JPH0553786B2

JPH0553786B2 -

Info

Publication number: JPH0553786B2
Application number: JP60147039A
Authority: JP
Inventors: Hamao Umezawa; Tomio Takeuchi; Masa Hamada; Hiroshi Naganawa; Tsutomu Sawa; Masaya Imoto; Hironobu Iinuma; Takeshi Uchida; Kunio Isshiki
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1985-07-04
Filing date: 1985-07-04
Publication date: 1993-08-10
Also published as: EP0213320B1; EP0213320A1; US4686308A; DE3660810D1; JPS6210048A

Description

【発明の詳細な説明】

発明の背景本発明は新規物質に関し、より具体的には抗腫
瘍活性並びに抗菌活性を有する新規生理活性物質
MH435に関する。抗腫瘍性物質並びに抗菌性物質に関しては既に
多数のものが医薬として実用化されているが、こ
れらは薬効および（または）副作用の点で必らず
しも満足できるものではなく、より優れた新規な
抗腫瘍性物質並びに抗菌性物質に関しては不断の
希求があるのが現状である。ビシヨツプ（Bishop、J.M.）は、ある種のガ
ン遺伝子産物がチロシン特異的プロテインキナー
ゼ活性を有することを報告している〔アニユア
ル・レビユー・オブ・バイオケミストリー（A.
Rev.Biochem.52 301〜354（1983）〕。またコーエ
ン（Cohen、S.）らは、チロシン特異的プロテイ
ンキナーゼが多くの細胞増殖因子による細胞増殖
の過程にシグナル物質として関与していると報告
している（ジヤーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー（J.Biol.Chem）257 1523〜1531
（1982））。本発明者らは、これらの事実に着目し
て、チロシン特異的プロテインキナーゼ活性の阻
害物質を広く自然界からスクリーニングし、これ
らが抗腫瘍活性並びに抗菌活性を有することを見
い出して、本発明を完成した。発明の概要本発明による新規生理活性物質MH435は、次
式（）で示されるものである。式中、Ｒは、次のＡ又はＢのいずれかを示す。Ａ：−CH＝Ｃ−NHCHO Ｂ：−CH₂−CH₂−NHCHO 発明の具体的説明新規生理活性物質MH435 (1) 化学構造本発明化合物のMH435は、上記式（）で
示される化学構造を有する。 (2) 理化学的性質

