JP2890579B2

JP2890579B2 - Ｘ線顕微鏡用の試料ホルダ

Info

Publication number: JP2890579B2
Application number: JP1336471A
Authority: JP
Inventors: 隆松原
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 1989-12-27
Filing date: 1989-12-27
Publication date: 1999-05-17
Anticipated expiration: 2014-05-17
Also published as: JPH03197837A

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、生体の高倍率観察に威力を発揮する軟Ｘ線
の透過観察に用いられて好適な液封型の試料カプセル、
特にその破裂防止技術に関する。

［従来の技術］医学や生物工学等における、生体の高倍率観察に対す
る要求の高まりに対応して、波長２〜5nm程度の軟Ｘ線
を用いるＸ線顕微鏡が注目されており、このＸ線顕微鏡
を用いて生体観察を行うための試料カプセルとしては、
特開昭63−263500号や同63−298200号に示されるものが
知られている。

第４図は、軟Ｘ線を用いるＸ線顕微鏡の一例の構造を
簡単に示し、また、第５図（ａ）、（ｂ）は、種々の材
料における軟Ｘ線の波長と線吸収係数の関係を示す。

軟Ｘ線は、Ｘ線と呼ばれる波長1pm〜10nmの領域の電
磁波のうち、通常は、200pm以上の波長を有するものと
され、波長400〜800nmの可視光線よりも２桁以上も短い
波長の電磁波である。また、この軟Ｘ線は、透過する物
質に良く吸収され、種々の物質内における光路単位長さ
当りの吸収率、すなわち線吸収係数は、物質の密度に比
例し、一般的には波長が長くなるほど高くなるが、第５
図（ａ）、（ｂ）にも示されるように、各物質の分子構
造に応じた波長の、低い線吸収係数の領域をいくつか有
する。

第４図において、コンデンサー光学系Ｃと試料ホルダ
Ｈと結像光学系Ｉと撮像装置Ｋは、Ｘ線発生器Ｇの出力
光軸上に直列に配置され、Ｘ線発生器Ｇから撮像装置Ｋ
までのＸ線光学系の光路長は約2mである。また、この光
学系全体は、排気系Ｖを有する真空槽Ｒ内に納められて
いる。

さて、観察試料を装填した試料カプセルＢを試料ホル
ダＨにセットした後、排気系Ｖを作動して真空槽Ｒ内を
真空排気し、真空度を4.8×10^-2Pa以下に維持した状態
で観察を行う。Ｘ線発生器Ｇから射出された軟Ｘ線ビー
ムは、コンデンサー光学系Ｃにより収束され、試料ホル
ダＨにセットされた試料カプセルＢを透過する。透過し
た軟Ｘ線は、結像光学系Ｉにより撮像装置Ｋ上に結像し
て真空槽Ｒ外のモニタ装置Ｍに観察像を与える。

軟Ｘ線を用いたＸ線顕微鏡は、軟Ｘ線に対し１気圧下
で２×10^-3μm^-1程度の吸収率を有する大気による吸収
を避けるために、光学系全体をその光路長に応じた高い
真空度に保つ必要があり、軟Ｘ線の収束に係るレンズ素
子に性能の良いものが得にくい等の欠点を有するが、可
視光線より格段に短い波長のＸ線を用いるため、従来の
光学顕微鏡よりも高い解像度を期待できる。また、生体
の直接観察を透過材料越しに行うことが可能で、組成培
養液とともに生体を液封した試料カプセルを用いれば、
生体試料を損傷することなく長時間にわたるその生理観
察を実行できる。従って、電子ビームを試料表面に対し
て直接照射する電子顕微鏡の場合のような、試料の乾燥
や金属蒸着等、観察物にダメージを与える前処理を不要
とすることができる。

また、第５図（ａ）の水に対する線吸収係数において
Ｖ字状に示されている、水の窓と呼ばれる水に対し同係
数が低い波長領域（2.3nm〜4.4nm）においては、第５図
（ａ）に示されるように、軟Ｘ線の水に対する吸収率
と、生体を構成する蛋白質等に対する吸収率との差が大
きい。従って、この波長領域の軟Ｘ線を使用すれば、例
えば細胞内に浮遊する小器官等を観察する場合に、その
観察画像のコントラストが良いという利点もある。

