JPH05509330A - Ｇｍｐ―１４０に対する糖タンパク質リガンド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 機能的に活性なセレクチンで誘導さするペプチド、およびＧＭＰ−１４０に対す るリガンド 主息ヱどえ！ 本発明は、一般に、ＧＭＰ（４０，ＥＬＡＭ（およびす７パ球ホーミングレセプ ターを含むセレクチン類（Ｓｅｌｅｃｔｉｎｓ）との結合反応をともなう炎症反 応の治療法と予防法に関する。

本発明は米国国立心臓、肺臓および血液研究所（ＮａｔｉｏｎａｌＨｅａｒｔ、 　Ｌｕｎｇ　ａｎｄ　Ｂｌｏｏｄ　１ｎｓｔｉｔｕｔｅ）の助成金によるもので あるから、米国政府は本発明に権利をもっている。

血小板とリンパ球の血管表面への付着は炎症反応の重要な要素であり、かつ補体 系、凝血系および免疫系の同時におこる相互に関連する活性化を伴う一連の複雑 な反応の一部である。

トロンビンおよびヒスタミンのような「迅速」活性化因子に暴露された内皮は２ 〜１０分以内に好中球に対して付着性になるが、一方腫瘍壊死因子およびインタ ーロイキン−１のようなサイトカイン類に暴露された内皮は、１〜６時間後に付 着性になる。迅速な内皮依存性のリンパ球の付着は、細胞表面での脂質媒介物血 小板活性化因子（ＰＡＦ）の発現と関連があり、およびおそらくその他の内皮リ ンパ球の表面レセプターの出現と関連がある。サイトカインで誘発される、内皮 のリンパ球に対するゆっ（すした付着は、少なくとも一部分は、内皮細胞レセプ ターのＥＬＡＭ−１で媒介される。このＥＬＡＭ−１は内皮細胞がサイトカイン 類に暴露された後に合成され、次いで細胞表面に輸送され、そこで好中球を補足 する。ＥＬＡＭ−１の単離、特性決定およびクローニングについては＜　Ｂｅｖ ｉｌａｃｑｕａらが５ａｆｅ但硯２４３巻、１１６０〜１１６５頁、１９８９年 で概説している。末梢リンパ節ホーミングレセプターは、「ネズミＭｅｌ１４抗 原」、ｒＬｅｕ８Ｊ、ｒ　Ｌｅｕ８抗原」およびｒＬＡＭ−ＩＪとも呼ばれるが 、末梢リンパ節において高内皮性小静脈にリンパ球を結合させる好中球、単球お よびリンパ球上の別の構造体である。このタンパク質の特性決定とクローニング については、Ｌａ５ｋｙら、Ｃｅ１１５６巻、１０４５〜１０５５頁、１９８９ 年（マウス）およびＴｅｄｄｅｒら、Ｌ−シ」−１１１１７０巻、１２３〜１３ ３頁、１９８９年に概説されている。

ＧＭＰ−１４０（顆粒膜タンパク質１４０）はＰＡＤＧＥＭとして知られている が、システィンに富んだ、強くグリコジル化された膜内存在性域タンパク質であ り、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法（５ＤＳ−ＰＡ ＧＥ）で測定した見かけの分子量は１４０．０００である。ＧＭＰ−１４０は、 ＭｅＥｖｅｒとＭａｒｔｉｎが最初にヒト血小板から精製した（Ｊ、　Ｂｉｏｌ 、　Ｃｅｍ、　２５９巻、９７９ｇ〜９８０４頁、１９８４年）。このタンパク 質は、Ｓ　ｔｅｎｂｅｒｇら（１９８５年）が報告しているように、休止血小板 のα顆粒中に存在しているが血小板を活性化してから迅速に細胞膜に再分布され る。ＧＭＰ−１４０が内皮細胞内に存在しこれらの細胞によって生合成されるこ とは、ＭｃＥｖａｒら、Ｌ立回７０（５）　５ｕｐｐｌ　１：３５５ａ、　Ａｂ ｓｔｒａｃｔ　Ｎｏ、１２７４　（１９８７年）に報告された。内皮細胞中で、 ＧＭＰ−１４０は、ワイベルパレイド（ＩＦｅｉｂｅｌ−Ｐａｌａｄｅ）体とし て知られている貯蔵顆粒に見られる。またＧＭＰ−１４０（ＰＡＤＧＥＭと呼ば れている）は、活性化された血小板と、好中球および単球との相互作用も媒介す ると報告されている（Ｌａｒｓｅｎら、Ｃｅ１ｌ　５９巻、３０５〜３１２頁、 １９８９年１０月およびＨａｍｂｕｒｇｅｒとＭｃＥｖｅｒＳＢｉ！２！２ｉ７ ５巻、５５０〜５５４頁、１９９０年）。

そのｃＤＮＡ由来アミノ酸配列は、Ｊｏｈｏｎｓｔｏｎら、廁■５６巻、１０３ ３〜１０４４頁、１９８９年３月２４日および１９８９年３月８日出願の米国特 許出願第０７／３２０．４０８号に報告されたが、独立して折り重なっているよ うである多数のモジュールドメインを含有していることを示している。Ｎ末端か ら始まって、これらのドメインは、１つの「レクチン」　ドメイン、１つのｒＥ ＧＦＪ　ドメイン、補体結合タンパク質中のものと類似の９つの縦列共通反復構 造、トランスメンブランドメイン（分化スプライシングから得られる可溶性形を 除く）および細胞質テールを含有している。

血小板もしくは内皮細胞がトロンビンのような媒介物で活性化されると、貯蔵顆 粒の膜は原形質膜とともに溶解して顆粒性の可溶性内容物が外部環境に放出され 、膜に結合していたＧＭＰ−１４０が、数秒以内に細胞表面に提供される。ＧＭ Ｐ−１４０が活性化された結果血小板および内皮細胞の表面に迅速に再分布する というとは、この糖タンパク質が炎症もしくは血管の破裂の部位で重要な役割を し得るということを示唆している。

ＥＬＡＭ−１、ホーミングレセプター、およびＧＮＰ−１４０はその構造と機能 が関連していることから「セレノチン類」と称されている。

血小板リンパ球の相互作用のインビボでの重要性はまだ綿密には研究されていな い。しかし血管の損傷に応答して、血小板は、内皮下面に付着して活性化され凝 血を助けることが知られている。また血小板および他の細胞は、微生物の侵入を 防止するためにリンパ球を創傷内に補充するのに重要な役割を果たす。逆に、リ ンパ球は、１ｓｓｅｋｕｔｚら、Ｌａｂ、　Ｉｎｖｅｓｔ。

４９巻、７１６頁、１９８３年に報告されているように、炎症部位の組織中に血 小板を補充する。

凝血と炎症の経路は、組織の損傷に応答して協調方式で調節される。例えば、活 性化された内皮細胞は、リンパ球に対して付着性になるのに加えて、その細胞表 面に組織因子を発現させ、それらの表面がトロンボモジュリンを発現するのを減 少させて、最終的に、細胞表面で凝血反応を起こり易くする。場合によっては、 単一のレセプターが、炎症と凝血のプロセスの両者に関与できる。

止血経路と炎症経路に関与するタンパク質は、ヒトの疾患の診断および治療を行 うのに重要である。しかしタンパク質を治療に用いるには多くの問題がある。タ ンパク質は、患者に投与するのに十分であるように大量生産すると、通常は経費 がかかる。更に、タンパク質を患者に複数回投与した後そのタンパク質に対する 反応が起こり得る。従って、対象のタンパク質と同じかまたはより優れた活性を 有し、安価に合成可能で、再現性があり、比較的無害なペプチドを開発すること が望ましい。また、インビトロとインビボの両方で用いて、セレノチン類の結合 作用を対象のタンパク質分子と同等に有効に調節することができて、かつ合成に 要する経費が少なく、より再現性が高く、反応を起こすことが少ないと考えられ る炭水化物の分子を開発することが望ましい。

それ故に、本発明の目的は、ＧＭＰ−１４０，ＥＬＡＭ（およびリンパ球ホーミ ングレセプターを含むセレノチン類と相互に作用するペプチドを提供することで ある。

本発明の他の目的は、ＧＭＰ−１４０に対するリンパ球リガンドの構造に基づい た構造を有し、ＧＭＩ’−１４０性付着相互作用を阻害する炭水化物ベースの薬 剤を提供することである。

それ故に本発明の目的は、ＥＬＡＭ−１のような他のセレノチン類とは全く異な るセレクチンである、ＧＭＰ−１４０に対するレセプターの一部を形成する炭水 化物構造体を提供することである。