【表】 MH435の製造 (1) 概要 MH435は現在のところ微生物の培養
（MH435−Ａ）と培養生産物の合成化学的修飾
（MH435−Ｂ）によつてのみしか得られていな
いが、その他の方法、例えば化学的方法により
全合成で製造することもできよう。微生物の培養による場合の菌株としては、ス
トレプトミセス属に属するMH435−Ａ生産能
を有するものが使用される。具体的には、本発
明者らの分離したMH435−hF3株がMH435−
Ａを生産することが発明者らによつて明らかに
されているが、その他の菌株については抗生物
質生産菌単離の常法によつて適当なものを自然
界より分離することが可能である。また、
MH435−hF3株を含めてMH435−Ａ生産菌を
変異処理（放射線処理等）に付して、MH435
−Ａ生産能を高める余地も残されている。さら
にまた、この微生物のMH435−Ａ産生に関す
る遺伝情報を担う遺伝子DNAを形質転換、細
胞融合その他の遺伝子操作的手法によつてMH
−435A生産能の微生物を誘導するもともでき
る。 (2) MH435−hF3株 MH435−Ａ生産能を有するストレプトミセ
ス属の菌株として本発明者らの見出している
MH435−hF3株は、下記の内容のものである。Ａ由来および寄託番号 MH435−hF3株は昭和59年11月に微生物
化学研究所において構内の土壌より分離され
た放線菌であつて、昭和60年５月21日に工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託されて、
「微工研菌寄第8246号」の番号を得ている。
そして昭和61年６月17日に「微工研条寄第
1082号」の番号を得ている。Ｂ MH435−hF3株の菌学的性状 (1) 形態 MH435−hF3株は、顕微鏡下で、分枝
した基中菌糸よりらせん形成を有する気菌
糸を伸長し、輪生枝はみとめられない。成
熟した胞子鎖は、10個以上の胞子の連鎖が
みとめられ、胞子の大きさは0.6〜0.8×1.0
〜1.2ミクロン位である。なお、胞子の表
面には比較的長いとげ状の突起を有する。 (2) 各種の培地における生育状態色の記載について、〔〕内に示す標準
は、コンテイナー・コーポレーシヨン・オ
ブ・アメリカのカラー・ハーモニイ・マニ
ユアル（Container Corporのtion of
AmericaのColor harmony manual）を
用いた。 (イ) シユクロース硝酸塩寒天培地（27℃培
養）無色の発育上に、黄茶〔2ni、
Mustard Brown〕〜茶灰〔2li Covert
Brown〕の気菌糸を着生し、溶解性色
素はみとめられない。 (ロ) グルコース・アスパラギン寒天培地
（27℃培養）うす黄の発育上に、明るいオリーブ灰
〜オリーブ灰（11／2ig、Olive Gray〜
11／2li Lt Olive Drab〜2li Covert
Brown〕の気菌糸を着生し、溶解性色
素はみとめられない。 (ハ) グリセリン・アスパラギン寒天培地
（ISP−培地５、27℃培養）うす黄茶〔2le、Mustard〜3pg、
Golden Brown〕の発育上に、明るい灰
〜明るいオリーブ灰〔1fe、Griege〜
11／2ge、Lt Olive Gray〕の気菌糸を
着生する。溶解性色素は、黄茶をおび
る。 (ニ) スターチ・無機塩寒天培地（ISP−培
地４、27℃培養）無色の発育上に、灰味オリーブ〔2ni、
Mustard Brown〕の気菌糸を着生す
る。溶解性色素はわずかに茶色味をおび
る程度である。 (ホ) チロシン寒天培地（ISP−培地７、27
℃培養）うす黄茶〔2gc、Bamboo〜2le、
Mustard〕〜黄茶〔3ug、Yellow
Maple〕の発育上に、茶白〜明るいオリ
ーブ灰〔1ge、Citron Gray〜11／2ge、
Lt Olive Gray〜11／2ig、Olive Gray〕
の気菌糸を着生する。溶解性色素は、黄
茶をおびる。 (ヘ) 栄養寒天培地（27℃培養）発育はうす黄茶〔2gc、Bamboo〕、気
菌糸は着生せず、溶解性色素もみとめら
れない。 (ト) イースト・麦芽寒天培地（ISP−培地
２、27℃培養）うす黄茶〔3le、Cinnamon〜3pg、
Golden Brown〕の発育上に、明るいオ
リーブ灰〔11／2lg、Golden Olive〕〜
オリーブ灰〔11／2ni、Olive〕の気菌糸
を着生し、溶解性色素はわずかに茶色味
をおびる程度である。 (チ) オートミール寒天培地（ISP−培地
３、27℃培養）無色からうす黄の発育上に、白〜オリ
ーブ灰の気菌糸を着生し、溶解性色素は
わずかに茶色味をおびる程度である。 (リ) グリセリン・硝酸塩寒天培地（27℃培
養）発育はうす黄〔2gc、Bamboo〕。気菌
糸は着生しないか、あるいは白の気菌糸
をわずかに着生する。溶解性色素は、わ
ずかに茶色味をおびる。 (ヌ) スターチ寒天培地（27℃培養）無色の発育上に黄茶の気菌糸を着生
し、溶解性色素はみとめられない。 (ル) リンゴ酸石灰寒天培地（27℃培養）発育はうす黄茶〔2ge、Bamboo〕、気
菌糸は着生しないか、あるいはごくわず
