JPH0823557B2 - 遠心分離した血液試料の細胞層界面を改良する方法 - Google Patents

遠心分離した血液試料の細胞層界面を改良する方法

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JPH0823557B2
JPH0823557B2 JP61045537A JP4553786A JPH0823557B2 JP H0823557 B2 JPH0823557 B2 JP H0823557B2 JP 61045537 A JP61045537 A JP 61045537A JP 4553786 A JP4553786 A JP 4553786A JP H0823557 B2 JPH0823557 B2 JP H0823557B2
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、抗凝血処理した全血の遠心分離試料中に赤
血球層と白血球層との間に改良されて一層明瞭になつた
界面を供する方法に関する。
先行技術 1976年４月２日発行の米国特許第4,027,660号および1
978年４月４日発行の米国特許第4,082,085号明細書は、
毛細管中へ抜き取られて遠心分離された抗凝集処理され
た全血の試料において白血球の示差計数（differential
leukocyte counts）を行う方法に関する。遠心分離の
際には、毛細管の血液試料中に一般的には円筒形の浮き
を配する。浮きは赤血球層へ沈み込み、軟膜へ達して物
理的に白血球と血小板の層を伸張するようになる。アク
リジンオレンジのような染料を用いて、軟膜を構成する
異なる成分を特異的に着色して、軟膜が毛細管中で複数
の別の色に着色されたバンドとして見えるようにする。
遠心分離中に密度に従つて各成分が層に分かれることに
より、各細胞バンドの境界線の間の距離を測定すること
によつて細胞を計数することが出来る。
1979年７月３日発行の米国特許第4,159,896号および1
980年１月１日発行の同第4,181,609号明細書には、上記
技術に準じて試験した幾つかの血液試料中に起こる問題
とその解決法を記載している。問題となるのは、赤血球
層の上部と白血球層の底部の間の分界が、余り明瞭でな
いことである。この不明瞭な画定は、血液試料中に見い
出される異常に低密度の赤血球が白血球層の下部領域に
沈降し易いことによつて起こる。上記先行技術が記載し
ている解決法は、血液試料にシユウ酸カリウムを加えて
赤血球の密度を増加させ、低密度の赤血球は遠心分離中
に赤血球層の大多数の細胞と共に沈降するようにするこ
とである。増加した密度を強調するために、遠心分離の
前に毛細管中で血液試料を加温しても良い。先行技術の
方法に従えば、外来患者のほぼ98％および入院患者のほ
ぼ70％で満足すべき赤血球−白血球境界面が得られる。
かなりの場合に、特に病院環境では先行技術は無効であ
るので、総ての場合に良好な赤血球−白血球分離が達成
されるより有効な方法が望ましいのは明らかである。
発明の要約 本発明は、実質的に総ての場合に抗凝集処理をした全
血の遠心分離試料中に赤血球と白血球の間に明瞭な分界
を設ける方法に関する。
改良された赤血球−白血球界面の分界線は、試料の遠
心分離の前に赤血球を互いに結合する物質を血液試料に
加えることによつて設けられる。血液試料に加えられる
物質は、赤血球間にタイプとは無関係に強力な結合を生
じ、且つ軟膜中の細胞には悪影響を及ぼさないものでな
ければならない。こうして遠心分離の前に赤血球を凝集
させると、試料を遠心分離すると赤血球はそれらの平均
密度に従つて沈降する。凝集した細胞の沈降速度も、よ
り速くなる。従つて、密度の小さい小赤血球や網状赤血
球は、通常とは異なつて重い赤血球上部に層を形成しな
いので、赤血球−白血球界面を不鮮明にすることはな
い。血液試料に加えられる物質は、Ｈ赤血球抗原および
／または混合Ａ、Ｂ、Ｈ抗原に対する抗体、ユーレツク
ス・ヨーロプス（Fulex Europus）から得られるような
レクチン（抗体様特性を有する植物性炭水化物）、およ
び全般的赤血球抗原に対する抗体、詳細にはモノクロナ
ル抗体のような物質である。好ましい物質は、標的細胞
を凝集させることが出来るヒト赤血球に特異的なモノク
ロナル抗体である。混合レクチンも有効である。これら
の物質の両方を組合せて、有効な付加物を供してもよ
い。
上記方法によつて解決される問題は、異常に小さな密
度の赤血球が正常な顆粒球中への侵入によつて起こる。
これらの異常に小さな密度の赤血球は、不十分な細胞形
成によつて生じるまたは機械的或いは他の損傷によつて
生じ小片であることがあり、或いはまた代謝上の損傷か
ら生じる膨潤した赤血球であることもある。それらはま
た成熟赤血球よりも低い浮遊密度を有することが知られ
ている未成熟赤血球であることもある。これらの細胞の
