JP2890580B2

JP2890580B2 - Ｘ線顕微鏡用試料カプセル

Info

Publication number: JP2890580B2
Application number: JP1336473A
Authority: JP
Inventors: 隆松原; 肇中村
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 1989-12-27
Filing date: 1989-12-27
Publication date: 1999-05-17
Anticipated expiration: 2014-05-17
Also published as: JPH03197836A

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、生体の高倍率観察に威力を発揮する軟Ｘ線
の透過観察を行うＸ線顕微鏡に用いられて好適な試料カ
プセル、特に観察視野における微細な観察対象の移動の
防止機構に関する。

［従来の技術］医学や生物工学等における、生体の高倍率観察に対す
る要求の高まりに対応して、波長２〜5nm程度の軟Ｘ線
を用いるＸ線顕微鏡が注目されており、このＸ線顕微鏡
を用いて生体観察を行うための試料カプセルとしては、
特開昭63−263500号や同63−298200号に示されるものが
知られている。

第４図は、軟Ｘ線を用いるＸ線顕微鏡の一例の構造を
簡単に示し、また、第５図（ａ）、（ｂ）は、種々の材
料における軟Ｘ線の波長と線吸収係数の関係を示す。

軟Ｘ線は、Ｘ線と呼ばれる波長1pm〜10nmの領域の電
磁波のうち、通常は、200pm以上の波長を有するものと
され、波長400〜800nmの可視光線よりも２桁以上も短い
波長の電磁波である。また、この軟Ｘ線は、透過する物
質に良く吸収され、種々の物質内における光路単位長さ
当りの吸収率、すなわち線吸収係数は、物質の密度に比
例し、一般的には波長が長くなるほど高くなるが、第５
図（ａ）、（ｂ）にも示されるように、各物質の分子構
造に応じた波長の、低い線吸収係数の領域をいくつか有
する。

第４図において、コンデンサー光学系Ｃと試料ホルダ
Ｈと結像光学系Ｉと撮像装置Ｋは、Ｘ線発生器Ｇの出力
光軸上に直列に配置され、Ｘ線発生器Ｇから撮像装置Ｋ
までのＸ線光学系の光路長は約2mである。また、この光
学系全体は、排気系Ｖを有する真空槽Ｒ内に納められて
いる。

さて、観察試料を装填した試料カプセルＢを試料ホル
ダＨにセットした後、排気系Ｖを作動して真空槽Ｒ内を
真空排気し、真空度を4.8×10^-2Pa以下に維持した状態
で観察を行う。Ｘ線発生器Ｇから射出された軟Ｘ線ビー
ムは、コンデンサー光学系Ｃにより収束され、試料ホル
ダＨにセットされた試料カプセルＢを透過する。透過し
た軟Ｘ線は、結像光学系Ｉにより撮像装置Ｋ上に結像し
て真空槽Ｒ外のモニタ装置Ｍに観察像を与える。

軟Ｘ線を用いたＸ線顕微鏡は、軟Ｘ線に対し１気圧下
で２×10^-3μm^-1程度の吸収率を有する大気による吸収
を避けるために、光学系全体をその光路長に応じた高い
真空度に保つ必要があり、軟Ｘ線の収束に係るレンズ素
子に性能の良いものが得にくい等の欠点を有するが、可
視光線より格段に短い波長のＸ線を用いるため、従来の
光学顕微鏡よりも高い解像度を期待できる。また、生体
の直接観察を透過材料越しに行うことが可能で、組成培
養液とともに生体を液封した試料カプセルを用いれば、
生体試料を損傷することなく長時間にわたるその生理観
察を実行できる。従って、電子ビームを試料表面に対し
て直接照射する電子顕微鏡の場合のような、試料の乾燥
や金属蒸着等、観察物にダメージを与える前処理を不要
とすることができる。

また、第５図（ａ）の水に対する線吸収係数において
Ｖ字状に示されている、水の窓と呼ばれる水に対し同係
数が低い波長領域（2.3nm〜4.4nm）においては、第５図
（ａ）に示されるように、軟Ｘ線の水に対する吸収率
と、生体を構成する蛋白質等に対する吸収率との差が大
きい。従って、この波長領域の軟Ｘ線を使用すれば、例
えば細胞内に浮遊小器官等を観察する場合に、その観察
する画像のコントラストが良いという利点もある。

