JPH03197838A - Ｘ線顕微鏡用試料カプセル - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、生体の高倍率観察に威力を発揮する軟Ｘ線の
透過観察を行うＸ線顕微鏡に用いられて好適な試料カプ
セル、特に観察視野における微細な観察対象の穆動の防
止機構に関する。

［従来の技術］ 医学や生物工学等における、生体の高倍率観察に対する
要求の高まりに対応して、波長２〜５ｒｖ程度の軟Ｘ線
を用いるＸ線顕＠鏡が注目されており、このＸ線顕微鏡
を用いて生体観察を行うための試料カプセルとしては、
特開昭６３−２６３５００号や同８３−２９８２００号
に示されるものが知られている。

第４図は、軟Ｘ線を用いるＸ線顕微鏡の一例の構造を簡
単に示し、また、第５図　（ａ）、（ｂ）は、種々の材
料における軟Ｘ線の波長と線吸収係数の関係を示す。

軟Ｘ線は、Ｘ線と呼ばれる波長１ｐｍ〜１０ｎｍの領域
の電磁波のうち、通常は、２００ｐＨ１以上の波長を有
するものとされ、波長４００〜８００　ｎｍ（７）可視
光線よりも２桁以上も短い波長の電磁波である。また、
この軟Ｘ線は、透過する物質に良く吸収され、種々の物
質内における光路単位長さ当りの吸収率、すなわち線吸
収係数は、物質の密度に比例し、一般的には波長が長く
なるほど高くなるが、第５図　（ａ）、（ｂ）にも示さ
れるように、各物貿の分子構造に応じた波長の、低い線
吸収係数の領域をいくつか有する。

第４図において、コンデンサー光学系Ｃと試料ホルダＨ
と結像光学系Ｉと撮像装置には、Ｘ線発生器Ｇの出力光
軸上に直列に配置され、Ｘ線発生器Ｇから撮像装置Ｋま
でのＸ線光学系の光路長は約２ｍである。また、この光
学系全体は、排気系Ｖを有する真空槽Ｒ内に納められて
いる。

さて、観察試料を装填した試料カプセルＢを試料ホルダ
Ｈにセットした後、排気系■を作動して真空槽Ｒ内を真
空排気し、真空度を４．８ｘ　１Ｏ−２Ｐａ以下に維持
した状態で観察を行う。Ｘ線発生器Ｇから射出された軟
Ｘ線ビームは、コンデンサー光学系Ｃにより収束され、
試料ホルダＨにセットされた試料カプセルＢを透過する
。透過した軟Ｘ線は、結像光学系Ｉにより撮像装置に上
に結像して真空槽Ｒ外のモニタ装置Ｍに観察像を与える
。

軟Ｘ線を用いたＸ線顕微鏡は１．軟Ｘ線に対し１気圧下
で２　Ｘ　１０−’μｍ−程度の吸収率を有する大気に
よる吸収を避けるために、光学系全体をその光路長に応
じた高い真空度に保つ必要があり、軟Ｘ線の収束に係る
レンズ素子に性能の良いものが得にくい等の欠点を有す
るが、可視光線より格段に短い波長のＸ線を用いるため
、従来の光学顕微鏡よりも高い解像度を期待できる。ま
た、生体の直接観察を透過材料越しに行うことが可能で
、組織培養液とともに生体を液封した試料カプセルを用
いれば、生体試料を損傷することなく長時間にわたるそ
の生理観察を実行できる。従って、電子ビームを試料表
面に対して直接照射する電子顕微鏡の場合のような、試
料の乾燥や金属蒸着等、観察物にダメージを与える前処
理を不要とすることができる。

また、第５図（ａ）の水に対する線吸収係数においてＶ
字状に示されている、水の窓と呼ばれる水に対し同係数
が低い波長領域（２，３ｎｍ〜４．４ｎｍ）においては
、第５図（ａ）に示されるように、軟Ｘ線の水に対する
吸収率と、生体を構成する蛋白質等に対する吸収率との
差が大きい。従って、この波長領域の軟Ｘ線を使用すれ
ば、例えば細胞内に浮遊する小器官等を観察する場合に
、その観察画像のコントラストが良いという利点もある
。

ところで、上述したように軟Ｘ線は、種々の物質により
簡単に吸収されてしまうから、軟Ｘ線光路中に挿入され
る、観察試料を気密封入した試料カプセルにおいては、
その試料層の厚さを薄く採るとともに、密閉を兼ねた観
察窓材の軟Ｘ線の吸収量を極力小さくする必要がある。

