JPH0643300A

JPH0643300A - Ｘ線顕微鏡を用いた観察方法及びそれに使用される試料ホルダ

Info

Publication number: JPH0643300A
Application number: JP4055730A
Authority: JP
Inventors: Toshihisa Tomie; 敏尚富江; Hideaki Shimizu; 秀明清水; Toshikazu Majima; 利和眞島; Hiroyuki Kondo; 洋行近藤
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology; Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1992-03-13
Filing date: 1992-03-13
Publication date: 1994-02-18

Abstract

(57)【要約】【目的】生物試料（１０）を直接又は間接に刺激しな
がらＸ線顕微鏡で観察する。【構成】Ｘ線顕微鏡を用いて、「媒質（９）中に浮遊
する生物試料（１０）」を観察する方法において、前記
媒質に「生物試料を直接又は間接に刺激する刺激物質
〔図１の（１１）から発生する〕」を接触させながら観
察する。開放型試料カプセルＢに試料（１０）を入れ、
これを刺激物質を共に試料ホルダのカプセル収納室（１
２）内に入れる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、Ｘ線顕微鏡を用いた観
察方法及びそれに使用される試料ホルダ、その他に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】医学や生物工学の分野では、通常の可視
光（波長λ＝約 400nm〜 800nm）を用いる顕微鏡よりも
解像度が高く、それでいて、生きた試料（以下、生物試
料と言う）例えば、細胞、バクテリア、精子、染色体、
ミトコンドリア、べん毛などが見られる高解像度の顕微
鏡を要求する声が日増しに高まっている。その理由は、
高解像度の電子顕微鏡では、生物試料が見られないから
である。そこで、可視光に代えて波長λ＝２〜５nmの軟
Ｘ線を用いるＸ線顕微鏡が開発されつつある。図３にＸ
線顕微鏡の簡単な構造と光学系を示す。図３において、
Ｘ線発生器Ｇから出射したＸ線は、コンデンサー光学系
Ｃで集光されて試料カプセルＢを照明する。そして、試
料カプセルＢを透過したＸ線は、結像光学系Ｉにより、
試料の像を撮像装置Ｋ上に結像させる。この像はモニタ
装置（テレビ画面）Ｍ上に映しだされる。Ｘ線発生器Ｇ
から撮像装置Ｋまでの光路長は、例えば２ｍ位である。
Ｒは鏡筒用真空容器、Ｖは容器Ｒ内を真空に排気するた
めの排気系、Ｈは、試料カプセルＢを保持する試料ホル
ダである。しかし、Ｘ線顕微鏡は、まだ、試作品の段階
にある。

【０００３】軟Ｘ線は、物質内を透過したとき物質によ
って吸収され、物質内の透過光路長（単位長さ）当たり
の吸収率すなわち線吸収係数は、物質の密度に比例し、
一般的には波長が長くなるほど高くなる。図４に、いく
つかの物質の線吸収係数スペクトルを示す。このように
物質に応じて線吸収係数が異なることを利用して生物試
料を観察する。

【０００４】ところで、軟Ｘ線は、空気の大部分を占め
る窒素によって吸収されてしまうので、Ｘ線発生器Ｇか
ら生物試料まで、生物試料から撮像装置Ｋまでを真空空
間（例えば、4.8 ×10^-2Pa）にしなければならない。他
方、生物試料は真空空間では死んでしまうので、適当な
液体の媒質（例えば水、培養液、体液、生理食塩水な
ど）に浮遊させ、これを適当な容器にいれて保護する必
要がある。このような容器を一般に試料カプセルと呼
ぶ。初期の試料カプセルは、図５に示すように、リング
状のスペーサとこれを挟む一対のＸ線透過膜（例えば、
厚さが0.05〜0.1 μｍ程度の窒化シリコン薄膜）からな
る。スペーサとこれを挟む一対のＸ線透過膜で囲まれた
空間は、試料室と呼ばれ、ここに“媒質とその中に浮遊
する生物試料”が満たされる。試料室は当然に真空空間
から隔離された密閉空間である。しかし、試料室は小さ
く、かつ、Ｘ線透過膜が薄いので、生物試料を含む媒質
を試料室に満たすとき、Ｘ線透過膜を破壊しがちであ
る。そこで、スペーサの一部に貫通孔を設けるか、スペ
ーサをリング状ではなく、いくつかの分割スペーサに分
解し、各分割スペーサの間に隙間を設ける（図６参照）
ことにより、試料室を開放空間とする試料カプセルが開
発された（例えば、特願平１−３３６４７１）。このよ
うな試料カプセルは開放型試料カプセルと呼ばれる。