本発明の他の目的は、これらのペプチドおよび炭水化物構造体を用いてリンパ球 が内皮もしくは血小板に付着するのを抑制する方法を提供することである。

本発明のさらなる目的は、これらのペプチドおよび炭水化物構造体を用いて免疫 応答と止血経路を調節する方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、ＧＭＰ−１４０，ＥＬＡＭ−１およびリン／４球ホ ーミングレセプターに関する診断上のアッセイに用いる炭水化物およびペプチド を提供することである。

λ肌立１１ ＧＭＰ−１４０のレクチン結合領域の３つの領域由来のペプチドは、ＧＭＰ−１ ４０、ＥＬＡＭ−１およびリンパ球ホーミングレセプターを含む「セレクチン類 」と選択的に相互に作用することが見い出されている。この３つの領域は、上記 ペプチドに含有される残基の番号にしたがってアミノ酸番号１９〜３４．５４〜 ７２および６６〜８９を含有している。なお残基１は、シグナルペプチドを切断 した後の前記成熟タンパク質のＮ末端と定義する。該ペプチドは、長さが５〜８ アミノ酸の短いものであり、標準的な技法で容易に調製することができる。

ＧＭＰ−１４０と結合する、フコシル化シアル化（Ｓｉａｌｙａｔｅｄ）ラクト サミン構造体も発見されている。この構造体は、α（２，３）シアル酸で置換さ れたラクトサミングリカン類を含有する受容体を改変できるα（１，３）フコシ ルトランスフェラーゼ類を発現させることによって生成される。骨髄性細胞には 存在するがリンパ球もしくは赤血球の細胞には存在しない共通の三糖構造体であ るＬｅ’すなわちＧａｌβ１．４（Ｆｕｃａ１．３）　ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｒ（ 式中Ｒはタンパク質もしくは他の炭水化物構造体）が、上記シアル酸化構造体の コアを形成している。実際の構造体はシアリルＬｅＸすなわちＮｅｕＡｃａ　２ −３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃａ　１．３）ＧｌｅＮＡｃ−Ｒであってもよい。他 の可能な構造体には、ジフコシルシアリルＬ　ｅＸｓすなわちより長いポリフコ シル化ポリアクトサミノグリカン（ｐｏｌｙｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ　ｐｏｌｙ ａｃｔｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ）または類縁の変異体が含まれる。これらの 構造体のいくつかは、種々のアフィニティ一度でＧＭＰ−１４０に結合できる。

実施例は、これらのペプチドが好中球に結合してＧＭＰ−１４０が好中球と結合 するのを阻害し、＋Ｃ６θ（好中球が固定されたＧＭＰ−１４０に付着するのを ５０％まで阻害するのに必要な投与量）が５０から３００マイクロモルの範囲内 にあることを実証している。

その結合親和性は、ＥＧＦドメイン由来配列と、このＥＧＦドメインとレクチド メインの両方に結合する二価のカオチンを用いて調節することがでいる。全セレ クチン類または個々のセレクチン類、特にＧＭＰ−１４０の結合を阻害するこれ らのペプチドの変異体をスクリーニングするのに有用なアッセイも示しである。

特異的グリコジルトランスフェラーゼでトランスフェクトされたチャイニーズハ ムスター卵Ｊｌ！　（ＣＩＯ）細胞系を用いる実施例によって、ＧＭＰ−１４０ に対するオリゴ糖リガンドがシアル化フコシル化構造体であり、そのシアル酸の 結合がＧａ１へのα２．３結合であり、およびフコースの結合はＧｌｃＮａｅへ のα１，３結合であり、そのＧｌｃＮａｃにＧａｌがβ１．４結合で結合してい ることがＮ認されている。

シアリルＬｅｘ、　ジフコジルシアリルＬｅｘ、またはより長いポリフコモル化 ポリアクトサミノグリカン変異体（合成で製造するかまたは遺伝子工学で作製し た細胞内で発現させる）を含む本発明のペプチドもしくは炭水化物の構造体は、 診断用薬として有用であり、かつ適切な医薬用キャリヤーを組合わせて凝血過程 もしくは炎症過程を調節もしくは阻害する臨床の適用に有用である。また本発明 のペプチドと炭水化物は、そのアミノ酸を化学的に改変するかまたはキャリヤー 分子もしくは不活性基質に結合させることによって、改変してインビボでの半減 期を増大することができる。またこれらの構造体に対する抗体も、診断用薬とし て、および凝血もしくは炎症のプロセスの調節に用いる医薬として有用である。

の　な！　ｄ 図１は内皮細胞ＧＭＰ−１４０のヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列である。

読取り枠の翻訳アミノ酸配列は、−文字コードで示しである。終止コドンは星印 で示している。細い下線は、血小板ＧＭＰ−１４０のＮ末端を含むＮ末端から２ ６のペプチドから決定したアミノ酸配列の一致している位置を示す。シグナルペ プチドは−４１から−１の位置に相当する。推定トランスメンプラントドメイン には太い下線をつけである。システィン残基は丸で囲み、アスパラギンが連結し た潜在的なグリコジル化部位（ＮＸＳ／Ｔ）は黒丸で示しである。３′未翻訳領 域における２つの潜在的なポリアデニル化シグナルには上側と下側に線をつけで ある。

図２は、　ＧＭＰ−１４０のレクチンドメインである、アミノ酸６６−７８（三 角印）、アミノ酸７３−８３　（四角印）、アミノ酸５４−６３　（丸印）およ びアミノ酸２３−３０　（黒丸印）が、ペプチドによって結合が阻害されるのを 、ペプチドのｍＭの値に対して結合した細胞の数を比較して実証したグラフであ る０図３ＡおよびＢは、次のようなマイクロタイターウェルへの好中球の特異的 付着性を比較した図であり、すなわち、（１）ペプチドをコートしていないウェ ル；　（２）ＫＨＬに結合されたレクチンドメインペプチド１９−３４をコート したウェル；または（３）ＫＬＨに結合された対照のカルボキン末端ペプチド（ アミノ酸残基７６１〜７７７）をコートしたウェル；をヒト血清アルブミンを含 有するハンクスの平衡塩類溶液で遮断したのちに、各ウェル毎に液相競合体の存 在下２Ｘ１０５の好中球を添加して比較した。

ウェルに入れる前に好中球に添加した液相競合体は次の通りである。図Ａ；金含 有ず（黒バー印）、精製血小板の糖タンパク質Ｉｒｂ−ｎＩａ（斜線バー印）、 または精製ＧＭＰ（４０Ｃ点彩パー印）；ならびに図Ｂ；金含有ず（黒バー印） 　、１．５ｍＭ　Ｃ末端ペプチド７６１−７７７　（斜線バー印）および１．５ 曹Ｍレクチンドメインペプチド１９−３４　（点彩バー印）である。

図４Ａ−Ｄは、トランスフェクトされた野生梨のＣＨＯ細胞と、■Ｌ６０細胞に 対するＧＭＰ−１４０の結合性を、ウェルをコートするのに使用したＧＮＰ−１ ４０の濃度（ｕｇ　ＧＭＰ−１４０／＋ｉｌ）、Ｃａ２”の存在もしくは非存在 、およびノイラミニダーゼ処理の関数としてＣＰＭＳ　Ｉ　Ｃｒとして測定した 結果を示すグラフである。図４ＡはＣＨＯのＧＭＰ−１４０に対する結合性を示 す［ＣＨＯ＋Ｃａ”　（四角印）　、ＣＨＯ−Ｃａ２゛（黒ひし形印）］；２図 ４はＬｅｃ８Ｃ）１０のＧＭＰ−１４０に対する結合性を示す［Ｌｅｃ８＋　Ｃ ａ”　（四角印）　ｓ　Ｌｅｃ８−ＬｅｅＣａ２″（黒ひし形印）］；２図４は ネオルイス（Ｎｅｏ　Ｌｅｖｉｓ）　ＣＨＯのＧＭＰ−１４０に対する結合性を 示す［ネオルイス＋Ｃａ”　（四角印）、ネオルイス、ノイラミニダーゼ（黒ひ し形）、およびネオルイス、ＥＤＴＡ　（黒画角印）コ；ならびに図４Ｄは、ｌ １ｌＬ６０細胞のＧＭＰ−１４０に対する結合性を示す［ＨＬ６０＋Ｃａ”　（ 四角中）　、　＋ＩＬ６０、／イラミニダーゼ（黒しひ形印）およびＨＬ６０、 ＥＤＴＡ　（黒画角印）］。

