BE1021926B1

BE1021926B1 - Werkijze voor semenanalyse

Info

Publication number: BE1021926B1
Application number: BE2014/0221A
Authority: BE
Inventors: Sven Comhaire; Björn Comhaire; Frank Eertmans; Veerle Bogaert
Original assignee: FertiPro N.V.
Priority date: 2014-04-01
Filing date: 2014-04-01
Publication date: 2016-01-27
Also published as: WO2015150423A1

Abstract

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op werkwijzen voor het detecteren van leukocyten in zaadmonsters, en op een kit voor het uitvoeren van deze werkwijzen. De werkwijzen omvatten het kleuren van leukocyten op basis van peroxidase- activiteit.

Description

WERKWIJZE VOOR SEMENANALYSE

TECHNISCH VELD

De onderhavige aanvraag heeft betrekking op werkwijzen voor het detecteren van leukocyten in zaadmonsters, en op instrumenten voor het uitvoeren van deze werkwijze.

ACHTERGROND

Semenanalyse is een belangrijk middel om zicht te krijgen op de vruchtbaarheid van de man. Traditionele parameters bij semenanalyse omvatten concentratie, motiliteit, en/of morfologie van de zaadcellen in het ejaculaat.

Een verdere parameter is het aantal witte bloedcellen (leukocyten) aanwezig in het ejaculaat. De leukocyten die het myeloperoxidase enzym bevatten kunnen zorgen voor de vorming van reactieve zuurstofverbindingen (reactive oxygen species of ROS) die membraanschade veroorzaken bij de zaadcellen. De aanwezigheid van meer dan één miljoen witte bloedcellen per ml ejaculaat wordt als abnormaal beschouwd en aangeduid met de term “leukocytospermie”. Hoewel leukocytospermie geen absolute indicatie is voor infertiliteit, wordt deze aandoening gemiddeld vastgesteld bij tussen 10 tot 20% van alle onvruchtbare mannen.

Zaadmonsters bevatten naast zaadcellen en witte bloedcellen doorgaans ook andere soorten (ronde) cellen zoals spermatogenetische precursorcellen.

Een relatief snelle en goedkope werkwijze om de witte bloedcellen te differentiëren van andere cellen in een zaadmonster maakt gebruik van de inherente peroxidase-activiteit van bepaalde witte bloedcellen. Inderdaad, de meeste witte bloedcellen in zaadmonsters zijn granulocyten, meer bepaald peroxidase bevattende neutrofiele granulocyten. Dit laat dus toe de ronde cellen te differentiëren op basis van peroxidase-activiteit.

In een dergelijke werkwijze worden de zaadcellen typisch in contact gebracht/blootgesteld aan/gemengd met een oplossing die peroxide en ortho-toluidine bevat. In aanwezigheid van peroxide en peroxidase vormt ortho-toluidine een gekleurd precipitaat, wat zorgt voor een kleuring van de leukocyten. Als alternatief voor ortho-toluidine wordt ook benzidine gebruikt. Ortho-toluidine en benzidine zijn echter carcinogene verbindingen, zodat bovenstaande methodes een risico inhouden voor de personen die de analyse uitvoeren. Er is dus nood aan verbeterde werkwijzen voor het screenen van zaadmonsters op de (verhoogde) aanwezigheid van witte bloedcellen.

SAMENVATTING

Hierin beschreven zijn werkwijzen voor het detecteren van witte bloedcellen in zaadmonsters, meer bepaald werkwijzen voor het screenen van zaadmonsters voor een verhoogde aanwezigheid van witte bloedcellen, die geen gebruik van carcinogene verbindingen, zoals ortho-toluidine en benzidine, vereisen, maar toch een betrouwbare detectie garanderen. 4-chloro-1-naphthol (4-CN) is een niet-carcinogene verbinding die wordt gebruikt als substraat voor peroxidase in immunologische detectiemethoden. Het gebruik van deze verbinding leidt echter tot een lage gevoeligheid in vergelijking met andere (carcinogene) substraten zoals benzidine. De onderhavige uitvinders hebben vastgesteld dat 4-chloro-1-naphthol echter verrassend goed geschikt is voor het detecteren van witte bloedcellen in zaadmonsters.

In een eerste aspect voorziet de onderhavige uitvinding in werkwijzen voor het detecteren van witte bloedcellen in een zaadmonster, die het gebruik van 4-CN omvatten. In meer bepaalde uitvoeringen omvatten deze werkwijzen een stap waarin de gefixeerde zaadcellen in contact worden gebracht met 4-CN en een peroxide verbinding waarna de leukocyten kunnen worden gedetecteerd. In verdere uitvoeringsvormen omvatten de werkwijzen de fixatie van cellen in het zaadmonster op een vaste drager en het contacteren van de op de vaste drager gefixeerde cellen met 4-CN en een peroxideverbinding.

