JPH0427382A - 新規微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はアスペルギルス　ニガーに属し、界面活性剤及
びプロテアーゼに対して耐性を有するセルラーゼを生産
する新規な微生物に関する。

〔従来の技術〕

繊維素分解酵素（セルラーゼ）の開発は、従来、バイオ
マス資源の有効利用を一大目標として進められており、
トリコデルマ属、アスペルギルス属、アクレモニウム属
、フミコーラ属等の糸状菌を中心に、シュウトモナス属
、セルロモナス属、ルミノコッカス属、バチルス属等の
細菌、更に、ストレプトコツカス属、アクチノマイセス
属等の放線菌を供給源とするセルラーゼが報告されてい
る。

しかしながら、現時点では、バイオマス用セルラーゼの
工業的規模での利用は多くない。

一方、セルラーゼの産業的用途として、衣料用洗浄剤の
配合成分としての利用が大きくなっている（特公昭５９
−４９２７９号公報、特公昭６０−２３１５８号公報、
特公昭６０−３６２４０号公報等）。斯かる衣料用洗浄
剤組成物として使用し得るセルラーゼを生産するには、
好アルカリ性バチルス属細菌の培養によりセルラーゼＡ
を採取する方法（特公昭５０−２８５１５号公報）、セ
ルロモナス属に属する好アルカリ性細菌を培養してアル
カリセルラーゼ３０１−Ａを生産する方法（特開昭５８
−２２４６８６号公報）、好アルカリ性バチルスＮｏ、
１１３９を培養してカルボキシルメチルセルラーゼ（ｃ
ＭＣ）を生産する方法（Ｈｏｒｉｋｏｓｉら、Ｊ、Ｇｅ
ｎ１Ｍ１ｃｒｏｂｉｏ１．、　１３１巻、　　３３３９
頁、　　（１９８５年））、ストレプトマイセス属の一
種を用いてアルカリセルラーゼを生産する方法（特開昭
６１−１９４８３号公報）、好アルカリ性細菌の一種バ
チルス・エスピーＫＳＭ−６３５（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　
ｓｐ、にＳトロ３５）を培養してアルカリセルラーゼＫ
を生産する方法（特開昭６３−１０９７７６号公報）等
の所謂アルカリセルラーゼを生産する方法と、バチルス
属細菌を培養してアルカリ耐性セルラーゼに−５２２及
びに−５８８を生産する方法（特開昭６４−３７２８５
号公報、特開昭６４−３７２８６号公報）等の所謂アル
カリ耐性セルラーゼを生産する方法が報告されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、これらのセルラーゼはタンパク質分解酵
素であるプロテアーゼに対する耐性を有していない。そ
のたｔ１プロテアーゼが配合された液体衣料用洗浄剤に
配合することができないという欠点を有している。

この欠点を解決するには、当該セルラーゼを固定化する
か、或は当該セルラーゼを化学修飾することにより安定
化させる方法等が考えられるが、この方法はコストがか
かったり、収率も悪いなど産業的利用に適しているとは
いえない。

従って、プロテアーゼとともに洗浄剤組成物に配合する
ことのできるプロテアーゼ耐性セルラーゼを産生ずる微
生物の提供が求ｔられていた。

〔課題を解決するための手段〕

斯かる実状において、本発明者らは、界面活性剤及びプ
ロテアーゼに対して耐性を有するセルラーゼ生産菌を自
然界より検索した結果、茨城県鹿島郡周辺の土壌より分
離した菌株が、界面活性剤及びプロテアーゼに対して耐
性を有するセルラーゼを生産することを見出し、本発明
を完成した。

すなわち、本発明はアスペルギルス　ニガーＫＳＭ−２
５と命名され、微工研菌寄第１１３２８号として寄託さ
れた新規微生物を提供するものである。

本発明のアスペルギルス　ニ、ｆｌ”−ＫＳＭ−２５は
以下に示すような菌学的性質を有する。

（ａ）　　形態 分生子柄の先端が膨らみ頂嚢となる。その表面上に梗子
が複列に直塗する胞子は黒色をし梗子の先端から、球状
または放射状に長い連鎖を形成する。

（ｂ）　　各培地における生育状態（３０℃で、８日間
培養） １）麦芽エキス寒天培地：コロニーは不規則形で中心凸
状。高さは２−４ｗ０表面の色は黒色、裏は白色。コロ
ニーの生育速度は、０．８３ｃｍ／日。

２）バレイショ・ブドウ糖寒天培地：コロニは不規則形
で中心凸状。高さは２−４ｍｍ０生育は極めて良好。表
面の色は黒色、裏は白色。コロニーの生育速度は、０．
４３ｃｍ／日。

