JPH06292575A - 新規セルラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 プロテアーゼ耐性を有し、広い基質特異性を
有する新規セルラーゼＳ−１。 【効果】 本発明のセルラーゼは、プロテアーゼ存在下
で洗浄効果を発現することができるため、衣料用洗浄剤
用添加酵素等として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規なセルラーゼに関
し、詳細にはプロテアーゼ耐性及び広い基質特異性を示
す新規セルラーゼＳ−１に関する。

【０００２】

【従来の技術】繊維素分解酵素（セルラーゼ）の開発
は、従来、バイオマス資源の有効利用を一大目標として
進められており、トリコデルマ属、フミコーラ属等の糸
状菌を中心に、シュウドモナス属、バチルス属等の細
菌、更に、ストレプトコッカス属、アクチノマイセス属
等の放線菌を供給源とするセルラーゼが報告されてい
る。しかしながら、作用特異性や物理化学的諸性質等、
その実態は未だ明確にされたとは言い難い。

【０００３】上記セルラーゼのうち、カルボキシメチル
セルロース（ＣＭＣ）に対する作用が特に高いものをＣ
ＭＣａｓｅと称するが、近年、このＣＭＣａｓｅの衣料
用洗浄剤への利用が、産業的用途として年々大きくなっ
ている（特公昭５９−４９２７９号公報、特公昭６０−
２３１５８号公報、特公昭６０−３６２４０号公報）。

【０００４】衣料用洗浄剤組成物として使用しうるセル
ラーゼを生産する方法として、バチルス属に属する好ア
ルカリ性細菌を培養して培地よりセルラーゼＡを採取す
る方法（特公昭５０−２８５１５号公報）、セルロモナ
ス属に属する好アルカリ性細菌を培養してアルカリセル
ラーゼ３０１−Ａを生産する方法（特開昭５８−２２４
６８６号公報）、好アルカリ性バチルスＮｏ．１１３９
を培養してカルボキシメチルセルラーゼを生産する方法
（Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ．，１３１巻、３３３９頁、（１９８５））、スト
レプトマイセス属の一種を用いてアルカリセルラーゼを
生産する方法（特開昭６１−１９４８３号公報）、好ア
ルカリ性細菌の一種バチルス・エスピー ＫＳＭ−６３
５（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＫＳＭ−６３５）を培養
してアルカリセルラーゼＫ等を生産する方法（特開昭６
３−１０９７７６〜１０９７７８号公報）、バチルス属
細菌を培養してアルカリ耐性セルラーゼＫ−５２２又は
Ｋ−５８８を生産する方法（特開昭６４−３７２８５号
公報、特開昭６４−３７２８６号公報）等のいわゆるア
ルカリ耐性セルラーゼを生産する方法が報告されてい
る。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
のセルラーゼはタンパク質分解酵素であるプロテアーゼ
に対する耐性を有しておらず、そのために、例えば、プ
ロテアーゼが配合された液体衣料用洗剤に同時に配合す
ることができなかった。また、プロテアーゼ耐性を有し
ていても、酵素活性等の点で満足できるものではなかっ
た。従って、プロテアーゼ耐性を有し、衣料用洗浄剤に
プロテアーゼとともに配合して洗浄効果を高め得る新規
なセルラーゼを新たに提供することが要望されていた。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、界面活性
剤耐性及びプロテアーゼ耐性を有するセルラーゼを生産
する微生物を自然界に求め、鋭意探索を続けた結果、今
般、茨城県鹿島郡周辺の土壌より採取したストレプトマ
イセス属に属する微生物が新規なプロテアーゼ耐性セル
ラーゼを生産すること及び該セルラーゼを更に精製する
とその主成分として新規なセルラーゼが得られることを
見いだし、本発明を完成した。