【０００５】開放型試料カプセルの試料室に“生物試料
を含む媒質”を満たすと、媒質の一部は外界に露出する
ので、一見すると、媒質はカプセル外に流出して失われ
ると予見される。しかし、実際には、一対にＸ線透過膜
の間隔は非常に狭い（例えば、１〜10μｍ程度）ので、
媒質の表面張力により媒質はカプセルから外には流出し
ない。

【０００６】試料カプセルは、小さいので取扱が不便な
ことから、一般には試料ホルダに保持させ、これをＸ線
顕微鏡にセットする。試料ホルダは、大まかに言うと、
一般に、有底の円筒状を呈する主ホルダ（１ａ）と円板
状を呈する押さえホルダ（１ｂ）との少なくとも２つの
部材からなり、両部材を接合すると両者の間に試料カプ
セルのカプセル収納室（１２）が形成される。カプセル
収納室は、試料カプセルより大きく、そのため、試料カ
プセルの横方向に空間を生じる。主ホルダと押さえホル
ダには、それぞれほぼ中央にＸ線透過のための開口部が
ある。この開口部を通ってＸ線が試料カプセルに入射
し、出射する。試料ホルダの一例を図７（断面図）に示
す。開放型試料カプセルでは、媒質が真空空間に触れ
る。そこで、試料ホルダは、試料カプセルを収納するカ
プセル収納室（１２）が真空空間と隔離する構造を有す
る。実際の例では、試料カプセルの基板（８）とホルダ
（１ａ，１ｂ）との間にＯリング（５）を置くことによ
り、カプセル収納室を密閉し、真空空間から隔離する。
但し、カプセル収納室は試料室とは通じている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】従来のＸ線顕微鏡は、
試料を単に試料室に入れるだけで、試料が直接又は間接
的に触れる周囲の環境を制御する手段は設けられていな
かった。一般にＸ線顕微鏡では試料ホルダを真空容器内
にセットした後、真空容器内を真空に排気する。この排
気に相当な時間がかかる。そのため、観察までに相当な
時間がかかることになる。従って、試料が好気性でかつ
自力走行可能な場合、試料自身が呼吸するため、試料室
内の酸素濃度が低下する。ところが、従来は、カプセル
収納室内が空気であったためこ、これに接している試料
室の周辺部は中心部（観察領域）に比べて酸素濃度が相
対的に高くなる。従って好気性試料の多くは試料室の周
辺部に移動してしまい、中心部（観察領域）に試料がい
なくなったり、少なくなるという問題があった。

【０００８】また、従来は、試料が触れている環境を変
化させた場合の試料の反応を観察することができないと
言う問題点があった。

【０００９】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者は、鋭
意研究した結果、試料に例えば酸素のような刺激物質を
与えながら、観察すればよいことを着想し、本発明を成
すに至ったよって、本発明は、第１に、Ｘ線顕微鏡を用
いて、「媒質中に浮遊する生物試料」を観察する方法に
おいて、前記媒質に「生物試料を直接又は間接に刺激す
る刺激物室」を接触させながら、観察することを特徴と
する方法（請求項１）を提供する。

【００１０】また、本発明は、試料室内に“媒質とその
中に浮遊する生物試料”を満たした開放型試料カプセ
ル、前記媒質と接触する「生物試料を直接又は間接に刺
激する刺激物質」、刺激物質を入れたカプセル収納室、
及び試料カプセルを保持すると共にカプセル収納室を真
空空間から隔離する試料ホルダとからなる組合せ（請求
項２）を、提供する。

【００１１】また、本発明は、カプセル収納室を備えた
試料ホルダにおいて、該カプセル収納室に「生物試料を
直接又は間接に刺激する刺激物質」を流入させる入口及
び出口を設けたことを特徴とするホルダ（請求項３）を
提供する。更に、本発明は、刺激物質を入れたカプセル
収納室を備えた試料ホルダ（請求項４）を提供する。