ところで、上述したように軟Ｘ線は、種々の物質によ
り簡単に吸収されてしまうから、軟Ｘ線光路中に挿入さ
れる、観察試料を気密封入した試料カプセルにおいて
は、その試料層の厚さを薄く採るとともに、密閉を兼ね
た観察窓材の軟Ｘ線の吸収量を極力小さくする必要があ
る。従って、この窓材には、軟Ｘ線に対する線吸収係数
が低くて膜強度も高い材料、例えば第５図（ｂ）の窒化
シリコンS_i3N₄等を薄膜形成したものが一般的に採用さ
れている。

第３図は、従来の試料カプセルの構造を説明するため
のもので、（ａ）は試料カプセルにの試料封入部分の平
面構造を、また（ｂ）は試料カプセルの断面構造をその
試料容器とともに示す。本従来例は、Ｘ線透過窓1c、2c
を形成した２枚のチップ１、２の間にリング状のスペー
サ３を挿入し、スペーサ３の内側の密閉空間に観察試料
を保持するものである。

第３図（ａ）、（ｂ）において、チップ１、２は、シ
リコン板1a、2a上に窒化シリコン薄膜1b、2bを形成した
後に、Ｘ線透過窓1c、2cに相当する部分のシリコン層を
エッチングにより除去したものである。ここで、薄膜1
b、2bの張られたＸ線透過窓1c、2cは200μｍ角の正方形
であり、その膜厚は、0.05〜0.1μｍである。また、チ
ップ１、２の対向する薄膜面の間に挿入される円環状の
スペーサ３は、試料層の厚さを保持するもので、用途に
応じて１〜15μｍの範囲で適切な厚さのものが選択され
る。例えば、軟Ｘ線の波長を2.3nmに選択して、窒化シ
リコン薄膜1b、2b膜厚をそれぞれ0.1μｍ、試料層
（水）の厚さを10μｍとすれば、それぞれの軟Ｘ線透過
率は39％、27.3％となり、全体では約11％の透過率が確
保される。

一方、スペーサ３は、表裏両面にシール面を有し、２
枚のチップ１、２と密着して円環の内側の試料空間の密
封を行う機能を兼ね備えている。また、試料容器４、５
は、ねじ６により相互に固定されるとともに、Ｏリング
８を介して、その内部に納めたチップ１、２を対向方向
に押圧するもので、この押圧力によりスペーサ３とチッ
プ１、２の接触面に、試料カプセルを真空中で保持する
ために必要な密着力が付与される。

［発明が解決しようとする課題］従来例の試料カプセルにおいては、チップ１上にスペ
ーサ３を載置して、その内側に液状の観察試料、例えば
培養液中に浮遊させた細胞を滴定した後、チップ２をか
ぶせ、試料容器４、５に納めねじ６で固定して試料準備
を完了する。次に、この試料カプセルを第４図のＸ線顕
微鏡にセットして真空引きを行った後、中央の矢印のよ
うに軟Ｘ線を透過させて観察を行うが、観察中、および
真空引き等の準備期間におる観察対象の移動が問題とさ
れる。

すなわち、スペーサ３内の試料空間よりも格段に狭い
観察窓1c、2cを通して、この観察窓1c、2cよりさらに格
段に小さな観察対象を視野に捕えるＸ線顕微鏡において
は、その観察視野が狭いため、観察対象のわずかな移動
も観察の阻害となる。例えば、培養液の対流や細胞の活
動に伴う移動に加えて、第４図のＸ線顕微鏡のように試
料カプセルを縦型に保持する場合には、重力や浮力によ
る観察対象の移動とそれに伴う観察対象の混入が発生す
るため、一個の対象物の長時間の連続観察は困難であっ
た。

本発明は、観察視野内における微細な観察試料の移動
を制限するとともに、観察試料の装填が容易で、しかも
観察窓に対する負担の少ない試料支持枠を備えた試料カ
プセルを提供することを目的とする。

［課題を解決するための手段］本発明の請求項第１項に係るＸ線顕微鏡用試料カプセ
ルは、対向させた２枚のＸ線透過窓付平板と、両平面間
の距離を保持するスペーサとからなる試料カプセルにお
いて、平板間の、窓内に相当する位置に、観察対象の通過を
阻害するが、試料液を通過させる逃げ道を有する試料保
持枠を配置したものである。