図５は、ネオルイスＣＨＯ細胞の固定化ＧＭＰ−１４０への結合性に対するモノ クローナル抗体の作用を示すグラフであり、対照（黒色バー）の結合χを対照と して、Ｇ１抗体（／／／印）、Ｓｉ２抗体（江廿印）およびＥＤＴＡ　Ｃ／／／ 印）それぞれの存在下での結合性を％で示したグラフである。

図６は、可溶性のＥＬＡＭ−１もしくはＧＭＰ−１４０によって結合される、ト ランスフェクトされたＣＯ３細胞を示すグラフである［対照および以下の阻害剤 の存在下：　ＥＬＡＭ−１なし、ＧＭＰ−１４０、および１１１８／７　（ＥＬ ＡＭ−１の結合を阻害するがＧＭＰ−１４０の結合を阻害しない）；ならびにＧ ＭＰ−１，４０なし、ＧＭＰ、およびＧ１の場合について示す。コ 図７は、トランスフェクトされたＣＯ３細胞が結合したＰＭＳ細胞とＨＴ−２９ 細胞（これらの細胞はシアリルＬｅｘを発現する）を示す（ｘ　１０−’）グラ フである。すなわち対照、　ＥＬＡＭ−１のみの場合と、さらにＥＬＡＭ−１に よる結合を阻害するがＧＭＰ−１４０による結合を阻害しないＨ１８／７抗体が 存在する場合；およびＧＭＰ−１４０のみの場合と、さらにＧＭＰ−１４０によ る結合を阻害するがＥＬＡＭ−１による結合を阻害しないＧ１抗体が存在する場 合について示す。

図８は、ネオルイスＣＨＯ細胞の固定化ＧＭＰ−１４０への結合性に対するトリ プシンの作用を示すグラフであり、対照（黒色バー）の結合性を１００％とした 場合の、トリプシンによる処理時（／／／印）およびＥＤＴＡの存在下（細いバ ー印）での結合性を％で示したグラフである。

発明の詳細な説明 ＧＭＰ−１４０の構造と生合成法を詳細に分析した。ＧＭＰ−１４０の全アミノ 酸配列を、精製された血小板ＧＭＰ−１４０由来のペプチドフラグメントのタン パク質配列決定の結果を組み合わせ、ヒト内皮細胞のｃＤＮＡライブラリーから ＧＭＰ−１４０をコードするｃＤＮＡをクローニングすることによって決定した 。ＧＭＰ−１４０は、その構造と機能の研究に基づいて、好中球に対するレセプ ターとして作用し、かつ補体タンパク質Ｃ３ｂおよび抗凝血性補因子のプロティ ンＳと相互に作用する。

ＧＭＰ−１４０のｃＤＮＡとアミノ酸配列ＧＭＰ−１４０に対する遺伝子のクロ ーニングは、Ｇ、　［、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ。

Ｒ，Ｇ、　ＣｏｏｋおよびＲ，Ｐ、　ＭｃＥｖｅｒが初めてＡｂｓｔｒａｃｔ　 １２３８５ｕｐｐｔ＋ａｅｎｔ　ＩＩ　Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ　７８（４）　 （１９８８年１０月）に報告している。オリゴヌクレオチドを、ＧＭＰ−１４（ ｌのペプチドのＮ末端アミノ酸の配列決定結果に基づいて調製して、ヒト内皮細 胞のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに使用した。７２７のアミノ 酸からなるタンパク質をコードする３、Ｏｋｂのクローンを単離した。

多くのシスティン、リシンおよびチロシンを含有する１１８の残基からなるＮ末 端ドメインは、アシアロ糖タンパク質のレセプターに類似しているが、このＮ末 端ドメインに、ＥＧＩ！の反復ドメイン構造と、各々６２のアミノ酸からなる８ つの縦列反復構造（ただし６番目の縦列反復構造のみ７Ｑのアミノ酸で構成され ている）とが続いている。これらの反復構造は、Ｃ３ｂとＣ４ｂを調節するタン パク質を含むタンパク質類のファミリーに見いだされる反復構造と相同であるが 、１反復構造当り６つの保存システィンを含有し、これは一般に４つの保存シス ティンを含有しているのと異なる独特の構造である。これらに対して、２４のア ミノ酸のトランスメンプラン領域と３５のアミノ酸の細胞質テールが続いている 。同じ遺伝子の転写体、可溶性形と膜または顆粒結合形を選択的にスプライスす ることによってもたらされる少なくとも２つの形のタンパク質、が存在するよう である。

内皮細胞ＧＭＰ−１４０の予測アミノ酸配列（図１に示す）には、６つの異なる 構造ドメインが存在することを示唆している。これらの領域の１つは、Ｃ端末の 近くにある２４残基の疎水性セグメントであり、メンプランスパニングドメイン の特徴を有する。そのタンパク質の大部分はこのドメインのＮ末端側に位置し、 細胞質外に存在しているようである。すなわち分泌顆粒のルーメンに体面してい るが、または細胞が活性化された後、細胞外環境に暴露される。

Ｎ末端から始まる第１のドメインは４１の残基（図１に−４１から−１の標職を つけて示す）を含有し、シグナルペプチドの特徴を有する。これらの残基中には いくつかの正の電荷を有するアミノ酸を含有し、次いで疎水性ドメインが続き、 次に極性残基が多い領域が続いている。−３および−１の位置に見られる電荷を もっていない小さな残基は、シグナルペプチドゼによって開裂される部位に見ら れる一般的な残基である。その上＝ に、血小板ＧＭＰ−１４０のＮ末端のアミノ酸配列は、残基１から２７の２７個 の位置のうち２５個が内皮細胞の推定配列に一致している。

シグナルペプチドに続いて、翻訳されるｃＤＮＡ配列によって、７８９の残基で 構成された成熟タンパク質が予測される。血小板ＧＭＰ−４４０ペプチドの配列 を内皮細胞の推定配列とを比べると、３４１の帰属アミノ酸のうち３３７が一致 することが分かったが、このことは、療法の細胞型が同じタンパク質を合成する ことを示唆している。

共通配列ＮｘＳ／Ｔを有する、１２の潜在的アスパラギン連結グリコジル化部位 がある。これらはすべて分子の細胞質外の部分に位置しており、かつ血小板ＧＭ Ｐ−１４０の炭水化物の組成に基づいてグリコジル化されているようである。そ の成熟タンパク質は、全アミノ酸の８％を占める６５のシスティンを含有してい る。これらの大部分はジスルフィド架橋で組繊化されていると予測されるが、そ の理由は、ヨードアセトアミドで処理しり非還元ＧＭＰ−１４０の試料中にごく 少量のカルボキシメチルシスティンを同定できるからである。

第２のドメインは残基１から始まり、その成熟タンパク質の最初の１１８のアミ ノ酸が含まれる。この領域は、リシン（１２％）、チロシン（１０％）、アスパ ラギン（１３％）およびトリプトファン（６％）の残基を豊富に含有している。

ＧＭＰ−１４０のこの領域は、このモチーフを有するタンパク質の多（が炭水化 物を結合するので「レクチンドメイン」と称される。

第３のドメインは残基１１９から始まり、６つのシスティンを含有する４０のア ミノ酸の配列を有する。ＧＭＰ−１４０のこの領域を、ＮＢＲＦのデータベース の配列と比較すると、同じシスティンの配列を含有する多数のタンパク質がある 。このモチーフで報告された最初のタンパク質は上皮増殖因子（ＥＧＦ）前駆物 質であり、１０の相同コピーを含有している（Ｇｒａｙら、Ｎａｔｕｒｅ　３０ ３巻、２３６〜２４０頁、１９８３年Ｈ５ｃｏｔｔら、Ｎａｔｕｒｅ　２２１巻 、２３６〜２４０頁、１９８３年）。

第４のドメインは残基１５９から始まり、各々６２のアミノ酸を含有する９つの 縦列共通反復構造で構成され、その上に、８つの残基と４つの残基の延長部分が それぞれ７番目と９番目の反復構造の末端にみとめられる。このドメインの境界 部は、最初の反復構造の最初のシスティンと推定トランスメンブランドメインの 前の最後の残基とともに任意に設定される。共通配列により、９つの反復構造の うちの少なくとも５つで多数のアミノ酸が生成することが分かる。すべての反復 構造が６つの保存システィン、３つのグリシン、および１つずつのトリプトファ ン、フェニルアラニン、プロリン、およびロイシンを含有している。そのンステ イン残基は、ｒＥＧＦＪ　ドメインに見られる６つのシスティンとは異なるモチ ーフで配列されている。その反復構造は、互いに、アミノ酸レベルで３１％かう ５６％同一テあり、ヌクレオチドレベルで４２％から６２％同一である。反復構 造間の配列を最大にするのにギャップを必要としない。