かな明るいオリーブ灰の気菌糸を着生
し、溶解性色素はみとめられない。 (ヌ) セルロース（27℃培養）発育は無色。明るいオリーブ灰の気菌
糸をごくわずかに着生し、溶解性色素は
みとめられない。 (ワ) ゼラチンの穿刺培養単純ゼラチン培地（20℃培養）では、
発育は無色〜うす黄、気菌糸は着生せ
ず、溶解性色素はみとめられない。グル
コース・ペプトン・ゼラチン培地（27℃
培養）では、発育はうす黄、気菌糸は着
生せず、溶解性色素もみとめられない。 (カ) 脱脂牛乳（27℃および37℃培養） 27℃の場合、うす黄の発育上にうつす
らと白の気菌糸を着生し、溶解性色素は
みとめられない。37℃培養の時は、生育
がやや悪く、発育はうす黄、気菌糸は着
生せず、溶解性色素もみとめられない。 (3) 生理的性質 (イ) 生育温度範囲スターチ・無機塩寒天培地（ISP−培
地４）を用い、20℃、24℃、27℃、30
℃、37℃、50℃の各温度で試験の結果、
50℃を除いていずれの温度でも生育する
が、最適温度は30℃付近と思われる。 (ロ) ゼラチンの液化（15％単純ゼラチン、
20℃培養およびグルコース・ペプトン・
ゼラチン、27℃培養）単純ゼラチン培地においては、培養後
４日目頃、またグルコース・ペプトン・
ゼラチン培地においては、培養後３日目
頃から液化がはじまる。その作用は中等
度〜強い方である。 (ハ) スターチの加水分解（スターチ・無機
塩寒天培地およびスターチ寒天培地）いずれの培地においても、みとめられ
ない。 (ニ) 脱脂牛乳の凝固・ペプトン化（脱脂牛
乳、27℃および37℃培養） 27℃の場合は、凝固なしに培養後10日
目頃よりペプトン化がはじまり、その作
用は中等度〜強い方である。なお、生育
のやや悪い37℃の時も、培養後14日目頃
よりペプトン化がはじまるが、その作用
は中等度〜弱い方である。 (ホ) メラニン様色素の生成（トリプトン・
イースト・ブロス、ISP−培地１：ペプ
トン・イースト、鉄寒天、ISP−培地
６：チロシン寒天、ISP−培地７、いず
れも27℃培養）いずれの培地においても、みとめられ
ない。 (ヘ) 炭素源の利用性（プリドハム・ゴトリ
ーブ寒天培地、ISP−培地９、27℃培
養）グルコース、ラフイノース、Ｄ−マン
ニトールを利用して発育し、Ｌ−アラビ
ノースはおそらく利用すると思われ、シ
ユクロース、ラムノースは利用しない。
Ｄ−キシロース、Ｄ−フラクトース、イ
ノシトールの利用性については、利用す
るか、否かはつきりしない。 (ト) リンゴ酸石灰の溶解（リンゴ酸石灰寒
天、27℃培養）培養後７日目頃から、発育周辺のリン
ゴ酸石灰を溶解する。その作用は、中等
度乃至強い方である。 (チ) 硝酸塩の還元反応（0.1％硝酸カリ含
有ペプトン水、ISP−培地８、27℃培
養）くり返しの試験で陰性の場合と陽性の
場合とがある。以上の性状を要約すると、MH435−hF3株は、
その形態上胞子のうをみとめず、気菌糸はらせ
ん形状を有し、輪生枝はみとめられない。ま
た、胞子の表面は、とげ状である。種々の培地
で、発育は無色〜うす黄あるいはうす黄茶、気
菌糸は明るいオリーブ灰〜オリーブ灰、あるい
は黄茶を呈する。溶解性色素は、わずかに茶〜
黄茶をおびる。メラニン様色素の生成は陰性、
または澱粉水解性はみとめられない。蛋白分解
力は、中等度〜強い方である。なお、この菌株の全菌体中に含まれる２，６
−ジアミノピメリン酸はLL−型であり、上記
の性状と考えあわせると、MH435−hF3株が
ストレプトミセス（Streptomyces）属に属す
ることは明らかである。これらの性状より、MH435−hF3株に類似
の既知菌種を検索すると、次の３種があげられ
る。すなわち、ストレプトミセス・ヴイリドス
ポルス（Streptomyces viridosporus）〔文
献：インターナシヨナル・ジヤーナル・オブ・
システマチツク・バクテリオロジー
（International Journal of Systematic
Bacteriology）22巻、371頁、1972年（文献
１）、英国特許第712547号明細書（文献２）〕ス
トレプトミセス・ヴイリドデイアスタテイクス
（Streptomyces viridodiastaticus）〔文献：同
誌19巻、500頁、1969年、同誌、30巻、405頁、
1980年〕およびストレプトミセス・ミタカエン
シス（Streptomyces mitakaensis）〔文献：
ザ・ジヤーナル・オブ・アンチビオチクス
（The Journal of Antibiotics）シリーズＡ、
11巻、14頁、1958号〕である。ストレプトミセス・ヴイリドデイアスタテイ
クス（IMC Ｓ−0350〔ISP5249〕およびストレ
プトミセス・ミタカエンシス（IMC Ｓ−0508
〔NIHJ77〕は、極めて類似した菌種であるが、
この２種のMH435−hF3株とは、比較試験に
より明らかに区別された。すなわち、顕微鏡所
見、特に気菌糸形成およびその先端のらせん形
成、気菌糸の色、牛乳のペプトン化等に関して
である。残るストレプトミセス・ヴイリドスポ
ルスとの比較試験結果は、下表に示す通りであ
る。