従って、この窓材には、軟Ｘ線に対する線吸収係数が低
くて膜強度も高い材料、例えば第５図　（ｂ）の窒化シ
リコン５１３８４を薄膜形成したものが一般的に採用さ
れている。

第３図は、従来の試料カプセルの構造を説明するための
もので、　（ａ）は、試料カプセルの試料封入部分の平
面構造を、また　（ｂ）は、試料カプセルの断面構造を
その試料容器とともに示す。本従来例は、Ｘ線透過窓Ｉ
Ｃ１２Ｃを形成した２枚のチップ１．２の間にリング状
のスペーサ３を挿入して、スペーサ３の内側の密閉空間
に観察試料を保持するものである。

第３図　（ａ）、（ｂ）において、チップ１．２は、シ
リコン板１ａ、２ａ上に窒化シリコン薄ｇｔ　ｂ。

２ｂを形成した後に、Ｘ線透過窓ＩＣ１２Ｃに相当する
部分のシリコン層をエツチングにより除去したものであ
る。ここで、薄膜１ｂ、２ｂの張られたＸ線透過窓１ｃ
、２ｃは２００μｍ角の正方形であり、その膜厚は、０
．０５〜０．１μ０である。また、チップ１．２の対向
する薄膜面の間に挿入される円環状のスペーサ３は、試
料層の厚さを保持するもので、用途に応じて１〜１５μ
ｍの範囲で適切な厚さのものが選択される。例えば、軟
Ｘ線の波長を２．３ｒ＋ｍに選択して、窒化シリコン薄
膜１ｂ、２ｂ膜厚をそれぞれ０，１μｍ、試料層（水）
の厚さを１０μｍとすれば、それぞれの軟Ｘ線透過率は
３９％、２７３％となり、全体では約１１％の透過率が
確保される。

一方、スペーサ３は、表裏両面にシール面を有し、２枚
のチップ１．２と密着して円環の内側の試料空間の密封
を行う機能を兼ね備えている。また、試料容器４．５は
、ねじ６により相互に固定されるとともに、０リング８
を介して、その内部に納めたチップ１．２を対向方向に
押圧するもので、この押圧力によりスペーサ３とチップ
１．２の接触面に、試料カプセルを真空中で保持するた
めに必要な密着性が付与される。

［発明が解決しようとする課題］ 従来例の試料カプセルにおいては、チップ１上にスペー
サ３を数置して、その内側に液状の観察試料、例えば培
養液中に浮遊させた細胞を滴定した後、チップ２をかぶ
せ、試料容器４．５に納めねじ６で固定して試料準備を
完了する。次に、この試料カプセルを第４図のＸ線顕微
鏡にセットして真空引きを行った後、中央の矢印のよう
に軟Ｘ線を透過させて観察を行うが、観察中、および真
空引き等の準備期間における観察対象の移動が問題とさ
れる。

すなわち、スペーサ３内の試料空間よりも格段に狭い観
察窓１ｃ、２ｃを通して、この観察窓ＩＣ１２Ｃよりさ
らに格段に小さな観察対象を視１Ｆに捕えるＸ線顕微鏡
においては、その観察視野が狭いため、観察試料のわず
かな移動も観察の阻害となる。例えば、培養液の対流や
細胞の活動に伴う移動に加えて、第４図のＸ線顕微鏡の
ように試料カプセルを縦型に保持する場合には、重力や
浮力による観察対象の移動とそれに伴う観察対象の混入
が発生するため、−個の対象物の長時間の連続観察は困
難であった。

本発明は、−個の観察対象を長時間、Ｘ線顕微鏡の狭い
観察視野の中に捕えることが容易な、試料空間内におけ
る微小な観察対象の移動を妨げる機構を備えた試料カプ
セルを提供することを目的とする。

［課題を解決するための手段］ 本発明の請求項第１項に係るＸ線顕微鏡用試料カプセル
は、対向させた２枚のＸ線透過窓付平板と、両平板間の
距離を保持するスペーサとからなる試料カプセルにおい
て、 平板間に、少なくとも１個の貫通孔または窪みを有する
試料保持枠を配置したものである。