【０００７】すなわち、本発明は、新規セルラーゼＳ−
１を提供するものである。

【０００８】本発明のセルラーゼＳ−１は、上記のスト
レプトマイセス属に属する微生物であるストレプトマイ
セス・エスピー ＫＳＭ−２６の培養物から分離され
る。以下に、このストレプトマイセス・エスピー ＫＳ
Ｍ−２６の菌学的性状を示す。なお、以下に記載の菌学
的性質の試験及び分類方法は、「特許庁編産業別審査基
準応用微生物工業」、「放線菌の同定実験法」（日本放
線菌学会編）及び「微生物の化学分類実験法」（駒形和
夫編）に基づいて行った。

【０００９】（ａ）形態 胞子形成菌糸の分岐法は、単純分岐、車軸分岐の何れも
見られる疑似輪生分岐であり、菌糸の形態はループ状及
び螺旋状である。胞子の数は１０胞子以上で、胞子表面
は平滑、大きさは短径約０．５μm 、長径１．２〜１．
４μm の楕円型である。鞭毛胞子、胞子嚢はない。胞子
柄の着生位置は気菌糸上である。

【００１０】（ｂ）培地における生育状態 表１に示す。

【００１１】

【表１】

【００１２】（ｃ）生理学的性質 （１）生育温度範囲：２０〜４０℃。 （２）ゼラチンの液化（グルコース、ペプトンゼラチン
培地）：２０℃及び２８℃の何れの培地でも液化はみら
れなかった。 （３）スターチの加水分解（スターチ寒天培地）：分解
する。 （４）脱脂牛乳の凝固、ペプトン化（脱脂牛乳培地）：
３０℃で培養したが、凝固後ペプトン化が見られた。 （５）メラニン様色素の生成（チロシン寒天培地及びペ
プトン・イースト鉄寒天培地）：生成する。

【００１３】（ｄ）炭素源の同化性（プリドハム・ゴド
リーブ寒天培地）（＋＋：良好 ＋：普通）

【表２】 Ｌ−アラビノース ＋＋ Ｄ−キシロース ＋＋ Ｄ−グルコース ＋＋ Ｄ−フラクトース ＋ シュークロース ＋＋ イノシトール ＋＋ Ｌ−ラムノース ＋＋ ラフィノース ＋＋ Ｄ−マンニット ＋＋

【００１４】ＫＳＭ−２３株は、形態学的に放線菌の特
徴を有する。また、細胞壁にＬ−Ｌ−ジアミノピメリン
酸を含むこと、基生菌糸を通常分断せずによく発達する
こと、菌核、分生子殻、胞子嚢を形成しないこと、気菌
糸に長い分節胞子を作り、胞子柄は疑似輪生分岐である
ことから、清野、長谷川らの細胞壁を主とする検索式に
従えば、ストレプトマイセス属と同定できる。

【００１５】更に、オートミール寒天培地での気菌糸の
色が赤色系であり、胞子鎖は、ループ状及び螺旋状、胞
子表面は平滑であること、可溶性色素は生成しないが、
メラニン様色素は生成すること及び、炭素源の同化性試
験の結果から野々村、或いはクウェスターの検索式に従
って検索すると、本菌株はストレプトマイセス属の新菌
株と同定されることから、ストレプトマイセス・エスピ
ー ＫＳＭ−２６と命名した。なお、本菌株は、ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１３５４８として工業技術院生命工学工業技術
研究所に寄託されている。

