JPH03197836A

JPH03197836A - Ｘ線顕微鏡用試料カプセル

Info

Publication number: JPH03197836A
Application number: JP1336473A
Authority: JP
Inventors: Takashi Matsubara; 隆松原; Hajime Nakamura; 肇中村
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 1989-12-27
Filing date: 1989-12-27
Publication date: 1991-08-29
Anticipated expiration: 2014-05-17
Also published as: JP2890580B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、生体の高倍率観察に威力を発揮する軟Ｘ線の
透過観察を行うＸ線顕微鏡に用いられて好適な試料カプ
セル、特に観察視野における微細な観察対象の移動の防
止機構に関する。

［従来の技術］医学や生物工学等における、生体の高倍率観察に対する
要求の高まりに対応して、波長２〜５ｎａ程度の軟Ｘ線
を用いるＸ線顕微鏡が注目されており、このＸ線顕微鏡
を用いて生体観察を行うための試料カプセルとしては、
特開昭６３−２６３５００号や同６３−２９８２００号
に示されるものが知られている。

第４図は、軟Ｘ線を用いるＸ線顕微鏡の一例の構造を簡
単に示し、また、第５図　（ａ）、（ｂ）は、種々の材
料における軟Ｘ線の波長と線吸収係数の関係を示す。

軟Ｘ線は、Ｘ線と呼ばれる波長１ｐｍ〜１０ｎｍの領域
の電磁波のうち、通常は、２００　ｐｍ以上の波長を有
するものとされ、波長４００〜８００　ｎｍの可視光線
よりも２桁以上も短い波長の電磁波である。また、この
軟Ｘ線は、透過する物質に良く吸収され、種々の物質内
における光路単位長さ当りの吸収率、すなわち線吸収係
数は、物質の密度に比例し、一般的には波長が長くなる
ほど高くなるが、第５図　（ａ）、（ｂ）にも示される
ように、各物質の分子構造に応じた波長の、低い線吸収
係数の領域をいくつか有する。

第４図において、コンデンサー光学系Ｃと試料ホルダＨ
と結像光学系ｒと撮像装置には、Ｘ線発生器Ｇの出力光
軸上に直列に配置され、Ｘ線発生器Ｇから撮像装置Ｋま
でのＸ線光学系の光路長は約２ｍである。また、この光
学系全体は、排気系Ｖを有する真空槽Ｒ内に納められて
いる。

さて、観察試料を装填した試料カプセルＢを試料ボルダ
Ｈにセットした後、排気系■を作動して真空槽Ｒ内を真
空排気し、真空度を４．８ｘ　１０”’Ｐａ以下に維持
した状態で観察を行う。Ｘ線発生器Ｇから射出された軟
Ｘ線ビームは、コンデンサー光学系Ｃにより収束され、
試料ホルダＨにセットされた試料カプセルＢを透過する
。透過した軟Ｘ線は、結像光学系Ｉにより撮像装置に上
に結像して真空槽Ｒ外のモニタ装置Ｍに観察像を与える
。

軟Ｘ線を用いたＸ線顕微鏡は、軟′Ｘ線に対し１気圧下
で２　Ｘ　１０−’μｍ　−１程度の吸収率を有する大
気による吸収を避けるために、光学系全体をその光路長
に応じた高い真空度に保つ必要があり、軟Ｘ線の収束に
係るレンズ素子に性能の良いものが得にくい等の欠点を
有するが、可視光線より格段に短い波長のＸ線を用いる
ため、従来の光学顕微鏡よりも高い解像度を期待できる
。また、生体の直接観察を透過材料越しに行うことが可
能で、組織培養液とともに生体を液封した試料カプセル
を用いれば、生体試料を損傷することなく長時間にわた
るその生理観察を実行できる。従って、電子ビームを試
料表面に対して直接照射する電子顕微鏡の場合のような
、試料の乾燥や金属蒸着等、観察物にダメージを与える
前処理を不要とすることができる。

また、第５図（ａ）の水に対する線吸収係数においてＶ
字状に示されている、水の窓と呼ばれる水に対し同係数
が低い波長領域（２，３％ｍ〜４．４ｎｍ）においては
、第５図（ａ）に示されるように、軟Ｘ線の水に対する
吸収率と、生体を構成する蛋白質等に対する吸収率との
差が大きい。従って、この波長領域の軟Ｘ線を使用すれ
ば、例えば細胞内に浮遊する小器官等を観察する場合に
、その観察画像のコントラストが良いという利点もある
。