ところで、上述したように軟Ｘ線は、種々の物質によ
り簡単に吸収されてしまうから、軟Ｘ線光路中に挿入さ
れる、観察試料を気密封入した試料カプセルにおいて
は、その試料層の厚さを薄く採るとともに、密閉を兼ね
た観察窓材の軟Ｘ線の吸収量を極力小さくする必要があ
る。従って、この窓材には、軟Ｘ線に対する線吸収係数
が低くて膜強度も高い材料、例えば第５図（ｂ）の窒化
シリコンS_i3N₄等を薄膜形成したものが一般的に採用さ
れている。

第３図は、従来の試料カプセル及び試料容器からなる
試料ホルダの構造を説明するためのもので、（ａ）は、
試料カプセルに用いられるスペーサの構造を、また
（ｂ）は、試料カプセル及び試料容器からなる試料ホル
ダの断面構造を示す。本従来例は、Ｘ線透過窓1c、2cを
形成した２枚のチップ１、２の間にリング状のスペーサ
3Rを挿入し、スペーサ3Rの内側の密閉空間に試料液を保
持するものである。

第３図（ａ）、（ｂ）において、チップ１、２は、シ
リコン板1a、2a上に窒化シリコン薄膜1b、2bを形成した
後に、Ｘ線透過窓1c、2cに相当する部分のシリコン層を
エッチングにより除去したものである。ここで、中央の
矢印のようにＸ線を透過させるための、薄膜1b、2bの張
られたＸ線透過窓1c、2cは200μｍ角の正方形であり、
その膜厚は、0.05〜0.1μｍである。

また、チップ１、２の対向する薄膜面の間に挿入され
る円環状のスペーサ3Rは、試料層の厚さを保持するもの
で、用途に応じて１〜15μｍの範囲で適切な厚さのもの
が選択される。例えば、軟Ｘ線の波長を2.3nmに選択し
て、窒化シリコン薄膜1b、2b膜厚をそれぞれ0.1μｍ、
また試料層（水）の厚さを10μｍとすれば、それぞれの
軟Ｘ線透過率は39％、27.3％となり、全体では約11％の
透過率が確保される。

一方、スペーサ3Rは、表裏両面にシール面を有し、２
枚のチップ１、２と密着して円環の内側の試料空間の密
封を行う機能を兼ね備える。また、試料容器4R、5Rは、
ねじ６により相互に固定されるとともに、Ｏリング８を
介してその内部に納めたチップ１、２を対向方向に押圧
するためのもので、この押圧力によりスペーサ3Rとチッ
プ１、２の接触面に、試料カプセルを真空中で保持する
ために必要な密着性が付与される。

［発明が解決しようとする課題］従来例の試料カプセルにおいては、チップ１上にスペ
ーサ3Rを載置して、その内側に液状の観察試料、例えば
培養液中に浮遊させた細胞を滴定した後、チップ２をか
ぶせ、試料容器4R、5Rに納めねじ６で固定して試料準備
を完了する。ところが、このときチップ１、２とスペー
サ3Rとで密閉された試料空間中の培養液も圧縮状態とな
り、内圧を高めてＸ線透過窓1c、2cの窒化シリコン薄膜
1b、2bを破裂させる事故が発生した。また、試料装填時
に破裂しなくても、後に第４図のＸ線顕微鏡にセットし
て真空排気を行った際に破裂する可能性があるため、窒
化シリコン薄膜1b、2b強度の安全率を高く採り、その厚
さを必要以上に厚く形成しておく必要があった。

本発明は、観察試料を装填する際にその内圧が高まら
ない、安全確実な試料カプセル及び試料容器からなる試
料ホルダを提供することを目的とする。

［課題を解決するための手段］本発明に係わる試料ホルダは、対向させた２枚のＸ線
透過窓付平板と両平板間の距離を保持するスペーサとか
らなるＸ線顕微鏡用試料カプセル及びカプセルを収容す
る試料容器からなるＸ線顕微鏡用試料ホルダであって、
試料カプセルはスペーサの一部に試料の逃げ口を有し、
試料容器はカプセルを外部より遮断する真空シールを有
することを特徴とするものである。

［作用］本発明に係る試料カプセルにおいては、スペーサを挟
んで対向した平板間の、スペーサの内側の空間に液状の
試料を保持した状態で、一方のＸ線透過窓から他方の窓
へ軟Ｘ線を透過させて観察を行う。