本発明の請求項第２項に係るＸ線顕微鏡用試料カプセル
は、請求項第１項の試料カプセルにおいて、試料保持枠
がそのスペーサを兼用するものである。

［作用］ 本発明の請求項第１項に係るＸ線顕微鏡用試料カプセル
においては、スペーサにより対向間隔を維持した平板間
の空間に、微小な観察対象を含む試料液を保持した状態
で、Ｘ線による観察対象のＸ線透過窓越しの観察を行う
。このとき、平板間に配置された試料保持枠は、その貫
通孔または窪みの内部に小体積の試料液を蓄え、観察対
象の移動範囲をこの小体積の範囲に制限する。

試料保持枠としては、感光性ガラス、感光性樹脂（レジ
スト）、金属箔、セラミック板を始め種々の材料を採用
できるが、Ｘ線非透過な材料を用いる場合には、開口は
すべて貫通孔である必要がある。また、透過型の光学顕
微鏡による予備観察を容易とするためには、ポリカーボ
ネイトやポリエステルのような透明材料の採用が望まし
い。

各貫通孔の開口形状やその大きさとしては、その中に納
まる細胞等の観察対象の大きさに適合して、その２倍以
上の径を有していることが望ましく、その位置としては
、Ｘ線透過窓内の観察に都合の良い場所にある必要があ
る。また、例えば、貫通孔壁を薄くして全体をハニカム
構造とすれば視野に占める貫通孔部分の面積が大きくな
って都合が良い。

また、試料保持枠は、試料装填状態において、両平板と
もに密着して観察窓内に小さな閉空間を貫通孔ごとに形
成するものでも良いが、培養液から酸素補給を行うよう
な場合には、平板との間に適当な隙間を形成して、試料
液の循環がいくらか維持されるのが望ましい。

本発明の請求項第２項に係るＸ線顕微鏡用試料カプセル
においては、試料保持枠の少なくとも一部分は、平板の
対向距離を維持するのに十分な強度を持つとともに両平
板に接触しており、平板間に挟まれて観察対象の移動を
制限する一方で、平板間の間隔を保ち、試料層の厚みを
保持する。

［本発明の実施例］ 本発明の実施例を図面を参照して説明する。ここで、第
３図　（ａ）、（ｂ）の従来例の場合と同様な構造と機
能を有する部材には同一の符号を付してその説明を省略
する。

第１図は、本発明の第１実施例に係る試料カプセルの構
造を説明するためのもので、　（ａ）は、試料カプセル
の試料封入部分の平面構造、また　（ｂ）は、試料カプ
セルの断面構造をその試料容器とともに示す。本実施例
は、チップ１．２（平板）とスペーサ３とで構成される
従来例の試料カプセルにおいて、多孔レジスト層７（試
料保持枠）を備えさせたものである。

第１図（ａ）において、チップ１の窒化シリコン薄膜ｌ
ｂ上には、Ｘ線透過窓１ｃ、２ｃに相当する部分に、フ
ォトリソグラフィ法で形成された直径５μｍの多数の貫
通孔を有する疎水性、または好ましくは親水性のレジス
ト層７が形成されている。このレジスト層７は、スペー
サ３よりもわずかに薄い厚さで、チップ２をかぶせた際
に、レジスト層７とチップ２との間に掻く薄い試料液層
を形成する。また、チップ１上に載置されたスペーサ３
とレジスト層７との間の空間が大きな試料液の貯留空間
を形成する。

さて、レジスト層７を形成したチップ１上にスペーサ３
を載置して、その内側に観察対象の細胞を含む培養液を
滴定し、チップ２をかぶせ、これを試料容器４．５に納
めてねじ６で締付けると、スペーサ３により、その厚さ
を保たれ、また周囲からは密閉された培養液空間が形成
される。ここで、Ｘ線透過窓１ｃ、２ｃ部においては、
レジスト層７の貫通孔内に微小な細胞を含む培養液が蓄
えられ、これらの細胞は貫通孔壁面に拘束されて外部へ
の移動や他側体との混入を抑制される。本実施例では、
レジスト層７とチップ２との間に試料液層が形成される
ので、培養液中の細胞に対する酸素供給が維持され、ま
たレジスト層７とチップ２との直接接触によるＸ線透過
窓１ｃ、２０部への不要な応力発生が無い。