Meer bepaald voorziet de onderhavige uitvinding in werkwijzen voor het detecteren van leukocyten in een zaadmonster, omvattend de fixatie van cellen in het zaadmonster; de kleuring door het contacteren van de cellen met 4-chloronaphthol (4-CN) en een peroxideverbinding; en het detecteren van leukocyten op basis van hun kleuring.

In bepaalde uitvoeringsvormen van de werkwijzen omvat de stap van de kleuring het contacteren van de cellen met een kleuroplossing die 4-CN bevat in een concentratie van 0,05mM tot 2,0mM.

In zekere uitvoeringsvormen bevat de kleuroplossing waterstofperoxide in een concentratie tussen 0,05 mM en 5,0 mM.

In bepaalde uitvoeringsvormen omvat de fixatie-oplossing één of meerdere verbindingen gekozen uit de lijst bestaande uit formaldehyde, ethanol, methanol, aceton, een dialdehyde fixatief, en propyleen glycol.

In bepaalde uitvoeringsvormen gebeurt de detectie via microscopie. In zekere uitvoeringsvormen omvat stap van fixatie van de cellen het aanbrengen van een vloeibaar zaadmonster op een vaste drager; optioneel, het uitsmeren van het zaadmonster over ten minste een deel van het oppervlak van de vaste drager; het drogen van het zaadmonster; het incuberen van het gedroogde zaadmonster met een fixatie-oplossing, daarbij verkrijgend een gefixeerd zaadmonster; en optioneel, het wassen van het gefixeerde zaadmonster.

In bepaalde uitvoeringsvormen wordt het zaadmonster aangebracht op een vaste drager voor detectie van de leukocyten. In verdere uitvoeringsvormen is de vaste drager een glasplaat.

In zekere uitvoeringsvormen omvat de werkwijze voor de detectie van leukocyten in een zaadmonster de fixatie van cellen in het zaadmonster op een vaste drager; het in contact brengen van de op de vaste drager gefixeerde cellen met 4-chloronaphthol (4-CN) en een peroxideverbinding; en het detecteren van leukocyten op de vaste drager op basis van hun kleuring.

In bepaalde uitvoeringsvormen omvat de werkwijze een bijkomende stap waarin de cellen aan een contrastkleurstof worden blootgesteld. In verdere uitvoeringsvormen omvat de contrastkleurstof Rose Bengal en/of Neutral Red.

In zekere uitvoeringsvormen is de hierin beschreven werkwijze een werkwijze voor het bepalen van de vruchtbaarheid van het zaadmonster.

De onderhavige uitvinding voorziet verder in werkwijzen voor de voorbereiding van een zaadmonster, waarbij de werkwijzen voorzien in de fixatie van cellen in het zaadmonster op een vaste drager; het in contact brengen van de op de vaste drager gefixeerde cellen met een kleuroplossing bevattend 4-chloronaphthol (4-CN) en een peroxideverbinding, daarbij verkrijgend een gekleurd staal; en optioneel, het blootstellen van de gekleurde cellen aan een contrastkleurstof.

De onderhavige uitvinding voorziet verder in kits voor het uitvoeren van de hierin beschreven werkwijzen voor het detecteren van leukocyten, omvattend een fixatie-oplossing, 4-CN, een oplossing bevattend een peroxideverbinding en optioneel een contrastkleurstof.

In bepaalde uitvoeringsvormen van de kit is de peroxideverbinding waterstofperoxide.

In zekere uitvoeringsvormen omvat de kit verder een vaste drager.

BESCHRIJVING VAN DE UITVINDING

Zoals verder gebruikt in deze tekst omvatten de enkelvoudsvormen “een”, “de”, “het” zowel het enkelvoud als de meervoudsvorm tenzij de context duidelijk anders is.

De termen “omvatten”, “omvat” zoals verder gebruikt zijn synoniem met “inclusief’, “includeren” of “bevatten, “bevat” en zijn inclusief of open en sluiten bijkomende, niet vernoemde leden, elementen of methode stappen niet uit. Wanneer in deze beschrijving wordt verwezen naar een product of proces dat bepaalde kenmerken, onderdelen of stappen “omvat", verwijst dit naar de mogelijkheid dat ook andere kenmerken, onderdelen of stappen aanwezig zijn, maar kunnen hierbij ook uitvoeringsvormen voorzien zijn die enkel de opgelijste kenmerken, onderdelen of stappen bevatten.

De opsomming van numerieke waarden aan de hand van cijferbereiken omvat alle waarden en fracties in deze bereiken, zowel als de geciteerde eindpunten.

