に、ソ
フトウエアと試薬との標準配置を用いて決定された。１
つの新鮮非病院血液試料が１０回吸引され、全てのＣＢ
Ｃパラメーターについて、平均と標準偏差（ＳＤ）が決
定（システムにより自働的に）された。ＳＤは、新鮮非
病院血液について、システムの不正確さの規格と比較さ
れた。この手続きはこの研究の毎日続けられた。試験法
の不正確さは、次の式：ＳＤ＝〔Sum(d2)/2N〕1/2 、こ
こにｄは特別な試薬を用いて得られた重複値間の差であ
り、Ｎはセット中の試料数、を用い、ペルオキシダーゼ
チャネルパラメーターについてのＳＤ（多数の提供者に
亘ってのためられたＳＤ）を計算することによりオフラ
インで決められた。
【０１０８】白血球分画（２６個の非病院試料）のペル
オキシダーゼ法の結果に対するBrijTM３５濃度の影響
オキシダーゼ法の結果に対するBrijTM３５濃度の影響
【０１０９】この実験において、２６個の非病院試料を
前記の標準ペルオキシダーゼＲ１試薬を用い、BrijTM３
５を０．１０と０．１２と０．１４g/L とを含有する試
験ペルオキシダーゼ法Ｒ１試薬を用いて、ペルオキシダ
ーゼ法で試験した（表６）。Day１血液試料について
は、臨床パラメーターはBrijTM３５濃度に対して影響さ
れない。パーセント単核細胞は確度規格に対し低く、パ
ーセントノイズはBrijTM３５濃度増加に従って減少す
る。％単核細胞を除けば、全ての他のパラメーターは確
度と精度との規格を満足する。
前記の標準ペルオキシダーゼＲ１試薬を用い、BrijTM３
５を０．１０と０．１２と０．１４g/L とを含有する試
験ペルオキシダーゼ法Ｒ１試薬を用いて、ペルオキシダ
ーゼ法で試験した（表６）。Day１血液試料について
は、臨床パラメーターはBrijTM３５濃度に対して影響さ
れない。パーセント単核細胞は確度規格に対し低く、パ
ーセントノイズはBrijTM３５濃度増加に従って減少す
る。％単核細胞を除けば、全ての他のパラメーターは確
度と精度との規格を満足する。
【０１１０】Day２血液試料に関し、％好酸球は標準法
および全ての３つの試験法に対しての確度規格を下廻っ
た。全ての他の臨床パラメーターは受入れ限度内にあっ
た。％ノイズ対応は試験された Day１試料について観察
されたと同じであった。このデータセットについて本質
的に、BrijTM３５濃度範囲０．１０と０．１２と０．１
４g/L に亘り、 Day１及び Day２試料について同じ数値
データが得られた。BrijTMの０．１４g/L 対０．１０g/
L の比較は％ノイズの減少：新鮮および時間をおいた血
液についてそれぞれ１３％と１７％、について利益を示
した。
および全ての３つの試験法に対しての確度規格を下廻っ
た。全ての他の臨床パラメーターは受入れ限度内にあっ
た。％ノイズ対応は試験された Day１試料について観察
されたと同じであった。このデータセットについて本質
的に、BrijTM３５濃度範囲０．１０と０．１２と０．１
４g/L に亘り、 Day１及び Day２試料について同じ数値
データが得られた。BrijTMの０．１４g/L 対０．１０g/
L の比較は％ノイズの減少：新鮮および時間をおいた血
液についてそれぞれ１３％と１７％、について利益を示
した。
【０１１１】BrijTM３５濃度変動（１４個の病院試料） この実験において病院血液試料１４個の試料セットが標
準ペルオキシダーゼ法試薬とBrijTM３５ ０．１０と
０．１２と０．１４g/L とを含有する試験ＰｘＲ１試薬
とを用いて試験された（表７）。 Day１と Day２との血
液試料について、本質的には試験試薬全てが確度規格を
満足させた。
準ペルオキシダーゼ法試薬とBrijTM３５ ０．１０と
０．１２と０．１４g/L とを含有する試験ＰｘＲ１試薬
とを用いて試験された（表７）。 Day１と Day２との血
液試料について、本質的には試験試薬全てが確度規格を
満足させた。
【０１１２】
【表６】
【０１１３】病院並びに非病院データセットから生成し
たサイトグラムは、次の特性：ノイズ／リンパ球分離
と、好中球とリンパ球と単核細胞と好酸球とＬＵＣとの
母集団のタイトネス（tightness)と、細胞母集団の染色
強度とサイトグラム上の位置と、ノイズ帯とリンパ球帯
間の浮動（floating）低しきい値の変動とに関して定性
的に検査され、総体的な一般的外観を、ペルオキシダー
ゼ法の標準試薬を用いて、血液試料の分析から得られた
サイトグラムと比較した。ペルオキシダーゼ法で検定さ
れた試料セットは Day１および Day２非病院試料（試料
１１個）と病院試料（試料１４個）との両者を含む。
たサイトグラムは、次の特性：ノイズ／リンパ球分離
と、好中球とリンパ球と単核細胞と好酸球とＬＵＣとの
母集団のタイトネス（tightness)と、細胞母集団の染色
強度とサイトグラム上の位置と、ノイズ帯とリンパ球帯
間の浮動（floating）低しきい値の変動とに関して定性
的に検査され、総体的な一般的外観を、ペルオキシダー
ゼ法の標準試薬を用いて、血液試料の分析から得られた
サイトグラムと比較した。ペルオキシダーゼ法で検定さ
れた試料セットは Day１および Day２非病院試料（試料
１１個）と病院試料（試料１４個）との両者を含む。
【０１１４】得られたサイトグラムから推論される結論
は、ペルオキシダーゼＲ１希釈剤中のBrijTM３５の０．
１２g/L は細胞母集団の分離を受入れられる根源ノイズ
水準とに関し、最良の総括的サイトグラムを作るという
ことである。０．１０g/L と０．１４g/L とは０．１２
g/L より望ましくないが、両者共方法での使用について
受入れられるものと思われる。 Day２試料に関し、Ｐｘ
Ｒ１試験希釈剤中のBrijTM３５の０．１０g/L はBrijTM
３５の０．１２g/L におけるよりやや高いパーセントノ
イズをもたらすが（即ち、 Day１試料について１６．７
％に対し２１．７％、そして Day２試料について１７．
７％に対し１８．９％）、BrijTM３５濃度０．１g/L は
Day２血液の分析にはよりよい（即ち、細胞母集団領域
がより密（tighter)である）と決められた。逆に、Ｒ１
試験希釈剤中のBrijTM３５の０．１４g/L はこの界面活
性剤の０．１２g/L におけるよりやや低いパーセントノ
イズをもたらした（即ち、 Day１試料について、１６．
７％に対し、１６．２％）。しかし、この界面活性剤の
０．１４g/L 濃度は Day２試料について僅かに悪い（即
ち、BrijTM３５の０．１４g/L は、より高い界面活性剤
濃度による、細胞母集団における散漫さを引き起す）。
定性的なサイトグラムの点検の結果は数値的分析と一致
する。
は、ペルオキシダーゼＲ１希釈剤中のBrijTM３５の０．
１２g/L は細胞母集団の分離を受入れられる根源ノイズ
水準とに関し、最良の総括的サイトグラムを作るという
ことである。０．１０g/L と０．１４g/L とは０．１２
g/L より望ましくないが、両者共方法での使用について
受入れられるものと思われる。 Day２試料に関し、Ｐｘ
Ｒ１試験希釈剤中のBrijTM３５の０．１０g/L はBrijTM
３５の０．１２g/L におけるよりやや高いパーセントノ
イズをもたらすが（即ち、 Day１試料について１６．７
％に対し２１．７％、そして Day２試料について１７．
７％に対し１８．９％）、BrijTM３５濃度０．１g/L は
Day２血液の分析にはよりよい（即ち、細胞母集団領域
がより密（tighter)である）と決められた。逆に、Ｒ１
試験希釈剤中のBrijTM３５の０．１４g/L はこの界面活
性剤の０．１２g/L におけるよりやや低いパーセントノ
イズをもたらした（即ち、 Day１試料について、１６．
７％に対し、１６．２％）。しかし、この界面活性剤の
０．１４g/L 濃度は Day２試料について僅かに悪い（即
ち、BrijTM３５の０．１４g/L は、より高い界面活性剤
濃度による、細胞母集団における散漫さを引き起す）。
定性的なサイトグラムの点検の結果は数値的分析と一致
する。
【０１１５】
【表７】
【０１１６】同類の実験からのデータは試験されたBrij
TM３５の５つの異なったロットが、Day１および Day２
の正常および病院血液試料について、本質的に同じ実行
データを生むことを示した。従って、BrijTM３５のロッ
ト対ロットへの変動がこの非イオン性界面活性剤含有の
試薬生成についての問題であることは予期されない。組
合わされた数値結果とサイトグラムに基づき、ペルオキ
シダーゼＲ１試薬組成物中のBrijTM３５の最適濃度範囲
は約０．１０〜０．１５g/L 、より好ましくは約０．１
１〜０．１３g/L であると選択された。試薬組成物中の
非イオン性界面活性剤例えばBrijTM３５の濃度は、熟達
した従事者により、分画法を行うのに採用される血液学
分析システムに従って日常的に調節できることは理解さ
れる。
TM３５の５つの異なったロットが、Day１および Day２
の正常および病院血液試料について、本質的に同じ実行
データを生むことを示した。従って、BrijTM３５のロッ
ト対ロットへの変動がこの非イオン性界面活性剤含有の
試薬生成についての問題であることは予期されない。組
合わされた数値結果とサイトグラムに基づき、ペルオキ
シダーゼＲ１試薬組成物中のBrijTM３５の最適濃度範囲
は約０．１０〜０．１５g/L 、より好ましくは約０．１
１〜０．１３g/L であると選択された。試薬組成物中の
非イオン性界面活性剤例えばBrijTM３５の濃度は、熟達
した従事者により、分画法を行うのに採用される血液学
分析システムに従って日常的に調節できることは理解さ
れる。
【０１１７】〔実施例５〕ペルオキシダーゼ法における
２界面活性剤含有Ｒ１試薬組成物の使用と共に、非溶血
性界面活性剤含有すすぎ溶液の使用による、変動するす
すぎ液残余の問題の回避
２界面活性剤含有Ｒ１試薬組成物の使用と共に、非溶血
性界面活性剤含有すすぎ溶液の使用による、変動するす
すぎ液残余の問題の回避
【０１１８】自働分析機での、ペルオキシダーゼ白血細
胞分画法実施における、変動するすすぎ液残余の問題を
回避するため、本発明のＲ１試薬組成物に含有する非イ
オン性界面活性剤とは異なる非イオン性非溶血性界面活
性剤を含有するすすぎ溶液を包含させることにより、本
発明の方法を更に改良してもよい。すすぎ溶液はここに
前記されていてそれはペルオキシダーゼ法において不活
性で非機能的な非溶血性界面活性剤例えばPluronicＰ１
０５を包含し、方法に対しほんの少しの体積増加以上の
ものは寄与しない。試料間すすぎは析出物の形成を軽減
し、半自働−および完全自働血液学分析機での、ペルオ
キシダーゼ白血球分画法実施の場合、多数の試料吸引後
の、ペルオキシダーゼ反応室における試料／試薬混合物
残余を除去する。
胞分画法実施における、変動するすすぎ液残余の問題を
回避するため、本発明のＲ１試薬組成物に含有する非イ
オン性界面活性剤とは異なる非イオン性非溶血性界面活
性剤を含有するすすぎ溶液を包含させることにより、本
発明の方法を更に改良してもよい。すすぎ溶液はここに
前記されていてそれはペルオキシダーゼ法において不活
性で非機能的な非溶血性界面活性剤例えばPluronicＰ１
０５を包含し、方法に対しほんの少しの体積増加以上の
ものは寄与しない。試料間すすぎは析出物の形成を軽減
し、半自働−および完全自働血液学分析機での、ペルオ
キシダーゼ白血球分画法実施の場合、多数の試料吸引後
の、ペルオキシダーゼ反応室における試料／試薬混合物
残余を除去する。
【０１１９】すすぎ液残余の問題に関する特別な実例は
次の通りである。改良された本発明の試薬と方法との設
計の前に、本発明者により、試料間すすぎサイクル終了
後、反応室にすすぎ溶液約８〜１０μL が残ることが見
出された。すすぎ溶液が本発明に従い非イオン性界面活
性剤BrijTM３５を含むように処方された場合、この一見
小体積のすすぎ液（即ち８〜１０μL)は、サイトグラム
中に描写される細胞分離結果に不利に影響するのに充分
な程有意である量のBrijTM３５を方法のＲ１段階に加え
る原因であることが発見された。例えばすすぎ液残余の
体積が約１０μL を越す場合は、好酸球母集団はサイト
グラムの好中球母集団中に移動し、単核細胞とリンパ球
とはサイトグラムで下にさがる。更に、すすぎ液残余の
体積が約１３．３μL であると、ペルオキシダーゼ法は
BrijTM３５の存在により完全に劣化する。方法の第１反
応段階の間に加えられるＰｘＲ１試薬溶液の体積は０．
２５mLであるから、ペルオキシダーゼ法の第１反応段階
における計算されるBrijTM３５濃度は約０．０９３〜
０．１２０g/L で、それはすすぎ液残余約８．０〜１
０．０μL の体積に対応する。
次の通りである。改良された本発明の試薬と方法との設
計の前に、本発明者により、試料間すすぎサイクル終了
後、反応室にすすぎ溶液約８〜１０μL が残ることが見