【００１２】

【作用】本発明によれば、生物試料を直接又は間接に刺
激物質で刺激しながら観察するので、生物試料をある程
度自由に操ることができる。例えば、カプセル収納室に
酸素ガス（本発明で言う刺激物質の例）を入れておけ
ば、媒質中の酸素濃度分布を中心部に薄く周辺部に高く
することができるので、試料が嫌気性で自力走行可能な
場合の場合、試料を中心部の観察領域に集めることがで
きる。また例えば、カプセル収納室に酸素を含まないガ
ス（本発明で言う刺激物質の例：窒素、アルゴン、ヘリ
ウムなど）を入れておけば、一般に、試料は試料室内に
ほぼ均一に分布しているので、試料室内の酸素濃度は均
一に低下し、中心部と周辺部との間に酸素濃度勾配が生
じない。従って、試料が好気性でかつ自力走行可能な場
合でも試料が周辺部へ拡散してしまうことがない。

【００１３】試料が好酸性（又は好アルカリ性）で自力
走行可能な場合にはカプセル収納室にアルカリ性（又は
酸素）のガス又は液体を入れておくと、媒質中のｐＨ分
布を中心部に高く（又は低く）周辺部に低く（又は高
く）することができるので、試料を中心部（＝観察領
域）に集めることができる。その外、本発明は、試料が
どんな刺激物質にどんな反応を示すかを初めて観察可能
にする。

【００１４】刺激物質としては、試料が好む物質、嫌う
物質、試料が忌避する物質、試料が反応する物質又はこ
のような物質を作りだす（遊離する）物質などを例とし
てあげることができる。以下、実施例により本発明をよ
り具体的に説明するが、本発明はこれに限られるもので
はない。

【００１５】

【実施例１】図１は、本実施例にかかる「開放型試料カ
プセルＢとそれを内部に保持した試料ホルダＨからなる
組合せ」を示す概略垂直断面図である。試料カプセルＢ
は、上に説明した従来のカプセルと同じであり、４つの
小スペーサ（７）とこれを挟む一対のＸ線透過膜（８
ａ）からなる。窒化シリコン薄膜からなるＸ線透過膜
（８ａ）は薄いので、シリコン基板（８）上に形成され
る。シリコン基板（８）は比較的厚く、Ｘ線を透過させ
ないので、中心部にＸ線透過用の窓孔（６）を有する。
スペーサ（７）は図１では見えないが、これを一対のＸ
線透過膜（８ａ）が挟んでいる。一対のＸ線透過膜（８
ａ）とスペーサが囲む空間が試料室で、ここに“媒質
（９）とその中に浮遊する生物試料（１０）”が満たさ
れている。ここでは、媒質（９）は水であり、生物試料
（１０）は好気性バクテリアである。

【００１６】試料ホルダＨは、大きく分けて、有底の円
筒状を呈する主ホルダ（１ａ）と円板状を呈する押さえ
ホルダ（１ｂ）との２部材からなる。主ホルダ（１ａ）
と押さえホルダ（１ｂ）には、それぞれほぼ中央にＸ線
透過のための開口部がある。この開口部を通ってＸ線が
試料カプセルに入射し、出射する。両ホルダを図１の矢
印Ｘ、Ｙ方向から締めつける適当な接合手段により接合
すると、内部に試料カプセルＢのカプセル収納室（１
２）が生じる。カプセル収納室（１２）は試料カプセル
Ｂより直径が大きく、そのため、試料カプセルを入れる
と、カプセルの外側に予備室が成形される。つまり、予
備室はカプセル収納室（１２）の一部をなす。カプセル
収納室（１２）はホルダ（１ａ，１ｂ）と試料カプセル
Ｂの基板（８）との間にＯリングを挟むことにより、外
部の真空空間と隔離される。カプセル収納室（予備室）
は、試料室とのみ通じており、試料室内の媒質は、この
予備室に露出している。

【００１７】カプセル収納室（予備室）には、脱酸素剤
（１１）が予め置かれてあり、始めは空気であったとし
ても時間が経過すると、カプセル収納室は酸素を含まな
いガス（ほとんど窒素）で満たされるようになる。その
ため、前述のように試料室内に酸素濃度の勾配が発生し
ないので、少なくとも試料の拡散は防げる。本実施例で
は、スペーサは一対のＸ線透過膜（８ａ）と別体に設け
られたように説明したが、実際には、非常に小さいの
で、どちらかのＸ線透過膜（８ａ）上に予め接合してあ
ることが望ましい。

