JP2015528691A - 細胞および/または組織を可溶化するための組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、アメリカ合衆国陸軍が認めた連邦認可番号W81XWH−06−01−00400に基づき政府支援を受けて成された。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
皮膚は、身体に通じる「窓」である。皮膚は、いくつかの理由によって、身体器官のうちでも独特のものである。すなわち(1)皮膚はヒト身体のうちで最大の器官であり;(2)皮膚は環境に直接曝露されており;(3)皮膚は優れた排出器官であり;(4)皮膚は身体のうちで最も視認可能かつアクセス可能な器官であり;かつ(5)皮膚は身体の高度に活性な免疫器官である。
一実施形態では、
下式:
を含む双性イオン性界面活性剤と;
下式:
H(CH2)aO(CH2CH2O)bH
[式中、a=12または16、かつb=2、4、10、20、または23]
を含む非イオン性界面活性剤とを含む組成物を提供する。
一実施形態では、下式:
を含む双性イオン性界面活性剤と;
下式:
H(CH2)aO(CH2CH2O)bH
[式中、a=12または16、かつb=2、4、10、20、または23]
を含む非イオン性界面活性剤とを含む組成物を提供する。
実施例
物質
DPS、DDPS、TPS、HPS、およびOPSをSigma−Aldrichから、双性イオン性界面活性剤として入手した。Brij 35、Brij 52、Brij C10、およびBrij 58をSigma−Aldrichから、非イオン性界面活性剤として入手した。Brij 30はTCI Americaから入手した。すべての溶液は、0.25%w/v双性イオン性界面活性剤および0.25%w/v非イオン性界面活性剤(0.25%v/v B30)を0.5%w/vの全濃度でPBS(pH=7.4)に加えることによって調製した。陽性対照は、1%v/v Triton X−100(TX−1)をPBSに入れることによって調製した。
ブタ皮膚からのタンパク質回収
モデル組織としてのブタ皮膚から、タンパク質を回収した。皮膚は、Lampire Biological Laboratories Inc.から凍結形態で入手し、−70℃で貯蔵した。使用する2時間前に、皮膚を室温(RT)にて解凍し、小片(2.5cm×2.5cm)に切断した。皮膚片を皮下脂質から剥がし、目に見える引っ掻き傷または擦傷を伴うことなく使用した。皮膚片をフランツ型拡散セル(FDC)アセンブリ(1.77cm2の組織曝露面積;Permegear)に載せることによって、タンパク質回収を実施した。FDCのレシーバーチャンバーにはPBSを装入し、ドナーチャンバーには試料採取緩衝液としての界面活性剤組合せ1mLを装入した。この緩衝液は他にも、超音波振動子と組織との間のカップリング流体として作用した。タンパク質回収を、20kHzの周波数で作動する600Wプローブ音波発生装置(Sonics & Materials)を用いて室温にて行った。超音波振動子を組織表面から5mmの距離に置き、50%デューティサイクルにて2.4W/cm2の超音波強度を3分間適用した。こうして可溶化された組織成分を含有することとなった試料採取緩衝液を吸引し、分析するまで-70℃にて維持した。
濃度依存性
TPS:Brij C10を濃度の作用について調査した。界面活性剤の濃度を1:1の比のTPS:Brij C10の0.5%、1%、および2%の全濃度で試験した。図3は、ブタ皮膚からの可溶性タンパク質および全タンパク質抽出有効性に対するTPS:Brij C10の濃度依存性を示している。
酵素保護
ウサギ由来のGAPDHをSigma−Aldrichから、モデル酵素として入手した。GAPDH粉末をddH2O(Milipore)に90U/mlまで溶かし、E管に分配し、次いで、-80℃にて貯蔵した。酵素保護を、本明細書において開示する各組合せ中でGAPDHをインキュベートすることによって実施し、陽性対照としてのPBS中での場合と比較した。GAPDHの濃度は0.5U/mlに固定した。GAPDHを37℃で10分間インキュベートした。GAPDH酵素の活性を(U/ml)、KDalert(商標)GAPDH Assay Kit(Ambion,Inc、TX、USA)によって評価した。図4は、双性イオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤の様々な組合せそれぞれにおいて保存されたGAPDHの活性をグラフの形態で示している。
細胞可溶化
HEK細胞(HEKa−APF、Invitrogen、CA、USA)を、Vent Cap(75cm2 Rectangular Canted Neck、Corning)を備えたCorning(登録商標)細胞培養処理フラスコ中で培養した。ヒト角質細胞成長サプリメントによって添加された60μMカルシウムを含むEpiLife(登録商標)Medium中で、HEK細胞を3〜8継代増殖させた。図6は、DPS:Brij 30、TPS:Brij C10、HPS:Brij 52、OPS:Brij 52、OPS:Brij C10、およびOPS:Brij 58を使用した場合の、t=0時間目(中黒の棒)、4℃にてt=4時間目(斜線模様の棒)、および室温にてt=4時間目(直交線模様の棒)のHEK細胞からの全タンパク質回収量を、TX-1と比較して示している。
インビトロアッセイ