出された。すすぎ溶液が本発明に従い非イオン性界面活
性剤BrijTM３５を含むように処方された場合、この一見
小体積のすすぎ液（即ち８〜１０μL)は、サイトグラム
中に描写される細胞分離結果に不利に影響するのに充分
な程有意である量のBrijTM３５を方法のＲ１段階に加え
る原因であることが発見された。例えばすすぎ液残余の
体積が約１０μL を越す場合は、好酸球母集団はサイト
グラムの好中球母集団中に移動し、単核細胞とリンパ球
とはサイトグラムで下にさがる。更に、すすぎ液残余の
体積が約１３．３μL であると、ペルオキシダーゼ法は
BrijTM３５の存在により完全に劣化する。方法の第１反
応段階の間に加えられるＰｘＲ１試薬溶液の体積は０．
２５mLであるから、ペルオキシダーゼ法の第１反応段階
における計算されるBrijTM３５濃度は約０．０９３〜
０．１２０g/L で、それはすすぎ液残余約８．０〜１
０．０μL の体積に対応する。
【０１２０】すすぎ液を通っての、Ｐｘ法のＲ１段階に
移るBrijTM３５の濃度の定量はこれらの試験の過程の間
に決定され、次の如くすすぎ液溶液はBrijTM３５ ３．
０g/L 含有されると表わされている。名目上のすすぎ液
残余体積は１０μL で、それはBrijTM３５の３０μg と
等価である。ペルオキシダーゼ法のＲ１段階へのBrijTM
３５ ３０μg の移動（即ち、ペルオキシダーゼＲ１希
釈剤２５０μL ＋血液１２μL または血漿〜７μL ＋す
すぎ溶液１０μL で全体積〜２６７μL)は、順繰り、方
法のＲ１段階の間BrijTM３５濃度０．１１２g/L とな
る。試験ペルオキシダーゼＲ１試薬は、ペルオキシダー
ゼ法におけるBrijTM３５の一定濃度の送達を可能にす
る、本質的に同じBrijTM３５濃度を含有するよう全て処
方されている。
移るBrijTM３５の濃度の定量はこれらの試験の過程の間
に決定され、次の如くすすぎ液溶液はBrijTM３５ ３．
０g/L 含有されると表わされている。名目上のすすぎ液
残余体積は１０μL で、それはBrijTM３５の３０μg と
等価である。ペルオキシダーゼ法のＲ１段階へのBrijTM
３５ ３０μg の移動（即ち、ペルオキシダーゼＲ１希
釈剤２５０μL ＋血液１２μL または血漿〜７μL ＋す
すぎ溶液１０μL で全体積〜２６７μL)は、順繰り、方
法のＲ１段階の間BrijTM３５濃度０．１１２g/L とな
る。試験ペルオキシダーゼＲ１試薬は、ペルオキシダー
ゼ法におけるBrijTM３５の一定濃度の送達を可能にす
る、本質的に同じBrijTM３５濃度を含有するよう全て処
方されている。
【０１２１】図４Ａ−４Ｆは、非イオン性界面活性剤例
えばBrijTM３５のない水性すすぎ組成物（図４Ａと４Ｃ
と４Ｅ）および非イオン性界面活性剤のある水性すすぎ
組成物（図４Ｂと４Ｄと４Ｆ）を使用して、本発明のペ
ルオキシダーゼ法における種々なすすぎ液残余体積の影
響を示している。ペルオキシダーゼ法のＲ１とＲ２との
段階においては、図４Ａ−４Ｆで示すごとく、方法のＲ
１試薬はＳＤＳ ０．１０５g/L を含有し、BrijTM３５
は含有していない。図４Ａと４Ｂとは、ペルオキシダー
ゼ法の実行から得られ、ペルオキシダーゼＲ１試薬溶液
の最終体積に７．９μL 寄与するすすぎ溶液残余のある
すすぎサイクルを伴ったサイトグラムを描写している
（図４Ａ：すすぎ液中BrijTM３５なし；図４Ｂ：すすぎ
液中BrijTM３５存在）。図４Ｃと４Ｄとは、ペルオキシ
ダーゼ法の実行から得られ、ペルオキシダーゼＲ１試薬
溶液の最終体積に１０μL 寄与する、すすぎ溶液残余の
あるすすぎサイクルを伴ったサイトグラムを描写してい
る（図４Ｃ：すすぎ液中BrijTM３５なし；図４Ｄ：すす
ぎ溶液中BrijTM３５存在）。図４Ｅと４Ｆとは、ペルオ
キシダーゼ法の実行から得られ、ペルオキシダーゼＲ１
試薬溶液の最終溶液の最終体積に１３．３μL 寄与する
すすぎ溶液残余のある、すすぎサイクルを伴ったサイト
グラムを描写している（図４Ｅ：すすぎ溶液中BrijTM３
５なし；図４Ｆ：すすぎ溶液中BrijTM３５存在）。結果
から決定出来るように、すすぎ溶液中に存在するBrijTM
３５とすすぎ液残余とはサイトグラム結果の一般的劣化
を生む。この結果は、BrijTM３５存在下でのすすぎ液残
余体積が増加した場合も、また、この結果が観察され
る。
えばBrijTM３５のない水性すすぎ組成物（図４Ａと４Ｃ
と４Ｅ）および非イオン性界面活性剤のある水性すすぎ
組成物（図４Ｂと４Ｄと４Ｆ）を使用して、本発明のペ
ルオキシダーゼ法における種々なすすぎ液残余体積の影
響を示している。ペルオキシダーゼ法のＲ１とＲ２との
段階においては、図４Ａ−４Ｆで示すごとく、方法のＲ
１試薬はＳＤＳ ０．１０５g/L を含有し、BrijTM３５
は含有していない。図４Ａと４Ｂとは、ペルオキシダー
ゼ法の実行から得られ、ペルオキシダーゼＲ１試薬溶液
の最終体積に７．９μL 寄与するすすぎ溶液残余のある
すすぎサイクルを伴ったサイトグラムを描写している
（図４Ａ：すすぎ液中BrijTM３５なし；図４Ｂ：すすぎ
液中BrijTM３５存在）。図４Ｃと４Ｄとは、ペルオキシ
ダーゼ法の実行から得られ、ペルオキシダーゼＲ１試薬
溶液の最終体積に１０μL 寄与する、すすぎ溶液残余の
あるすすぎサイクルを伴ったサイトグラムを描写してい
る（図４Ｃ：すすぎ液中BrijTM３５なし；図４Ｄ：すす
ぎ溶液中BrijTM３５存在）。図４Ｅと４Ｆとは、ペルオ
キシダーゼ法の実行から得られ、ペルオキシダーゼＲ１
試薬溶液の最終溶液の最終体積に１３．３μL 寄与する
すすぎ溶液残余のある、すすぎサイクルを伴ったサイト
グラムを描写している（図４Ｅ：すすぎ溶液中BrijTM３
５なし；図４Ｆ：すすぎ溶液中BrijTM３５存在）。結果
から決定出来るように、すすぎ溶液中に存在するBrijTM
３５とすすぎ液残余とはサイトグラム結果の一般的劣化
を生む。この結果は、BrijTM３５存在下でのすすぎ液残
余体積が増加した場合も、また、この結果が観察され
る。
【０１２２】本発明の改良された試薬組成物と方法とを
用いると、残余は微々たるものになる。それに加えて結
果の確度と精度とが非常に満足すべきものである。非イ
オン性界面活性剤BrijTM３５は本発明人により、もしす
すぎ組成物または溶液中に存在し、もしペルオキシダー
ゼ法で種々な量で持ちこされると、受入れられないサイ
トグラム結果を引き起し、特に、それがサイトグラム中
白色細胞集団の劣化に際立たす薬剤であることが決定さ
れた。
用いると、残余は微々たるものになる。それに加えて結
果の確度と精度とが非常に満足すべきものである。非イ
オン性界面活性剤BrijTM３５は本発明人により、もしす
すぎ組成物または溶液中に存在し、もしペルオキシダー
ゼ法で種々な量で持ちこされると、受入れられないサイ
トグラム結果を引き起し、特に、それがサイトグラム中
白色細胞集団の劣化に際立たす薬剤であることが決定さ
れた。
【０１２３】ここに説明した如く、ペルオキシダーゼ法
におけるすすぎ溶液への非溶血性界面活性剤例えばPlur
onic（例えばPluronicＰ１０５）と、本発明の新規の、
改良されたＲ１希釈試薬組成物の使用は、種々なすすぎ
液残余の影響を軽減し、根源ノイズの受入れられる水準
を維持し、 Day２血液試料を用いるＰｘ法で得られる、
受入れられる結果を可能にする。こうして、本発明に従
って、イオン性界面活性剤（例えばＳＤＳ）と非イオン
性界面活性剤（例えばポリエトキシラートBrijTM３５）
とを含有するＲ１試薬組成物は実験により室温で２４時
間またはそれ以上経った血液試料に関して有用であるこ
とが見出された。更に本発明に従うと、Pluronicのよう
な界面活性剤を含有するすすぎ溶液の使用はここに記載
のような白血球分画法から得られる結果も改良する。
におけるすすぎ溶液への非溶血性界面活性剤例えばPlur
onic（例えばPluronicＰ１０５）と、本発明の新規の、
改良されたＲ１希釈試薬組成物の使用は、種々なすすぎ
液残余の影響を軽減し、根源ノイズの受入れられる水準
を維持し、 Day２血液試料を用いるＰｘ法で得られる、
受入れられる結果を可能にする。こうして、本発明に従
って、イオン性界面活性剤（例えばＳＤＳ）と非イオン
性界面活性剤（例えばポリエトキシラートBrijTM３５）
とを含有するＲ１試薬組成物は実験により室温で２４時
間またはそれ以上経った血液試料に関して有用であるこ
とが見出された。更に本発明に従うと、Pluronicのよう
な界面活性剤を含有するすすぎ溶液の使用はここに記載
のような白血球分画法から得られる結果も改良する。
【０１２４】〔実施例６〕Ｒ１試薬組成物とペルオキシ
ダーゼ法とを用いる、白血球分画法の自働分析 この実施例は自働血液学分析機と、本発明の改良された
方法と試薬とを用いる迅速（即ち６０または１０２個試
料／時に対し１２０個試料／時）白色細胞分画分析につ
いての決定を記載する。技術に熟達した人達には、種々
な分析機とシステムとが、本発明に従う方法と試薬とを
用いて使用され、ここに記載の利益が提供されてもよい
ことが明らかになるであろう。
ダーゼ法とを用いる、白血球分画法の自働分析 この実施例は自働血液学分析機と、本発明の改良された
方法と試薬とを用いる迅速（即ち６０または１０２個試
料／時に対し１２０個試料／時）白色細胞分画分析につ
いての決定を記載する。技術に熟達した人達には、種々
な分析機とシステムとが、本発明に従う方法と試薬とを
用いて使用され、ここに記載の利益が提供されてもよい
ことが明らかになるであろう。
【０１２５】全血試料を用いると、方法のＲ１反応段階
において、試料１２μL に２界面活性剤含有Ｒ１試薬希
釈剤２５０μL を与えられる。約１９秒後に、過酸化水
素（３．０g/L)含有希釈剤２５０μL と４−クロロ−α
−ナフトール（７０g/L)含有希釈剤１２５μL を加え
る。これは第２反応段階（Ｒ２）と考えられる。色原体
含有試薬添加後約１３秒後、流出液を電子−光学的検出
システムを通過させ、サイトグラムを調製する。白血細
胞の大きさとその染色の度合いを、細胞１つずつについ
て測定（前方角散乱対吸収）し、サイトグラムにプロッ
トする。サイトグラムはコンピューターにより分析し、
全白色細胞数と、好中球と好酸球と単核細胞とリンパ球
と巨大未染色細胞との分集団分画とを得る。図は、自働
装置での、本発明の方法実施に用いた自働血液学分析機
の電子−光学的検出システムから得られたサイトグラム
を説明している。そのサイトグラムは、本発明の試薬と
方法とにより、区別された白血球の型（すなわちＷＢ
Ｃ）１）リンパ球、２）単核細胞、３）好中球、４）好
酸球、５）赤色細胞幻影と血小板とから得られる根源ノ
イズおよび６）ＬＵＣを示している。
において、試料１２μL に２界面活性剤含有Ｒ１試薬希
釈剤２５０μL を与えられる。約１９秒後に、過酸化水
素（３．０g/L)含有希釈剤２５０μL と４−クロロ−α
−ナフトール（７０g/L)含有希釈剤１２５μL を加え
る。これは第２反応段階（Ｒ２）と考えられる。色原体
含有試薬添加後約１３秒後、流出液を電子−光学的検出
システムを通過させ、サイトグラムを調製する。白血細
胞の大きさとその染色の度合いを、細胞１つずつについ
て測定（前方角散乱対吸収）し、サイトグラムにプロッ
トする。サイトグラムはコンピューターにより分析し、
全白色細胞数と、好中球と好酸球と単核細胞とリンパ球
と巨大未染色細胞との分集団分画とを得る。図は、自働
装置での、本発明の方法実施に用いた自働血液学分析機
の電子−光学的検出システムから得られたサイトグラム
を説明している。そのサイトグラムは、本発明の試薬と
方法とにより、区別された白血球の型（すなわちＷＢ
Ｃ）１）リンパ球、２）単核細胞、３）好中球、４）好
酸球、５）赤色細胞幻影と血小板とから得られる根源ノ
イズおよび６）ＬＵＣを示している。
【０１２６】全血の最終的希釈は１：５３で、全反応時
間は約３０−３２秒である。自働分析機で実行されるペ
ルオキシダーゼ法の熱的側面の一般的で非限定的例は次
の様なものである。即ち、方法のＲ１段階において、血
液試料とＲ１試薬希釈剤とは約６９±２℃にあるペルオ
キシダーゼ室に入る。約１５〜２０秒の期間を持つＲ１
反応段階の間、温度は約６５〜７５℃あるいは約６５〜
７０℃に上昇する。その後、方法の第２段階（即ちＲ
２）において、基質試薬が添加される。Ｒ２温度は約５
０〜６５℃で、約５〜８秒の期間であり、その時間の間
に温度は約７３±２℃に上昇させられ、これがペルオキ
シダーゼ法終了の最終温度である。すすぎ溶液はペルオ
キシダーゼ法のＲ２段階終了後、すすぎサイクルで用い
られる。試料すすぎサイクルは、１つの試料サイクルか
ら他への試料残余を防ぐためと、自働血液学分析機シス
テムの流路（hydraulic)中の集積を防ぐために必要であ
る。
間は約３０−３２秒である。自働分析機で実行されるペ