【表】

〔チロシン特異的プロテインキナーゼ活性の測定法〕

チロシン特異的プロテインキナーゼ活性は、エ
ピダーマル・グロース・フアクター受容体のもつ
チロシン特異的プロテインキナーゼ活性としてヒ
ト上皮カルシノーマ細胞Ａ−431の膜画分を用い、
カーペンター等（G.Carpenter et al）〔（ザ・ジ
ヤーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（The Jaurnal of Biological Chemistry）、254
4874〜4891（1979）〕記載の酵素活性測定法を改
良して行つた。すなわち、ImM MnCl₂、100ng
エピダーマル・グロース・フアクター、40μｇ
Ａ−431膜画分、7.5μｇアルブミン、3μｇヒスト
ン及びMH435−ＡもしくはMH435−Ｂを含む
50μの20ｍＭヘペス緩衝液（PH7.4）を０℃／10
分間でプレインキユベーシヨン後、〔ガンマー
³²P〕アデノシン三リン酸（0.25ｍCi／0.125ml）
を10μ添加し、０℃で30分間反応を行つた。
50μをサンプリングし、ワツトマンNo.3MM
紙に吸着させ、氷冷したTCA中に浸漬し、30分
間放置後、紙をとりだし、TCA、エタノール、
エーテルで洗浄し、紙に付着した³²Pのカウン
トを測定した(a)。同時に、検体だけを除いて同様
に反応・処理した時のカウント(b)、またそれぞれ
膜画分を除いた測定値を（a′）および（b′）とし
て、エピダーマル・ル・グロース・フアクター・
レセプラーキナーゼの阻害率を式〔ａ−a′）／
（ｂ−b′）〕×100により計算した。 MH435の生理活性本発明のMH435は、次に示すように抗腫瘍活
性並びに抗菌活性を有しており、医薬として有用
な化合物である。 (1) チロシン特異的プテインキナーゼの阻害活性前記の測定法で求めたMH435−Ａおよび
MH435−Ｂの50％阻害濃度は、それぞれ0.55μ
ｇ／mlおよび0.6μｇ／mlであつた。 (2) 培養ガン細胞に対する作用本発明によるMH435−Ａ物質は、L1210白
血病細胞、IMCカルシノーマ細胞、Ki−
NRK、ts Src−NRK、Ａ−431細胞の培養細
胞の増殖を非常に低濃度で阻止する。（下表）

【表】なおIC₅₀は、各細胞をデイシユにまき（３〜５
×10⁴cells／dish）、１日培養（37℃、CO₂濃度
５％）後、MH435−Ａを添加し、さらに同条
件で３日間培養後、細胞数を計数することによ
り測定した。 (3) 急性毒性（LD₅₀）本発明のMH435−Ａ物質のマウス腹腔１回
投与によるLD₅₀値は、200mg／Kg以上であつ
た。 (4) 抗菌活性ミユーラーヒントン培地を用いた寒天希釈法
による各種細菌に対する最低発育阻止濃度
（MIC）を次表に示す。