De term “ongeveer” zoals gebruikt wanneer gerefereerd word naar een meetbare waarde zoals een parameter, een hoeveelheid, een tijdsduur, en zo meer, is bedoeld variaties te omsluiten van +/- 10% of minder, bij voorkeur +1-5% of minder, meer bij voorkeur +/-1% of minder, en meer nog bij voorkeur +/-0.1% of minder, van en vanaf de gespecificeerde waarde, in zo ver de variaties van toepassing zijn om te functioneren in de bekend gemaakte uitvinding. Het dient te worden verstaan dat de waarde waarnaar de term “ongeveer” refereert op zich, ook werd bekend gemaakt. Alle in deze beschrijving aangehaalde referenties worden hierbij door verwijzing in hun geheel opgenomen.

Tenzij anders gedefinieerd, hebben alle termen bekend gemaakt in de uitvinding, inclusief technische en wetenschappelijke termen, de betekenis zoals een vakman deze gewoonlijk verstaat. Als verdere leidraad, worden definities opgenomen voor verdere toelichting van termen die in de beschrijving van de uitvinding worden gebruikt.

De onderhavige beschrijving heeft betrekking op werkwijzen voor het detecteren van witte bloedcellen in zaadmonsters, op basis van peroxidase-activiteit. De hierin beschreven methoden omvatten het contacteren van een zaadmonster met een peroxideverbinding en 4-chloro-1-naphthol (4-CN). De meeste leukocyten aanwezig in sperma bevatten myeloperoxidase. In aanwezigheid van myeloperoxidase en de peroxideverbinding vormt 4-CN een gekleurd precipitaat, wat toelaat de leukocyten te detecteren.

Meer bepaald voorziet de onderhavige uitvinding in een eerste aspect werkwijzen voor het detecteren van witte bloedcellen in een zaadmonster, waarin cellen van een zaadmonster in contact worden gebracht met een peroxidaseverbinding en 4-CN. In meer specifieke uitvoeringsvormen omvatten de werkwijzen de fixatie van (de cellen van) het zaadmonster, het in contact brengen van het zaadmonster met een peroxidaseverbinding en 4-CN en de detectie van leukocyten.

De hierin beschreven werkwijzen zijn werkwijzen voor semenanalyse. Hierbij wordt gebruik gemaakt van een zaadmonster. De wijze waarop het zaadmonster, ook “semenmonster" genoemd, wordt verkregen is niet kritisch voor de uitvinding. Gewoonlijk wordt dit verkregen via masturbatie, waarbij de zaadlozing (het ejaculaat) wordt opgevangen in een steriel monsterpotje. Bij voorkeur wordt hierbij de gehele zaadlozing opgevangen. Dit kan de betrouwbaarheid van het resultaat van de werkwijze verhogen.

In bepaalde uitvoeringsvormen van de onderhavige werkwijzen wordt het zaadmonster onderworpen aan een voorbehandeling die de detectie vergemakkelijkt en/of verbetert. Meer specifiek zal in bepaalde uitvoeringsvormen het zaadmonster op een vaste drager worden aangebracht, om detectie van de leukocyten in het staal via lichtmicroscopie mogelijk te maken. Als vaste drager wordt bij voorkeur een glasplaat gebruikt, bijvoorbeeld een objectglaasje. Dit laat een eenvoudige analyse van de gefixeerde cellen toe via (licht)microscopie (zie verder). Bij voorkeur wordt het staal uitgesmeerd over de vaste drager. Doorgaans is bij het aanbrengen op een drager, slechts een geringe hoeveelheid vloeibaar zaadmonster vereist. Bij voorkeur wordt in dergelijke werkwijzen een volume tussen 2 en 20 pl_ gebruikt. Wanneer een zaadmonster op een vaste drager wordt voorzien, is het doorgaans aan te raden om het zaadmonster te drogen alvorens hierop verdere stappen uit te voeren. Om het drogen van het zaadmonster te bespoedigen kan de drager eventueel licht worden verwarmd, bijvoorbeeld op een temperatuur rond 37°C.

Het is echter ook voorzien dat de detectie van de gekleurde leukocyten in het zaadmonster kan gebeuren op andere wijzen, zoals via flowcytometrie. In deze uitvoeringsvormen wordt een staal van het vloeibaar (of vloeibaar gemaakt) zaadmonster in een proefbuisje overgebracht en gemengd met de verder hierin beschreven reagentia, waarna detectie kan uitgevoerd worden met behulp van een haemocytometer.

In een geprefereerde uitvoeringsvorm van de hierin beschreven werkwijzen wordt onverdund ejaculaat gebruikt. In andere uitvoeringsvormen kan het nodig zijn om het zaadmonster te verdunnen of te concentreren. In bepaalde uitvoeringsvormen wordt voorzien dat het zaadmonster een concentratie heeft aan spermacellen van minstens 20x106 cellen/ml.

In bepaalde uitvoeringsvormen omvatten de onderhavige werkwijzen een fixatie van de cellen van het zaadmonster. Er werd immers vastgesteld dat fixatie de effectiviteit waarmee de leukocyten in het monster kunnen worden gekleurd met 4-CN verhoogt. Meer bepaald werd vastgesteld dat de beste resultaten verkregen werden bij het fixeren van het zaadmonster op een vaste drager.