ルオキシダーゼ法の熱的側面の一般的で非限定的例は次
の様なものである。即ち、方法のＲ１段階において、血
液試料とＲ１試薬希釈剤とは約６９±２℃にあるペルオ
キシダーゼ室に入る。約１５〜２０秒の期間を持つＲ１
反応段階の間、温度は約６５〜７５℃あるいは約６５〜
７０℃に上昇する。その後、方法の第２段階（即ちＲ
２）において、基質試薬が添加される。Ｒ２温度は約５
０〜６５℃で、約５〜８秒の期間であり、その時間の間
に温度は約７３±２℃に上昇させられ、これがペルオキ
シダーゼ法終了の最終温度である。すすぎ溶液はペルオ
キシダーゼ法のＲ２段階終了後、すすぎサイクルで用い
られる。試料すすぎサイクルは、１つの試料サイクルか
ら他への試料残余を防ぐためと、自働血液学分析機シス
テムの流路（hydraulic)中の集積を防ぐために必要であ
る。
【０１２７】〔実施例７〕本発明のＲ１試薬組成物およ
び方法における適合性に関する種々な非イオン性界面活
性剤の分析 本発明の改良された試薬と方法とにおける使用に適当な
非イオン性ポリエトキシラート界面活性剤の型を決める
ため、次の実験を行った。
び方法における適合性に関する種々な非イオン性界面活
性剤の分析 本発明の改良された試薬と方法とにおける使用に適当な
非イオン性ポリエトキシラート界面活性剤の型を決める
ため、次の実験を行った。
【０１２８】方法の第１反応段階における使用のための
ペルオキシダーゼＲ１試験試薬組成物は次のようにして
調製された。蒸留水中の種々なポリエトキシラートの
３．０g/L 溶液２００μL を、記載された段階１試薬組
成物５０．０mLに添加し、６０mLポリプロピレンねじぶ
た遠心分離管に入れる。界面活性剤溶液を、蒸留水９
７．０mLにポリエトキシラート３．０ｇ添加し、溶液が
沸騰始めるまで加熱攪拌して調製する。約３０分間で室
温にまで冷却後、その溶液２００μL をペルオキシダー
ゼＲ１試薬組成物の他の成分に添加し、Ｒ１試験試薬を
作る。ここに試験したポリエトキシラートは種々な源か
ら商業的に入手し得て、例えばBrijTM界面活性剤はＩＣ
ＩとRuger から得られ、Macol 界面活性剤はMazer から
得られ、Sipionic界面活性剤はAlcolac から得られ、Tr
itonＸTM界面活性剤はSigma, Union CarbideまたはRohm
& Haas から得られ、IgepalＣＯ８９７はＧＡＦから得
られ、PluronicＰ１０５はＢＡＳＦから得られ、Surfon
icＮ３１．５はHuntsmanから得られる。イオン性界面活
性剤に関しては、ＴＤＡＰＳはBoehringer-Mannheim か
ら得られ、ＴＴＡＢはSigma から得られる。
ペルオキシダーゼＲ１試験試薬組成物は次のようにして
調製された。蒸留水中の種々なポリエトキシラートの
３．０g/L 溶液２００μL を、記載された段階１試薬組
成物５０．０mLに添加し、６０mLポリプロピレンねじぶ
た遠心分離管に入れる。界面活性剤溶液を、蒸留水９
７．０mLにポリエトキシラート３．０ｇ添加し、溶液が
沸騰始めるまで加熱攪拌して調製する。約３０分間で室
温にまで冷却後、その溶液２００μL をペルオキシダー
ゼＲ１試薬組成物の他の成分に添加し、Ｒ１試験試薬を
作る。ここに試験したポリエトキシラートは種々な源か
ら商業的に入手し得て、例えばBrijTM界面活性剤はＩＣ
ＩとRuger から得られ、Macol 界面活性剤はMazer から
得られ、Sipionic界面活性剤はAlcolac から得られ、Tr
itonＸTM界面活性剤はSigma, Union CarbideまたはRohm
& Haas から得られ、IgepalＣＯ８９７はＧＡＦから得
られ、PluronicＰ１０５はＢＡＳＦから得られ、Surfon
icＮ３１．５はHuntsmanから得られる。イオン性界面活
性剤に関しては、ＴＤＡＰＳはBoehringer-Mannheim か
ら得られ、ＴＴＡＢはSigma から得られる。
【０１２９】表８に示すごとく、次のポリエトキシラー
トの族または類を用いた。
トの族または類を用いた。
【０１３０】
【表８】
【０１３１】試薬セット当り１０個の血液試料はVacuta
inerTM管中に正常提供者から集め、Ｋ3 ＥＤＴＡにより
抗凝固化された。データは開栓管吸引を用いる自働分析
機で集めた。重複 Day１血液試料は各試薬セットを用い
吸引した。同じ提供者セットからの開栓されていない試
料は一夜室温で貯蔵され、 Day２（ Day２試料）で、手
動で検定した。標準運転のソフトウエアは１０２個試料
／時でおこり、試験試料と試薬とは１２０個試料／時の
処理量で運転された。システムは運転指図書に従い、試
料運転前毎日洗浄し、ペルオキシダーゼチャネル利得
は、それぞれの用いられている自働システムに関する運
転指図書に従って定めた。
inerTM管中に正常提供者から集め、Ｋ3 ＥＤＴＡにより
抗凝固化された。データは開栓管吸引を用いる自働分析
機で集めた。重複 Day１血液試料は各試薬セットを用い
吸引した。同じ提供者セットからの開栓されていない試
料は一夜室温で貯蔵され、 Day２（ Day２試料）で、手
動で検定した。標準運転のソフトウエアは１０２個試料
／時でおこり、試験試料と試薬とは１２０個試料／時の
処理量で運転された。システムは運転指図書に従い、試
料運転前毎日洗浄し、ペルオキシダーゼチャネル利得
は、それぞれの用いられている自働システムに関する運
転指図書に従って定めた。
【０１３２】システム不正確さは試験試薬の評価の前と
後との両方の、ソフトウエアと試薬との標準配置を用い
て決めた。１つの Day１の血液試料は１０回吸引し、全
てのパラメーターに関し、平均並びに標準偏差を決定
（システムにより自働的に）した。標準偏差は新鮮血液
について決定されている、システムの不正確さを規格に
比較された。その手続きは研究の毎日行われた。
後との両方の、ソフトウエアと試薬との標準配置を用い
て決めた。１つの Day１の血液試料は１０回吸引し、全
てのパラメーターに関し、平均並びに標準偏差を決定
（システムにより自働的に）した。標準偏差は新鮮血液
について決定されている、システムの不正確さを規格に
比較された。その手続きは研究の毎日行われた。
【０１３３】試験方法不正確さ決定のため、１０個の試
料が重複して吸引された。不正確さは次の式：ＳＤ＝
〔Sum(d2)/2N〕1/2 、ここにｄは特別な試薬で得られた
重複値の間の差であり、Ｎは１０試料セット中の試料の
数である、を用いて、ペルオキシダーゼチャネルパラメ
ーターに関する標準偏差、ＳＤ（多数の提供者に亘り集
められたＳＤ）を計算することによりオフラインで算定
された。
料が重複して吸引された。不正確さは次の式：ＳＤ＝
〔Sum(d2)/2N〕1/2 、ここにｄは特別な試薬で得られた
重複値の間の差であり、Ｎは１０試料セット中の試料の
数である、を用いて、ペルオキシダーゼチャネルパラメ
ーターに関する標準偏差、ＳＤ（多数の提供者に亘り集
められたＳＤ）を計算することによりオフラインで算定
された。
【０１３４】試験ＰｘＲ１試薬は２セットで評価され
た。各セットについて、標準ペルオキシダーゼ法（例え
ばTECHNICON Ｈ●３TM自働分析機で行われた）が参考と
して包含されている。その参考値は本発明の改良された
方法と試薬との不存在の下で得られた Day１平均値と定
義されている。 Day１と Day２との試料に関する確
度（"acc")はその参考に対して決定される。 Day１試料
と Day２の時間をおいた試料とに関する確度基準は異な
る。その上、不正確さは Day１血液試料についてのみ決
定された（表９参照）。
た。各セットについて、標準ペルオキシダーゼ法（例え
ばTECHNICON Ｈ●３TM自働分析機で行われた）が参考と
して包含されている。その参考値は本発明の改良された
方法と試薬との不存在の下で得られた Day１平均値と定
義されている。 Day１と Day２との試料に関する確
度（"acc")はその参考に対して決定される。 Day１試料
と Day２の時間をおいた試料とに関する確度基準は異な
る。その上、不正確さは Day１血液試料についてのみ決
定された（表９参照）。
【０１３５】BrijTM５２はＨＬＢ５．３を持ち（表１０
参照）、それ故疎水性で、通常油中水乳化適用には使用
されない。Ｈ●３TM自働分析機で実施された自働ペルオ
キシダーゼ法は水中油乳化を用いている（即ち、赤色細
胞と血小板膜の脂質材料は界面活性剤ミセルによりペル
オキシダーゼ流出液の水性環境中に“溶解”されてい
る）。
参照）、それ故疎水性で、通常油中水乳化適用には使用
されない。Ｈ●３TM自働分析機で実施された自働ペルオ
キシダーゼ法は水中油乳化を用いている（即ち、赤色細
胞と血小板膜の脂質材料は界面活性剤ミセルによりペル
オキシダーゼ流出液の水性環境中に“溶解”されてい
る）。
【０１３６】
【表９】
【０１３７】
【表１０】
【０１３８】一般に、ペルオキシダーゼ流出液には次の
成分、ＰｘＲ１試薬溶液、Ｐｘ１０．２５mLと、色原体
含有試薬溶液、Ｐｘ２ ０．１２５mLと、過酸化水素含
有試薬溶液Ｐｘ３ ０．２５mLと、血液試料１２μL と
が包含されている。Ｐｘ１とＰｘ３（３．０g/L 水性過
酸化水素）とは水性溶液であるが、Ｐｘ２はジエチレン
グリコール（非水性であるが水混合性溶剤）に溶解して
いる４−クロロ−ナフトールの溶液である。
成分、ＰｘＲ１試薬溶液、Ｐｘ１０．２５mLと、色原体
含有試薬溶液、Ｐｘ２ ０．１２５mLと、過酸化水素含
有試薬溶液Ｐｘ３ ０．２５mLと、血液試料１２μL と
が包含されている。Ｐｘ１とＰｘ３（３．０g/L 水性過
酸化水素）とは水性溶液であるが、Ｐｘ２はジエチレン
グリコール（非水性であるが水混合性溶剤）に溶解して
いる４−クロロ−ナフトールの溶液である。
【０１３９】ＨＬＢ３〜６の範囲の界面活性剤が油中水
乳化に推薦される。対照的に水中油乳化に推薦されるＨ
ＬＢ範囲は約８−１８である（M.J. Rosen, 1978, Surf
actant and Interfacial Phenomena, Wiley-Interscien
ce, 243-244 頁）。
乳化に推薦される。対照的に水中油乳化に推薦されるＨ
ＬＢ範囲は約８−１８である（M.J. Rosen, 1978, Surf
actant and Interfacial Phenomena, Wiley-Interscien
ce, 243-244 頁）。
【０１４０】TritonＸTM−３０５はＨＬＢ １７．３を
持つので非常に親水性であることを示し、水中油乳化に
適している。しかし、この界面活性剤の次善の性能は分
析の条件の下で極端に親水性の結果であってもよい。多
数のペルオキシダーゼ研究の結果として、本発明者は、
赤色細胞が、試料の貯蔵の間に起る生化学的変化によ
り、室温貯蔵の後溶解に対しより抵抗するようになるこ
とを観察した。新しく記載した方法と試薬との確度と信
頼性とは、時間につれての血液試料の劣化と、最適以下
の、時間をおいた試料条件にも拘らずその様な試料につ
いて検定を実行し、適当な結果を得るための必要性との
見地から特に重要である。
持つので非常に親水性であることを示し、水中油乳化に
適している。しかし、この界面活性剤の次善の性能は分
析の条件の下で極端に親水性の結果であってもよい。多
数のペルオキシダーゼ研究の結果として、本発明者は、
赤色細胞が、試料の貯蔵の間に起る生化学的変化によ
り、室温貯蔵の後溶解に対しより抵抗するようになるこ
とを観察した。新しく記載した方法と試薬との確度と信
頼性とは、時間につれての血液試料の劣化と、最適以下
の、時間をおいた試料条件にも拘らずその様な試料につ
いて検定を実行し、適当な結果を得るための必要性との
見地から特に重要である。
【０１４１】イオン性界面活性剤に加えて、次の非イオ
ン性界面活性剤、BrijTM５８とIgepalTMＣＯ８９７とTr
itonＸTM−１００とSiponic Ｅ１５とTritonＸTM−４０
５とBrijTM７６とMyrjTM５３を含有するペルオキシダー
ゼＲ１試薬組成物の全ては Day１血液試料の分析におい
て正確に、受入れられる様に働く。しかし、 Day２試料
については、IgepalTMＣＯ８９７とTritonＸTM−４０５
とMyrjTM５３とを含有するＰｘＲ１試験試薬は受入れら
れない数値およびサイトグラム結果を与える様に見える
（表９および１０参照）。これらのポリエトキシラート
はそれぞれ１７．８と１７．９と１７．９のＨＬＢ値
と、それぞれ３３．０と３３．３と３１．８との％ノイ
ズ値とを持つ。それに加えて、これらの界面活性剤の使
用で得られるサイトグラムの他の一般性状はＷＢＣＰを
上昇させ、％好中球と％リンパ球とをゆがめる。示した
ようにMyrjTM５３はステアリン酸のカルボン酸エステル
であり、それは水性溶液中、加水分解に対しより安定で
ないようである。表９と１０とで用いた略字は：ＷＢＣ