【００１６】本発明のセルラーゼＳ−１を製造するに
は、ストレプトマイセス・エスピーＫＳＭ−２６を培養
し、その培養物からセルラーゼＳ−１を採取すればよ
い。

【００１７】上記の菌株を用いて本発明のセルラーゼＳ
−１を得るには、適当な培地に該菌株を接種し、常法に
従って培養すればよい。培養培地としては、資化し得る
窒素源と炭素源を適宜組み合わせて配合したものが使用
される。この炭素源及び窒素源については、特に制限は
ない。例えば、窒素源としては、硝安、硫安、塩安、リ
ン酸アンモニウム、硝酸ソーダ、コーングルテンミー
ル、大豆粉、コーンスチープリカー、カザミノ酸、酵母
エキス、ファーマメディア、イワシミール、肉エキス、
ペプトン、ハイプロ、アジパワー、コーンソイビーンミ
ール、コーヒー粕、綿実油粕、カルチベータ、アジック
ス、ゼスト、グルタミン酸ソーダなどが、また、炭素源
としては、籾殻、ふすま、濾紙、一般紙類、おが屑等の
植物繊維質、廃糖蜜、転化糖、カルボキシメチルセルロ
ース（ＣＭＣ）、アビセル、セルロース綿、キシラン、
ペクチン、リボース、アラビノース、キシロース、グル
コース、マンノース、フラクトース、ガラクトース、乳
糖、麦芽糖、しょ糖、トレハロース、マンニット、グリ
セリン、澱粉、酢酸、クエン酸などが挙げられる。その
他に、リン酸、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Na⁺ 、
K⁺ などの無機塩や、必要であれば、無機・有機微量栄
養源を添加することもできる。

【００１８】培養物からの目的物であるセルラーゼＳ−
１の採取及び精製は、一般の酵素の採取及び精製の手段
に準じて行うことができる。すなわち、例えば培養物を
遠心分離、濾過等によって菌体を分離し粗酵素液を得る
ことができる。この粗酵素液はそのまま使用することも
できるが、必要に応じて、例えば、塩析法、溶媒沈澱法
（メタノール、エタノール、イソプロパノール等）によ
ってタンパク質を沈澱させたり、限外濾過（例えば、旭
化成工業社製、分画分子量１．３万）により濃縮後、凍
結乾燥により、粗酵素粉末とすることができる。具体的
には塩析法の場合、例えば、硫安（３０〜５０％飽和画
分）で沈澱させた後、濾過或いは遠心分離、脱塩するこ
とによってこれを凍結乾燥粉末にすることができる。脱
塩の方法としては透析又はセファデックスＧ−２５（フ
ァルマシア社製）等を用いるゲル濾過法の一般的方法が
用いられる。更に、目的物であるセルラーゼＳ−１の精
製は、例えば弱酸性条件下でＤＥＡＥ−トヨパールを用
いてイオン交換を行い色素を吸着させることにより行わ
れる。未吸着画分について、弱アルカリ条件下でもう一
度ＤＥＡＥ−トヨパールでイオン交換クロマトグラフィ
ーを行い、次にセファクリルＳ−２００でゲル濾過を行
う。更に精製度を上げるために必要に応じて、アフィニ
ティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロ
マトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等を利用する
ことも有効である。

【００１９】かくして得られたセルラーゼＳ−１は、以
下に示す酵素学的性質を有する。なお、酵素活性の測定
は、以下の方法に従って行った。

【００２０】酵素活性測定法 （１）ＣＭＣ分解活性 反応系でのＣＭＣ（Ａ０１ＭＣ、山陽国策パルプ社製）
の終濃度が１％、リン酸緩衝液（pH７）の終濃度が４０
mMとなるような基質溶液０．９mlに、適宜希釈した酵素
液０．１mlを加えて４０℃、２０分間反応させる。反応
後１mlのＤＮＳ溶液を加え１００℃で５分間煮沸する。
煮沸後直ちに氷冷し、４mlのイオン交換水を加えた後、
５３５nmの吸光度を測定する。同時にグルコースの検量
線を測定し、酵素力価は、上記の条件下で１分間に１μ
mol のグルコースに相当する還元糖を生成する酵素量を
１単位とした。

【００２１】（２）ｐ−ニトロフェニルセロビオシド分
解活性 反応系での基質（シグマ社製）の終濃度が１０mM、リン
酸緩衝液（pH７）終濃度が４０mMとなるような基質溶液
０．９mlに適宜希釈した酵素液０．１mlを加えて４０
℃、１０分間反応させる。その後、１Ｍ Na₂CO₃を３ml
加えて反応を停止後、すばやく４０５nmの吸光度を測定
する。酵素力価は、上記の条件下で１分間に１μmol の
ｐ−ニトロフェノールを遊離させる酵素量を１単位とし
た。