割合は、正常の密度のものに比べて比較的小さいが、そ
れらの数は顆粒球層と混合して崩壊させるのに十分であ
ることもある。本発明の方法は、これらの異常に小さな
密度の赤血球物質を正常の赤血球群と不可逆的に結合さ
せるものである。添加する物質は、赤血球のみに特異的
で且つ総ての赤血球を平均密度を有する細胞の小集合体
に転換させる或る種の「膠」として特徴付けることがで
きる。この平均密度は顆粒球の密度より大きいので、赤
血球と顆粒球との間に完全な分離が生じる。これらの集
合体は、そのクラスター中に白血球を取り込むことが出
来ないほど大きいものであつてはならない。
レクチンを凝集物質として用いる場合には、次のもの
を用いる。すなわち、ユーレツクス・ヨーロプス、トリ
チクム・ブルガリスおよびフアーゼオルス・ブルガリス
のようなレクチンであり、これらは本発明の方法におい
て用いることが出来、且つシグマ・ケミカル・カンパニ
ー、セントルイス、ミズーリー（Sigma Chemical Com
pany,St.Louis、Missoure）から粉末状で市販されてい
る。レクチンのような生物学的物質を用いるときは、そ
の物質の活性成分が知られていなかつたりまたは少なく
とも不十分にしか定義されていないので、生物学的物質
の有効溶液濃度を明記することが不可能な場合がしばし
ばある。従つて、次の滴定を行うことによつて、それぞ
れのレクチンの有効濃度を決定する必要がある。
（粉末状の）レクチン物質の既知重量または容量を、
既知容量の食塩水のような適当な媒質に溶解させる。既
知の出発点濃度から有効濃度を誘導するので、初期濃度
だけは重要である。次に、引き続く滴定は、出発流体を
連続希釈することによつて行う。半希釈（half dilutio
ns）が好ましい。この処理を継続して、原溶液から最大
希釈使用溶液までの濃度範囲を調製する。連続希釈中
に、各希釈液数滴を等量の血液と混合する。次に、生成
する混合物を、赤血球の凝集について目視により検査す
る。混合物の最小有効濃度（力価）が分かつたならば、
その濃度を約４倍から10倍に希釈して、赤血球の有効な
凝集が起こることを確かめ且つ試薬を節約する。この方
法で過剰量を用いることによつて、溶液の経時的分解の
可能性は否定される。
発明の詳細な説明 上述のごとく、総てのヒト赤血球で見い出されるが白
血球上では見い出されない抗原に特異的なモノクロナル
抗体は、本発明の方法において用いるのに好ましい凝集
物質である。幾つかの抗原が、実質的に総てのヒト赤血
球に見い出されている。このような普遍的な赤血球抗原
の例は、Ｈ抗原とグリコホリンである。これらのタイプ
の抗原に対する抗血清とモノクロナル抗体の調製と選択
は、周知である。高濃度のモノクロナル抗体は、標準的
な免疫法を用いて腹水として生成させることが出来る。
抗体含有腹水は、マウスから得られ、これを緩衝剤で１
から1000分の１に希釈する。これによつて、本発明の方
法において所望な赤血球の凝集を引き起こすのに用いる
抗体含有試薬が生成する。
通常は、本発明の処理法は次のようになる。赤血球凝
集物質を細胞層を視覚的に識別するのに必要なだけの着
色料または染料と共に毛細管の内部で乾燥させる。上記
の赤血球凝集物質及び着色料または染料でコーティング
した毛細管中に血液試料を引き入れ、浮きを毛細管内に
配置する。管の底に蓋をして、試料を遠心分離する。赤
血球物質が白血球層に上昇しない透明で均一な赤血球−
白血球界面が得られる。軟膜成分が、規則的に縞模様を
付けて、バンド高さを精確に測定して、精確な計数を行
うことが出来るようになる。
本発明の処理法によれば、多くの試験で起こる赤血球
と白血球との分離が不十分であるという先行技術の問題
はなくなることが容易に理解されるであろう。添加物は
白血球に悪影響を及ぼすことはなく、精確な測定のため
の均一な赤血球−白血球界面を生成する。赤血球は、通
常の方法で浮きを付けることが出来る。
本発明は、細胞の副集団を選択的に凝集させて、遠心
分離した血液試料中にこの副集団の良好に画定された層
を形成させることも出来る。例えば、赤血球の副集団で
ある網状赤血球は、これらの網状赤血球の表面上に見い
出されるトランスフエリン受容体に特異的なモノクロナ
ル抗体を加えることによつて、残りの赤血球とは別個に
バンド形成させることが出来る。この方法によつて、よ
り精確な網状赤血球数の計測を行うことが出来る。これ
は貧血の鑑別診断に有用な手段であり、従来法によつて
行うと非常に時間のかかることなのである。
本発明は、血液試料に好酸球に特異的な抗体を加える
ことによつて、遠心分離した血液試料中で白血球の副集
団である好酸球を凝集させて別個のバンドとするのに用
いることも出来る。現在では、好酸球は顆粒球層へ分散
し易いので、遠心分離法によつて容易に測定することは
出来ないのである。
もう一つの改良には、或るタイプの細胞を凝集させる