Ｐ：％全白血細胞、％ＮＥＵＴ：％好中球、％ＬＹＭＰ
Ｈ：％リンパ球、％ＭＯＮＯ：％単核細胞、％ＥＯＳ：
％好酸球、％ＬＵＣ：％巨大未染色細胞、％ＮＯＩＳ：
ペルオキシダーゼ法実行に随伴する根源ノイズ、ＨＬ
Ｂ：親水性親油性比値である。
ン性界面活性剤、BrijTM５８とIgepalTMＣＯ８９７とTr
itonＸTM−１００とSiponic Ｅ１５とTritonＸTM−４０
５とBrijTM７６とMyrjTM５３を含有するペルオキシダー
ゼＲ１試薬組成物の全ては Day１血液試料の分析におい
て正確に、受入れられる様に働く。しかし、 Day２試料
については、IgepalTMＣＯ８９７とTritonＸTM−４０５
とMyrjTM５３とを含有するＰｘＲ１試験試薬は受入れら
れない数値およびサイトグラム結果を与える様に見える
（表９および１０参照）。これらのポリエトキシラート
はそれぞれ１７．８と１７．９と１７．９のＨＬＢ値
と、それぞれ３３．０と３３．３と３１．８との％ノイ
ズ値とを持つ。それに加えて、これらの界面活性剤の使
用で得られるサイトグラムの他の一般性状はＷＢＣＰを
上昇させ、％好中球と％リンパ球とをゆがめる。示した
ようにMyrjTM５３はステアリン酸のカルボン酸エステル
であり、それは水性溶液中、加水分解に対しより安定で
ないようである。表９と１０とで用いた略字は：ＷＢＣ
Ｐ：％全白血細胞、％ＮＥＵＴ：％好中球、％ＬＹＭＰ
Ｈ：％リンパ球、％ＭＯＮＯ：％単核細胞、％ＥＯＳ：
％好酸球、％ＬＵＣ：％巨大未染色細胞、％ＮＯＩＳ：
ペルオキシダーゼ法実行に随伴する根源ノイズ、ＨＬ
Ｂ：親水性親油性比値である。
【０１４２】どういう方法ででも理論に縛られることは
ないが、ペルオキシダーゼ法に用いられるＲ１試薬組成
物中の界面活性剤の可能性ある機能は次のものの１つま
たは２つ、（１）赤色細胞と血小板との溶解となる膜透
過と、（２）水不溶性４−クロロナフトールの複合体化
と、この基質の、染色が起る細胞中への輸送と、（３）
赤色細胞の残骸の乳化、それによるペルオキシダーゼチ
ャンネル中における集積の減少、が包含されていてもよ
い。
ないが、ペルオキシダーゼ法に用いられるＲ１試薬組成
物中の界面活性剤の可能性ある機能は次のものの１つま
たは２つ、（１）赤色細胞と血小板との溶解となる膜透
過と、（２）水不溶性４−クロロナフトールの複合体化
と、この基質の、染色が起る細胞中への輸送と、（３）
赤色細胞の残骸の乳化、それによるペルオキシダーゼチ
ャンネル中における集積の減少、が包含されていてもよ
い。
【０１４３】添付している図で描写している典型的サイ
トグラムにおいて、原点におけるノイズ／リンパ球本体
（frunk)の幅と黒さ（細胞の数に関連する）は％ノイズ
の増加と共に増大する。一般に、時間をおいた血液試料
で得られたサイトグラムは新鮮血液中の好中球の境界以
下に落ちる好中球を示している。母集団に関しても時間
をおいた血液において拡がる傾向がある。この実施例か
らの結果はサイトグラムは試験した種々なポリエトキシ
ラート界面活性族の間では同等であることを示している
（表８、実施例７参照）。しかし特に前記し、ＨＬＢが
約９．６〜１６．９の範囲にある界面活性剤族１と２
（例えばポリエチレングリコールにエーテル化されてい
る直鎖または分枝オクチルフェニル疎水物）とから誘導
される界面活性剤は Day１と Day２との血液試料の分析
において受入れられる仕方で働く。これらの結果は、水
中油乳化に関し、一般的に推薦される界面活性剤ＨＬＢ
範囲約８〜１８と一致する。自働ペルオキシダーゼ法例
えばＨ●３TMシステムで行われるペルオキシダーゼ法に
おいて、赤色細胞膜残骸は、水性環境中、界面活性剤ミ
セルにより乳化される脂質（“油質”）材料であり、そ
れ故この型の分析についての効果のある様式は水中油乳
化である。
トグラムにおいて、原点におけるノイズ／リンパ球本体
（frunk)の幅と黒さ（細胞の数に関連する）は％ノイズ
の増加と共に増大する。一般に、時間をおいた血液試料
で得られたサイトグラムは新鮮血液中の好中球の境界以
下に落ちる好中球を示している。母集団に関しても時間
をおいた血液において拡がる傾向がある。この実施例か
らの結果はサイトグラムは試験した種々なポリエトキシ
ラート界面活性族の間では同等であることを示している
（表８、実施例７参照）。しかし特に前記し、ＨＬＢが
約９．６〜１６．９の範囲にある界面活性剤族１と２
（例えばポリエチレングリコールにエーテル化されてい
る直鎖または分枝オクチルフェニル疎水物）とから誘導
される界面活性剤は Day１と Day２との血液試料の分析
において受入れられる仕方で働く。これらの結果は、水
中油乳化に関し、一般的に推薦される界面活性剤ＨＬＢ
範囲約８〜１８と一致する。自働ペルオキシダーゼ法例
えばＨ●３TMシステムで行われるペルオキシダーゼ法に
おいて、赤色細胞膜残骸は、水性環境中、界面活性剤ミ
セルにより乳化される脂質（“油質”）材料であり、そ
れ故この型の分析についての効果のある様式は水中油乳
化である。
【０１４４】〔実施例８〕白血球分画のＰｘＲ１試薬と
ペルオキシダーゼ法とへの適合性についての、低ＨＬＢ
値を持つ界面活性剤の分析とPluronicの評価
ペルオキシダーゼ法とへの適合性についての、低ＨＬＢ
値を持つ界面活性剤の分析とPluronicの評価
【０１４５】ＳＤＳ ０．１０５g/L 含有するＰｘＲ１
試薬溶液中に処方されている、より低いＨＬＢ値をもつ
ポリエトキシラート界面活性剤の潜在的利用と効果とを
試験するため実験を行った。従ってＨＬＢ値５．３〜１
７．９を持つ界面活性剤を試験した。
試薬溶液中に処方されている、より低いＨＬＢ値をもつ
ポリエトキシラート界面活性剤の潜在的利用と効果とを
試験するため実験を行った。従ってＨＬＢ値５．３〜１
７．９を持つ界面活性剤を試験した。
【０１４６】試薬セットの一部としての、試験Ｒ１試薬
組成物の性能を、５つの Day１非病院血液試料と、５つ
の、室温に貯蔵された後に検定された Day２非病院試料
よりなる試料を用い決定された。性能は現在の自働分析
機規格に対し、確度と精度とに関し判断された。次のパ
ラメーター、ＷＢＣＰと％好中球（％ＮまたはＮｅｕ
ｔ）と％リンパ球（％Ｌｙ）と％単核細胞と、％好酸球
（％Ｅｏｓ）と％巨大未染色細胞（％ＬＵＣ）と％ペル
オキシダーゼノイズ（％Ｎｏｉｓｅ）を追跡した。
組成物の性能を、５つの Day１非病院血液試料と、５つ
の、室温に貯蔵された後に検定された Day２非病院試料
よりなる試料を用い決定された。性能は現在の自働分析
機規格に対し、確度と精度とに関し判断された。次のパ
ラメーター、ＷＢＣＰと％好中球（％ＮまたはＮｅｕ
ｔ）と％リンパ球（％Ｌｙ）と％単核細胞と、％好酸球
（％Ｅｏｓ）と％巨大未染色細胞（％ＬＵＣ）と％ペル
オキシダーゼノイズ（％Ｎｏｉｓｅ）を追跡した。
【０１４７】ＳＤＳを０．１０５g/L と、次の他の界面
活性剤例えばBrijTM３５とMacolTMＮＰ４とSurfonicTM
Ｎ３１．５とPluronicＰ１０５とMacolTM ＴＤ３とTrit
onＸTM３５とを含有する試験ＰｘＲ１試薬を、実施例７
に記載の方法に従い調製した。典型的な試験界面活性剤
とその対応するＨＬＢ値を示す。
活性剤例えばBrijTM３５とMacolTMＮＰ４とSurfonicTM
Ｎ３１．５とPluronicＰ１０５とMacolTM ＴＤ３とTrit
onＸTM３５とを含有する試験ＰｘＲ１試薬を、実施例７
に記載の方法に従い調製した。典型的な試験界面活性剤
とその対応するＨＬＢ値を示す。
【０１４８】 界面活性剤 ＨＬＢ値 BrijTM３５ １６．９ MacolTM ＮＰ４ ８．９ SurfonicTMＮ３１．５ ７．７ PluronicＰ１０５ １２−１８ MacolTM ＴＤ３ ８．０ TritonＸTM３５ ７．８ 付加した研究が、本発明に従って処方されたペルオキシ
ダーゼＲ１試薬組成物中の非イオン性界面活性剤として
のBrijTM３５の代替物としてPluronic試験するために、
行われた。
ダーゼＲ１試薬組成物中の非イオン性界面活性剤として
のBrijTM３５の代替物としてPluronic試験するために、
行われた。
【０１４９】実施例７で記載し、表９と１０とに示した
如く、 Day１と Day２血液試料を用いる受入れられる自
働ペルオキシダーゼ法結果はＨＬＢ値約９．３〜１６．
９を持つ界面活性剤を用いて得られる。Ｒ１試薬組成物
中の、ＨＬＢ値約１７．３以上並びに低ＨＬＢ値例えば
ＨＬＢ＝５．３を持つ界面活性剤は受入れられないデー
タをもたらした。
如く、 Day１と Day２血液試料を用いる受入れられる自
働ペルオキシダーゼ法結果はＨＬＢ値約９．３〜１６．
９を持つ界面活性剤を用いて得られる。Ｒ１試薬組成物
中の、ＨＬＢ値約１７．３以上並びに低ＨＬＢ値例えば
ＨＬＢ＝５．３を持つ界面活性剤は受入れられないデー
タをもたらした。
【０１５０】Ｐ１０５を含むPluronicは、ここに記載の
実験に用いられた他のポリエトキシラートとは明らかに
異なる構造をもっている。Pluronicの構造においては、
３つの領域：（ＰＯＥ)n−（ＰＯＰ）m−（ＰＯＥ）n、
ここにＰＯＥとＰＯＰとはそれぞれポリオキシエチレン
とポリオキシプロピレンを表わす、がある。ＰＯＥ領域
は親水性（即ち“親水部”）で、ＰＯＰ領域は疎水性
（即ち“疎水部”）である。また１つのＰＯＥ領域の側
面に配置されている２つのＰＯＰ領域がある“逆転”Pl
uronic即ち“Ｒ”シリーズも存在する（Pluronic & Tet
ronic Surfactants, BASF Corporation, 1987 参照）。
PluronicにはＨＬＢ値が割り当てられている。Ｐ１０５
に関してはＨＬＢ値は１２−１８である。Ｐ１０５に割
り当てられている広いＨＬＢ範囲は、よりせまいＨＬＢ
値を割り当てられている、２つの領域（domain）のポリ
エトキシラートのそれと鋭い対照にある。Pluronic構造
は他の２領域ポリエトキシラート（ポリエトキシ化アル
コールとフェノール）とは有意に異なっている故に、Pl
uronicはポリエトキシラートの別々の類を表わしてい
る。従って、２領域と３領域ポリエトキシラート間の差
異は、本発明のペルオキシダーゼ試薬と方法とに採用し
て成功できる潜在的非イオン性界面活性剤としての２領
域ポリエトキシラートに関する効用の予報値としてのＨ
ＬＢ尺度の利用を可能にする。
実験に用いられた他のポリエトキシラートとは明らかに
異なる構造をもっている。Pluronicの構造においては、
３つの領域：（ＰＯＥ)n−（ＰＯＰ）m−（ＰＯＥ）n、
ここにＰＯＥとＰＯＰとはそれぞれポリオキシエチレン
とポリオキシプロピレンを表わす、がある。ＰＯＥ領域
は親水性（即ち“親水部”）で、ＰＯＰ領域は疎水性
（即ち“疎水部”）である。また１つのＰＯＥ領域の側
面に配置されている２つのＰＯＰ領域がある“逆転”Pl
uronic即ち“Ｒ”シリーズも存在する（Pluronic & Tet
ronic Surfactants, BASF Corporation, 1987 参照）。
PluronicにはＨＬＢ値が割り当てられている。Ｐ１０５
に関してはＨＬＢ値は１２−１８である。Ｐ１０５に割
り当てられている広いＨＬＢ範囲は、よりせまいＨＬＢ
値を割り当てられている、２つの領域（domain）のポリ
エトキシラートのそれと鋭い対照にある。Pluronic構造
は他の２領域ポリエトキシラート（ポリエトキシ化アル
コールとフェノール）とは有意に異なっている故に、Pl
uronicはポリエトキシラートの別々の類を表わしてい
る。従って、２領域と３領域ポリエトキシラート間の差
異は、本発明のペルオキシダーゼ試薬と方法とに採用し
て成功できる潜在的非イオン性界面活性剤としての２領
域ポリエトキシラートに関する効用の予報値としてのＨ
ＬＢ尺度の利用を可能にする。
【０１５１】ポリエトキシラートの２領域類は疎水部−
Ｏ−（ＰＯＥ）n−ＯＨとして表わすことができる。そ
の疎水部は長鎖、分枝鎖または直鎖アルコール例えばBr
ijTM３５の何れかであることが出来る。代って、他の普
通に用いられる疎水構造は、直鎖または分枝鎖炭化水素
がフェノール構造に結合されていて、それがこんどはＰ
ＯＥ領域に結合されているオクチルフェニル（例えばTr
itonTMＸシリーズ）またはノナフェニル類（例えばTrit
onＮTMシリーズ、MacolTM ＮＰシリーズ、SurfonicTMＮ
Ｐシリーズなど）である。
Ｏ−（ＰＯＥ）n−ＯＨとして表わすことができる。そ
の疎水部は長鎖、分枝鎖または直鎖アルコール例えばBr
ijTM３５の何れかであることが出来る。代って、他の普
通に用いられる疎水構造は、直鎖または分枝鎖炭化水素
がフェノール構造に結合されていて、それがこんどはＰ
ＯＥ領域に結合されているオクチルフェニル（例えばTr
itonTMＸシリーズ）またはノナフェニル類（例えばTrit