【００２２】（３）ｐ−ニトロフェニルグルコピラノシ
ド分解活性 反応系での基質（シグマ社製）の終濃度が１０mM、リン
酸緩衝液（pH７）終濃度が４０mMとなるような基質溶液
０．９mlに適宜希釈した酵素液０．１mlを加えて４０
℃、１０分間反応させる。その後、１Ｍ Na₂CO₃を３ml
加えて反応を停止後、すばやく４０５nmの吸光度を測定
する。酵素力価は、上記の条件下で１分間に１μmol の
ｐ−ニトロフェノールを遊離させる酵素量を１単位とし
た。

【００２３】（４）ｐ−ニトロフェニルキシロピラノシ
ド分解活性 反応系での基質（シグマ社製）の終濃度が１０mM、リン
酸緩衝液（pH７）終濃度が４０mMとなるような基質溶液
０．９mlに適宜希釈した酵素液０．１mlを加えて４０
℃、１０分間反応させる。その後、１Ｍ Na₂CO₃を３ml
加えて反応を停止後、すばやく４０５nmの吸光度を測定
する。酵素力価は、上記の条件下で１分間に１μmol の
ｐ−ニトロフェノールを遊離させる酵素量を１単位とし
た。

【００２４】（５）アビセル分解活性 基質として５％アビセル（メルク社製）を用いた以外は
ＣＭＣ分解活性と同様に行った。

【００２５】（６）リン酸膨潤セルロース分解活性 基質として０．４％リン酸膨潤セルロースを用いた以外
はＣＭＣ分解活性と同様に行った。

【００２６】（７）濾紙分解活性 基質として０．１％濾紙を用いた以外はＣＭＣ分解活性
と同様に行った。

【００２７】酵素学的性質 （１）作用 ＣＭＣによく作用し、これらを溶解せしめ、還元糖を生
成する。

【００２８】（２）基質特異性 ＣＭＣのほか、ｐ−ニトロフェニルセロビオシド、キシ
ラン及びリケナンに対して明らかに強い分解能を有する
ことがわかった。また、濾紙、リン酸膨潤セルロース、
カードラン及びラミナリンに対しても若干の活性を有す
る。しかし、アビセル等、結晶質繊維に対する分解活性
は有していない。

【００２９】（３）作用pH及び至適pH ＣＭＣを基質とした場合の作用pHは４〜１０、至適pHは
６．８であった。pH５．５〜８．０において、至適pHで
の活性の５０％以上の活性を有する（図１）。

【００３０】（４）pH安定性 ４０℃、２時間処理した場合、pH４．５〜８．０で失活
しない（図２）。

【００３１】（５）作用温度及び至適温度 ４０mM、pH７のリン酸緩衝液中で作用温度を測定した結
果、ＣＭＣを基質とした場合の作用温度は２０〜７０
℃、至適温度は５０℃であった。３０〜６０℃において
も至適温度での活性の５０％以上の相対活性を有する
（図３）。

【００３２】（６）温度安定性 ４０mM、pH７のリン酸緩衝液中で、３０分間各温度で処
理した場合、０〜４５℃の間で安定である（図４）。

【００３３】（７）界面活性剤の影響 アルキルスルホン酸ナトリウム塩（ＳＡＳ）、アルキル
硫酸エステルナトリウム塩（ＡＳ）又はポリオキシエチ
レンアルキル硫酸ナトリウム塩（ＥＳ）の１０％水溶液
とともに４０℃で保存した場合２週間後でも５０％以上
の残存活性を有する。

【００３４】（８）プロテアーゼ耐性 各種プロテアーゼ０．１％存在下で３日間で８０％以上
の残存活性を有する。

【００３５】（９）金属イオンの影響 ２mM各種金属イオンを加え、その影響を検討した結果、
Sn²⁺、Fe²⁺、Cu²⁺、Zn ²⁺及びHg²⁺により阻害され、Co²⁺
により活性化された。