３）ツアペック寒天培地：コロニーはやや不規則形で中
心やや凸状。高さは２−３ｍｍ０表面の色は黒色、裏は
白色。コロニーの生育速度は、０．８３ｃｍ／日。

４）サブロー寒天培地：コロニーは円形で渦状に凸状。

高さは２−４ｎｎｏ０表面の色は黒色、裏は白色。コロ
ニーの生育速度は、０．８３ｃｍ／日。

５）オートミール寒天培地：コロニーは円形で偏平状。

高さは１−２ｎｎｎ０生冑は良好で、水滴有り。表面の
色は黒色、裏は白色。コロニーの生育速度は、１．１０
ｃｍ／日。

６）ＹｐＳｓ寒天培地：コロニーは円形で偏平状。高さ
は１−２ｍｍ、表面の色は黒色、裏は白色。色素は生成
しない。コロニーの生育速度は、１．１０ｃｍ／日。

（ｃ）　　各生理的、生態的性質 １）生育ｐＨ：ｐＨ４−１０ ２）生育温度：２０−４０℃ ３）生育ＮａＣｊ！濃度＝３Ｍ以下 ４）至適ｐＨ：ｐＨ５−６ ５）至適温度：３０℃ ６）硝酸塩資化性：　＋ ７）Ｖ−Ｐテスト： 以上の菌学的性質について、“微生物の分類と同定（上
）”　（長谷用武治著、株式会社学会出版センター発行
）、“カビの分離・培養と同定”（宇日用俊−１室井哲
夫訳、医歯薬訳出版株式会社発行）に記載されている検
索表を参照にした結果、本菌株は、アスペルギルス　ニ
ガーに属する新菌株と判断し、アスペルギルス　ニガー
ＫＳＭ−２５と命名して微工研菌寄第１１３２８号とし
て工業技術院微生物工業技術研究所に寄託した。

本発明のアスペルギルス−ニガーＫＳＭ−２５は界面活
性剤及びプロテアーゼに対して耐性を有するセルラーゼ
（以下、単に［プロテアーゼ耐性セルラーゼ」という）
を産生ずる。斯かるプロテアーゼ耐化セルラーゼを得る
には、本菌株を培地に接種し、常法に従って固体または
液体培養すればよい。培地中には資化し得る炭素源及び
窒素源を適当量含有せしめておくことが好ましい。この
炭素源及び窒素源については特別に制限はなく、例えば
、窒素源としては、無機態の硝安、硫安、塩安、リン酸
アンモニウム、硝酸ソーダや大豆粉、コーンスチープリ
カー、カザミノ酸、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、
綿実油粕、カルチベータ、アジックス及びグルタミン酸
ソーダ等が挙げられ、また、炭素源としては、籾殻、ふ
すま、おが屑等のｍ物ｍｍ質、ＣＭＣ，アビセル、セル
ロース綿、キシラン、ペクチンに加え、資化し得る炭素
源、例えば、アラビノース、キシロース、グルコース、
マンノース、フラクトース、ガラクトース、ショ糖、ト
レハロース、グリセリンや資化し得る有機酸、例えば、
クエン酸や酢酸が挙げられる。また、その他、リン酸、
Ｍｇ”、Ｃａ”、Ｎａ”＋　Ｋ十等の無機塩や、必要で
あれば、無機、有機微量栄養源を培地中に適宜添加する
こともできる。

培養は３０℃で３日間振とうまたは通気撹拌培養を行う
。培養後、フィルタープレスにより、菌体及び不溶物を
除けば粗酵素液が得られる。かくして得られた粗酵素液
はそのまま使用することもできるが、必要に応じて精製
を行う。この目的物であるプロテアーゼ耐性セルラーゼ
の精製は、常法に従い行うことができる。更に必要に応
じ、プロテアーゼ耐化であることを利用してプロテアー
ゼ処理をすることにより採取及び精製を行うこともでき
る。

すなわち、例えば、塩析法、溶媒沈澱法（メタノール、
エタノール、イソプロパツール等）によってタンパク質
を沈澱させたり、限外濾過（例えば、旭化成社製、分画
分子量１．３万）により濃縮後、凍結乾燥により、粗酵
素粉末とすることができる。具体的には塩析法の場合、
例えば、硫安（６０〜１００％飽和画分）で沈澱させた
後、濾過或いは遠心分離、脱塩することによってこれを
凍結乾燥粉末にすることができる。脱塩の方法としては
透析又はセファデックス（、−２５（ファルマシア社製
）等を用いるゲル濾過法等の一般的方法が用いられる。

〔発明の効果〕

本発明のアスペルギルス−ニガーＫＳＭ−２５は新規な
微生物であり、これの産生ずるプロテアーゼ耐化セルラ
ーゼは、界面活性剤、プロテアーゼ等の洗浄剤配合成分
に対して極めて強い耐性を有している。

〔実施例〕

以下、実施例及び参考例を挙げて本発明を更に詳しく説
明する。

尚、本実施例におけるＣＭＣアーゼ活性測定法は以下の
通りである。

（１）ＣＭＣアーゼ活性 １０ｍｇＣＭＣ（ＡＯＩＭＣ，山間国策パルプ社製）　
、１００ｍＭ各緩衝液全緩衝液質溶液０．９−に０．１
−の酵素溶液を加え、４０℃、２０分反応した。反応後
、３．５−ジニトロ−サリチル酸（３゜５−ｄｉｎｉｔ
ｒｏ−ｓａｌｉｃｙｌｉｃ　ａｃｉｄ　（ＤＭＳ）　）
法にて還元糖の定量を行った。すなわち、反応後、１．
０−にＤＮＳ試薬１．０−を加え、５分間、１００℃で
加熱発色させ、冷却後、４．０ｒｎｌの蒸留水を加えて
希釈した。これを波長５３５ｎｍで比色定量した。酵素
力価は、上記の条件下で１分間に１μｍｏβのグルコー
スに相当する還元糖を生成する酵素量を１単位とした。