一方、スペーサには、その一部に試料の逃げ口が開い
ているから、試料の内圧が高まるとここから試料があふ
れ出して内圧の上昇を緩和する。従って、例えば試料装
填時に、両平板を対向方向に押圧してスペーサが変形す
るような場合においても試料内圧の上昇量は小さく、観
察窓に対する負荷もあまり大きくならない。ここで、ス
ペーサ自体は試料の密閉機能を持たないから、試料カプ
セルを真空中に保持するためには、スペーサの外部に密
閉手段を設ける必要があるが、これは、スペーサの外側
の基板間に設けた環状のシール部材としても良いが、両
平板の対向しない面をシール面とする密閉容器等として
も良い。この密閉手段とスペーサの間に形成された空間
が、あふれ出た観察試料を受け止めるとともに、スペー
サ内の試料空間における圧力上昇を緩和する。

［本発明の実施例］本発明の実施例を図面を参照して説明する。ここで、
第３図（ａ）、（ｂ）の従来例の場合と同様な構造と機
能を有する部材には同一の符号を付してその説明を省略
する。

第１図は、本発明の第１実施例に係る試料カプセル及
び試料容器からなる試料ホルダの構造を説明するための
もので、（ａ）は、試料カプセルに用いられるスペーサ
の構造を、また（ｂ）は、試料カプセル及び試料容器か
らなる試料ホルダの断面構造を示す。本実施例は、試料
の逃げ道3aを形成したスペーサ３およびチップ１、２
（平板）で構成される試料空間の密閉を、試料容器４、
５に備えた３つのＯリングシール８及び8aで行うもので
ある。

第１図（ａ）において、チップ１上に載置されたスペ
ーサ３は、Ｘ線透過窓1c、2cに相当する部分を含む面積
の長方形の試料空間と、試料の逃げ道である溝部3aとを
備える。

また、第１図（ｂ）において、チップ１、２を収納し
た試料容器４、５は、Ｘ線透過窓1c、2cを露出させる窓
と、この窓に沿ったＯリング８によるチップ１、２に対
する環状のシール面と、試料容器４、５相互間のＯリン
グ8aによるシール面とを有する。この３つのシール面で
閉じられた空間が、スペーサ３内部の試料空間を含む、
外部に対する密閉空間である。

ところで、本実施例において、チップ１、２の製作は
次の手順で行った。

まず、シリコン板1a、2a上にLP−CVD法により窒化シ
リコン薄膜を形成した。プロセス条件は、減圧された雰
囲気ガス（NH₃ガスおよびS_iH₂Cl₂ガス）中で700〜900℃
に温度維持したシリコン板1a、2aの表裏両面に窒化シリ
コンS_i3N₄層を気相成長させ、内部応力が10⁹〜10¹¹dyn/
cm²に制御された薄膜1b、2bを形成した。このLP−CVD法
は、量産性に優れ、膜中の内部欠陥が少なく、膜の内部
応力のコントロールも容易である。

次に、裏面の窒化シリコン薄膜にフォトリソグラフィ
法により、Ｘ線透過窓1c、2cに相当する孔を形成し、こ
の孔から異方性エッチングによりシリコン層を、表面の
窒化シリコン板1b、2bに達するまで除去した。ここで、
エッチング液にはエチレンジアミンとピロカテコールと
水の混合液を用いた。

以上により、窒化シリコン薄膜1b、2bの張られたＸ線
透過窓1c、2cを有するチップ１、２を得た。

さて、チップ１上にスペーサ３を載置してその内側に
液状の観察試料を滴定し、チップ２をかぶせた後に、こ
れを試料容器４、５に納めてねじ６で締付けると、Ｏリ
ングシール８及び8aによる各シール面に必要なシール機
能が付与されるとともに、圧縮された試料空間からスペ
ーサ３の溝部3aを通って余分な試料があふれ出して、試
料空間の圧力上昇が緩和される。