【００３６】（10）分子量 セファクリルＳ−２００によるゲル濾過法及びＳＤＳ電
気泳動法にて２２，０００±２，０００の分子量を有す
る。

【００３７】（11）中性糖の含量 フェノール硫酸法では、発色は認められない。

【００３８】

【発明の効果】本発明の新規セルラーゼＳ−１は、ほと
んど糖を含有していないにも拘わらず、極めて強いプロ
テアーゼ耐性を示す。更に、基質特異性に関しては、従
来のセルラーゼと比較して非常に作用範囲が広く、より
天然に近いセルロース（濾紙、リン酸膨潤セルロース）
にも作用する。

【００３９】また、pH７付近に至適pHを有しているが、
作用pHは４〜１０であり、アルカリ側でも作用すること
が認められ、広範囲で極めて安定である。

【００４０】従って、本発明のセルラーゼは、プロテア
ーゼ存在下で洗浄効果を発現することができるため、衣
料用洗浄剤用添加酵素その他に有効に利用することがで
きるものである。

【００４１】

【実施例】次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明
するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００４２】実施例１ 茨城県鹿島郡周辺の採取土壌約１ｇを１％NaCl含有滅菌
水５mlに懸濁し、攪拌静置後、その上清をスクリーニン
グ用ＣＭＣ含有寒天培地（培地１）に塗布し、３０℃で
２〜７日培養後、ハローを形成したコロニーを選出し、
セルラーゼ生産菌を取得した。取得菌は、肉眼的及び、
顕微鏡的に単一になるまで単集落分離を繰り返すと、純
粋な分離菌を得ることができた。更に得られた菌を液体
培地（培地２）に接種し、３０℃、３日間振とう培養し
た。培養後、遠心分離した上清液に、１％ＥＳ、サビナ
ーゼ（ノボ社製）を１ＡＵ／mlとなるように添加し、４
０℃にて保存し、pH９におけるＣＭＣａｓｅ活性の残存
活性を測定し、プロテアーゼ耐性セルラーゼ生産菌を選
択した。上記の方法により、本発明のストレプトマイセ
ス・エスピー ＫＳＭ−２６（ＦＥＲＭ Ｐ−１３５４
８）を取得することができた。

【表３】 培地１ ＣＭＣ含有寒天培地（ＨＡ−Ａｇａｒ） ＣＭＣ ３％ 腐植酸 ０．１％ KH₂PO₄ ０．２％ MgSO₄・7H₂O ０．０５％ NaCl ０．１％ Agar １％ 培地２ ＣＭＣ １％ ポリペプトン ０．１％ 酵母エキス ０．０５％ KH₂PO₄ ０．１％ MgSO₄・7H₂O ０．０２％

【００４３】実施例２ 実施例１で得たストレプトマイセス・エスピー ＫＳＭ
−２６を、実施例１の培地２においてＣＭＣに代えて３
％ふすまを、ポリペプトンに代えて０．５％硝酸を用い
た液体培地に接種し、３０℃、３日間、通気量０．５vv
m 、攪拌数２００rpm で３０ｌ発酵槽により培養した。
培養後、フィルタープレスにより、菌体及び不溶物を除
き、粗酵素液を得た。この粗酵素１５ｌを限外濾過（旭
化成工業社製、分画分子量６，０００）により濃縮、脱
塩を行い、１ｌの粗酵素液を得た。更に、凍結乾燥を行
い、乾燥粉体としたものをセルラーゼＳ−１を精製する
際の出発物質とした。

【００４４】実施例３ 実施例２で得られた乾燥粉体（比活性１０．８ＫＵ／mg
タンパク）について以下の手順で精製を行った。乾燥粉
体５ｇを５００mlの０．０２mMリン酸緩衝液（pH６）に
溶解し、９，０００×ｇで１０分間遠心分離後、上清
を、同溶液で平衡化したＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍに
よる陰イオン交換クロマトグラフィーに付した。この操
作による未吸着画分を凍結乾燥し、ＤＥＡＥトヨパール
６５０Ｍ（pH８．５）で再度クロマトグラフィーに付し
た後、未吸着画分を分取、凍結乾燥し、次にセファクリ
ルＳ−２００でゲル濾過を行った。その結果、セルラー
ゼＳ−１（１３６．３ＫＵ／mg）を分離することができ
た。