Dus in bepaalde uitvoeringsvormen omvatten de hierin beschreven werkwijzen het aanbrengen van het zaadmonster op een vaste drager en het fixeren van de cellen. De eigenlijke fixatie van het zaadmonster op de vaste drager gebeurt typisch door het incuberen van de vaste drager + (gedroogd) zaadmonster met een fixatie-oplossing. In bepaalde uitvoeringsvormen omvat de fixatie van het zaadmonster op de vaste drager de volgende stappen: (a1) het aanbrengen van een vloeibaar zaadmonster op een vaste drager; (a2) optioneel, het uitsmeren van het zaadmonster over (een deel van) het oppervlak van de vaste drager; (a3) het drogen van het zaadmonster; (a4) het incuberen van het gedroogde zaadmonster met een fixatie-oplossing, daarbij verkrijgend een gefixeerd zaadmonster; en (a5) optioneel, het wassen van het gefixeerde zaadmonster.

Volgens alternatieve werkwijzen kunnen de cellen gefixeerd worden door ze in oplossing in contact te brengen met een fixatie-oplossing, en na fixatie op een vaste drager aan te brengen. Wanneer geen gebruik gemaakt wordt van een vaste drager kunnen de cellen eveneens gefixeerd worden door ze in oplossing te brengen met een fixatie-oplossing.

In bepaalde uitvoeringsvormen zal na fixatie het zaadmonster bij voorkeur worden gewassen of gespoeld (zie hieronder). In bepaalde uitvoeringsvormen wordt de fixatievloeistof verdund.

Geschikte fixatie-oplossingen voor het fixeren van zaadmonsters zijn goed gekend door de vakman. Voorbeelden van geschikte fixatie-oplossingen zijn formaldehyde, ethanol, methanol, aceton, propyleen glycol, dialdehyden en mengsels daarvan en/of waterige oplossingen daarvan.

De term “waterige oplossing" zoals hierin gebruikt, duidt op een oplossing die ten minste 50 gewichts% water bevat. Bij voorkeur bevat de fixatie-oplossing minstens 10 gewichts% aan één of meerdere verbindingen gekozen uit de lijst bestaande uit formaldehyde, ethanol, methanol, aceton, een dialdehyde, en propyleen glycol; bij voorkeur minstens 20 gewichts%. Een bijzonder geschikte fixatie-oplossing is formaline (37 gewichts% formaldehyde in water). Alternatieve fixatie-oplossingen die geen aldehyden zoals formaldehyde bevatten zijn echter ook gekend door de vakman en beschikbaar op de markt zoals bij voorbeeld GreenFix® (Diapath), Accustain® (Sigma Aldrich), CaroSafe® (Carolina) of ook Histochoice® (Amresco). In bepaalde uitvoeringsvormen bevat de fixatie-oplossing dus geen formaldehyde. In verdere uitvoeringsvormen bevat de fixatie-oplossing geen aldehyden.

De contacttijd van het zaadmonster met de fixatie-oplossing kan afhangen van het type fixatie-oplossing. In de meeste gevallen volstaat een contacttijd tussen 10 seconden en 5 minuten, bijvoorbeeld ongeveer 30 seconden.

Zoals hierboven aangegeven zal de fixatie van het zaadmonster bij voorkeur gevolgd worden door een wasstap. Dit houdt in dat het zaadmonster één of meerdere malen in contact wordt gebracht met een neutrale oplossing, zoals water of een buffer (bijvoorbeeld een fosfaatbuffer).

De hierin beschreven werkwijze omvatten als essentiële stap het kleuren van de leukocyten in het zaadmonster. Hiervoor wordt het zaadmonster in contact gebracht met 4-CN en een peroxideverbinding, typisch in oplossing.

Zoals hierboven beschreven zal 4-CN in aanwezigheid van myeloperoxidase in de leukocyten en de peroxideverbinding een donker gekleurd precipitaat vormen, wat toelaat de leukocyten te differentiëren van andere cellen in het zaadmonster. In de hierin beschreven werkwijze wordt 4-CN dus gebruikt als een chromogene verbinding die kleur krijgt (zwart) in de aanwezigheid van peroxidase en een peroxide. In tegenstelling tot andere van dergelijke verbindingen zoals benzidine en ortho-toluidine, is 4-CN niet carcinogeen en dus veiliger in gebruik.

De kleuring op basis van peroxidase-activiteit vereenvoudigt de detectie van leukocyten in het zaadmonster. Een aantal types leukocyten zoals lymfocyten, macrofagen, en monocyten bevatten geen peroxidase en worden dus niet gekleurd op basis van peroxidase-activiteit. Dergelijke leukocyten vormen typisch slechts een klein aandeel van de leukocyten in zaadmonsters. Inderdaad, het grootste aantal leukocyten in zaadmonsters zijn typisch neutrofiele granulocyten, die peroxidase-actief zijn en dus kunnen worden gekleurd via 4-CN. De telling van het aantal peroxidase-actieve leukocyten in een zaadmonster is dus typisch representatief voor het totale aantal leukocyten. In bepaalde uitvoeringsvormen is de hierin beschreven werkwijze een werkwijze voor het detecteren en/of tellen van peroxidase-actieve neutrofielen in een zaadmonster, zoals neutrofiele granulocyten.