第５のドメインは残基７３１から始まる２４残基の推定トランスメンブランドメ インである。この第５ドメインに続いて第６ドメインがあり、この第６ドメイン は、高電荷を有するいくつかの残基で始まりそのタンパク質のＣ末端の残基７８ ９で終わる３５残基の推定細胞質セグメントである。セリン、トレオニンおよび チロメンの残基、ならびに翻訳後に修飾されるかもしれないシスティンには、ホ スホリル化されうる部位がある。

２つの異なる枠内欠失部（ｉｎ−ｆｒａｍｅ−ｄｅｌｅｔｉｏｎ）が、詳細に試 験された４つの内皮細胞クローンの配列中に同定される。第１の欠失部は１８６ ｂｐである。この欠失によって、第７の共通反復構造から６２のアミノ酸が除か れ、９つの反復構造の代わりに８つの反復構造を含有するタンパク質が予測され る。第２の欠失部は１２０ｂｐであり、第９の反復構造の末端の直後の４０のア ミノ酸を除去されている。欠失した領域は、トランスメンブラン領域と、細胞質 領域の最初のい（っかの残基を含んでいる。

Ｃ末端における残りの２８の残基は第９の反復構造の直後に続くと予測される。

親水性を示す図（５ｔｅとＤｏｏｌｉｔｔｌｅ％Ｊ、Ｍ（江」包Ｌ１５７巻、１ ０５〜１３２頁、１９８２年）は、この形態のＧＮＰ−１４０が可溶性であるこ とを予報している。

ＧＭＰ−１４０は、血小板および内皮細胞に存在するレセプターであり、好中球 と単球の表面リガンドに結合して炎症過程を促進することが実証されている。

ＧＭＰ−１４０は、リンパ球が活性化された内皮細胞および血小板に付着するた めのレセプターとして働（という結論は、本来次のようないくつかの観察結果に 基づいてなされた。すなわちトロンビンもしくはヒスタミンで刺激された内皮の 表面のＧＭＰ−１４０の迅速な出現が、これらのアゴニストによって刺激された 内皮への好中球の誘発性付着と平行して起こることｉＧＭＰ−１４０の細胞表面 への再分布を起こすトロンビンのようなアゴニストで血小板を刺激した後だけ起 こり、ＡＤＰのような血小板アゴニストでは起こらない、好中球もしくは単球と 血小板との相互作用；リンパ球が内皮を通過して組織へ移行する前に内皮に結合 する主要な部位である後毛細血管静脈におけるＧＭＰ−１４（ｌの濃度；組織培 養マイクロタイターウェルにコートしたＧＭＰ−１４０に対する精製された好中 球の特異的付着；ヒスタミンによって刺激された培養ヒト謄静派内皮細胞への好 中球の付着の６０〜９０％がＧＭＰ−１４０に対するポリクローナル抗体で阻止 されること；　ＧＭＰ−１４０のｃＤＮＡ由来アミノ酸配列が、ＥＬＡ、Ｍ−１ 、好中球に結合することがすでに知られている内皮細胞タンパク質、およびリン パ球ホーミングレセプターのアミノ酸配列に相似していることである。続く研究 によって、Ｃａ”の存在下、ＧＭＰ−１４０はまた刺激された血小板への好中球 の付着を媒介するが、刺激されていない血小板については媒介しないことが実証 さレタ。血小板の好中球への結合は、ＧＭＰ−１４０に対するモノクローナル抗 体および精製されたＧＭＰ−１４０によって阻害された。

他の研究によって、ＧＭＰ−１４０が、補体系タンパク質であるＣ３ｂ、および 抗凝血性補因子タンパク質であるプロティンＳに結合することが実証された。Ｇ ＭＰ−１４０は、血漿タンパク質のＣ４ｂ結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）と配列相 同性を共有しており、このＣ４ｂｐは血漿タンパク質Ｃ４ｂと相互に作用するの みならずプロティンＳと相互に作用する。

ＧＭＰ−１４０由来のペプチドが、診断用薬として有用であり、およびワンバク 球がＧＭＩ’−１４０を認識するのを阻止できるペプチドの治療上の有効量を患 者に投与して患者の止血応答と炎症応答を調節するのに有用であることが発見さ れたのである。

また、他のタンパク質、特にＥＬＡＭ−１およびそのホーミングレセプターのレ クチンドメインと相同性のＧＭＰ−１４０のレクチンドメイン内のペプチド配列 は、好中球が精製されたＧＭＰ−１４０に付着するのを選択的に阻害するので、 患者およびこれらの分子による結合性の変化を特徴とする疾患の診断上のアッセ イ、ならびにこの結合を変化させる化合物のスクリーニングアッセイに用いるこ とができ、および凝血および／または炎症の過程を伴う、リンパ球と、血小板も しくは内皮細胞との相互作用を抑制もしくは調節するのに臨床上有用に違いない ことが発見されたのである。

ＧＭＰ−１４０のｃＤＮＡ由来の一次構造によって、血管系におけるＧＭＰ（４ ０の機能についていくつかのことが分かる。最も注目すべき観察結果は、ＧＭＰ −１４０が、血管細胞にみられ最近クローニングされた２つの他のレセプターと 構造が著しく類似していることである。

これらの類似したレセプターの第１のものはＥＬＡＭ−１である。

ＥＬＡＭ−１は未刺激の内皮中には存在しない内皮細胞タンパク質である。しか し、内皮が腫瘍壊死因子またはインターロイキン−１のようなサイトカイン類に 暴露されると、ＥＬＡＭ−１の遺伝子が転写されてＲＮＡを産生じ、次いでその ＲＮＡはタンパク質に翻訳される。その結果、ＥＬＡＭ−１はタンパク質に翻訳 される。

その結果、ＥＬＡＭ−１は、Ｂｅｖｉ　１ａｃｑｕａら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４巻、９２３８〜９２４２頁、１９８７年 に記載されているように、サイトカイン類に暴露されてから１−４時間後に内皮 細胞の表面に発現される（顆粒内に貯蔵されて活性化後数秒以内に細胞表面に現 れるＧＭＰ−１４０とは異なる）。ＥＬＡＭ−１は、好中球が、サイトカインで 処理された内皮に付着するのを媒介することが判明し、従って、リンパ球をサイ トカインで刺激された内皮を通過させて組織中へ移行させるのに重要であるらし い。ＥＬＡＭ−１の一次構造は、ＥＬＡＭ−１が「レクチン」　ドメイン、ＥＧ Ｆドメインおよび補体調節タンパク質の反復構造に類似の６つの反復構造（ＧＮ Ｐ−１４０の９つの反復構造の代わりに）、トランスメンブランドメイン、およ び短い細胞質テールを含有することを示している。ＧＭＰ−１４０とＥＬＡＭ− １間には、両方のタンパク質を通じて広範囲の相同配列が存在するが、その相似 性がレクチンドメインとＥＧＦドメインにおいて特に顕著である。

ＧＭＰ−１４０に構造全体が類似している第２の分子は、リンパ球に見出される ホーミングレセプターである。ホーミングレセプターは、高内皮性細胞もしくは 高内皮性細胞脈と呼ばれる、リンパ組織中の特殊な内皮細胞にリンパ球を結合さ せるリンパ球表面構造体である（　ＹｅｄｎｏｃｋおよびＲｏｓｅ％Ａｄｖａｎ ｃｅｓ　ｉｎ　１１朋１１■４４巻、Ｆ、　１．　Ｄｉｘｏｎｉｌ集、３１３〜 ３１Ｂ頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８９年に 概説されている）。この結合によって、リンパ球は内皮を通過してリンパ組織に 移行し、そこで処理された抗原に暴露される。そのリンパ球は次にリンパ系を通 じて血液中に再び入る。そのホーミングレセプターは、レクチンドメイン、ＥＧ Ｆドメイン、２つの補体結合性反復構造、トランスメンブランドメイン、および 短い細胞質テールを含有している。このホーミングレセプターも、特にレクチン ドメインおよびＥＧＦドメインが、ＧＭＰ−１４０と広範囲の相同配列を共有し ている。

ＧＭＰ（４０、ＥＬＡＭ−１およびこのホーミングレセプター（ＬＥＵ−８）そ れぞれのレクチンドメイン間の比較を表Ｉに示す、これらの配列相似性に基づい て、好中球がＧＭＦ−１４０に結合するのを阻害するペプチドであって、ＥＬＡ Ｍ−１、そのホーミングレセプター、および他の相同セレクチン類が炎症過程の 成分に結合するのを阻害するか、または逆にＧＭＰ−１４０の結合だけを阻害す るペプチドを選択することが可能なはずである。