のに用いる抗体に螢光物質を添加することがある。例え
ば、抗トランスフエリン受容体抗体をフルオレセインに
結合させると、網状赤血球は他の赤血球集団から分離さ
れて、区別される。
本発明の記載態様は本発明の概念から離反することな
しに様々に変化および変更させることが可能であるの
で、特許請求の範囲に記載の事柄を除き、本発明を制限
するものではない。
フロントページの続き (72)発明者 スチーブン シー．ワードロウ アメリカ合衆国コネチカツト州ブランフオ ード、サンセツト ヒル ドライブ 128 (72)発明者 ロバート エイ．レビン アメリカ合衆国コネチカツト州ギルフオー ド，ピルグリム レーン 31 (72)発明者 ロドルフオ アール．ロドリゲツ アメリカ合衆国ニユージヤージー州ランド ルフ，メドウ ブルツク ロード 16 (72)発明者 マイクル アール．ロケン アメリカ合衆国カルフオルニア州ロス ア ルトス，サン ジユアン コート 29 (56)参考文献 特開 昭58−500366（ＪＰ，Ａ)

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】遠心分離した血液試料中にあり、すべての
    ヒトに存在する、目的血液細胞種の良好に画定されたバ
    ンドを生成させる方法において、該目的血液細胞種の凝
    集を選択的に促進する抗体の有効量を血液試料に加える
    ことを特徴とする、上記方法。
  2. 【請求項２】前記抗体が、血液試料中の目的血液細胞種
    中にのみ見い出される抗原に特異的な抗体である、特許
    請求の範囲第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】抗体がモノクローナル抗体である、特許請
    求の範囲第２項記載の方法。
  4. 【請求項４】螢光染料が前記抗体に付着している、特許
    請求の範囲第３項記載の方法。
  5. 【請求項５】前記螢光染料がフルオレセインである、特
    許請求の範囲第４項記載の方法。
  6. 【請求項６】目的血液細胞種が網状赤血球である、特許
    請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載の方法。
  7. 【請求項７】赤血球の良好に画定されたバンドを生成さ
    せる方法において、該赤血球中にのみ見い出される抗原
    に特異的に結合し、該赤血球の凝集を選択的に促進する
    モノクローナル抗体の有効量を血液試料に加えることを
    特徴とする上記方法であって、上記バンドは明瞭で良好
    に画定された界面を赤血球と白血球との間に形成し、上
    記モノクローナル抗体の有効量は血液試料中のすべての
    赤血球を凝集させて複数の赤血球群を形成し、該赤血球
    群は血液試料中の全赤血球の平均密度に実質的に等しい
    密度を有する上記方法。
  8. 【請求項８】前記モノクローナル抗体が、Ａ、Ｂおよび
    Ｈ抗原、グリコホリンおよびそれらの混合物から成る群
    から選択されるヒト赤血球抗原に特異的である、特許請
    求の範囲第７項記載の方法。
  9. 【請求項９】赤血球の良好に画定されたバンドを生成さ
    せる方法において、白血球数を精確に計算できるように
    ヒト血液試料中の赤血球と白血球との間に明瞭で良好に
    画定された界面を生成させるために、 （ａ） 赤血球に特異的であり、血液試料中のすべての
    赤血球を凝集して複数の赤血球群にさせ、該赤血球群が
    血液試料中の全赤血球の平均密度に実質的に等しい密度
    を有するようにさせるモノクローナル抗体の有効量を透
    明な毛細管に加え、 （ｂ） 血液試料の一部を上記の透明な毛細管中に抜き
    取り、 （ｃ） この毛細管の血液試料中に円筒形浮きを配し、 （ｄ） 毛細管中の血液試料と浮きを十分に遠心分離し
    て、毛細管中に赤血球と白血球の層を生成させる、 上記方法。
  10. 【請求項１０】モノクローナル抗体が、Ａ、ＢおよびＨ
    抗原、グリコホリンおよびそれらの混合物から成る群か
    ら選択されるヒト赤血球抗原に特異的である特許請求の
    範囲第９項記載の方法。
  11. 【請求項１１】螢光染料が前記抗体に付着している、特
    許請求の範囲第10項記載の方法。
  12. 【請求項１２】前記螢光染料がフルオレセインである、
    特許請求の範囲第11項記載の方法。
JP61045537A 1985-11-01 1986-03-04 遠心分離した血液試料の細胞層界面を改良する方法 Expired - Lifetime JPH0823557B2 (ja)

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