In bepaalde uitvoeringsvormen van de hierin beschreven werkwijzen wordt de kleuring uitgevoerd op een gefixeerd zaadmonster en omvat de kleuring van de leukocyten de incubatie van het gefixeerde zaadmonster met een kleuroplossing, meer bepaald een waterige oplossing, die 4-CN en een peroxideverbinding bevat.

In bepaalde uitvoeringsvormen omvat de kleuroplossing tussen 0,005mM en 5,0mM 4-CN, bij voorkeur tussen 0,05mM en 2,0mM. De kleuroplossing is doorgaans een waterige oplossing die gemaakt wordt op basis van een substraatoplossing. Het 4-CN wordt hierbij opgelost in een alcohol zoals methanol en wordt dan verdund met een buffer.

Voor de hierin beschreven werkwijze zijn geen andere chromogene verbindingen vereist dan 4-CN. In een voorkeursvorm omvat de kleuroplossing geen andere chromogene verbindingen dan 4-CN. Met name bevat de kleuroplossing in dergelijke uitvoeringsvormen geen chromogene verbinding zoals benzidine en ortho-toluidine. Het is echter niet uitgesloten dat in andere uitvoeringsvormen de kleuroplossing wel andere (niet-carcinogene) chromogene verbindingen bevat naast 4-CN.

Naast 4-CN bevat de kleurstofoplossing ook één of meerdere peroxideverbindingen, meer bepaald organische peroxideverbindingen. Voorbeelden van geschikte peroxideverbindingen zijn waterstofperoxide (H202), methyl peroxide, ethyl peroxide, of combinaties daarvan. De hierin beschreven werkwijze is echter niet beperkt tot deze verbindingen. In een voorkeursuitvoering wordt waterstofperoxide gebruikt. De (totale) concentratie van de peroxideverbinding (en) in de kleuroplossing bedraagt bij voorkeur tussen 0,05mM en 5,0mM, bijvoorbeeld ongeveer 0,5mM.

In bepaalde uitvoeringsvormen is de kleuroplossing gebufferd, bij een pH tussen 6 en 10, bij voorkeur tussen 7 en 9. Een voorbeeld van een geschikte buffer is een Tris-buffer. In bepaalde uitvoeringsvormen bevat de kleuroplossing één of meerdere zouten, bijvoorbeeld NaCI.

De contacttijd van het gefixeerde zaadmonster met de kleuroplossing kan afhangen van de samenstelling van de kleuroplossing, bijvoorbeeld van de concentratie 4-CN, het type en concentratie peroxideverbinding, en dergelijke. In de meeste gevallen volstaat een contacttijd tussen 1 en 30 minuten.

Na de kleuring wordt het zaadmonster bij voorkeur gewassen of gespoeld. Deze was- of spoelstap wordt doorgaans uitgevoerd met een neutrale oplossing zoals water of een gebufferde oplossing.

De hierboven beschreven kleuring op basis van peroxidase-activiteit zorgt voor een kleuring van (peroxidase bevattende) leukocyten, maar niet van de andere cellen in het zaadmonster, zoals zaadcellen. Om ook de detectie van andere cellen in het zaadmonster mogelijk te maken of te vereenvoudigen, kunnen de hierin beschreven werkwijzen in bepaalde uitvoeringsvormen ook een contrastkleuring omvatten. De contrastkleuring kan worden verkregen door de incubatie van het zaadmonster met een oplossing van een contrastkleurstof. De oplossing van de contrastkleurstof is bij voorkeur een waterige oplossing. In een voorkeursvorm wordt een contrastkleurstof gebruikt die is geschikt voor het kleuren van zaadcellen en niet gekleurde leukocyten, zodat deze cellen eenvoudiger kunnen worden gedifferentieerd ten opzichte van de myeloperoxidase-bevattende leukocyten in het monster.

Kleurstoffen en werkwijzen voor het kleuren van zaadcellen zijn goed gekend door de vakman. Niet-limiterende voorbeelden van geschikte kleurstoffen zijn haematoxyline (bv. Mayer’s Hemalum), phloxine B, Rose Bengal, en Neutral Red (toluylene red).

De contacttijd van het zaadmonster met de contrastkleurstof kan afhangen van de het type en de concentratie van de kleurstof. In de meeste gevallen volstaat een contacttijd tussen 1 en 10 minuten.