ところで、スペーサは、この実施例の形状および材料
に限定されないから、スペーサは、金属、プラスチック
ス、ガラス等の箔を貼付けても良いし、メッキや蒸着に
より所定厚さの膜を形成しても良い。また、シリコンを
エッチングして所定厚さの段差を形成した後、窒化シリ
コン膜を付け、スペーサとしても良い。簡単には、感光
性レジストまたは感光性ガラスを用いて、所定厚さに塗
布後、第２図にも示されるような形状に露光、現像して
得ることができる。なお形状は第２図に示したものは一
例であり、これに限られないが、逃げ口の幅としては、
0.1〜1.5mmが適当である。

第２図（ａ）〜（ｄ）は、本発明の別の実施例に係る
試料カプセルに用いられるそれぞれのスペーサの構造を
示す。

第２図（ａ）のスペーサ3Aは、その内側に、チップ
１、２のＸ線透過窓1c、2cよりも格段に大きな試料空間
面積を形成するが、Ｘ線透過窓1c、2cに相当する部分に
受け部3bが設けられているから、この試料カプセルを縦
型に保持した際に、培養液中の細胞等が沈降してＸ線透
過窓1c、2cから外れることが避けられる。

また、第２図（ｂ）のスペーサ3Bは、Ｘ線透過窓1c、
2cに相当する試料空間から上下左右４方向に溝部3aが形
成されている。これらの溝部3aは細いので、圧力がかか
った場合以外には液体の流動が無い。

また、第２図（ｃ）のスペーサ3Cは、Ｘ線透過窓1c、
2cに相当する試料空間の上部に十分な培養液を蓄えられ
るように、空間を設けたものである。

また、第２図（ｄ）のスペーサ３は、試料空間を大き
く取ったものである。

また、この他にも、例えばスペーサ３を多孔性の材料
で形成して圧力上昇分の液体を吸収させたり、スペーサ
３の一部分をダイアフラム状に形成して圧力上昇分を外
部にふくらませる構造としたりする等の変形が可能であ
り、スペーサ３はチップ１に固定されたものでも良い。

［発明の効果］本発明に係る試料カプセルでは、内圧が上昇すると、
スペーサに形成された試料の逃げ口から余分な液体試料
があふれ出て、内圧の上昇を緩和するから、観察窓に対
する負荷はあまり大きくならない。従って、観察窓の厚
さは必要最小限とすることが可能で、これを薄くすれ
ば、軟Ｘ線の透過率が増してより鮮明な画像を得ること
も可能である。また、従来のようなスペーサ内に装填す
る試料の量の厳密な制御が不要となり、試料装填後の試
料カプセル取扱いも自由となる。さらに、頻繁に試料の
詰替えや再使用を行っても試料カプセルおよび各構成部
材の寿命も伸び、信頼性も向上するから、観察作業全体
における能率化、材料費の低減を容易に達成できる。

【図面の簡単な説明】第１図は、本発明の実施例に係る試料カプセル及び試料
容器からなる試料ホルダの構造を示し、（ａ）は、試料
カプセルに用いられるスペーサの平面図、（ｂ）は、試
料カプセル及び試料容器からなる試料ホルダを示した断
面図である。第２図（ａ）〜（ｄ）は、本発明の別の実施例に係る試
料カプセルにそれぞれ用いられるスペーサの平面図であ
る。第３図は、従来例の試料カプセル及び試料容器からなる
試料ホルダの構造を示したもので、（ａ）は、試料カプ
セルに用いられるスペーサの平面図、（ｂ）は、試料カ
プセル及び試料容器からなる試料ホルダを示した断面図
である。第４図は、一般的な、軟Ｘ線を用いるＸ線顕微鏡の構成
を示す模式図である。第５図（ａ）（ｂ）は、各種物質の軟Ｘ線に対する線吸
収係数を示す線図である。［主要部分の符号の説明］１、２……チップ、３……スペーサ４、５……試料容器、3a……溝部 1c、2c……Ｘ線透過窓 8a……本発明のシール

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) G01N 1/28 G01N 23/04 G21K 7/00

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】対向させた２枚のＸ線透過窓付平板と両平
板間の距離を保持するスペーサとからなるＸ線顕微鏡用
試料カプセル及び該カプセルを収容する試料容器からな
るＸ線顕微鏡用試料ホルダであって、前記試料カプセルは前記スペーサの一部に試料の逃げ口
を有し、前記試料容器は前記カプセルを外部より遮断する真空シ
ールを有することを特徴とするＸ線顕微鏡用試料ホルダ。