onＮTMシリーズ、MacolTM ＮＰシリーズ、SurfonicTMＮ
Ｐシリーズなど）である。
【０１５２】ペルオキシダーゼＲ１試薬組成物がＳＤＳ
と、ＨＬＢ値約７．７〜８．９を持つポリエトキシ化ア
ルコールまたはフェノールとの両者を含有するように処
方され、この組成物が Day２血液試料の分析に用いられ
た場合、サイトグラムは何１つ、リンパ球領域とノイズ
領域間に谷を示さない。それ故％リンパ球は４つ全ての
場合高く、％好中球は３つの場合低い。その様な試薬の
一連のセットはペルオキシダーゼ法のＲ１試薬組成物中
での使用には受入れられないと判断された。観察された
受入れられない性能の最もありそうな原因は、これらポ
リエトキシラート界面活性剤が、自働血液学分析機を用
いるペルオキシダーゼ法適用のためには余りに疎水性す
ぎる（即ち、ＨＬＢが低すぎる）ということである。そ
れ故、イオン性界面活性剤例えばＳＤＳまたはＴＤＡＰ
Ｓ存在の下で、ポリエトキシ化アルコールまたはフェノ
ールについては、要求されるＨＬＢ値は約９．３〜１
７．３、より好ましくは約９．７〜１６．９であるべき
であると結論された。Pluronicは非イオン性界面活性剤
の別個の類を表わしているが、この類の一員、即ちPlur
onicＰ１０５はペルオキシダーゼ試薬と方法とにおいて
有用でないことがわかった。当業者には違った構造ある
いは性状をもつ他のPluronicが、本発明の試薬中での使
用のために助けとなる充分な界面活性剤溶血性状を与え
る種々なＨＬＢ値を有する故に有用であるかもしれない
ことが理解できるはずである。
と、ＨＬＢ値約７．７〜８．９を持つポリエトキシ化ア
ルコールまたはフェノールとの両者を含有するように処
方され、この組成物が Day２血液試料の分析に用いられ
た場合、サイトグラムは何１つ、リンパ球領域とノイズ
領域間に谷を示さない。それ故％リンパ球は４つ全ての
場合高く、％好中球は３つの場合低い。その様な試薬の
一連のセットはペルオキシダーゼ法のＲ１試薬組成物中
での使用には受入れられないと判断された。観察された
受入れられない性能の最もありそうな原因は、これらポ
リエトキシラート界面活性剤が、自働血液学分析機を用
いるペルオキシダーゼ法適用のためには余りに疎水性す
ぎる（即ち、ＨＬＢが低すぎる）ということである。そ
れ故、イオン性界面活性剤例えばＳＤＳまたはＴＤＡＰ
Ｓ存在の下で、ポリエトキシ化アルコールまたはフェノ
ールについては、要求されるＨＬＢ値は約９．３〜１
７．３、より好ましくは約９．７〜１６．９であるべき
であると結論された。Pluronicは非イオン性界面活性剤
の別個の類を表わしているが、この類の一員、即ちPlur
onicＰ１０５はペルオキシダーゼ試薬と方法とにおいて
有用でないことがわかった。当業者には違った構造ある
いは性状をもつ他のPluronicが、本発明の試薬中での使
用のために助けとなる充分な界面活性剤溶血性状を与え
る種々なＨＬＢ値を有する故に有用であるかもしれない
ことが理解できるはずである。
【０１５３】従って、ペルオキシダーゼＲ１試薬組成物
中ＳＤＳ ０．１０５g/L 存在の下での、０．１２g/L
の２領域ポリエトキシラート非イオン性界面活性剤に関
しては、ＨＬＢ約５．３〜８．９および約１７．３以上
のものは方法での使用を受入れられないことを、これら
の研究から決定した。対照的に、Ｒ１試薬に処方され、
約９．７〜１６．９の範囲のＨＬＢ値を持つ界面活性剤
（即ち、３つの通常の型の疎水部を含む構造を持つ界面
活性剤）がこの方法において受入れられる結果を与え
る。Pluronicは３領域構造に基づくポリエトキシラート
の別の類を包含する。PluronicＰ１０５は、このPluron
icが２領域ポリエトキシラートの有用なＨＬＢ範囲と重
なる広いＨＬＢ範囲１２〜１８を当てがわれている事実
にも拘らず、ペルオキシダーゼＲ１試薬組成物中に０．
１２g/L で（ＳＤＳ ０．１０５g/L 存在の下）処方さ
れた場合受入れられない。
中ＳＤＳ ０．１０５g/L 存在の下での、０．１２g/L
の２領域ポリエトキシラート非イオン性界面活性剤に関
しては、ＨＬＢ約５．３〜８．９および約１７．３以上
のものは方法での使用を受入れられないことを、これら
の研究から決定した。対照的に、Ｒ１試薬に処方され、
約９．７〜１６．９の範囲のＨＬＢ値を持つ界面活性剤
（即ち、３つの通常の型の疎水部を含む構造を持つ界面
活性剤）がこの方法において受入れられる結果を与え
る。Pluronicは３領域構造に基づくポリエトキシラート
の別の類を包含する。PluronicＰ１０５は、このPluron
icが２領域ポリエトキシラートの有用なＨＬＢ範囲と重
なる広いＨＬＢ範囲１２〜１８を当てがわれている事実
にも拘らず、ペルオキシダーゼＲ１試薬組成物中に０．
１２g/L で（ＳＤＳ ０．１０５g/L 存在の下）処方さ
れた場合受入れられない。
【０１５４】〔実施例９〕白血球分画のＰｘＲ１試薬組
成物とペルオキシダーゼ法においての適合性に関する、
イオン性界面活性剤の他の類の分析
成物とペルオキシダーゼ法においての適合性に関する、
イオン性界面活性剤の他の類の分析
【０１５５】イオン性界面活性剤の他の類（例えば陽イ
オン性または双性イオン性界面活性剤）が本発明の改良
された試薬組成物および方法への使用が適当であるかど
うかを決定するため、そのようなイオン性界面活性剤を
用いて、付加的な実験を行った。これらの研究は、陰イ
オン性界面活性剤例えばＳＤＳよりはむしろ、陽イオン
性および双性イオン性界面活性剤が、ペルオキシダーゼ
Ｒ１試薬組成物中で、非イオン性界面活性剤（例えばBr
ijTM３５）０．１２g/L と組合せての使用が適当である
かどうかを試験するために設計された。実験は自働血液
分析機の情況の下で行われ、BrijTM３５のないすすぎ液
を用いるすすぎサイクルを採用した。試験した１つの陽
イオン性界面活性の例は臭化テトラデシルトリメチルア
ンモニウム即ちＴＴＡＢであり、試験された双性イオン
性界面活性剤の例はテトラデシルアンモニオプロパンス
ルホナート即ちＴＤＡＰＳである。
オン性または双性イオン性界面活性剤）が本発明の改良
された試薬組成物および方法への使用が適当であるかど
うかを決定するため、そのようなイオン性界面活性剤を
用いて、付加的な実験を行った。これらの研究は、陰イ
オン性界面活性剤例えばＳＤＳよりはむしろ、陽イオン
性および双性イオン性界面活性剤が、ペルオキシダーゼ
Ｒ１試薬組成物中で、非イオン性界面活性剤（例えばBr
ijTM３５）０．１２g/L と組合せての使用が適当である
かどうかを試験するために設計された。実験は自働血液
分析機の情況の下で行われ、BrijTM３５のないすすぎ液
を用いるすすぎサイクルを採用した。試験した１つの陽
イオン性界面活性の例は臭化テトラデシルトリメチルア
ンモニウム即ちＴＴＡＢであり、試験された双性イオン
性界面活性剤の例はテトラデシルアンモニオプロパンス
ルホナート即ちＴＤＡＰＳである。
【０１５６】ＳＤＳを含有しない（例えばＰｘ１／Ｎｏ
ＳＤＳ）試験Ｒ１試薬は、BrijTM３５（蒸留水中の３０
g/L 溶液４．０mL）、ソルビトール１１３．０ｇ、リン
酸水素二ナトリウム２．０８ｇ（Mallinkrodt）、リン
酸二水素ナトリウム１１．８９ｇ（Mallinkrodt）、Ｎ
ａＣｌ ０．４８８ｇ（Mallinkrodt ７５８１ＫＭＥ
Ｒ）、Ｎａ2 ＥＤＴＡ ０．７５０ｇ（Mallinkrodt ４
９３１ＫＭＨＫ）、ホルムアルデヒド（３７％）１５０
ml（Mallinkrodt)を含有させて調製した。検定の中間pH
は７．２３であった。試験試薬は０．２ミクロンポリス
ルホン膜４７mm円板（Gelman Supor）を通して濾過し
た。イオン性界面活性剤は次の如くＰｘ１／ｎｏＳＤＳ
に添加した。ＴＤＡＰＳまたはＴＴＡＢいずれかの３０
g/L 溶液２００μL を６０mlポリプロピレンねじ蓋管中
の５０mlＰｘ１／ＮｏＳＤＳに添加する。PluronicＰ１
０５含有すすぎ試薬は全ての試験分析すすぎサイクル中
に用いられた。セット当り５つの正常血液試料が正常篤
志家からVacutainerTM管中に採られ、Ｋ3 ＥＤＴＡによ
り抗凝固化された。データは手動開栓管吸引によるTECH
NICON Ｈ●TMシリーズの自働血液学分析機で集められ、
方法は実施例２に記載のように行われた。
ＳＤＳ）試験Ｒ１試薬は、BrijTM３５（蒸留水中の３０
g/L 溶液４．０mL）、ソルビトール１１３．０ｇ、リン
酸水素二ナトリウム２．０８ｇ（Mallinkrodt）、リン
酸二水素ナトリウム１１．８９ｇ（Mallinkrodt）、Ｎ
ａＣｌ ０．４８８ｇ（Mallinkrodt ７５８１ＫＭＥ
Ｒ）、Ｎａ2 ＥＤＴＡ ０．７５０ｇ（Mallinkrodt ４
９３１ＫＭＨＫ）、ホルムアルデヒド（３７％）１５０
ml（Mallinkrodt)を含有させて調製した。検定の中間pH
は７．２３であった。試験試薬は０．２ミクロンポリス
ルホン膜４７mm円板（Gelman Supor）を通して濾過し
た。イオン性界面活性剤は次の如くＰｘ１／ｎｏＳＤＳ
に添加した。ＴＤＡＰＳまたはＴＴＡＢいずれかの３０
g/L 溶液２００μL を６０mlポリプロピレンねじ蓋管中
の５０mlＰｘ１／ＮｏＳＤＳに添加する。PluronicＰ１
０５含有すすぎ試薬は全ての試験分析すすぎサイクル中
に用いられた。セット当り５つの正常血液試料が正常篤
志家からVacutainerTM管中に採られ、Ｋ3 ＥＤＴＡによ
り抗凝固化された。データは手動開栓管吸引によるTECH
NICON Ｈ●TMシリーズの自働血液学分析機で集められ、
方法は実施例２に記載のように行われた。
【０１５７】ここに記載の白血球分画の標準あるいは対
照法においては、ＰｘＲ１試薬組成物は唯一の界面活性
剤としてＳＤＳを含有し、BrijTM３５はすすぎ液残余の
結果として（即ちBrijTM３５とＳＤＳとの両者を含有す
るすすぎ液によって、実施例５参照）Ｒ１段階に供給さ
れることが判った。本発明の知見に従って行われる試験
方法においては、ＰｘＲ１試薬組成物は陰イオン性界面
活性剤ＳＤＳと非イオン性界面活性剤BrijTM３５との両
者を含有し、すすぎ溶液はＳＤＳもBrijTMも含有しな
い。
照法においては、ＰｘＲ１試薬組成物は唯一の界面活性
剤としてＳＤＳを含有し、BrijTM３５はすすぎ液残余の
結果として（即ちBrijTM３５とＳＤＳとの両者を含有す
るすすぎ液によって、実施例５参照）Ｒ１段階に供給さ
れることが判った。本発明の知見に従って行われる試験
方法においては、ＰｘＲ１試薬組成物は陰イオン性界面
活性剤ＳＤＳと非イオン性界面活性剤BrijTM３５との両
者を含有し、すすぎ溶液はＳＤＳもBrijTMも含有しな
い。
【０１５８】陰イオン性界面活性剤ＳＤＳが、濃度０．
１２g/L の陽イオン性４級ハロゲン化アンモニウム界面
活性剤ＴＴＡＢによるかあるいは、濃度０．１２g/L の
双性イオン性界面活性剤ＴＴＡＢによるかの何れかによ
って置きかえられたＰｘ１試薬組成物を採用したＰｘ法
の有効性が検定された。ＴＴＡＢ ０．１２g/L とBrij
TM３５ ０．１２g/L を含有するＲ１試薬（"Reagent
１")を用いて得られた結果は意外であり、サイトグラム
の左側における赤色細胞の“縞”（streak）になる赤血
細胞の不充分な溶解の故に、ペルオキシダーゼデータが
得られなかった。対照的に、ＴＤＡＰＳ濃度０．１２g/
L とBrijTM３５ ０．１２g/L とを含有するＲ１試薬
は、ペルオキシダーゼ法で検定された Day１と Day２血
液試料両者に関し受入れられるデータを与えた（表１１
参照）。これらの結果は、双性イオン性界面活性剤例え
ばＴＤＡＰＳが、本発明のペルオキシダーゼ法に用いら
れるＰｘＲ１試薬組成物中の非イオン性界面活性剤と共
に用いるのに適していることを示した。
１２g/L の陽イオン性４級ハロゲン化アンモニウム界面
活性剤ＴＴＡＢによるかあるいは、濃度０．１２g/L の
双性イオン性界面活性剤ＴＴＡＢによるかの何れかによ
って置きかえられたＰｘ１試薬組成物を採用したＰｘ法
の有効性が検定された。ＴＴＡＢ ０．１２g/L とBrij
TM３５ ０．１２g/L を含有するＲ１試薬（"Reagent
１")を用いて得られた結果は意外であり、サイトグラム
の左側における赤色細胞の“縞”（streak）になる赤血
細胞の不充分な溶解の故に、ペルオキシダーゼデータが
得られなかった。対照的に、ＴＤＡＰＳ濃度０．１２g/
L とBrijTM３５ ０．１２g/L とを含有するＲ１試薬
は、ペルオキシダーゼ法で検定された Day１と Day２血
液試料両者に関し受入れられるデータを与えた（表１１
参照）。これらの結果は、双性イオン性界面活性剤例え
ばＴＤＡＰＳが、本発明のペルオキシダーゼ法に用いら
れるＰｘＲ１試薬組成物中の非イオン性界面活性剤と共
に用いるのに適していることを示した。
【０１５９】
【表１１】