In bepaalde uitvoeringsvormen wordt deze contrastkleuring uitgevoerd op een zaadmonster dat reeds een fixatiestap heeft ondergaan. De contrastkleuring wordt bij voorkeur uitgevoerd na de kleuring van de leukocyten. De volgorde van deze kleuringen is echter niet kritisch voor de hierin beschreven werkwijze. In bepaalde uitvoeringsvormen kan de contrastkleuring dus worden uitgevoerd voor het uitvoeren van de kleuring van de leukocyten zoals hierboven beschreven. In bepaalde uitvoeringsvormen kan de contrastkleuring gelijktijdig worden uitgevoerd met de kleuring van de leukocyten.

Na de contrastkleuring wordt het zaadmonster bij voorkeur gewassen of gespoeld. Deze was- of spoelstap wordt doorgaans uitgevoerd met een neutrale oplossing zoals water of een gebufferde oplossing.

Detectie van leukocvten

De onderhavige werkwijzen voorzien dat na de kleuring van de leukocyten en optioneel andere cellen zoals zaadcellen in het zaadmonster, de leukocyten gedetecteerd en/of geteld worden.

De detectie of telling van de leukocyten en/of zaadcellen gebeurt bij voorkeur via (licht)microscopie. Deze techniek is goed gekend door de vakman. Voor een goede betrouwbaarheid van de telling worden de cellen bij voorkeur geteld op een aantal verschillende plaatsen op de vaste drager, zodat de verkregen resultaten representatief zijn voor het volledige monster.

De onderhavige werkwijzen zijn voorzien om een betrouwbare detectie van leukocyten in een zaadmonster toe te laten. In bepaalde uitvoeringsvormen vinden de onderhavige werkwijzen hun toepassing als werkwijzen voor het kwantificeren van het aantal witte bloedcellen in een zaadmonster. Hierbij kan het volstaan enkel de leukocyten in (een representatief deel van) het zaadmonster te tellen. Door de kleuring met 4-CN worden de peroxidase-actieve leukocyten waargenomen als donker tot zwart gekleurde cellen, zodat zij eenvoudig te onderscheiden zijn van de andere cellen in het zaadmonster, via lichtmicroscopie of andere optische detectiemethoden.

Concreet kan de concentratie aan leukocyten in het ejaculaat als volgt worden berekend. Wanneer L gelijk is aan het aantal peroxidase- positieve cellen en S het aantal spermacellen vertegenwoordigd die in dezelfde microscoopvelden zijn geteld als de peroxidase positieve cellen, dan kan de concentratie aan leukocyten (C) als volgt worden berekend: C= Nx(L/S). In deze formule staat N gelijk aan de concentratie aan spermatozoa (mill per mL) van het ejaculaat..

De Wereldgezondheidsorganisatie (World Health Organisation - WHO) gebruikt als richtwaarde voor een abnormaal hoog aantal witte bloedcellen - i.e. leukocytospermie - een aantal van meer dan één miljoen per ml ejaculaat. Leukocytospermie kan een indicatie zijn voor fertiliteit. Bijgevolg is de onderhavige werkwijze in bepaalde uitvoeringsvormen een werkwijze voor het bepalen van de vruchtbaarheid van een zaadmonster.

Naast problemen betreffende fertiliteit kan leukocytospermie ook wijzen op een onderliggend medisch probleem, zoals een infectie van de geslachtsorganen, bijvoorbeeld chronische prostatitis.

In bepaalde uitvoeringsvormen van de hierin beschreven werkwijze worden niet enkel leukocyten gedetecteerd, maar ook ander cellen, in het bijzonder zaadcellen. In dergelijke uitvoeringsvormen omvat de werkwijze bij voorkeur ook een contrastkleuring zoals hierboven beschreven, waardoor de zaadcellen eenvoudig te differentiëren zijn ten opzichte van de andere cellen in het monster. Het detecteren en tellen van zaadcellen kan gebeuren via microscopische technieken zoals hierboven beschreven voor leukocyten. Indien de concentratie zaadcellen in het zaadmonster gekend is, bijvoorbeeld aan de hand van een parallelle analyse van het ejaculaat via een andere techniek, kan de concentratie van de leukocyten worden bepaald aan de hand van de zaadcelconcentratie en de verhouding van het aantal leukocyten ten opzichte van het aantal zaadcellen.

De vakman zal begrijpen dat het detecteren en tellen van cellen via microscopie (gedeeltelijk) kan worden geautomatiseerd. Analyse van microscopiebeelden kan bijvoorbeeld gebeuren aan de hand van commercieel verkrijgbare software, dat een automatische detectie en telling van de cellen mogelijk maakt.

Werkwijzen voor monstervoorbereidina

De analyse van het zaadmonster zoals hierboven beschreven dient niet onmiddellijk na de fixatie en kleuring te gebeuren. In bepaalde gevallen kunnen de monstervoorbereiding en de analyse op verschillende locaties worden uitgevoerd.