本発明の請求項第２項に係るＸ線顕微鏡用試料カプセ
ルは、請求項第１項の試料カプセルにおいて、保持枠を
平板のいずれかの透過窓上に予め接合させたものであ
る。

［作用］本発明の請求項第１項に係るＸ線顕微鏡用試料カプセ
ルにおいては、スペーサにより対向間隔を維持した平板
間の空間に、微小な観察対象を含む試料液を保持した状
態で、Ｘ線による観察対象のＸ線透過窓越しの観察を行
う。このとき、平板間に配置された試料保持枠は、その
貫通孔または窪みの内部に小体積の試料液を蓄え、観察
対象の移動範囲をこの小体積の範囲に制限する。一方、
この試料保持枠の貫通孔または窪みには、試料液の逃げ
口、例えば個々の貫通孔を連通する溝が設けられている
から、これらの貫通孔は袋小路を形成せず、試料液の装
填の際や局所的な試料液の圧縮状態が発生した際には、
試料保持枠高さ内における試料液の横の流れが形成され
る。従って、局所的な圧力上昇はこの流れに沿って分散
し、また試料保持枠を越えて貫通孔から試料液があふれ
出すことも無い。

この試料保持枠としては種々の材料を応用できるがポ
リカーボネイトやポリエステルといった透明材料を採用
すれば、透過型の光学顕微鏡による観察にも併用できる
ので便利である。

本発明の請求項第２項に係るＸ線顕微鏡用試料カプセ
ルにおいては、試料保持枠は、例えばフォトリソグラフ
ィ法により多数の貫通孔を形成した平板上の感光性ガラ
ス層、または感光性樹脂（レジスト）層として、予め平
板上に接合されているから、試料カプセルの部品点数お
よびその組立て手順は試料保持枠を持たないものと同じ
である。また、この試料保持枠は単独では取り扱われ
ず、それ自身では自己形状を保持する必要が無い。ま
た、試料空間内における接触面が減るから、異物の挟み
込みの可能性が減る。

［本発明の実施例］本発明の実施例を図面を参照して説明する。ここで、
第３図（ａ）、（ｂ）の従来例の場合と同様な構造と機
能を有する部材には同一の符号を付してその説明を省略
する。

第１図は、本発明の実施例に係る試料カプセルの構造
を説明するためのもので、（ａ）は、試料カプセルの試
料封入部分の平面構造、また（ｂ）は、試料カプセルの
断面構造をその試料容器とともに示す。本実施例は、チ
ップ１、２（平板）とスペーサ３とで構成される従来例
の試料カプセルにおいて、溝付きのレジスト層７（試料
保持枠）を備えさせたものである。

第１図（ａ）において、チップ１の窒化シリコン薄膜
1b上には、Ｘ線透過窓1cに相当する部分に、フォトリソ
グラフィ法により幅10μｍの多数の平行溝を形成した疎
水性でない、または好ましくは親水性のレジスト層７が
形成され、これらの各溝は一方の端が共通に開放されて
いる。レジスト層７は、スペーサ３よりわずかに薄く、
チップ２をかぶせた際には、レジスト層７とチップ２と
の間に極く薄い試料液層を形成する。また、チップ１上
に載置されたスペーサ３とレジスト層７との間の空間が
大きな試料液の貯留空間を形成する。

さて、レジスト層７を形成したチップ１上にスペーサ
３を載置して、その内側に観察対象の細胞を含む培養液
を滴定し、チップ２をかぶせ、これを試料容器４、５に
納めてねじ６で締付けると、スペーサ３によりその厚さ
を保たれ、また周囲からは密閉された試料液空間が形成
されるが、Ｘ線透過窓1c、2c部では、微細な観察対象を
含んだ試料液は層状に区分され、各層を越えた移動が制
限される。また、ねじ６の締付けに伴って、チップ２と
レジスト層７との間の余分な試料液は各溝に流れ込み、
溝に沿って流れて、溝の開放端から排水されるから、チ
ップ２とレジスト層７との間の異物の挟み込みや局所的
な圧力上昇が回避される。

第２図（ａ）〜（ｃ）は、本発明の別の実施例に係る
試料カプセルに用いられる試料保持枠の平面構造をチッ
プやスペーサとともに示す。

第２図（ａ）の試料カプセルは、９個の貫通孔を相互
に浅い溝で連結したレジスト層7aをチップ１上に形成し
たもので、溝の幅を細胞よりも小さくすれば、各貫通孔
内からの細胞の流出や細胞同士の混合が阻止される。