【０１６０】要約すると、実施例７〜９で行われた実験
に関しては、ＨＬＢ値約７．７〜８．９を持つポリエト
キシ化アルコールおよびフェノールは、ＰｘＲ１試薬組
成物中の非イオン性界面活性剤BrijTM３５の置換物とし
て受入れられない。PluronicＰ１０５、ブロック共重合
体（ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリ
オキシエチレン）もまた、ＰｘＲ１試薬組成物における
イオン性界面活性剤と組合わせて不満足なものであった
（サイトグラム中に高い５ノイズを生ずる）。陽イオン
性界面活性剤例えばＴＴＡＢはＰｘＲ１試薬組成物中の
ＳＤＳの受入れられない置換物であることが判ったこと
は注目される。しかし、双性イオン性界面活性剤例えば
ＴＤＡＰＳはＳＤＳの受入れられる、有用な置換物であ
る。
に関しては、ＨＬＢ値約７．７〜８．９を持つポリエト
キシ化アルコールおよびフェノールは、ＰｘＲ１試薬組
成物中の非イオン性界面活性剤BrijTM３５の置換物とし
て受入れられない。PluronicＰ１０５、ブロック共重合
体（ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリ
オキシエチレン）もまた、ＰｘＲ１試薬組成物における
イオン性界面活性剤と組合わせて不満足なものであった
（サイトグラム中に高い５ノイズを生ずる）。陽イオン
性界面活性剤例えばＴＴＡＢはＰｘＲ１試薬組成物中の
ＳＤＳの受入れられない置換物であることが判ったこと
は注目される。しかし、双性イオン性界面活性剤例えば
ＴＤＡＰＳはＳＤＳの受入れられる、有用な置換物であ
る。
【０１６１】全ての特許出願と発行された特許と原文と
公表論文とここに引用した参考資料との内容はそっくり
そのまま参考資料に組入れられている。
公表論文とここに引用した参考資料との内容はそっくり
そのまま参考資料に組入れられている。
【０１６２】種々な変化が前記の組成物と方法とに、本
発明の範囲と精神とから逸脱することなく、作ることが
出来るから、前記の説明中に含まれ、付随する図面中に
示され、或は添付されている請求事項中に定義されてい
る全ての内容は例証として解釈され、限定する意味では
ないことを意図している。
発明の範囲と精神とから逸脱することなく、作ることが
出来るから、前記の説明中に含まれ、付随する図面中に
示され、或は添付されている請求事項中に定義されてい
る全ての内容は例証として解釈され、限定する意味では
ないことを意図している。
【０１６３】本発明を更に説明し、種々な態様を通じて
理解を助けるために呈示した添付の図において、図は、
本発明に従い、説明のように調製された種々な水性試薬
組成物または希釈剤或はそれらの改良された試薬を、自
働血液学分析機の電子−光学的検出装置を用いて白血細
胞分画測定のペルオキシダーゼ法に利用した場合に得ら
れるサイトグラムを描写している。図１Ａに描写されて
いる数字の表示はサイトグラムの違った領域を確認する
のに役立つものであり、各図において同一である。示し
ている様に、数字１はリンパ球母集団の領域、数字２は
単核細胞母集団の領域、数字３は好中球母集団の領域を
示し、数字４は好酸球母集団を示し、数字５は血小板お
よび赤色細胞幻影から起る根源ノイズの領域を示し、数
字６はＬＵＣ母集団の領域を示す。
理解を助けるために呈示した添付の図において、図は、
本発明に従い、説明のように調製された種々な水性試薬
組成物または希釈剤或はそれらの改良された試薬を、自
働血液学分析機の電子−光学的検出装置を用いて白血細
胞分画測定のペルオキシダーゼ法に利用した場合に得ら
れるサイトグラムを描写している。図１Ａに描写されて
いる数字の表示はサイトグラムの違った領域を確認する
のに役立つものであり、各図において同一である。示し
ている様に、数字１はリンパ球母集団の領域、数字２は
単核細胞母集団の領域、数字３は好中球母集団の領域を
示し、数字４は好酸球母集団を示し、数字５は血小板お
よび赤色細胞幻影から起る根源ノイズの領域を示し、数
字６はＬＵＣ母集団の領域を示す。
【０１６４】図１Ａ−１Ｄはイオン性界面活性剤のみを
含有するように処方されたペルオキシダーゼＲ１試薬組
成物を用いる、白血細胞分画のＰｘ法の実行が受入れら
れる結果を与えるかどうかを試験するために行った実験
結果を表わす。Ｐｘ法は更に、すすぎ液が非イオン性界
面活性剤がないかあるいは非溶血性界面活性剤Pluronic
を持つか何れかに処方されている、すすぎサイクルも含
んでいる。図１Ａは Day１血液試料で行われたＰｘ法の
結果を描写しているサイトグラムである。図１Ａで用い
られたＲ１試薬組成物はＳＤＳ（硫酸ドデシルナトリウ
ム）０．１０５g/L 含有し、図１Ａで用いられたすすぎ
試薬溶液はBrijTM３５ ３．０g/L とＳＤＳ ２．０g/
L を含有した。図１Ｂは Day２血液試料で行われたＰｘ
法の結果を示すサイトグラムである。図１Ｂに用いられ
たＲ１試薬組成物はＳＤＳ ０．１０５g/L 含有し、図
１Ｂで用いられたすすぎ試薬溶液はBrijTM３５ ３．０
g/L とＳＤＳ ２．０g/L を含有した。図１Ｃは Day２
血液試料について行われた結果を示すサイトグラムであ
る。図１Ｃに用いられたＲ１試薬組成物はＳＤＳ０．１
０５g/L を含有した。図１Ａと１Ｂとに対して、図１Ｃ
に用いられた、すすぎ試薬溶液は、リン酸塩緩衝の食塩
水中非溶血性界面活性剤Pluronic１０５１．０g/L 含有
した（表２参照）。図１Ｄは Day２血液試料について行
ったＰｘ法の結果を示すサイトグラムである。図１Ｃと
同様に、図１Ｄ中で用いたＰｘ試薬組成物はＳＤＳを含
有するが、より高濃度即ち０．１７g/L のＳＤＳであっ
た。そのすすぎ液は図１Ｃについて説明したものと同一
であった。図１Ａ−１Ｄの結果は、ＳＤＳのみを持つＲ
１試薬組成物と、イオン性界面活性剤ＳＤＳおよび非イ
オン性界面活性剤BrijTM３５両者を持つすすぎ試薬とを
用いて行った、 Day１試料分析の受入れられる結果（図
１Ａ）と比較して、ＳＤＳのみを含有するよう処方され
たＲ１試薬組成物と図１Ａで用いたと同じすすぎサイク
ル溶液とを用いて実行した Day２血液試料分析は、受入
れられる根源ノイズを与えることを示している。対照的
に、もしすすぎ液がPluronicＰ１０５界面活性剤のみを
含有していると（図１Ｃと１Ｄ）、サイトグラムは受入
れられない水準の根源ノイズを示す。図１Ｃと１Ｄとは
Ｐｘ試薬組成物中の唯一つのイオン性界面活性剤は、す
すぎ液が非イオン性界面活性剤例えばBrijTM３５を含有
していない場合、Ｐｘ法からの受入れられ、有用な結果
を得るのには不充分である。本発明者が測定した如く、
図１Ｃと１Ｄとに示されている、 Day２血液試料の受入
れられない結果はＲ１試料組成物中における非イオン性
界面活性剤の欠除に帰すことができる。
含有するように処方されたペルオキシダーゼＲ１試薬組
成物を用いる、白血細胞分画のＰｘ法の実行が受入れら
れる結果を与えるかどうかを試験するために行った実験
結果を表わす。Ｐｘ法は更に、すすぎ液が非イオン性界
面活性剤がないかあるいは非溶血性界面活性剤Pluronic
を持つか何れかに処方されている、すすぎサイクルも含
んでいる。図１Ａは Day１血液試料で行われたＰｘ法の
結果を描写しているサイトグラムである。図１Ａで用い
られたＲ１試薬組成物はＳＤＳ（硫酸ドデシルナトリウ
ム）０．１０５g/L 含有し、図１Ａで用いられたすすぎ
試薬溶液はBrijTM３５ ３．０g/L とＳＤＳ ２．０g/
L を含有した。図１Ｂは Day２血液試料で行われたＰｘ
法の結果を示すサイトグラムである。図１Ｂに用いられ
たＲ１試薬組成物はＳＤＳ ０．１０５g/L 含有し、図
１Ｂで用いられたすすぎ試薬溶液はBrijTM３５ ３．０
g/L とＳＤＳ ２．０g/L を含有した。図１Ｃは Day２
血液試料について行われた結果を示すサイトグラムであ
る。図１Ｃに用いられたＲ１試薬組成物はＳＤＳ０．１
０５g/L を含有した。図１Ａと１Ｂとに対して、図１Ｃ
に用いられた、すすぎ試薬溶液は、リン酸塩緩衝の食塩
水中非溶血性界面活性剤Pluronic１０５１．０g/L 含有
した（表２参照）。図１Ｄは Day２血液試料について行
ったＰｘ法の結果を示すサイトグラムである。図１Ｃと
同様に、図１Ｄ中で用いたＰｘ試薬組成物はＳＤＳを含
有するが、より高濃度即ち０．１７g/L のＳＤＳであっ
た。そのすすぎ液は図１Ｃについて説明したものと同一
であった。図１Ａ−１Ｄの結果は、ＳＤＳのみを持つＲ
１試薬組成物と、イオン性界面活性剤ＳＤＳおよび非イ
オン性界面活性剤BrijTM３５両者を持つすすぎ試薬とを
用いて行った、 Day１試料分析の受入れられる結果（図
１Ａ）と比較して、ＳＤＳのみを含有するよう処方され
たＲ１試薬組成物と図１Ａで用いたと同じすすぎサイク
ル溶液とを用いて実行した Day２血液試料分析は、受入
れられる根源ノイズを与えることを示している。対照的
に、もしすすぎ液がPluronicＰ１０５界面活性剤のみを
含有していると（図１Ｃと１Ｄ）、サイトグラムは受入
れられない水準の根源ノイズを示す。図１Ｃと１Ｄとは
Ｐｘ試薬組成物中の唯一つのイオン性界面活性剤は、す
すぎ液が非イオン性界面活性剤例えばBrijTM３５を含有
していない場合、Ｐｘ法からの受入れられ、有用な結果
を得るのには不充分である。本発明者が測定した如く、
図１Ｃと１Ｄとに示されている、 Day２血液試料の受入
れられない結果はＲ１試料組成物中における非イオン性
界面活性剤の欠除に帰すことができる。
【０１６５】図２Ａ−２Ｊは、いろいろ変えた濃度の非
イオン性界面活性剤のみを含有するように処方されたＲ
１試薬組成物を用いるＰｘ法の実行が受入れられるデー
タおよび結果を与えるかどうかを試験するために行った
実験結果を示している。示されるように図２Ａ−２Ｅは
Day１血液試料で行ったＰｘ法の結果を描写するサイト
グラムであり、図２Ｆ−２Ｊは Day２血液試料で行った
Ｐｘ法の結果を描写するサイトグラムである。図２Ａと
２Ｆとに用いたＰｘＲ１試薬組成物は、BrijTM３５
０．１２g/L とＳＤＳ ０．１０５g/L とを含有し、 D
ay１と Day２血液試料分析とに関し、対照として役立
つ。図２Ｂ−２Ｅおよび図２Ｇ−２Ｊ中に用いられるＰ
ｘＲ１試験試薬組成物は非イオン性界面活性剤（即ち、
０．０g/L ＳＤＳ）を含有する。この試験組成物は非イ
オン性界面活性剤BrijTM３５を次の量含有する。図２Ｂ
と２ＧはBrijTM３５ ０．０g/L 含有し、図Ｃと２Ｈと
はBrijTM３５ ０．１４g/L を含有し、図２Ｄと２Ｉと
はBrijTM３５ ０．２８g/L を含有し、図２Ｅと２Ｊと
はBrijTM３５ ０．４２g/L 含有する。図２Ａ−２Ｊ中
に示す如く、受入れられないサイトグラムはＰｘＲ１試
薬組成物中唯非イオン性界面活性剤を用いるＰｘ法の実
行から得られる。それ故、非イオン性界面活性剤のみで
は、Ｐｘ法から受入れられる結果を得るには充分でな
い。
イオン性界面活性剤のみを含有するように処方されたＲ
１試薬組成物を用いるＰｘ法の実行が受入れられるデー
タおよび結果を与えるかどうかを試験するために行った
実験結果を示している。示されるように図２Ａ−２Ｅは
Day１血液試料で行ったＰｘ法の結果を描写するサイト
グラムであり、図２Ｆ−２Ｊは Day２血液試料で行った
Ｐｘ法の結果を描写するサイトグラムである。図２Ａと
２Ｆとに用いたＰｘＲ１試薬組成物は、BrijTM３５
０．１２g/L とＳＤＳ ０．１０５g/L とを含有し、 D
ay１と Day２血液試料分析とに関し、対照として役立
つ。図２Ｂ−２Ｅおよび図２Ｇ−２Ｊ中に用いられるＰ
ｘＲ１試験試薬組成物は非イオン性界面活性剤（即ち、
０．０g/L ＳＤＳ）を含有する。この試験組成物は非イ
オン性界面活性剤BrijTM３５を次の量含有する。図２Ｂ
と２ＧはBrijTM３５ ０．０g/L 含有し、図Ｃと２Ｈと
はBrijTM３５ ０．１４g/L を含有し、図２Ｄと２Ｉと
はBrijTM３５ ０．２８g/L を含有し、図２Ｅと２Ｊと
はBrijTM３５ ０．４２g/L 含有する。図２Ａ−２Ｊ中
に示す如く、受入れられないサイトグラムはＰｘＲ１試
薬組成物中唯非イオン性界面活性剤を用いるＰｘ法の実
行から得られる。それ故、非イオン性界面活性剤のみで
は、Ｐｘ法から受入れられる結果を得るには充分でな
い。
【０１６６】図３Ａ−３Ｄは、すすぎサイクルを含み、
非イオン性界面活性剤とイオン性界面活性剤と両者を共
に含有するよう処方されているＰｘＲ１試薬組成物を用
いるＰｘ法の実行が受入れられるデータと結果とを、特
に Day２血液試料を用いる分析で与えるかどうかを試験
するために実行した実験結果を示す。示されるように、
図３Ａと３Ｂとは、BrijTM３５ ０．０g/L とＳＤＳ
０．１０５g/L とを包含するＰｘＲ１試薬組成物を用い