【００４５】実施例４ 実施例３で得られたセルラーゼＳ−１及び特開昭６３−
１０９７７７号公報記載のＣＭＣアーゼＩについて、種
々の基質に対する酵素活性を、pH７のリン酸緩衝液を用
いて測定した。その結果、表４に示したように、セルラ
ーゼＳ−１は、ＣＭＣのほかにｐ−ニトロフェニルセロ
ビオシド、キシラン及びリケナンに対して明らかに高い
分解能を有し、濾紙、リン酸膨潤セルロース、カードラ
ン及びラミナリンに対しても活性を示した。また、アビ
セルに対しては、全く分解能を有していない。この結果
から明らかなように、本発明のセルラーゼＳ−１は、Ｃ
ＭＣアーゼＩに比較して広い基質特異性を有している。

【００４６】

【表４】

【００４７】実施例５ 実施例３で得られたセルラーゼＳ−１について、プロテ
アーゼ耐性を測定した。トリプシン（シグマ社製）、サ
ビナーゼ（ノボ社製）を終濃度で０．１％となるように
添加し、０．１Ｍリン酸緩衝液（pH７．０）中で４０℃
で保存した。この結果を表５に示す。

【００４８】

【表５】

【図面の簡単な説明】

【図１】セルラーゼＳ−１の酵素反応pHと相対活性の関
係を示す図である。

【図２】セルラーゼＳ−１の処理pHと相対活性の関係を
示す図である。

【図３】セルラーゼＳ−１の反応温度と相対活性の関係
を示す図である。

【図４】セルラーゼＳ−１と処理温度と相対活性の関係
を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 山田 直人 茨城県鹿島郡波崎町土合本町１−8762−23 花王土合社宅１−201

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次の物理化学的性質を有するセルラーゼ
   Ｓ−１。 （１）作用 カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）によく作用し、
   これらを溶解せしめ、還元糖を生成する。 （２）基質特異性 ＣＭＣのほか、キシラン、リケナン及びｐ−ニトロフェ
   ニルセロビオシドに対して非常によく作用し、また濾
   紙、リン酸膨潤セルロース、カードラン及びラミナリン
   に対しても若干作用する。 （３）作用pH及び至適pH ＣＭＣを基質とした場合の作用pHは４〜１０、至適pHは
   ６．８である。pH５．５〜８．０において、至適pHでの
   活性の５０％以上の活性を有する。 （４）pH安定性 ４０℃、２時間処理した場合、pH４．５〜８．０で失活
   しない。 （５）作用温度及び至適温度 ＣＭＣを基質とした場合の作用温度は２０〜７０℃、至
   適温度は５０℃である。３０〜６０℃においても至適温
   度での活性の５０％以上の相対活性を有する。 （６）温度安定性 pH７．０、３０分間処理した場合、０〜４５℃の間で安
   定である。 （７）界面活性剤の影響 アルキルスルホン酸ナトリウム塩（ＳＡＳ）、アルキル
   硫酸エステルナトリウム塩（ＡＳ）又はポリオキシエチ
   レンアルキル硫酸ナトリウム塩（ＥＳ）の１０％水溶液
   とともに４０℃で保存した場合２週間後でも５０％以上
   の残存活性を有する。 （８）プロテアーゼ耐性 プロテアーゼ存在下で３日間で８０％以上の残存活性を
   有する。 （９）金属イオンの影響 Sn²⁺、Fe²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺及びHg²⁺により阻害され、Co²⁺
   により活性化される。 （10）分子量 ２２，０００±２，０００（セファクリルＳ−２００に
   よるゲル濾過法及びＳＤＳ電気泳動法による）。 （11）糖の含量 フェノール硫酸法では、発色は認められない。
2. 【請求項２】 ストレプトマイセス・エスピー ＫＳＭ
   −２６（ＦＥＲＭＰ−１３５４８）の培養物より分離取
   得されたものである請求項１記載のセルラーゼＳ−１。