ところで、上述したように軟Ｘ線は、種々の物質により
簡単に吸収されてしまうから、軟Ｘ線光路中に挿入され
る、観察試料を気密封入した試料カプセルにおいては、
その試料層の厚さを薄く採るとともに、密閉を兼ねた観
察窓材の軟Ｘ線の吸収量を極力小さくする必要がある。

従って、この窓材には、軟Ｘ線に対する線吸収係数が低
くて膜強度も高い材料、例えば第５図　（ｂ）の窒化シ
リコン５１３Ｎ　４等を薄膜形成したものが一般的に採
用されている。

第３図は、従来の試料カプセルの構造を説明するための
もので、　（ａ）はこの試料カプセルの試料封入部分の
平面構造を、また　（ｂ）はこの試料カプセルの断面構
造をその試料容器とともに示す。本従来例は、Ｘ線透過
窓１ｃ、２ｃを形成した２枚のチップ１．２０間にリン
グ状のスペーサ３を挿入し、スペーサ３の内側の密閉空
間に観察試料をパ；ミ持するものである。

第３図　（ａＪ、（ｂ）において、チップ１．２は、シ
リコン板１ａ、２ａ上に窒化シリコン薄膜１ｂ、２ｂを
形成した後に、Ｘ線透過窓１ｃ、２ｃに相当する部分の
シリコン層をエツチングにより除去したものである。こ
こで、薄膜１ｂ、２ｂの張られたＸ線透過窓１ｃ、２ｃ
は２００μｍ角の正方形であり、その膜厚は、０．０５
〜０．１μｍである。また、チップ１．２の対向する薄
膜面の間に挿入される円環状のスペーサ３は、試料層の
厚さを保持するもので、用途に応じて１〜１５μｍの範
囲で適切な厚さのものが選択される。例えば、軟Ｘ線の
波長を２．３％ｍに選択して、窒化シリコン薄膜１ｂ、
２ｂ膜厚をそれぞれ０．１μｍ、試料層（水）の厚さを
１０μｍとすれば、それぞれの軟Ｘ線透過率は３９％、
２７．３％となり、全体では約１１％の透過率が確保さ
れる。

一方、スペーサ３は、表裏両面にシール面を有し、２枚
のチップ１．２と密着して円環の内側の試料空間の密封
を行う機能を兼ね備えている。また、試料容器４．５は
、ねじ６により相互に固定されるとともに、０リング８
を介して、その内部に納めたチップ１．２を対向方向に
押圧するもので、この押圧力によりスペーサ３とチップ
１．２の接触面に、試料カプセルを真空中で保持するた
めに必要な密着力が付与される。

［発明が解決しようとする課題］従来例の試料カプセルにおいては、チップ１上にスペー
サ３を載置して、その内側に液状の観察試料、例えば培
養液中に浮遊させた細胞を滴定した後、チップ２をかぶ
せ、試料容器４．５に納めねじ６で固定して試料準備を
完了する。次に、この試料カプセルを第４図のＸ線顕微
鏡にセットして真空引きを行った後、中央の矢印のよう
に軟Ｘ線を透過させて観察を行うが、観察中、および真
空引き等の準備期間における観察対象の穆勅が問題とさ
れる。

すなわち、スペーサ３内の試料空間よりも格段に狭い観
察窓１ｃ、２ｃを通して、この観察窓ＩＣ１２Ｃよりさ
らに格段に小さな観察対象を視野に捕えるＸ線顕微鏡に
おいては、その観察視野が狭いため、観察対象のわずか
な移動も観察の阻害となる。例えば、培養液の対流や細
胞の活動に伴う移動に加えて、第４図のＸ線顕微鏡のよ
うに試料カプセルを縦型に保持する場合には、重力や浮
力による観察対象の）３動とそれに伴う観察対象の混入
が発生するため、−個の対象物の長時間の連続観察は困
難であフた。

本発明は、観察視野内における微細な観察試料の移動を
制限するとともに、観察試料の装填が容易で、しかも観
察窓に対する負担の少ない試料支持枠を備えた試料カプ
セルを提供することを目的とする。

［課題を解決するための手段］本発明の請求項第１項に係るＸ線顕微鏡用試料カプセル
は、対向させた２枚のＸ線透過窓付平板と、両平板間の
距離を保持するスペーサとからなる試料カプセルにおい
て、平板間の、窓内に相当する位蓋に、試料の逃げ道を有す
る試料保持枠を配置したものである。