る、 Day１血液試料について行ったＰｘ法の結果を描写
するサイトグラムである。図３Ａに示す分析に用いたす
すぎ溶液はBrijTM３５ ３．０g/L とＳＤＳ ２．０g/
L とを包含する。図３Ｂに示す分析に用いたすすぎ溶液
はBrijTM３５ ０．０g/L とＳＤＳ ２．０g/L とを包
含する。図３Ｃは、BrijTM３５ ０．０g/L とＳＤＳ
０．１０５g/L とを含有するＰｘＲ１試薬組成物および
BrijTM３５ ０．０g/L とＳＤＳ ２．０g/L を包含す
るすすぎサイクル試薬とを用いる、 Day２血液試料につ
いて行ったＰｘ法の結果を描写するサイトグラムであ
る。図３Ｄは、 Day２血液試料と、BrijTM３５ ０．１
２g/L およびＳＤＳ ０．１０５g/L の両者を包含する
ＰｘＲ１試薬組成物と、ＳＤＳもBrijTM３５も含有せ
ず、非溶血性界面活性剤PluronicＰ１０５を含有する新
たに開示されたすすぎ試薬溶液を用いたＰｘ法の実行結
果を描写するサイトグラムである。図３Ａ−３Ｄの結果
は、 Day２血液試料の分析から得られるサイトグラムの
完全性（integrity)は、すすぎ溶液がBrijTM３５を含有
していない場合、Ｒ１試薬組成物中のイオン性界面活性
剤に加えて非イオン性界面活性剤の包含が必要であるこ
とを示している。
非イオン性界面活性剤とイオン性界面活性剤と両者を共
に含有するよう処方されているＰｘＲ１試薬組成物を用
いるＰｘ法の実行が受入れられるデータと結果とを、特
に Day２血液試料を用いる分析で与えるかどうかを試験
するために実行した実験結果を示す。示されるように、
図３Ａと３Ｂとは、BrijTM３５ ０．０g/L とＳＤＳ
０．１０５g/L とを包含するＰｘＲ１試薬組成物を用い
る、 Day１血液試料について行ったＰｘ法の結果を描写
するサイトグラムである。図３Ａに示す分析に用いたす
すぎ溶液はBrijTM３５ ３．０g/L とＳＤＳ ２．０g/
L とを包含する。図３Ｂに示す分析に用いたすすぎ溶液
はBrijTM３５ ０．０g/L とＳＤＳ ２．０g/L とを包
含する。図３Ｃは、BrijTM３５ ０．０g/L とＳＤＳ
０．１０５g/L とを含有するＰｘＲ１試薬組成物および
BrijTM３５ ０．０g/L とＳＤＳ ２．０g/L を包含す
るすすぎサイクル試薬とを用いる、 Day２血液試料につ
いて行ったＰｘ法の結果を描写するサイトグラムであ
る。図３Ｄは、 Day２血液試料と、BrijTM３５ ０．１
２g/L およびＳＤＳ ０．１０５g/L の両者を包含する
ＰｘＲ１試薬組成物と、ＳＤＳもBrijTM３５も含有せ
ず、非溶血性界面活性剤PluronicＰ１０５を含有する新
たに開示されたすすぎ試薬溶液を用いたＰｘ法の実行結
果を描写するサイトグラムである。図３Ａ−３Ｄの結果
は、 Day２血液試料の分析から得られるサイトグラムの
完全性（integrity)は、すすぎ溶液がBrijTM３５を含有
していない場合、Ｒ１試薬組成物中のイオン性界面活性
剤に加えて非イオン性界面活性剤の包含が必要であるこ
とを示している。
【０１６７】図４Ａ−４Ｆは発明のペルオキシダーゼ法
における種々なすすぎ液残余の影響を決定するために、
全血試料について実行した実験結果を描写するサイトグ
ラムである（実施例５）。図４Ａ−４Ｆに示した実験に
用いたＰｘＲ１試薬組成物はＳＤＳ ０．１０５g/L 含
有する。すすぎサイクルに用いたすすぎ溶液の組成は、
すすぎ液がＳＤＳ ２．０g/L(図４Ａと４Ｃと４Ｅとに
示す如く）か、ＳＤＳ２．０g/L ＋BrijTM３５ ３．０
g/L(図４Ｂと４Ｄと４Ｆとに示す如く）か何れかを含有
するようにすすぎサイクルに用いるすすぎ溶液の組成が
異なる。図４Ａと４ＢとはＰｘ法で用いられるすすぎサ
イクルからのすすぎ液残余量約７．９μL のサイトグラ
ム結果を示す。図４Ｃと４ＤとはＰｘ法で用いられるす
すぎサイクルからのすすぎ液残余量約１０．１μL のサ
イトグラム結果を示す。図４Ｅと４Ｆとは、Ｐｘ法に用
いられるすすぎサイクルからのすすぎ液残余量約１３．
３μL のサイトグラム結果を示す。サイトグラムはすす
ぎ溶液中の非イオン性界面活性剤BrijTM３５の存在は、
もし残余量が約８．０μL を越えると受入れられない結
果を生ずることを示している。上記の図１Ａ〜図１Ｄは
まとめて図１として、同様に図２Ａ〜図２Ｊは図２とし
て、図３Ａ〜３Ｄは図３として、図４Ａ〜図４Ｆは図４
として、添付図面中に示してある。
における種々なすすぎ液残余の影響を決定するために、
全血試料について実行した実験結果を描写するサイトグ
ラムである（実施例５）。図４Ａ−４Ｆに示した実験に
用いたＰｘＲ１試薬組成物はＳＤＳ ０．１０５g/L 含
有する。すすぎサイクルに用いたすすぎ溶液の組成は、
すすぎ液がＳＤＳ ２．０g/L(図４Ａと４Ｃと４Ｅとに
示す如く）か、ＳＤＳ２．０g/L ＋BrijTM３５ ３．０
g/L(図４Ｂと４Ｄと４Ｆとに示す如く）か何れかを含有
するようにすすぎサイクルに用いるすすぎ溶液の組成が
異なる。図４Ａと４ＢとはＰｘ法で用いられるすすぎサ
イクルからのすすぎ液残余量約７．９μL のサイトグラ
ム結果を示す。図４Ｃと４ＤとはＰｘ法で用いられるす
すぎサイクルからのすすぎ液残余量約１０．１μL のサ
イトグラム結果を示す。図４Ｅと４Ｆとは、Ｐｘ法に用
いられるすすぎサイクルからのすすぎ液残余量約１３．
３μL のサイトグラム結果を示す。サイトグラムはすす
ぎ溶液中の非イオン性界面活性剤BrijTM３５の存在は、
もし残余量が約８．０μL を越えると受入れられない結
果を生ずることを示している。上記の図１Ａ〜図１Ｄは
まとめて図１として、同様に図２Ａ〜図２Ｊは図２とし
て、図３Ａ〜３Ｄは図３として、図４Ａ〜図４Ｆは図４
として、添付図面中に示してある。
【図１】イオン性界面活性剤を使った実験結果を示すサ
イトグラムである。
イトグラムである。
【図２】非イオン性界面活性剤を使った実験結果を示す
サイトグラムである。
サイトグラムである。
【図３】イオン性界面活性剤と非イオン性界面活性剤を
使った実験結果を示すサイトグラムである。
使った実験結果を示すサイトグラムである。
【図４】すすぎ液残余の影響を調べる実験結果を示すサ
イトグラムである。
イトグラムである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジァン、エフ、クレミンズ アメリカ合衆国カネティカット州06706、 ウォータベリ、パーディ・ロウド 199番
Claims (78)
- 【請求項１】 （ａ）血液試料と水性試薬組成物とを混
合して均一な反応混合物を形成させ、その試薬組成物は
（ｉ）赤血細胞は溶解してヘモグロビンを放出させる
が、その試料中の白血細胞母集団は溶解しない有効濃度
の非イオン性ポリエトキシラート界面活性剤と、（ｉ
ｉ）赤血細胞は溶解するが、その試料中の白血細胞母集
団は溶解しない有効濃度の陰イオン性または双性イオン
性類のイオン性界面活性剤と、（ｉｉｉ）白血細胞を化
学的に橋かけさせるが、その試料中の溶解性の赤血細胞
は橋かけしない有効濃度のホルムアルデヒドまたはパラ
ホルムアルデヒドと、（ｉｖ）その試料中のリンパ球の
検出性を増大させる有効濃度の糖または糖アルコール
と、（ｖ）その反応混合物の中性または中性に近いｐＨ
を約６．９〜７．６に保持するための緩衝剤または緩衝
剤混合物を含有し、（ｂ）その段階（ａ）の反応混合物
を約６０〜７５℃の温度に加熱し、それによって試料中
の赤血細胞を溶解し白血細胞を固定し、そして、（ｃ）
その反応混合物中の白血細胞の少くとも一部分を染色
し、その懸濁物中に染色された白血球母集団と染色され
てない白血球母集団とを生じさせ、その場合、前記水性
試薬混合物中における非イオン性界面活性剤とイオン性
界面活性剤との両者の存在が、新鮮血液試料および採血
後室温で少くとも約１日貯蔵した時間を置いた血液試料
に関し、正確で信頼性のある白血球分画計数結果を段階
（ｃ）の後に与える各段階を包含する、試料中の白血細
胞分集団の内因性ペルオキシダーゼ活性の測定に基く、
赤血細胞と白血細胞とを含有する新鮮または時間を置い
た全血試料についての白血細胞分画計数および分集団分
析のための改良された方法。 - 【請求項２】 段階（ａ）（ｉ）の非イオン性界面活性
剤が約９．３〜１７．５の親水性親油性比即ちＨＬＢ値
を持つ、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 非イオン性界面活性剤のＨＬＢ値が約
９．５〜１７．３である、請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 非イオン性界面活性剤のＨＬＢ値が約
９．７〜１６．９である請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 （ａ）血液試料と水性試薬組成物とを混
合して反応混合物を形成させ、その試薬組成物は（ｉ）
９．３〜１７．５の親水性親油性比即ちＨＬＢ値を持
ち、試料中の赤血細胞は溶解してヘモグロビンを放出さ
せるが、白血細胞母集団は溶解しない有効濃度で存在す
る非イオン性ポリエトキシラート界面活性剤と、（ｉ
ｉ）試料中赤血細胞は溶解させるが白血細胞は溶解しな
い有効濃度の、陰イオン性または双性イオン性類のイオ
ン性界面活性剤と、（ｉｉｉ）試料中白血細胞は化学的
に橋かけさせるが、溶解性の赤血細胞は橋かけさせない
有効濃度のホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒ
ドと、（ｉｖ）試料中のリンパ球の検出性を増大させる
有効量の糖または糖アルコールと、（ｖ）試薬混合物の
ｐＨを中性または中性に近いｐＨ約６．９〜７．６に維
持させる緩衝剤または緩衝剤混合物とを含有し、 （ｂ）段階（ａ）で調製されたその反応混合物を約６０
〜７５℃の温度に加熱し、それによって試料中の赤血細
胞を溶解し、白血細胞を固定し、そして （ｃ）その反応混合物中の少くとも一部分の白血細胞を
染色して、懸濁物中に染色された白血細胞母集団と染色
されていない白血球母集団とを生じさせ、その場合、水
性試薬混合物中における非イオン性界面活性剤とイオン
性界面活性剤との両者の存在が新鮮血液試料および採血
後室温で少くとも約１日貯蔵された、時間を置いた試料
に関し、正確で信頼性のある白血細胞分画計数結果を段
階（ｃ）の後に与える各段階を包含する、試料中の白血
球分集団の内因性ペルオキシダーゼ活性測定に基く、赤
血細胞と白血細胞とを含有する新鮮あるいは時間を置い
た全血試料に関する、白血細胞分画の計数と分集団分析
とのための改良された方法。 - 【請求項６】 段階（ａ）（ｉ）における非イオン性界
面活性剤のＨＬＢ値が約９．５〜１７．３である請求項
５に記載の方法。 - 【請求項７】 非イオン性界面活性剤のＨＬＢ値が約
９．７〜１６．９である、請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】 非イオン性ポリエトキシラート界面活性
剤を、ポリエチレングリコールにエーテル化された直鎖
脂肪族疎水物と、ポリエチレングリコールにエーテル化
された分枝鎖脂肪族または芳香族オクチルフェニル疎水
物と、ポリエチレングリコールにエーテル化された直鎖
脂肪族または芳香族ノニルフェニル疎水物と、ポリエチ
レングリコールにエーテル化された直鎖脂肪族とからな
る群から選択する、請求項１または５に記載の方法。 - 【請求項９】 非イオン性界面活性剤がポリエチレング
リコールにエーテル化されている直鎖脂肪族疎水物であ
る、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】 非イオン性界面活性剤がＢｒｉｊTM３
５である、請求項９に記載の方法。 - 【請求項１１】 非イオン性界面活性剤がポリエチレン
グリコールにエーテル化された分枝鎖脂肪族または芳香
族疎水物である、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１２】 非イオン性界面活性剤がＴｒｉｔｏｎ
ＸTM−１００である、請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１３】 非イオン性ポリエトキシラート界面活
性剤が段階（ａ）の水性試薬組成物中に約０．０９〜
０．２１ｇ／Ｌの量で存在する、請求項１または５に記
載の方法。 - 【請求項１４】 イオン性界面活性剤が陰イオン性類で
ある、請求項１または５に記載の方法。 - 【請求項１５】 陰イオン性界面活性剤が炭素原子約１
０〜１６個含有する硫酸アルキルのアルカリ金属塩を包
含する、請求項１４に記載の方法。 - 【請求項１６】 陰イオン性界面活性剤が硫酸ドデシル
アルカリ金属を包含する、請求項１５に記載の方法。 - 【請求項１７】 陰イオン性界面活性剤が硫酸ドデシル