可溶化された細胞中の全タンパク質を、Micro BCA Protein Assay Kit(Fisher Scientific、PA、USA)を使用して分析した。トリプシン処理した細胞を血球計算板(Fisher Scientific、PA、USA)でカウントし、96ウェルプレートに加えた。一晩成長させた後に、培地を除去し、溶解剤(TX−1、DPS:Brij 30、TPS:Brij C10、HPS:Brij 52、OPS:Brij 52、OPS:Brij C10、およびOPS:Brij 58)100μlに交換した。図7は、それら同じ試薬中で可溶化されたHEK細胞において、t=0目(中黒の棒)、4℃にてt=4時間目(斜線模様の棒)、および室温にてt=4時間目(直交線模様の棒)に測定されたGAPDH活性を示している。
組織可溶化
安楽死させたマウスから皮膚組織を収集し、使用するまで−80℃で貯蔵した。各組織約10mgを2ml管に入れた。冷却した溶解緩衝液(TX−1、TPS:Brij C10、HPS:Brij 52、およびOPS:Brij C10)400μlおよびプロテアーゼ阻害薬カクテル錠剤(Roche Applied Science、IN、USA)を管に加えた(50mlあたり錠剤1個;錠剤1個はアンチパイン塩酸塩3mg、アプロチニン0.5mg、ベスタチン0.5mg、キモスタチン1mg、E−64 3mg、EDTA−Na210mg、ロイペプチン0.5mg、Pefabloc SC20mg、ペプスタチン0.5mg、およびホスホラミドン3mgを含有する)。ホモジナイザー(IKA、NC、USA)を13,000rpmで1分間使用して、組織を均質化した。図9は、TPS:Brij C10、HPS:Brij 52、およびOPS:Brij C10を使用した場合に、均質化したマウス皮膚から回収された全タンパク質をTX−1の場合と比較して示している。図10は、均質化したマウス皮膚において測定された特異的GAPDH活性を示している。
Claims (30)
- nが12であり、aが16であり、かつbが10である、請求項1に記載の組成物。
- nが14であり、aが12であり、かつbが4である、請求項1に記載の組成物。
- nが14であり、aが16であり、かつbが2である、請求項1に記載の組成物。
- nが14であり、aが16であり、かつbが10である、請求項1に記載の組成物。
- nが16であり、aが12であり、かつbが4である、請求項1に記載の組成物。
- nが16であり、aが16であり、かつbが2である、請求項1に記載の組成物。
- nが16であり、aが16であり、かつbが10である、請求項1に記載の組成物。
- nが18であり、aが12であり、かつbが4である、請求項1に記載の組成物。
- nが18であり、aが16であり、かつbが2である、請求項1に記載の組成物。
- nが18であり、aが16であり、かつbが10である、請求項1に記載の組成物。
- nが18であり、aが16であり、かつbが20である、請求項1に記載の組成物。
- 前記組成物が、緩衝液中で約7.0よりも塩基性のpHを有する、請求項1に記載の組成物。
- 前記組成物が緩衝液中で約7.0〜約9.0のpHを有する、請求項1に記載の組成物。
- 対象の可溶化された領域の少なくとも一部を除去して、前記皮膚上に曝露面を残すことと、
前記曝露面に、治療用組成物および化粧用組成物の少なくとも1種を適用することと
をさらに含む、請求項15に記載の方法。 - 前記適用が、前記曝露面に、DNAをベースとする薬物、RNAをベースとする薬物、タンパク質をベースとする薬物、ペプチドをベースとする薬物、脂質をベースとする薬物、炭水化物をベースとする薬物、小分子薬物、ナノ粒子をベースとする薬物、およびリポソーム封入薬物のうちの少なくとも1種を含む治療用組成物を適用することを含む、請求項16に記載の方法。
- 前記適用が、前記曝露面に、エラスチン、エラスチンをベースとするペプチド、コラーゲン、コラーゲンをベースとするペプチド、レスベラトロール、イデベノン、コエンザイムQ10、アセチルヘキサペプチド−3、グリコサミノグリカン、パルミトイルペンタペプチド−4、ヒアルロン酸ナトリウム、およびそれらの組合せのうちの少なくとも1種を含む化粧用組成物を適用することを含む、請求項16に記載の方法。
- 粘膜、皮膚、または他の組織から分析物を回収するための方法であって、
少なくとも1種の分析物を含有する前記粘膜、皮膚、または他の組織上の対象領域に、エネルギーを適用することと、
前記領域を、下式:
を含む双性イオン性界面活性剤と、
下式:
H(CH2)aO(CH2CH2O)bH
[式中、aは12および16から選択され、かつbは2、4、10、20、または23から選択されるが、
ただし、nが10である場合、aおよびbは同時にそれぞれ12および4ではないことを条件とする]
を含む非イオン性界面活性剤と
を含む組織可溶化組成物と接触させて、それによって、少なくとも1種の分析物を含有する粘膜、皮膚、または他の組織の少なくとも一部を可溶化することと、
前記可溶化された粘膜、皮膚、および他の組織から、前記少なくとも1種の分析物を収集することとを含む方法。 - 前記分析物がタンパク質を含む、請求項19に記載の方法。
- 前記分析物が癌バイオマーカーを含む、請求項19に記載の方法。
- 前記分析物が抗体を含む、請求項19に記載の方法。
- 前記分析物がペプチドを含む、請求項19に記載の方法。
- 前記分析物が脂質を含む、請求項19に記載の方法。
- 前記分析物が核酸を含む、請求項19に記載の方法。
- 前記分析物が小分子を含む、請求項19に記載の方法。
- 前記分析物が微生物を含む、請求項19に記載の方法。
- 前記分析物が兵器剤を含む、請求項19に記載の方法。
- 前記分析物が環境汚染物質を含む、請求項19に記載の方法。
- 前記分析物が薬物を含む、請求項19に記載の方法。
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