本発明の請求項第２項に係るＸ線顕微鏡用試料カプセル
は、請求項第１項の試料カプセルにおいて、保持枠を平
板のいずれかの透過窓上に予め接合させたものである。

［作用コ本発明の請求項第１項に係るＸ線顕微鏡用試料カプセル
においては、スペーサにより対向間隔を維持した平板間
の空間に、微小な観察対象を含む試料液を保持した状態
で、Ｘ線による観察対象のＸ線透過窓越しの観察を行う
。このとき、平板間に配置された試料保持枠は、その貫
通孔または窪みの内部に小体積の試料液を蓄え、観察対
象の移動範囲をこの小体積の範囲に制限する。一方、こ
の試料保持枠の貫通孔または窪みには、試料液の逃げ口
、例えば個々の貫通孔を連通する溝が設けられているか
ら、これらの貫通孔は袋小路を形成せず、試料液の装填
の際や局所的な試料液の圧縮状態が発生した際には、試
料保持枠高さ内における試料液の横の流れが形成される
。従って、局所的な圧力上昇はこの流れに沿って分散し
、また試問保持枠を越えて貫通孔から試料液があふれ出
すことも無い。

この試料保持枠としては種々の材料を応用できるがポリ
カーボネイトやポリエステルといった透明材料を採用す
れば、透過型の光学顕微鏡による観察にも併用できるの
で便利である。

本発明の請求項第２項に係るＸ線顕微鏡用試料カプセル
においては、試料保持枠は、例えばフォトリソグラフィ
法により多数の貫通孔を形成した平板上の感光性ガラス
層、または感光性樹脂（レジスト）層として、予め平板
上に接合されているから、試料カプセルの部品点数およ
びその組立て手順は試料保持枠を持たないものと同じで
ある。

また、この試料保持枠は！＃独では取り扱われず、それ
自身では自己形状を保持する必要が無い。また、試料空
間内における接触面が減るから、異物の挟み込みの可能
性が減る。

［本発明の実施例］本発明の実施例を図面を参照して説明する。ここで、第
３図　（ａ）、（ｂ）の従来例の場合と同様な構造と機
能を有する部材には同一の符号を付してその説明を省略
する。

第１図は、本発明の実施例に係る試料カプセルの構造を
説明するためのもので、　（ａ）は、試料カプセルの試
料封入部分の平面構造、また　（ｂ）は、試料カプセル
の断面構造をその試料容器とともに示す。本実施例は、
チップ！、２（平板）とスペーサ３とで構成される従来
例の試料カプセルにおいて、溝付きのレジスト層７（試
料保持枠）を備えさせたものである。

第１図（ａ）において、チップ１の窒化シリコン薄ｎｉ
　ｔ　ｂ上には、Ｘ　ＭＩ透過窓１ｃに相当する部分に
、フォトリソグラフィ法により幅１１０ｌ１の多数の平
行溝を形成した疎水性、または好ましくは親水性のレジ
スト層７が形成され、これらの置溝は一方の端が共通に
開放されている。レジスト層７は、スペーサ３よりわず
かに薄く、チップ２をかぶせた際には、レジスト層７と
チップ２との間に掻く薄い試料液層を形成する。また、
チップ１上に載置されたスペーサ３とレジスト層７との
間の空間が大きな試料液の貯留空間を形成する。

さて、レジスト層７を形成したチップ１上にスペーサ３
を載置して、その内側に観察対象の細胞を含む培養液を
滴定し、チップ２をかぶせ、これを試料容器４．５に納
めてねじ６で締付けると、スペーサ３によりその厚さを
保たれ、また周囲からは密閉された試料液空間が形成さ
れるが、Ｘ線透過窓ＩＣ１２０部では、微細な観察対象
を含んだ試料液は層状に区分され、各層を越えた移動が
制限される。また、ねじ６の締付けに伴って、デツプ２
とレジスト層７との間の余分な試料液は置溝に流れ込み
、溝に沿って流れて、溝の開放端から排水されるから、
チップ２とレジスト層７との間の異物の挟み込みや局所
的な圧力上昇が回避される。

第２図　（ａ）〜　（ｃ）は、本発明の別の実施例に係
る試料カプセルに用いられる試料保持枠の平面構造をチ
ップやスペーサとともに示す。

第２図　（ａ）の試料カプセルは、９個の貫通孔を相互
に浅い溝で連結したレジスト層７ａをチップ１上に形成
したもので、溝の幅を細胞よりも小さくすれば、各貫通
孔内からの細胞の流出や細胞同士の混合が阻止される。