また、第２図（ｂ）の試料カプセルは、チップ１上に
試料保持枠として、１本の折曲げた溝を形成したレジス
ト層7bを用いるもので、浮遊性、沈降性の細胞に対して
もの拘束が容易であり、各細胞の溝内に自主的に、列状
に整列する。

また、第２図（ｃ）の試料カプセルは、レジスト層7c
でスペーサ機能を兼用させたもので、スペーサ部分の外
側に達する排出路を設けてある。この試料カプセルで
は、さらに外側に気密を維持するためのシールを設ける
必要があるが、内圧が上昇した分、シール面の外へ試料
液が排出させるので内圧上昇は最小となる。

なお、このような考えは第１図（ａ）、および第２図
（ａ）、（ｂ）の試料カプセルにも応用が可能である。
スペーサ３に同様な溝部を設けることで、余分な試料液
を逃がすことができ、内圧上昇は最小となる。ここで、
この溝部を十分に細く形成すれば、圧力がかかった場合
以外には液体の流動が無いから、スペーサ３の内側には
適当な量の試料液が保存され、細胞は養分の補給が可能
となる。

また、スペーサ３を多孔性の材料にして圧力上昇分の
液体を吸収させたり、スペーサ３の一部分をダイヤフラ
ム状に形成して圧力上昇分を外部にふくらませる構造と
したりする等の変形も可能である。

ただし、いずれの場合においても、スペーサを越えて
（通過して）その外側に試料液が逃げるような場合に
は、試料容器は第６図に示すようにＯリング８を備えて
シーリングを行う。

［発明の効果］本発明の請求項第１項に係る試料カプセルにおいて
は、試料保持枠が試料液および試料液中の観察対象の移
動を制限するから、観察中、視野からの観察対象の離脱
や、他の細胞等との混入の確率を著しく下がる。従っ
て、同一の観察対象を長時間に渡り追跡することが容易
となる。また、微細な観察対象を含む試料液のうち、余
分なものは試料の逃げ道を通じて支持枠外部に流出する
から、気泡の追い出しや試料の装填が容易であり、試料
枠と平板との間の異物の挟み込みや局所的な圧力上昇が
減少して、Ｘ線透過窓の破裂事故が防止される。

本発明の請求項第２項に係る試料カプセルにおいて
は、試料支持枠それ自身には形状保持能力を必要としな
いから、開口形状を複雑化したり、厚みを薄くする等、
支持枠の材質、厚さ、開口の形状や大きさ等を必要に応
じて自由自在に選択できる。また試料カプセルの総部品
点数を増すことなく試料支持枠の効果を得られ、試料カ
プセルの組立ても容易である。さらに、試料空間内にお
ける接触面が減るから、異物の挟み込みによる試料の汚
染や観察窓への負担が減る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の実施例に係る試料カプセルを説明す
るための図で、（ａ）はこの試料カプセルの試料封入部
分の構造を示す平面図、また（ｂ）はこの試料カプセル
を試料容器とともに示した断面図である。第２図（ａ）〜（ｃ）は、本発明の別の実施例に係る試
料カプセルにおける、それぞれの試料封入部分の構造を
示す平面図である。第３図は、従来例の試料カプセルを説明するための図
で、（ａ）はこの試料カプセルの試料封入部分の構造を
示す平面図、また（ｂ）はこの試料カプセルを試料容器
とともに示した断面図である。第４図は、一般的な、軟Ｘ線を用いるＸ線顕微鏡の構成
を示す模式図である。第５図（ａ）（ｂ）は、各種物質の軟Ｘ線に対する線吸
収係数を示す線図である。第６図は、試料容器にシーリング機構を設けたものの断
面図である。［主要部分の符号の説明］１、２……チップ、３……スペーサ４、５……試料容器、７……レジスト層 1c、2c……Ｘ線透過窓

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) G01N 1/28 G21K 7/00 G01N 23/04

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】対向させた２枚のＸ線透過窓付平板と、両
平板間の距離を保持するスペーサとからなるＸ線顕微鏡
用試料カプセルにおいて、前記平板間であって、前記窓内に相当する位置に、観察
対象の通過を阻害するが、試料液を通過させる逃げ道を
有する試料保持枠を配置したことを特徴とする試料カプ
セル。
【請求項２】前記保持枠を前記平板のいずれかの前記透
過窓上に予め接合させたことを特徴とする請求項第１項
記載の試料カプセル。