ＧＭＰ−１４０に結合スるフコシル化シアル化ラクトサミン構造体を発見された 。この構造体は、α（２Ｊ）シアル酸置換うクトサミノグリカンを含有する受容 体を改変することができるα（１，３）フコシルトランスフェラーゼを発現する ことによって生成することができる。骨髄細胞に存在するがリンパ球もしくは赤 血球細胞には存在しない共通の三糖構造体であるＬｅ’″すなわちＧａｌβ１． ４（Ｆｕｅα１．３）ＧＩｃＮＡｃβ１−Ｒ（式中、Ｒはタンパク質もしくは他 の炭水化物構造）は、上記のシアル化構造のコアを形成している。実際の構造は シアリルしｅｘｓすなわちＮｅｕＡｃαて、ＧＭＰ−１４０のりガントへの結合 をインビボで操作することが可能である。単一の分子に結合した多数のシアル化 フコシル化ラクトサミンを使用すれば、天然のリガンド以上に、人工の分子に対 してＧＭＰ−１４０の親和性を増大させることができる。

以下の実施例によって上記の結論をもたらした物質、方法および試験結果をさら に説明するが本発明を限定するものではない。

実施例１　：　ＧＭＰ−１４０のレクチンドメイン由来のペプチドによる、好中 球の固定化ＧＭＰ〜１４０への結合の競合阻害の証明。

分子内部に引っ込んでいると予想される２つの疎水性ストレッチを除いて、レク チンドメインの１１８個の残基のほとんどすべてにまたがる一連のペプチドを合 成することにより、ＧＭＰ−１４０レクチンドメインの役割をテストした。また 、レクチンドメインにつづ＜　ＥＧＦ様ドノドメイン６個の残基）を含むペプチ ドをも合成した。また対照として、分子の共通反復構造、トランスメンプラン領 域、およびＣ末端（細胞質テール）のうちのひとつから、ペプチドを得た。レク チンドメイン由来の活性ペプチドを表Ｉに示す。表Ｉはまた、ＥＬＡＭ−１およ びホーミングレセプターであるＬＥＵ−８のレクチンドメインの関連する配列の 配置をも示す。ｔ−Ｂｏａの化学的特性を利用したＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓ ｔｅｍｓ　Ｍｏｄｅｌ　４３０Ａ自動ペプチド合成機か、または、Ｆ＋＋＋ｏｃ の化学的特性を利用したＤｕｐｏｎｔ　ＲＡＭＰＳ手動ペプチド合成機かのいず れかで、ペプチドを調製した。合成が行われた樹脂からの開裂後、逆相高性能液 体クロマトグラフィーにより、すべてのペプチドを精製した。

プラスチックウェル上に固定化された精製ＧＮＰ−１４０への好中球の付着を阻 害する、ペプチドの能力を調べるために、Ｇｅｎｇら、ｈムＲ３４３，７５７− ７６０（１９９０）に記載のアッセイを用いて、ペプチドをスクリーニングした 。

Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ＆！Ｍｏｎｏ−Ｐｏｌｙ分離媒体における 密度勾配遠心分離法により、ヒト好中球をヘパリン処理した全血から単離する。

好中球懸濁液は、９８％より高い純度およびトリパンブルー排除法による９５％ より高い生存度を有する。付着アッセイツタめに、好中球を、５諺ｇ／■ｌヒト 血清アルブミン（■ＢＳＳ／Ｈ３Ａ）と共に１．２６　ｍＭ　Ｃａ”および０． ８１　ｍＭ　Ｍｇ２°（ＨＢＳＳ、　Ｇｉｂｃｏ）を含むハンクス平衡塩類溶液 中に、２　ｘ　１０’細胞／ｍｌの濃度で懸濁する。付着アッセイを、Ｃｏｒｎ ｉｎｇ製９６ウエルマイクロタイタープレートにおいて３回行い、様々なタンパ ク質溶液５０マイクロリフドルを用いて４℃で一晩インキコベートする。

以下のように、抗体５１２−セファロースＴ″でのイムノアフィニティークロマ トグラフィーおよびＭｏｎｏ−Ｑ”カラム（ＦＬＰＣ，Ｐｈａｒ＋５ａｃｉａ　 Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）でのイオン交換りＯ？トゲラフイーにより、Ｇ ＭＰ−１４０をヒト血小板溶解産物から単離する。

血液銀行から得て４℃で貯蔵した使用期限の過ぎたヒト血小板パック（１００ユ ニツト）をプールし、ｐＥｌ、５の５　ｍＭ　ＥＤＴＡに調整し、１リツトルボ トル中で３０分間、４．００Ｏｒｐｍで遠心分離する。次いで、０．１　Ｍ　Ｎ ａＣｌ、　２０　ｍＭトリス　ｐＥｌ　７．５　（ＴＢＳ）、Ｓ−２０を含むＨ ＢＳＳで３回洗浄し、ＨＢＳＳで１回洗浄する。細胞（ウェル毎にＺ　ｘ　１０ ５個）をウェルに添加し、２２℃で２０分間インキコベートした。次いで、ウェ ルをＨＢＳＳ／ＨＳＡで満たし、アセテートテープ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）で密封 し、５分間１５０ｇで遠心分離してひっくり返した。非付着細胞および上澄みを 廃棄した後、各ウェルの含有物を、Ｓｉｇｍａ製０．５ｚ臭化ヘキサデシルトリ メチルアンモニウムの５０膳Ｍリン酸カリウム溶液ｐＨ６，０，Ｚｏｏマイクロ リットルを用いて可溶化し、Ｌｅｙら、１ｌｆｌ！１ｉ７３．１３２４−１３３ ０（１９８９）に記載のように、ミエロペルオキシダーゼ活性についてアッセイ する。結合した細胞の数を、ミエロペルオキシダーゼ活性対細胞の数の標準曲線 から導き出した。すべてのアブセイ条件下において、細胞は、全ミエロペルオキ シダーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼの５％未満を放出した。結果を表Ｉに示す 。負の対照としてのＣ末端ペプチド（ＧＮＰ−１４０のアミノ酸残基７６１−７ ７７）の存在下で、１０ｏｚの付着が見られ、この値は、細胞にペプチドも抗体 も添加されない対照の場合と同じである。５％という値は特異的付着の９５％が 阻害されたことを意味するので、阻害を、より低い付着率と解釈する。

ＧＭＰ−１４０のＥＧＦドメイン由来のペプチドは、どれも付着を阻害しなかっ た。しかし、レクチンドメインの３つの非隣接領域由来のペプチドは、付着を阻 害した。そのレクチンドメイン由来の３つの領域とは、アミノ酸１９から３４、 アミノ酸５４から７２、アミノ酸７３から８９、およびアミノ酸６６−７８の重 複ペプチドである。アミノ酸は、ペプチドに含まれる残基の数に基づいて番号付 けられ、残基１は、シグナルペプチドの開裂後の成熟タンパク質のＮ末端と定義 づけられる。

現在、活性を有することが知られている、これらの配列に由来する最も短いペプ チド配列は、それが由来するレクチンドメインの面積にある程度依存して変化す る、８個から１３個のアミノ酸の範囲にある。より短いペプチドのいくつかは、 より長いペプチド配列よりも高い活性を有する。この時点で特徴づけられる最も 短い活性ペプチドは、レクチンドメインアミノ酸２３から３０であり、レクチン ドメインアミノ酸１９から３４由来のものである。このペプチドは、ＥＬＡＭ− １中の単一のアミノ酸の違いを除いて、ＧＭＰ−１４０、ＥＬＡＭ−１、および ホーミングレセプターの間で同一であり、従って、３個のセレクチンすべてによ って媒介された細胞−細胞接触を阻害する。現時点で周知の、レクチンドメイン アミノ酸５４から７２由来の最も短い活性ペプチドは、アミノ酸５４から６３で ある。現時点で周知の、レクチンドメインアミノ酸７ｇ−８９由来の最も短い活 性ペプチドは、アミノ酸７３から８３である。さらに、アミノ酸６６から７８に またがる重複ペプチドは、非常に活性が高い。アミノ酸６６から８３にまたがる 領域から、２つの、活性があってより短い、非重複ペプチドを設計することが可 能であり得る。

表工に示すように、これらの領域のいくつかは、他の領域よりも、セレクチンの 間でより高度に保存されている。その結果、全セレクチンを含む、相互作用を調 節するための高度に保存された領域由来のペプチドを用いること、およびＧＭＰ −１４０のみを含む、相互作用を調節するためのセレクチンの間でより低い程度 で保存されている領域からのペプチドを用いることが可能である。例えば、レク チン領域１９−３４（残基２３−３０）の中心コアは、３つの分子の間で非常に 高度に保存されている。対照的に、レクチン領域５４から７２由来のアミノ酸配 列５４から６０は、セレクチンの間で多くの違いを有する。