【００１８】

【実施例２】図２は本実施例にかかる試料ホルダＨを示
す概略断面図で、説明の都合上使用状態に置いた開放型
試料カプセルＢも合わせて示してある。図２は、端面図
ではないので、スペーサ（７）も向こうに見える。一対
のＸ線透過膜（８ａ）がスペーサ（７）を挟んでおり、
一対のＸ線透過膜（８ａ）とスペーサが囲む空間が試料
室（１３）である。図２では、試料室（１３）に試料が
入っていない。試料室（１３）は開放されており、カプ
セル収納室（１２）内に通じている。カプセル収納室
（１２）は実施例１と同じくホルダ（１ａ，１ｂ）と試
料カプセルとの間に形成され、Ｏリング（５）によって
外部の真空空間とは隔離されている。但し、カプセル収
納室（１２）には、入口（２）と出口（３）を設けてあ
り、これを通して刺激物質を連続的に供給、排出するこ
とができる。従って、試料によって刺激物質が消費又は
分解されても差し支えない。この場合、刺激物質は気体
でも液体でもよい。また、刺激物質を適当な溶媒又は希
釈剤、希釈ガスに溶解又は混合した状態で供給してもよ
い。試料が媒質中に存在しているときには、カプセル収
納室に流入された刺激物質が、媒質のカプセル収納室に
露出している部分から溶け込み、試料に触れている環境
を変化される。

【００１９】観察の間、入口（２）と出口（３）を通し
てカプセル収納室（１２）内に刺激物質を供給してもよ
いし、カプセル収納室（１２）内に最初に存在した空気
を入口（２）から刺激物質を供給し、空気は出口（３）
から排出させることによってカプセル収納室（１２）内
を刺激物質で置換した後、入口（２）と出口（３）に栓
をしてもよい。その上で顕微鏡にセットして観察するの
である。この場合、栓に代えて入口（２）と出口（３）
にバルブを設置してもよい。

【００２０】

【発明の効果】本発明によれば、生物試料を刺激物質で
刺激しながら観察するので、生物試料をある程度自由に
操ることができる。例えば、試料を観察領域に集めて観
察することができる。また、試料がどんな刺激物質にど
んな反応を示すかを初めて観察可能にする。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施例１にかかる「開放型試料カプセ
ルＢとそれを内部に保持した試料ホルダＨからなる組合
せ」を示す概略断面端面図である。

【図２】同じく実施例２にかかる試料ホルダＨを示す概
略断面図で、説明の都合上、使用状態に置いた開放型試
料カプセルＢも合わせて示してある。

【図３】Ｘ線顕微鏡の簡単な構造を示す概念図である。

【図４】Ｘ線吸収係数のスペクトルを示すグラフであ
る。

【図５】初期の試料カプセル（非開放型）の分解斜視図
（概略）である。

【図６】開放型試料カプセルの分解斜視図（概略）であ
る。

【図７】従来の試料ホルダに概略断面図である。説明の
都合上、使用状態に置いた開放型試料カプセルＢも合わ
せて示してある。

【符号の説明】

１ａ主ホルダの本体１ｂ押さえホルダの本体２入口３出口４Ｘ線透過のための開口部５Ｏリング６Ｘ線透過のための窓孔７スペーサ８基板８ａＸ線透過透過膜９媒質１０生物試料１１脱酸素剤（刺激物質の一例）１２カプセル収納室１３試料室Ｂ試料カプセル（７＋８＋８ａ）Ｈ試料ホルダ（１ａ＋１ｂ）Ｃコンデンサー光学系Ｉ結像光学系Ｋ撮像装置Ｒ鏡筒用真空容器Ｍモニタ装置Ｖ真空排気系ＧＸ線発生器

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者清水秀明茨城県つくば市梅園１丁目１番４工業技術院電子技術総合研究所内 (72)発明者眞島利和茨城県つくば市梅園１丁目１番４工業技術院電子技術総合研究所内 (72)発明者近藤洋行東京都品川区西大井１ー６ー３株式会社ニコン大井製作所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｘ線顕微鏡を用いて、「媒質中に浮遊す
る生物試料」を観察する方法において、前記媒質に「生
物試料を直接又は間接に刺激する刺激物質」を接触させ
ながら、観察することを特徴とする方法。
【請求項２】試料室内に“媒質とその中に浮遊する生
物試料”を満たした開放型試料カプセル、前記媒質と接
触する「生物試料を直接又は間接に刺激する刺激物
質」、刺激物質を入れたカプセル収納室、及び試料カプ
セルを保持すると共にカプセル収納室を真空空間から隔
離する試料ホルダとからなる組合せ。
【請求項３】カプセル収納室を備えた試料ホルダにお
いて、該カプセル収納室に入口及び出口を設けたことを
特徴とする試料ホルダ。
【請求項４】刺激物質を入れたカプセル収納室を備え
た試料ホルダ。