第２図　（ａ）〜　（ｄ）は、本発明の別の実施例に係
る試料カプセルに用いられる試料保持枠の平面構造をチ
ップやスペーサとともに示す。

第２図　（ａ）の試料カプセルは、試料保持枠としてフ
ィルター用の多孔質樹脂膜７ａを用いたものである。フ
ィルター用の多孔質樹脂膜７ａは、種々の貫通孔直径や
膜厚を有するものが広く市販されているため、これらの
中から用途に応じたものを選択してチップ１．２間に挿
入すれば、簡単に試料保持枠を得られる。

また、第２図　（ｂ）の試料カプセルは、チップ１上に
試料保持枠として、円形の貫通孔を１個だけ形成したレ
ジスト層７ｂを設けたものである。

また、第２図　（Ｃ）の試料カプセルは、チップ１上に
試料保持枠として、十字型の貫通孔を１個形成したレジ
スト層７ｃを設けたものである。貫通孔形状を？ｌ雑に
すれば、貫通孔内の培養液量を維持したままで、貫通孔
壁面による細胞の拘束力を高めることができ、例えば、
観察視野内で細胞の姿勢を揃えたい場合等に有効である
。

また、第２［３（ｄ）の試料カプセルは、スペーサｍ　
ｆｉＥを兼ね備えた試料保持枠である金属薄膜７ｄをチ
ップ１上に形成したもので、金属箔７ｄのＸ線透過窓Ｉ
Ｃ５２Ｃに相当する中央部分には、規則正しく配列させ
た貫通孔が形成されている。この試料カプセルは、試料
液を滴定してチップ２をかぶせるだけで試料空間が形成
される。

なお、第１図　（ａ）および第２図　（ａ）〜　（ｄ）
のスペーサ３に溝部を設けることで、チップをセットす
る際にＸ線透過窓にかかる圧力をさらに逃がすことが可
能となる。この溝部は、十分に細く形成されれば、圧力
がかかった場合以外には液体の流動が無いから、適当な
量の試料液はスペーサ３の内側に保存される。

また、スペーサ３を多孔性の材料にして、圧力上昇分の
液体を吸収させたり、スペーサ３の一部分をダイヤフラ
ム状に形成して、圧力上昇分の液体を外部にふくらませ
る構造としたりする等の変形も可能である。

ただし、いずれの場合においても、スペーサを越えて（
通過して）試料液が逃げる場合には、その試料容器は、
第６図に示すように、Ｏリング８を備えてシーリングを
行う。

［発明の効果］ 本発明の請求項第１項に係る試料カプセルにおいては、
試料保持枠が試料液および試料液中の観察対象の自由な
移動を妨げ、観察対象の移動範囲を試料保持枠の内側だ
けに限定することも可能であるから、観察視野からの観
察対象の離脱や、他の細胞等との混入の確率を著しく下
げることが可能である。従って、同一の観察対象を長時
間に渡り追跡することが容易となる。

本発明の請求項第２項に係る試料カプセルにおいては、
部品点数を増すことなく容易に試料支持枠を得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の実施例に係る試料カプセルを説明す
るための図で、　（ａ）はこの試料カプセルの試料封入
部分の構造を示す平面図、また　（ｂ）はこの試料カプ
セルを試料容器とともに示した断面図である。 第２図　（ａ）〜　（ｄ）は、本発明の別の実施例に係
る試料カプセルにおける、それぞれの試料封入部分の構
造を示す平面図である。 第３図は、従来例の試料カプセルを説明するための図で
、　（ａ）は、試料カプセルの試料封入部分の構造を示
す平面図、また　（ｂ）は、試料カプセルをその試料容
器とともに示した断面図である。 第４図は、一般的な、軟Ｘ線を用いるＸ線顕微鏡の構成
を示す模式図である。 第５図　（ａ）　　（ｂ）は、各種物質の軟Ｘ線に対す
る線吸収係数を示す線図である。 第６図は、試料容器にシーリング機構を設けたものの断
面図である。 ［主要部分の符号の説明］ １．２・・・チップ　　　３・・・スペーサ４．５・・
・試料容器　　７・・・レジスト層１ｃ、２ｃ・・・Ｘ
線透過窓

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）対向させた２枚のＸ線透過窓付平板と、両平板間
   の距離を保持するスペーサとからなるＸ線顕微鏡用試料
   カプセルにおいて、 前記平板間に、少なくとも一個の貫通孔または窪みを有
   する試料保持枠を配置したことを特徴とする試料カプセ
   ル。
2. （２）前記保持枠が前記スペーサを兼用していることを
   特徴とする請求項第１項記載の試料カプセル。