De onderhavige uitvinding voorziet daarom in een werkwijze voor het voorbereiden van een zaadmonster, die gekenmerkt zijn door een kleuring van het zaadmonster met 4-chloronaphthol (4-CN). In bepaalde uitvoeringsvormen wordt het zaadmonster op een vaste drager gefixeerd. In meer bepaalde uitvoeringsvormen omvatten de hierin voorziene methoden voor het voorbereiden van een staal de volgende stappen: (a) de fixatie van cellen in het zaadmonster op een vaste drager; (b) het contacteren van de op de vaste drager gefixeerde cellen met een kleuroplossing bevattend 4-chloronaphthol (4-CN) en een peroxideverbinding, daarbij verkrijgend een gekleurd staal; en (c) optioneel, het contacteren van de gekleurde cellen met een contrastkleurstof.

Deze werkwijze resulteert in een gefixeerd en gekleurd zaadmonster, dat kan worden gebruikt voor het detecteren van leukocyten in het zaadmonster zoals hierboven beschreven. Het verloop van de werkwijze voor monstervoorbereiding kan analoog verlopen als hierboven beschreven voor de werkwijzen voor het detecteren van leukocyten in een zaadmonster.

Kits

De onderhavige beschrijving voorziet verder in middelen voor het uitvoeren van de hierboven beschreven werkwijzen, zoals combinaties van reagentia voor het uitvoeren van deze werkwijzen, of kits die deze reagentia bevat.

In bepaalde uitvoeringsvormen bevatten de hierin voorziene kits een fixatie-oplossing, 4-CN, en een peroxideverbinding zoals hierboven beschreven, en optioneel een contrastkleurstof. De peroxideverbinding en het 4-CN, al dan niet in waterige oplossing, bevinden zich bij voorkeur in afzonderlijke recipiënten, zoals glazen flesjes of Eppendorf® tubes. Dit kan de houdbaarheid van deze reagentia verlengen. In bepaalde uitvoeringsvormen wordt het 4-CN in poedervorm voorzien. Optioneel kan een kit één of meer bufferoplossingen bevatten. Optioneel kan de kit een vaste drager bevatten zoals een draagglas.

In bepaalde uitvoeringsvormen omvat een kit: - een fixatie-oplossing, bij voorkeur omvattend minstens 10 gewichts% aan één of meerdere verbindingen gekozen uit de lijst bestaande uit een fixatief zoals bij voorbeeld formaldehyde, ethanol, methanol, aceton, propyleen glycol of alternatieve fixatieven zoals dialdehyden; - 4-CN; - een (waterige) oplossing bevattend een peroxideverbinding, bij voorkeur waterstofperoxide in een concentratie tussen 0,1 en 10 gewichts%, nog bij voorkeur tussen 0,5 en 5 gewichts%. 4-CN kan in de kit aanwezig zijn in vaste vorm zoals in poedervorm, of in oplossing. Bij voorkeur is 4-CN aanwezig in vaste vorm, omdat deze vorm doorgaans stabieler is dan 4-CN in oplossing. In andere uitvoeringsvormen is 4-CN voorzien in oplossing, bij voorkeur met een concentratie 4-CN tussen 0,01 mM en 1,0mM, nog bij voorkeur tussen 0,5mM en 1,0mM Geschikte oplosmiddelen voor 4-CN omvatten, maar zijn niet beperkt tot, methanol, ethanol, propanol, isopropanol, water, of mengsels daarvan; bij voorkeur methanol, water, of een mengsel daarvan.

Optioneel kan de fixatie-oplossing één of meerdere elementen omvatten gekozen uit de lijst bestaande uit: een bufferoplossing met een pH tussen 6 en 10; bijvoorbeeld een Tris-buffer; een contrastkleurstof; bij voorkeur Rose Bengal en/of neutral red; een vaste drager.

Verder kan een kit zoals hierin voorzien optioneel een recipiënt voor het ejaculaat, en/of andere middelen zoals een pipet bevatten.

In bepaalde uitvoeringsvormen is de kit gelimiteerd tot de hierboven opgesomde elementen. Het is echter mogelijk dat de kit verder instructies bevat voor het gebruik van de kit volgens de hierin beschreven werkwijzen.

De onderhavige uitvinding zal worden geïllustreerd door de volgende niet-beperkende uitvoeringsvormen.