（以下余白） 一〇 表Ｉ　：　ＧＭＰ−１４０のレクチンドメイン、ＥＬＡＭ−１、およびＬＥＵ− ８の比較、そして、ＧＭＰ−１４０由来ペプチドの存在下における、ＧＭＰ−１ ４０への好中球の結合率。

クンバフ“良／へ゛１°ナビ　１ミノ　シ叉　車呑令外１１９−３０　−−−− −−−−−−−−　１２ｔ２３−３４　３０士 ２１−コＱ　２０＆ ＧＭＰ−１４０ＲＫＮ’Ｎ’ＫＴＷ　ＴＷＶＧＴＫＫＡＬＴ　ＮＥ５４−６３　 −−−−−−−−−−　１’３ｔ５４−５８　−−−−−　１．０８１ ５９−６３　１．０２に ５４−６０　−−−−−−−　６：１ｔ表！続き。

ワン１％’７　’ｌ／　八’　７°ナト　イミｌ　う支　朱百令Ｐａ、固定化Ｇ ＭＰ−１４０に結合した細胞の数を、Ｇｅｎｇら、狂ｍ■３４３ニアＳ’ｌ−１ ６０（１９９０）に記載のように決定した。対照Ｃ末端ペプチド（残基７６１− ７７７）の存在下において結合した細胞の数を１０ｏｚに樟準化した。この値は 、ペプチドを含まないときに観察されたものと同一であった。ペプチドによる付 着の阻害は、１００％よりも大幅に低い付着値により示される。例えば、５工と いう値は、対照において見られる付着が９５％阻害されたということを示す。す べてのペプチドを加えて、１．５　＋ｉＭという最終濃度にした。

実施例２　：　ＧＭＰ−１４０のレクチンドメイン由来のペプチドによる、固定 化ＧＭＰ−１４０へのモノクローナル抗体の結合の競合阻害の証明。

実施例１は、ＧＭＰ−１４０のレクチンドメインの３つの領域由来のペプチドが 、表面に固定化されたＧＭＰ−１４０に対する好中球の結合を阻害するというこ とを示す。そのペプチドがまた、固定化ＧＭＰ−１４０に対するモノクローナル 抗体の結合をも阻害するかどうかを決定するための研究も行った。

ＧＭＰ−１４０に対する好中球の付着をブロックする３つのモノクローナル抗体 （＋＊Ａｂ）を発生させ、Ｇ１．Ｇ２、およびＧ３と命名した。

精製タンパク質を用いた競合ＥＬＩＳＡに基づいて、Ｇ１、Ｇ２、およびＧ３は 各々、異なる、または部分的に重複したエピトープを認識する。１．５■Ｍペプ チドを、２．５マイクログラム／議ｌの濃度でビオチニル化ｉＡｂに添加し、次 いで、得られた物質を、実施例１に記載のように、ＧＮＰ−１４０を含むウェル に添加した。結合を、アビジン検出システムを用いたＥＩｊＳＡにより測定した 。

モノクローナル抗体を、以下のようにビオチニル化した。

０．５ｍｌの精製［ｇＧ抗体（ＰＢＳ中に１■ｇ／■Ｌ　ｐＨ７，４）に、３． ２鵬ＭＮ−ヒドロキシスクシンイミドビオチンのジメチルスルホキシド溶液５０ μｌおよびＩ　Ｍ　ＮａＨＣＯｚ　５０μｌを添加した。室温で２時間、暗所で インキュベートした後、５０μｍのＩＭ　ＮＨａＣＬにより反応を停止した。次 いで、ＰＢＳ中で平衡させたＰＤ−１０カラム上でゲル濾過して、ビオチニル化 抗体を他の成分から分離した。ＥＬ［ＳＡを以下のように行った。全工程を室温 で行った。

１．５■Ｍペプチドを有するまたは有さない、ビオチニル化抗体（２，５μｇ／ ｍｌ）を、実施例１に記載のように、ＧＭＰ−１４０により分属する。

実施例４：ペプチドの改変およびＧＭＰ〜１４０への付着力の比較いくつかの場 合においては、インビボで分子の半減期を増大させるために、アミノ酸自身の変 更、またはキャリヤー分子への付着により、ペプチドを改変することが必要であ る。

Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｔｆｃａｌｓから市販されているＩｎｊｅｃｔキプトのよ うな標準的な手順を用いて、レクチンペプチド１９−３４を、そのＮ末端システ ィンにより、キャリヤータンパク質キーホールリンペブトヘモシアニンに結合し た。次いで、このペプチド−にＬＥ［複合体を実施例１に記載のアッセイでテス トし、結合した細胞の数を決定した。

図３Ａおよび図３Ｂは、（１）ペプチドをコートしていない、（２）ｒＨＬに結 合したレクチンドメインペプチド１９−３４をコートした、または（３）ＫＬＨ こ結合した対照カルボキシ末端ペプチド（アミノ酸残基７６１−７７７）をコー トした、マイクロタイターウェルに対して行われ、液相競合体の存在下において 、各ウェルに２ｘ１０５個の好中球を添加する前に、ヒト血清アルブミンを含む ハンクス平衡塩類溶液によりブロックした、好中球の特異的付着を比較したもの である。ウェルに入れる前に好中球に添加した液相競合体は、皆無（対照）、精 製血小板糖タンパク質１１ｂ−１１１ａ　（対照）、または、精製ＧＭＰ−１４ ０（パネルＡ）；あるいは、皆無（対照）、１．５＋ｉＭＣ末端ペプチド７６１ −７７７　（対照）、１．５１Ｍレクチンドメインペプチド１９−３４　（パネ ルＢ）であつた。

グラフより、レクチンペプチド−ＫＨＬ結合体は、プラスチック上に固定化され た場合は、天然のＧＭＰ−１４０はど効果的ではないが、好中球の付着を直接支 持するということが明白である。

比較のために、ウェルに２００，０００個の好中球を添加した時、レクチンペプ チド１９−３４は４０．０００個を結合し、ＧＭＰ−１４０はｔｚｏ、ｏ。

０個を結合した。単にプラスチックへのペプチドのコートを促進するために、ペ プチドをＫＬＨにカップリングする。液相精製ＧＭＰ−１４０およびレクチンペ プチド１９−３４を用いるが、他のタンパク質またはペプチドを用いない、付着 に関する競合能力は、付着が特異的であるということを示す。他の研究において は、レクチンドメインの他の領域、ＥＧＦドメイン、およびＧＭＰ−１４０の散 在した他の領域の多くのペプチドは、固定化ＧＭＰ−１４０に対する好中球の付 着を阻害しない。

（以下余白） 実施例５：酵素消化によるＧＭＰ−１４０に対する「リガンド」または「カウン ターレセプター」の特性付はレクチン１９−３４ペプチドは、ＧＭＰ−１４０の 白血球との相互作用をブロックする３つのモノクローナル抗体すべてがＧＭＰ− １４０と結合するのを妨げる。これにより、白血球の認識におけるレクチンドメ インの重要性がさらに証明される。このデータから、レクチンドメインのコンフ ォメーシヲンがＥＧＦドメインと相互作用することにより調節され、これらの相 互作用は次に、レクチンドメインおよびＥＧＦドメインの両方に結合し得る二価 カチオンにより調節されることが仮定される。この結果、好中球および単球上の レセプターに結合する親和性および特異性を付与する３次元フンフォメーション のレクチンドメインが得られる。

好中球を単離し、Ｃａ”／Ｍｇ”がないＨＢＳＳにＩＢ／ｓ＋１のＨＳＡおよび １＋ｍＭのＣａ２°を補充した（■ＢＳＳ／ＨＳＡ／Ｃａ）中に４Ｘ１０’／Ｉ ＩＩとなるように懸濁し、使用するまで４℃で保存した。