実施例 茨城県鹿島郡波崎町周辺の採取土壌約１ｇを１％Ｎａｆ
ｊ！含有滅菌水５−に懸濁し、撹拌・静置後、その上清
をスクリーニング用ＣＭＣ含有寒天培地（培地１）に塗
布して３０℃で２−７日培養後、ハローを形成したコロ
ニーを選比し、ＣＭＣアーゼ生産菌を取得した。取得菌
は、肉眼的及び、顕微鏡的に単一になるまで単集落分離
を繰り返すと、純粋な分離菌を得ることができた。更に
得られた菌を液体培地（培地２）に接種し、３０℃、３
日間振とう培養した。培養後遠心分離した上清液に、１
％ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステルナトリウム
塩（ＥＳ）、サビナーゼ（ノボ社製）をＩＡＵ／−とな
るように添加し、４０℃にて保存し、ｐＨ９におけるＣ
ＭＣアーゼ活性の残存活性を測定し、プロテアーゼ耐性
セルラーゼ生産菌を選択した。

上記の方法により、本発明のアスペルギルス−ニガー　
ＫＳＭ−２５（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１３２８）を取得する
ことができた。

参考例１ 実施例で得たアスペルギルス　ニガー　ＫＳＭ−２５株
を、ＣＭＣを３％フスマに代え、ポリペプトンを０．５
％硝酸に代えた実施例の液体培地２に接種し、３０℃、
３日間、通気量Ｑ、５ｖｖｍ、撹拌数２０Ｏｒｐｍで３
０ｆ発酵槽により培養した。培養後、フィルタープレス
により菌体及び不溶物を除き、粗酵素液を得た。この粗
酵素液１５Ｉ２を限外濾過（旭化成社製、分画分子量１
．３万）により濃縮、脱塩を行い１１の粗酵素液を得た
。さらに、凍結乾燥を行い、乾燥粉体としてプロテアー
ゼ耐性酵素（比活性　１０５単位／ｇ）１８．６ｇを得
た。

尚、酵素活性はｐＨ９に於ける測定値である。

参考例２ 参考例１で得られた粗酵素液を１０％ＥＳ、サビナーゼ
ＩＡＵ／ｍｊ！と共存させ、４０℃、２週間後の残存活
性を測定した。その結果、６３％の活性を有していた。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の菌学的性質を有し、アスペルギルス−ニガーＫ
   ＳＭ−２５と命名され、微工研菌寄第１１３２８号とし
   て寄託された新規微生物。 （ａ）形態 分生子柄の先端が膨らみ頂嚢となる。その表面上に梗子
   が複列に直生する。胞子は黒色をし梗子の先端から、球
   状または放射状に長い連鎖を形成する。 （ｂ）各種培地における生育状態 １）麦芽エキス寒天培地：コロニーは不規則形で中心凸
   状で、高さは２−４ｍｍ。表面の色は黒色、裏は白色。 コロニーの生育速度は、０．８３ｃｍ／日。 ２）バレイショ・ブドウ糖寒天培地：コロニーは不規則
   形で中心凸状で、高さは２−４ｍｍ。生育は極めて良好
   。表面の色は黒色、裏は白色。 コロニーの生育速度は、０．４３ｃｍ／日。 ３）ツアペック寒天培地：コロニーはやや不規則形で中
   心やや凸状で、高さは２−３ｍｍ。表面の色は黒色、裏
   は白色。コロニーの生育速度は、０．８３ｃｍ／日。 ４）サブロー寒天培地：コロニーは円形で渦状に凸状で
   、高さは２−４ｍｍ。表面の色は黒色、裏は白色。コロ
   ニーの生育速度は、０．８３ｃｍ／日。 ５）オートミール寒天培地：コロニーは円形で偏平状で
   、高さは１−２ｍｍ。生育は良好で、水滴有り。表面の
   色は黒色、裏は白色。コロニーの生育速度は、１．１０
   ｃｍ／日。 ６）ＹｐＳｓ寒天培地：コロニーは円形で偏平状で、高
   さは１−２ｍｍ。表面の色は黒色、裏は白色。色素を生
   成しない。コロニーの生育速度は、１．１０ｃｍ／日。 （ｃ）各生理的、生態的性質 １）生育ｐＨ：ｐＨ４−１０ ２）生育温度：２０−４０℃ ３）生育ＮａＣｌ濃度：３Ｍ以下 ４）至適ｐＨ：ｐＨ５−６ ５）至適温度：３０℃ ６）硝酸塩資化性：＋ ７）Ｖ−Ｐテスト：