【表】

【表】実施例実施例１ MH435−Ａ生産菌、MH435−hF3株の斜面培
養物から一白菌耳量をあらかじめ120℃ 20分間
滅菌した培地（500mlの三角フラスコに110mlずつ
分注した。グリセロール３％、魚粉２％、炭酸カ
ルシウム0.2％を含むPH7.4の培地）に接種した。
27℃／毎分180回転で好気的に振とう培養した。
経時的にMH435−Ａ産生量を培養液の抗エピダ
ーマル・グロース・フアクター・レセプターキナ
ーゼ活性の測定により検討した。その結果、エピ
ダーマル・グロース・フアクター・レセプターキ
ナーゼの阻害活性により定量したMH435−Ａ培
養液濃度は培養４日後に最高に達し、以下６日後
まで安定に維持されたが、その後は徐々に低下し
た。実施例２実施例１で示した培養条件で48時間培養した種
培養液を実施例１と同様の培地に３ml接種し、同
様に96時間培養してから得られた培養液５リツト
ルを遠心分離にかけて、4.6リツトルの培養液
を得た。得られた培養液4.6リツトルを等量の
酢酸ブチルで抽出し、酢酸ブチルを減圧下に濃縮
乾固して、360mgを得た。得られた粗粉末を20ｇ
のシリカゲル（メルク社製「キーゼルゲル60」、
70〜230メツシユ）のカラムに吸着させ、クロロ
ホルム・メタノール混液の比率を少しずつ変化さ
せながら、段階的に溶出させてMH435−Ａを含
む画分を集め、減圧下に濃縮乾固して、110mgの
粗粉末を得た。この粗粉末のエピダーマル・グロ
ース・フアクター・レセプター・キナーゼ阻害活
性（IC₅₀）は、1.6μｇ／mlであつた。この粗粉末をメタノールに溶解し、これを予め
20％メタノール水溶液で平衡化した分取用高速液
体クロマトグラフ用逆相カラム「ヌクレオシル
₅C₁₈」（M.ナーゲル社製）に吸着させ、カラムか
ら20％メタノール水溶液で毎分８mlの流速で溶出
させた。溶出液を10mlずつ分画し、活性画分を集
めて減圧下に濃縮し、酢酸ブチルで抽出後、濃縮
乾固し、少量の酢酸エチルに溶解後、クロロホル
ムで結晶化を試みた結果、60.3mgのMH435−Ａ
の結晶を得た。このMH435−Ａの結晶物のエピ
ダーマル・グロース・フアクター・レセプターキ
ナーゼ阻害活性（IC50）は0.55μｇ／mlであつた。実施例３実施例２で得られたMH435−Ａの結晶23.4mg
を10mlのメタノールに溶解し、酸化白金１スパー
テル添加後、水素気流下で２時間還元処理を行な
い、過後、液を減圧下で濃縮し、シリカゲル
の薄層（メルク社「キーゼルゲル60F₂₅₄」）に吸
着させ、トルエン：ガセトン＝１：１混流にて展
開し、分離したMH435−Ｂ画分をかきとり、酢
酸エチルで溶出した。このようにして得た画分を
濃縮後、メタノールにて平衡化した「セフアデツ
クスLH−20」カラム1.0×40cmを同じ組成の溶媒
にて通過させ、減圧乾固後、MH435−Ｂを10.1
mg得た。このMH435−Ｂのエピダーマル・グロ
ース・フアクター・レセプターキナーゼ阻害活性
（IC₅₀）は6.0μｇ／mlであつた。

Claims

【特許請求の範囲】１次式で示される新規生理活性物質MH435 式中、Ｒは、次のＡ又はＢのいずれかを示す。Ａ：−CH＝Ｃ−NHCHO Ｂ：−CH₂−CH₂−NHCHO