VOORBEELDEN

Het aantal witte zaadcellen in een aantal zaadmonsters werd nagegaan volgens een specifieke uitvoeringsvorm van de hierin beschreven werkwijze, waarvan het protocol hieronder is gegeven. 1) 7 microliter van een vloeibaar zaadmonster wordt geplaatst op een draagglas en over het draagglas uitgesmeerd met behulp van een dekglaasje. 2) Er wordt gewacht tot het uitgesmeerde zaadmonster is gedroogd. Het drogen kan worden versneld door het draagglas te verwarmen rond 37°C. 3) Het draagglas wordt geplaatst in een bad met een fixatie-oplossing (bijvoorbeeld 37 gewichts% formaldehyde in water; of een formaldehyde-vrije fixatie-oplossing zoals hierboven beschreven), gedurende 1 minuut. Hierbij wordt het zaadmonster gefixeerd op het draagglas. 4) Het gefixeerde zaadmonster wordt gedurende 1 minuut gewassen met water. 5) Een kleuroplossing wordt bereid door het samenvoegen van een substraatoplossing (0.85 mL; 0.75 mM 4-CN in methanol), een bufferoplossing (4.15 mL; 60 mM tris buffer met 240 mM NaCI), en 2.5 pL additief (3 w/v% waterstofperoxide). 6) Het draagglas wordt geplaatst in de kleuroplossing, en geïncubeerd gedurende 5 minuten. 7) Het draagglas wordt gewassen met water gedurende 30 seconden en vervolgens gedroogd. 8) 10uL van een oplossing met contrastkleurstof (’Rose Bengal + Neutral Red) wordt op het draagglas gebracht en afgedekt met het dekglas. 9) De witte bloedcellen worden geteld via lichtmicroscopie.

Claims

CONCLUSIES

1. Een werkwijze voor het detecteren van leukocyten in een zaadmonster, omvattend: (a) de fixatie van cellen in het zaadmonster; (b) het contacteren van de cellen met 4-chloronaphthol (4-CN) en een peroxideverbinding; (c) het detecteren van leukocyten op basis van hun kleuring.
2. De werkwijze volgens conclusie 1, waarbij stap (b) omvat het contacteren van de cellen met een kleuroplossing die 4-CN bevat in een concentratie van 0,05mM tot 2,0mM.
3. De werkwijze volgens conclusie 1 of 2, waarbij de kleuroplossing waterstofperoxide bevat in een concentratie tussen 0,05 mM en 5,0mM.
4. De werkwijze volgens één der conclusies 1 tot 3, waarbij de fixatie-oplossing één of meerdere verbindingen omvat, gekozen uit de lijst bestaande uit formaldehyde, ethanol, methanol, aceton, een dialdehyde fixatief, en propyleen glycol.
5. De werkwijze volgens één der conclusies 1 tot 4, waarbij stap (a) omvat: (a1) het aanbrengen van een vloeibaar zaadmonster op een vaste drager; (a2) optioneel, het uitsmeren van het zaadmonster over ten minste een deel van het oppervlak van de vaste drager; (a3) het drogen van het zaadmonster; (a4) het incuberen van het gedroogde zaadmonster met een fixatie-oplossing, daarbij verkrijgend een gefixeerd zaadmonster; en (a5) optioneel, het wassen van het gefixeerde zaadmonster.
6. De werkwijze volgens één der conclusies 1 tot 5, waarbij het zaadmonster wordt aangebracht op een vaste drager voor detectie van de leukocyten.
7. De werkwijze volgens conclusie 6, waarbij de vaste drager een glasplaat is.
8. De werkwijze volgens één der conclusies 1 tot 7, waarbij de werkwijze de volgende stappen omvat: (a) de fixatie van cellen in het zaadmonster op een vaste drager; (b) het in contact brengen van de op de vaste drager gefixeerde cellen met 4-chloronaphthol (4-CN) en een peroxideverbinding; en (c) het detecteren van leukocyten op de vaste drager op basis van hun kleuring.
9. De werkwijze volgens één der conclusies 1 tot 5, waarbij de detectie gebeurt via microscopie.
10. De werkwijze volgens één der conclusies 1 tot 9, waarbij de werkwijze een bijkomende stap omvat waarin de cellen aan een contrastkleurstof, zoals bijvoorbeeld Rose Bengal en Neutral Red , worden blootgesteld.
11. De werkwijze volgens één der conclusies 1 tot 10, waarbij deze werkwijze een werkwijze is voor het bepalen van de vruchtbaarheid van het zaadmonster.
12. Een werkwijze voor de voorbereiding van een zaadmonster, omvattend: (a) de fixatie van cellen in het zaadmonster op een vaste drager; (b) het in contact brengen van de op de vaste drager gefixeerde cellen met een kleuroplossing bevattend 4-chloronaphthol (4-CN) en een peroxideverbinding, daarbij verkrijgend een gekleurd staal; en (c) optioneel, het blootstellen van de gekleurde cellen aan een contrastkleurstof.
13. Een kit voor het uitvoeren van de werkwijze volgens één der conclusies 1 tot 12, omvattend: een fixatie-oplossing; - een oplossing bevattend 4-CN; - een oplossing bevattend een peroxideverbinding; en optioneel, een contrastkleurstof.
14. De kit volgens conclusie 13, waarbij de peroxideverbinding waterstofperoxide is.
15. De kit volgens conclusie 13 of 14, verder omvattend een vaste drager.