好中球をトリプシンまたはエラスターゼのいずれかのプロテアーゼで処理して、 このレセプターがプロテアーゼ感受性タンパク質成分を含有しているかどうかを 決定した。Ｅ［ＢＳＳ／１０ａ＋Ｍ　ＭＯＰＳ、　ｐＨ７，５（ＨＢＳＳ／ＭＯ ＰＳ）中に懸濁した好中球を、２ｍＭのジイソプロピルフルオロホスフェート（ ＤＦＰ）で２２℃で１０分間、２回処理して、内因性血清プロテアーゼを不活性 化した。次ニ細胞をＨＢＳＳ／ＭＯＰＳで洗浄し、８分の１容量の８％バラホル ムアルデヒドで２２℃で３０分間、固定して、次に、８分の１容量の０．５Ｍグ リシン１０．２５Ｍトリス、ｐｉ（７，５を加えた。固定したＦＩＢＳＳ／ＭＯ Ｆ’Ｓ中の好中球（７，５ｘｌＯ’／＋＊ｌ）をＴＰＣに一トリプシン（０，７ ７ＭＭ、４ＩＵ／ｍｌ）と−緒に１０分間、またはエラスターゼ（４０ＭＭ、　 ７．ｌｌＵ／ｍｌ）トー緒に３０分間、３７℃でインキユベートした。コントロ ール細胞をＤＦＰまたは緩衝液のみで予め不活性化した同一濃度の酵素と一緒に 同一の条件下でインキユベートした。インキュベーション期間の後、ＤＦＰを加 えて２ｄとし、細胞を４００ｇで５分間ペレット化した。細胞をＨＢＳＳ／ＭＯ ＰＳで再懸濁し、ざらにＤＦＰを加えて２ｍＭとした。４００ｇで５分間遠心分 離した後、細胞ベレットをＨＢＳＳ／ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）　／Ｃａ中 に４ｘｌＯ６／＋＊１となるように再懸濁し、［’　２５［］ＧＭＰ（４０の特 異的結合を決定した６　０．１５Ｍ　ＮａＣ１，ＳＯ＋＊Ｍアセテート、ｐＨ６ ，０、Ｌｏｎｇ／＋＊Ｉ　ＨＳＡ、　９ｍＭ　ＣａＣｌ２．０．０５％アジ化ナ トリウム（消化緩衝液）中にＤＦＰ処理して固定した好中球（１，６ＸＩＱ７／ ＋＊ｌ）を、ノイラミニダーゼ、エンド−β−ガラクトシダーゼ、または緩衝液 と一緒に、２０ＭＭロイペプチン、３０ＡｔＭアンチパイン、０．６４＋ｓＭベ ンザミジン、および１００　ＫＩＵ／ｍｌアプロチニンの存在下で、３７℃で時 間を変えてインキュベートした。いくつかのインキュベージコンでは、消化緩衝 液に溶解した０、５からＺＱｍＭのフイラミニダーゼインヒビターＮｅｕ２ｅｎ ５Ａｃを加えてインキュベーションした。このような濃度では、インヒビターに よる反応混合物のｐＨへの影響はなかった。酵素による処理の後、細胞を冷たい ＨＢＳＳ／ＨＳＡ／Ｃａで２回洗浄し、ＨＢＳＳ／ＩＳＡ／Ｃａ中に４ｘｌＯ６ ７ｍｌとなるように再懸濁して、その後、［＋２５１］ＧＭＰ−１４０の結合を 測定した。使用したＮＤＶノイラミニダーゼはウィルス粒子の懸濁液であった。

これら粒子の各々は約１０３個のノイラミニダーゼ分子を含有し、一方、Ｖ、　 ｃｈｏｌｅｒａｅ酵素は溶液中に存在する。

［”ＩＩＣＭＰ−１４０の好中球への結合はプロテアーゼによって４から５％に 減少したが、ジイソプロピルフルオロホスフェートで不活性化されたエラスター ゼまたはトリプシンによっては減少しなかった。これにより、ＧＭＰ−１４０に 対する白血球カウンターレセプターの少（とも実質的なフラクシ冒ンは、プロテ アーゼ感受性タンパク質成分を含有、またはこれに結合することが示される。

Ｖｆｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ　 Ｂｉｏｅｈｅｗｉｃａｌｓ、　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　ＩＮ）またはニュ ーカッスル病ウィルス（ＮＤＶ）　（Ｐａｕｌｓｏｎ、Ｊ、Ｃ，、ら、Ｊ、’ｏ 　、Ｃｔｍ、２５４：２１２０−２１２４　（１９７９）に記載のように単離） のいずれかから得られるノイラミニダーゼ、およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｆ ｒａｇｉｌｉｓ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）から得られるエ ンド−β−ガラクトシダーゼにより、好中球を処理した。Ｖ、　ｃｈｏｌｅｒａ から得られるノイラミニダーゼはα２−３−１α２−６−５α２−８−結合した シアル酸を開裂させる。ＮＤＶノイラミニダーゼは、α２−３−およびα２−８ −結合したシアル酸のみを開裂させる。

好中球をＶｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａから精製したノイラミニダーゼで処理す ると、”’　［ＧＭＰ−１４０１のヒト好中球への結合、および好中球の固定化 ＧＭＰ−１４０への付着の両方が著しく減少した。これにより、シアル酸残基が ＧＭＰ（４０に対する白血球のカウンターレセプターの実質的な成分を構成する ことがわかる。０．１から０．２　Ｕ／ｍｌのＶ、　ｅｈｏｌｅｒａまたはＮＤ Ｖノイラミニダーゼと一緒に１０かう３０分間インキュベートすると、ＧＮＰ− １４０の特異的な結合は、偽処理されたコントロールと比較すると各々２８±９ および５２±Ｈ（平均値上標準偏差、ｎ・７）に減少した。この効果はノイラミ ニダーゼ調整物中の内因性好中球プロテアーゼまたはプロテアーゼの混入のいず れかによるものであるという可能性を最小限にするために、好中球を固定化する 荊にＤＰＰで処理し、内因性血清プロテアーゼを不活性化した。そして、１０＋ ｓｇ／ｍｌ　ＥＩＳＡおよびいくつかのプロテアーゼインヒビターの存在下でノ イラミニダーゼをインキユベーシッンした。ノイラミニダーゼ効果の特異性はさ らに、ノイラミニダーゼの競合インヒビターＮｅｕ２ｅｎ５Ａｃが、ＧＭＰ−１ ４０の好中球への結合がノイラミニダーゼにより減少するのを阻止し得ることに より示された。

Ｎｅｕ２ｅｎ５Ａｃは、用量依存的にノイラミニダーゼの効果を阻害し、１ｃｓ ａは２．５■Ｍであった。

これらの結果により、ＧＭＰ−１４０に対する白血球上のカウンターレセプター 、またはリンガントは糖タンパク質であり、ここでは、レセプター機能のために はシアル酸が必要であることが示される。好中球はα２−３−およびα２−６− 結合したシアル酸を共に含有するが、α２−８−結合は検出されていない。ＮＤ Ｖノイラミニダーゼで処理した後、　ＧＭＰ−１４０の結合が一部失われること から、レセプター中のシアル酸結合の少くともいくつかはα２−３４であること が示唆される。Ｖ、　ｃｈｏｌｅｒａ酵素を使用してさらに大きな阻害が観察さ れたことは、α２−６−結合がまたレセプター機能のためにも必要であることを 意味し得、または、これらの結果は、無傷ウィルスの成分であるＮＤＶ酵素によ って本質的な結合のすべてに接近し得ないためであり得る。

赤血球細胞およびリンパ球細胞とは対照的に、骨髄細胞は、α２−３−またはα ２−６−結合シアル酸を末端とし得るポリラクトサミ／グリカンが豊富である。

これらラクトサミノグリカンの多くはフコシル化されている。これらの構造は好 中球の糖タンパク質および糖脂質の両方に存在する。ＧＭＰ−１４０の認職にお けるこれらグリカンの可能な役割を調べるために、細胞を、糖タンパク質の分枝 していないポリラクトサミニル側鎖のガラクトースとＮ−アセチルグルコサミン の間のβ１−４結合を加水分解するエンド−β−ガラクトシダーゼで処理した。

固定した好中球を０．２　Ｕ／＋ｓｌまでのＥ．　ｆｒｅｕｎｄｉｉエンド−β −ガラクトシダーゼで３０分間、または０．４　Ｕ／ｍｌまでのＢ．　ｆｒａｇ ｉｌｉｓエンド−β−ガラクトシダーゼで６０分間、前処理してもＧＭＰ−１４ ０の特異的結合に対する影響はなかった。これらの酵素が結合に影響を与えない ことは、ＧＭＰ−１４０を認識する構造がポリラクト−サミン側鎖上には存在し ないことと一致する。

別の可能性として、および恐らくより高い可能性として、関連する側鎖はこれら の条件下では酵素による加水分解に対して非感受性であり得る。分枝したポリラ クトサミ／グリカンは好中球には存在しないが、高度にフコシル化したおよび／ または分枝したポリラクトサミノグリカンはこの酵素による加水分解に耐性であ る。さらに、Ｎ−または〇−結合構造のコアに直接結合する単一のラクトサミノ グリカンは酵素に耐性であり得る。