また、第２図　（ｂ）の試料カプセルは、チップ１上に
試料保持枠として、１木の折曲げた溝を形成したレジス
ト層７ｂを用いるもので、浮遊性、沈降性の細胞に対し
てもその拘束が容易であり、各細胞は溝内に自主的に、
列状に整列する。

また、第２図　（Ｃ）の試料カプセルは、レジスト層７
Ｃでスペーサ機能を兼用させたもので、スペーサ部分の
外側に達する排出路を設けである。この試料カプセルで
は、さらに外側に気密を維持するためのシールを設ける
必要があるが、内圧が上昇した分、シール面の外へ試料
液が排出されるので内圧上昇は最小となる。

なお、このような考えは第１図　（ａ）、および第２図
　（ａ）、　（ｂ）の試料カプセルにも応用が可能であ
る。スペーサ３に同様な溝部を設けることで、余分な試
料液を逃がすことができ、内圧上昇は最小となる。ここ
で、この溝部を十分に細（形成すれｉ′ｉ、圧力がかか
った場合以外には液体の流動が無いから、スペーサ３の
内側には適当な量の試料液が保存され、細胞は養分の補
給が可能となる。

また、スペーサ３を多孔性の材料にして圧力上昇分の液
体を吸収させたり、スペーサ３の一部分をダイヤフラム
状に形成して圧力上昇分を外部にふくらませる構造とし
たりする等の変形も可能である。

ただし、いずれの場合においても、スペーサを越えて（
通過して）その外側に試料液が逃げるような場合には、
試料容器は第６図に示すようにＯリング８を備えてシー
リングを行う。

［発明の効果］本発明の請１求項第１項に係る試料カプセルにおいては
、試料保持枠が試料液および試料液中の観察対象の移動
を制限するから、観察中、視野からの観察対象の離脱や
、他の細胞等との混入の確率を著しく下がる。従って、
同一の観察対象を長時間に渡り追跡することが容易とな
る。また、微細な観察対象を含む試料液のうち、余分な
ものは試料の逃げ道を通じて支持枠外部に流出するから
、気泡の追い出しや試料の装填が容易であり、試料枠と
平板との間の異物の挟み込みや局所的な圧力上昇が減少
して、Ｘ線透過窓の破裂事故が防止される。

本発明の請求項第２項に係る試料カプセルにおいては、
試料支持枠それ自身には形状保持能力を必要としないか
ら、開口形状を複雑化したり、厚みを薄くする等、支持
枠の材質、厚さ、開口の形状や大きさ等を必要に応じて
自由自在に選択できる。また試料カプセルの総部品点数
を増すことなく試料支持枠の効果を得られ、試料カプセ
ルの組立ても容易である。さらに、試料空間内における
接触面が減るから、異物の挟み込みによる試料の汚染や
観察窓への負担が減る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の実施例に係る試料カプセルを説明す
るための図で、　（ａ）はこの試料カプセルの試料封入
部分の構造を示す平面図、また　（ｂ）はこの試料カプ
セルを試料容器とともに示した断面図である。第２図　（ａ）〜　（ｃ）は、本発明の別の実施例に係
る試料カプセルにおける、それぞれの試料封入部分の構
造を示す平面図である。第３図は、従来例の試料カプセルを説明するための図で
、　（ａ）はこの試料カプセルの試料封入部分の構造を
示す平面図、また　（ｂ）はこの試料カプセルを試料容
器とともに示した断面図である。第４図は、一般的な、軟Ｘ線を用いるＸ線顕微鏡の構成
を示す模式図である。第５図　（ａ）　　（ｂ）は、各種物質の軟Ｘ線に対す
る線吸収係数を示す線図である。第６図は、試料容器にシーリング機構を設けたものの断
面図である。［主要部分の符号の説明］１．２・・・チップ　　　３・・・スペーサ４．５・・
・試料容器　　７・・・レジスト層１ｃ、２　ｃ　−Ｘ
　！ｊＡ透過窓

Claims

【特許請求の範囲】

（１）対向させた２枚のＸ線透過窓付平板と、両平板間
の距離を保持するスペーサとからなるＸ線顕微鏡用試料
カプセルにおいて、前記平板間であって、前記窓内に相当する位置に、試料
の逃げ道を有する試料保持枠を配置したことを特徴とす
る試料カプセル。
（２）前記保持枠を前記平板のいずれかの前記透過窓上
に予め接合させたことを特徴とする請求項第１項記載の
試料カプセル。