ナトリウムである、請求項１６に記載の方法。 - 【請求項１８】 イオン性界面活性剤が双性イオン性類
である、請求項１または５に記載の方法。 - 【請求項１９】 双性イオン性界面活性剤がスルホベタ
インである、請求項１８に記載の方法。 - 【請求項２０】 スルホベタインがテトラデシルジメチ
ルアンモニオプロパンスルホナート（ＴＤＡＰＳ）また
はドデシルジメチル−アンモニオプロパンスルホナート
（ＤＤＡＰＳ）である、請求項１９に記載の方法。 - 【請求項２１】 双性イオン性界面活性剤がコール酸誘
導体である、請求項１８に記載の方法。 - 【請求項２２】 コール酸誘導体が３−［（３−コーラ
ミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ
−１−プロパンスルホナートである、請求項２１に記載
の方法。 - 【請求項２３】 陰イオン性または双性イオン性界面活
性剤が段階（ａ）の試薬溶液中約０．０５０〜０．１２
５ｇ／Ｌの量で存在する、請求項１４に記載の方法。 - 【請求項２４】 段階（ａ）の水性試薬組成物が更に多
価金属イオンのキレート剤を包含する、請求項１または
５に記載の方法。 - 【請求項２５】 多価金属イオンキレート剤が濃度約１
〜５ｍＭである、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ジナトリウムＥ
ＤＴＡまたはＥＧＴＡ、トリナトリウムＥＤＴＡまたは
ＥＧＴＡあるいはテトラナトリウムＥＤＴＡまたはＥＧ
ＴＡである請求項２４に記載の方法。 - 【請求項２６】 段階（ａ）の試薬組成物が更にアルカ
リ金属塩化物を包含している、請求項１または５に記載
の方法。 - 【請求項２７】 段階（ａ）の試薬組成物中のアルカリ
金属塩化物をＮａＣｌとＫＣｌとＬｉＣｌとからなる群
から選択する、請求項２６に記載の方法。 - 【請求項２８】 塩が試薬組成物中約６．８〜１０．３
ｍＭの量で存在するＮａＣｌである、請求項２７に記載
の方法。 - 【請求項２９】 ホルムアルデヒドは試薬組成物中に濃
度約５２〜５８ｇ／Ｌで存在する請求項１または５に記
載の方法。 - 【請求項３０】 緩衝剤または緩衝剤混合物が水性試薬
組成物のｐＨを約７．０〜７．４に維持する請求項１ま
たは５に記載の方法。 - 【請求項３１】 緩衝剤がＮａ2ＨＰＯ4とＮａＨ2ＰＯ4
との緩衝剤混合物を包含する、請求項１または５に記載
の方法。 - 【請求項３２】 染色段階がペルオキシダーゼ活性の白
血細胞の染色を含む、請求項１または５に記載の方法。 - 【請求項３３】 染色段階が反応混合物を過酸化水素及
び色原体と速に混合することを包含する、請求項３２に
記載の方法。 - 【請求項３４】 色原体が４−クロロ−１−ナフトール
である、請求項３３に記載の方法。 - 【請求項３５】 糖または糖アルコールを、スクロース
とフラクトースとデキストロースとソルビトールとマン
ニトールとより成る群から選択する、請求項１または５
に記載の方法。 - 【請求項３６】 糖アルコールがソルビトールである、
請求項３５に記載の方法。 - 【請求項３７】 ソルビトールが段階（ａ）の試薬組成
物中に約１１０〜１２０ｇ／Ｌの量で存在する、請求項
３６に記載の方法。 - 【請求項３８】 段階（ｃ）の、染色させた及び染色さ
れていない白血細胞の懸濁液を電子ー光学的検出システ
ムを通過させ、そしてその懸濁液中の白血細胞の白血細
胞分画を得る段階を更に包含する、請求項１または５に
記載の方法。 - 【請求項３９】 その段階を自働化血液学分析器の反応
室内で行う、請求項３８に記載の方法。 - 【請求項４０】 更に、分画法の段階（ａ）から（ｃ）
までを行った後、自働分析器のその室を、エチレンオキ
シドとプロピレンオキシドとの共重合物、好ましくは約
９５０〜４０００の分子量を有し、ポリオキシプロピレ
ン約９０〜２０％とポリオキシエチレン約１０〜８０％
を持つエチレンオキシドとプロピレンオキシドの共重合
物である非溶血性非イオン性界面活性剤を包含する水性
すすぎ試薬組成物ですすぐ段階（ｄ）を包含する、請求
項３９に記載の方法。 - 【請求項４１】 すすぎ組成物を包含する界面活性剤が
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ類の１つである、請求項４０に記載の
方法。 - 【請求項４２】 ＰｌｕｒｏｎｉｃがＰｌｕｒｏｎｉｃ
Ｐ１０５である、請求項４１に記載の方法。 - 【請求項４３】 すすぎ組成物が更に次の成分：ＮａＣ
ｌとＫＣｌとＬｉＣｌとからなる群から選択されるアル
カリ金属塩化物、Ｐｒｏｃｌｉｎ１５０とＰｒｏｃｌｉ
ｎ３００とＧｅｒｍａｌｌ １１５とＤｏｗａｃｉｌ
２００とＢｒｏｎｏｐｏｌとよりなる群から選択される
殺菌化合物、３，３´−ジチオプロプリオン酸と３，３
´−ジチオ酢酸とＴｒｏｌｏｘTMまたはビタミンＥ、Ｂ
ＨＴまたは２、６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチル
フフェノール、ＢＨＡまたは２−ｔｅｒｔ−ブチル−４
−メトキシフェノールとＭＥＨＱまたはρ−メトキシフ
ェノール、およびその水性すすぎ組成物のｐＨを約６．
９〜７．６に維持するための緩衝剤または緩衝剤混合物
の１つまたはそれ以上を包含する、請求項４０に記載の
方法。 - 【請求項４４】 水性すすぎ組成物が約２８５〜３０５
ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの浸透圧重量モル濃度を持つ、請求
項４０に記載の方法。 - 【請求項４５】 水性すすぎ組成物がＮａＣｌとＰｒｏ
ｃｌｉｎ１５０と３，３´−チオジプロプリオン酸とｐ
Ｈを約７．０〜７．５に維持するための緩衝剤または緩
衝剤混合物とを包含する、請求項４３に記載の方法。 - 【請求項４６】 水性すすぎ組成物中に、ＮａＣｌが濃
度約７．４０〜８．０ｇ／Ｌで存在し、Ｐｒｏｃｌｉｎ
１５０が濃度約０．２５〜０．６０ｍＬ／Ｌで存在し、
３，３´−チオジプロプリオン酸が濃度約５０〜１５０
ｍｇ／Ｌで存在する、請求項４５に記載の方法。 - 【請求項４７】 水性混合物中に （ａ）赤色細胞を溶解してヘモグロビンを放出させる
が、試料中の白血細胞母集団は溶解しない有効濃度の非
イオン性ポリエトキシラート界面活性剤と （ｂ）赤血細胞を溶解してヘモグロビンを放出させる
が、試料中の白血細胞母集団は溶解しない有効濃度の陰
イオン性または双生イオン性界面活性剤と （ｃ）試料中のリンパ球の検出性を増大する有効濃度の
糖または糖または糖アルコールと （ｄ）白血細胞は化学的に橋かけするが、試料中の溶解
性赤血細胞は橋かけしない有効濃度のホスムアルデヒド
またはパラホスムアルデヒドと （ｅ）試薬組成物のｐＨを約６．９〜７．６に維持する
ための緩衝剤または緩衝剤混合物とを包含する、全血試
料中の白血球の分集団中の内因性ペルオキシダーゼ活性
を測定することに基礎を置いた、全血試料中の白血球分
画の測定と分集団分析のための赤血細胞の溶解と白血球
の染色のための改良された試薬組成物。 - 【請求項４８】 非イオン性界面活性剤が親水性親油性
比即ちＨＬＢ値約９．３〜１７．３を持つ、請求項４７
に記載の組成物。 - 【請求項４９】 非イオン性界面活性剤のＨＬＢ値が約
９．７〜１６．９である、請求項４８に記載の組成物。 - 【請求項５０】 更に、多価金属イオンのキレート剤を
包含する請求項４７に記載の組成物。 - 【請求項５１】 水性混合物中に （ａ）親水性親油性比即ちＨＬＢ値約９．３〜１７．５
を持ち、赤色細胞を溶解してヘモグロビンを放出させる
が、試料中の白血細胞母集団は溶解しない有効濃度の非
イオン性ポリエトキシラート界面活性剤と、 （ｂ）赤血細胞を溶解してヘモグロビンを放出させる
が、試料中の白血細胞は溶解しない有効濃度の陰イオン
性または双性イオン性界面活性剤と、 （ｃ）試料中のリンパ球の検出性を増大させるに有効濃
度の糖または糖アルコールと、 （ｄ）白血細胞は化学的に橋するが、試料中の溶解性赤
血細胞は橋かけしない有効濃度のホルムアルデヒドまた
はパラホルムアルデヒドと、 （ｅ）試薬組成物のｐＨを約６．９〜７．６に維持する
ための緩衝剤または緩衝混合物とを包含する、血液試料
中の白血球分集団における内因性ペルオキシダーゼ活性
測定に基く、全血試料の白血球分画の測定と分集団分析
とのための、赤血細胞の溶解と白血球の染色とのための
改良された試薬組成物。 - 【請求項５２】 非イオン性ポリエトキシラート界面活
性剤を、ポリエチレングリコールにエーテル化されてい
る直鎖脂肪族疎水物と、ポリエチレングリコールにエー
テル化されている分枝鎖脂肪族または芳香族オクチルフ
ェニル疎水物と、ポリエチレングリコールにエーテル化
されている直鎖脂肪族または芳香族ノニル疎水物と、ポ
リエチレングリコールにエーテル化されている直鎖脂肪
酸とからなる群から選択する請求項４７または５１に記
載の組成物。 - 【請求項５３】 非イオン性界面活性剤がポリエチレン
グリコールにエーテル化されている直鎖脂肪族疎水物で
ある請求項５２に記載の組成物。 - 【請求項５４】 非イオン性界面活性剤がＢｒｉｊTM３
５である請求項５３に記載の組成物。 - 【請求項５５】 非イオン性界面活性剤がポリエチレン
グリコールにエーテル化されている分枝鎖脂肪族または
芳香族疎水物である請求項５２に記載の組成物。 - 【請求項５６】 非イオン性界面活性剤がＴｒｉｔｏｎ
ＸTM−１００である請求項５５に記載の組成物。 - 【請求項５７】 非イオン性界面活性剤がその組成物中
に約０．０９〜０．２０ｇ／Ｌの量で存在する、請求項
４７または５１に記載の組成物。 - 【請求項５８】 界面活性剤が陰イオン性界面活性剤で
ある、請求項４７または５１に記載の組成物。 - 【請求項５９】 陰イオン性界面活性剤が炭素原子約１
０〜１６個含有する硫酸アルキルのアルカリ金属塩を包
含する、請求項５８に記載の組成物。 - 【請求項６０】 陰イオン性界面活性剤が硫酸ドデシル
アルキル金属塩である請求項５９に記載の組成物。 - 【請求項６１】 陰イオン性界面活性剤が硫酸ドデシル
ナトリウムである請求項６０に記載の組成物。 - 【請求項６２】 界面活性剤が双性イオン界面活性剤で
ある、請求項４７または５１に記載の組成物。 - 【請求項６３】 双性イオン界面活性剤がスルホベタイ
ンである、請求項６２に記載の組成物。 - 【請求項６４】 スルホベタインがテトラデシルジメチ
ルアンモニオプロパンスルホナート（ＤＤＡＰＳ）また
はドデシルジメチル−アンモニオプロパンスルホナート
（ＤＤＡＰＳ）である、請求項６３に記載の組成物。 - 【請求項６５】 双性イオン界面活性剤がコール酸誘導
体である、請求項６２に記載の組成物。 - 【請求項６６】 コール酸誘導体が３−［（３−コーラ
ミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ
−１−プロパンスルホナートである請求項６５に記載の
組成物。 - 【請求項６７】 陰イオン性または双性イオン性界面活
性剤が組成物中約０．０５０〜０．１２５ｇ／Ｌの量で
存在する請求項４７または５１に記載の組成物。 - 【請求項６８】 更にアルカリ金属塩化物を包含する請
求項４７または５１に記載の組成物。 - 【請求項６９】 アルカリ金属塩化物をＮａＣｌとＫＣ
ｌとＬｉＣｌとからなる群から選択する請求項６８に記
載の組成物。 - 【請求項７０】 塩がＮａＣｌであり、試薬組成物中に
約６．８〜１０．３ｍＭの濃度で存在する請求項６９に
記載の組成物。 - 【請求項７１】 ホルムアルデヒドが組成物中約５２〜
５８ｇ／Ｌの濃度で存在する請求項４８または５１に記
載の組成物。 - 【請求項７２】 緩衝剤がＮａ2ＨＰＯ4とＮａＨ2ＰＯ4
との混合物を包含する請求項４８または５１に記載の組
成物。 - 【請求項７３】 糖または糖アルコールをスクロースと
フルクトースとデキストロースとソルビトールとマンニ
トールとからなる群から選択する請求項４７または５１
に記載の組成物。 - 【請求項７４】 糖アルコールがソルビトールである請
求項７３に記載の組成物。 - 【請求項７５】 ソルビトールが組成物中約１１０〜１
２０ｇ／Ｌの濃度で存在する請求項７４に記載の組成
物。 - 【請求項７６】 更に、多価金属イオンのキレート剤を
包含する請求項４７または５１に記載の組成物。 - 【請求項７７】 多価金属キレート剤がＥＤＴＡ、ＥＧ
ＴＡ、ジナトリウムＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ、トリナト
リウムＥＤＴＡまたはＥＧＴＡあるいはテトラナトリウ
ムＥＤＴＡまたはＥＧＴＡである請求項７６に記載の組
成物。 - 【請求項７８】 キレート剤がジナトリウムＥＤＴＡで
あり、約１〜５ｍＭの濃度で存在する請求項７７に記載
の組成物。
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