実施例６：シアル化したフコシル化構造がＧＭＰ−１４０に結合するための必要 条件 以下の研究は、ジョーシア大学のＲｉｃｈａｒｄ　ＣｕｎＩＩｉｎｇｓによりチ ャイニーズハムスターの卵巣細胞、すなわちＣＨＯ細胞を使用して行われた。使 用した細胞系には、Ａｄｅ−Ｃ細胞および特異的グリコジルトランスフェラーゼ で永久にトランスフェクトされたＡｄｓ−Ｃ細胞が含まれる。Ａｄｅ−Ｃ細胞は 、これらが非常に低レベルの内因性α（１．３）フコシルトランスフェラーゼを 含有するために選択された。これらの細胞は以下に述べる研究では野生型細胞と 呼ばれる。トランスフェクトされた細胞は、野生型細胞上には存在しない特定の 盟のオリゴ糖を発現する。

Ｌｅｔ８　ＣＨＯと呼ばれる、使用する別のＣＨＯ細胞系にはＵＤＩ’Ｇａｌに 対するトランスポーターを欠（。この結果、細胞にはガラクトシル化およびシア ル化した複合糖質がない（ＤｅｕｔｓｃｈｅｒおよびＨｉｒｓｃｂｂｅｒｇ．ム ーし」１Ｊ上ｌ−２６１：９６−１００．　１９８６）。これらのいくつかの細 胞に存在するオリゴ糖構造およびその細胞の型を表ＩＩＩに示す。関連する細胞 としては、野生型細胞（　ＣＨＯ）、ネオルイス（Ｎｅｏ　Ｌａｗ）　、ネオル イス関連細胞（Ｎｅｏ　Ｌｅｔ　（ｔｅｌ））、およびＬｅｔ８　ＣＨＯ細胞（ Ｌｅｃｌｌ）がある。

以下の方法を用いて細胞を培養およびトランスフェクトした。

ＣＨＯ系のＡｄｅ−Ｃ（ＯａｔａｓおよびＰａｔｔｌ！ｌｒ＄ｏｎｓ３：５６１ −５７７　（１９７７）；　Ｖａｎ　Ｋｅｕｒｅｎら、ｍ、Ｊ、　３１１ニア９ ３−８０４　（１９８６））を、１０％のウシ胎児血清を補充したα−改変イー グル培地で増殖させた。トランスフェクトされたＣＩＯ細胞を、４００μｇ／ｍ 　ｌのＧ４１ｇ　（Ｇ［ＢＣＯ）　（活性薬剤）を補充した培地で増殖させた。

前述のように、Ａｄｅ−ＣＣＨＯ細胞をａ　（１，３／１．４）フコシルトラン スフェラーゼをコードするＤＮＡで安定にトランスフェクトすることにより、Ｎ ｅｗ　Ｌａｗ　ＣＨＯ細胞を調製した（１．ｏｗｅら、姐Ｌ　５３：４７５−４ Ｊ１４．１９９Ｇ、この文献ではこの細胞をＣＨＯ−ＦＴと呼んだ）。野生型Ｃ ＨＯ細胞を、ＧＤＰフコースが非シアル化うクトーサミノグリカンのみに転移す るのを触媒するα（１，３）フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡで 同様の方法により安定にトランスフェクトすることにより、Ｎｅｏ　Ｌｅｌ（ｒ ｅｌ）　（ｒｅｌ）関連細胞を調製した。このトランスフェラーゼは、Ｌｏｖｅ ら、廊、ｌｌ　６３：４７５−４１１４．１９９０に記載されている。これらト ランスフェクトされた細胞系は共にミシガン大学のＤｒ、　Ｊｏｈｎ　Ｌｏｖｅ から贈与されたものである。

ＧＭ！’−１４０を含有するセレクチンが結合する炭水化物に関する結果および 結論 野生型ＣＨＯ細胞およびトランスフェクトされたＣｌｌｌ０細胞により生成され る構造を表ＩＩ＋に示す。野生型ＣＦＩＯ細胞はＧａｌβ１．４細胞上のＧＭＰ −１４０に対するオリゴ糖リガンドの少くとも実質的なフラクションがタンパク 質により運ばれることが示唆される。

これらのデータにより、ＧＭＰ−１４０に対するオリゴ糖リガンドはシアル化し たフコシル化構造であることが確認される。シアル酸結合は、ＣＥ［０細胞がＣ ２，６結合を有しないため、ＧａｌにＣ２，３結合し得る。フコース結合はＧｌ ｃＮＡｅにＣ１，３結合し、ＧｌｃＮＡｃにはβ１，４結合によりＧａｌが結合 している。可能な構造としては、シアリルＬｅｘ自体、ジフコシルシアリルＬ　 ｅ　ｌｌｓ　シアリルＬｅｘのより長いポリフコシル化ポリラクトーサミノグリ カン変異株、または上記成分の要素を含有する分枝構造がある。Ｌｅ８自体は結 合に対する必要な親和性または特異性を提供しない。

末端シアル酸に最も近いＧｌｃＮＡｃに結合するＦｕｅがないシアル化構造を有 するＶＩＭ−２は、この構造はＧＭＰ−１，４０に結合しないＮｅｏＬｅｗｉ　 ｓ関連細胞上に存在するため、ＧＭＰ−１４０に対して親和性を有し得る。しか し、ＮｅｏＬｅｖｆｓ関連細胞上に存在するＶＩＭ−２の数量は知られていない 。数量が少い場合は、ＶＩＭ−２がＧＭＦ−１４０に対していくらか親和性があ る場合でも、細胞は十分には結合しない。

別の研究により、高濃度のＬｅ”は付着を阻害することが示されているが、Ｌｅ ’三糖類を含むＬＮＦＩ＋＋は、３００μＭまでの濃度では、精製され固定化さ れたＧＭＰ−１４０への好中球の結合には全く影響を及ぼさない。

１ＪｉＰ＋　７　：　ＧＭＰ−１４０およびＥＬＡＭ−１によるリガンドの結合 における相違の証明 ＥＬＡＭ−１およびＧＭＰ−１４０に対するリガンドが同一または非常に類似し ていることを示すデータにもかかわらず、そうではないことを示す２つの証拠が ある。

まず第１に、ＧＭＰ−１４０またはＥＬＡＭ−１をコードするｅＤＮＡでトラン スフェクトされたＣＯ３細胞への好中球の付着は、両タイプのトランスフェクト された細胞に対して特異的な付着を示す。

Ｇｅｎｇら、１ｆａｔｕｒｅ　（１９９０）に記載されているように、ＧＭＰ− １４０でトランスフェクトされた細胞への付着を、ＧＮＰ−１４０に対するモノ クローナル抗体Ｇ１によりブロックし、ＥＬＡＭ−１でトランスフェクトされた 細胞への付着を、ＥＬＡＭ−１に対するモノクローナル抗体１１１１１／７によ りブロックした。しかし、液相ＧＭＰ−１４０は、ＧＭＰ−１４０でトランスフ ェクトされた細胞への付着をブロックしたが、ＥＬＡＭ−１でトランスフェクト された細胞への付着には影響を与えなかった。（図６） 箪２に、豊富な量のシアリルＬｅ”を含むヒトがん腫細胞系■Ｔ−２９は、ＥＬ ＡＭ−１でトランスフェクトされた細胞に結合するが、ＧＭＰ−１４０でトラン スフェクトされた細胞には結合しない。（図図６および図７のデータは、ＧＭＰ −１４０およびＥＬＡＭ−１が、若干具なる構造のリガンドを認識し、モして／ または同じリガンドを認識する親和性の点で異なることを示している。ＧＭＰ− １４０およびＥＬＡＭ−１はそれぞれ、親和性の程度が異なる関連したオリゴ糖 構造の範囲に結合し得る。

ＥＬＡＭ（およびＧＭＰ（４０による結合を比較研究するために使用される方法 および物質は、以下のものであった：細胞の単離および培養物 Ｍｏｏｒｅら、Ｊ、ＣｅｌユＢｆｏ１．１１２．４９１−４９９　（１９９１） に記載されているように、モノポリ分離媒体を用いて、正常なボランティアから ヒト好中球を単離した。ヒ）　ＭＬ−６０前骨髄細胞およびＨＴ−２９ヒト結腸 がん腫細胞を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ 、　ＭＤ）から得たｏ　１１１．−ａｏ細胞を、ＲＰＭＩ−１６４０／１０１ウ シ胎児血清中に保存した。ＨＴ−２９細胞を、１０％ウシ胎児血清（ｆｅｓ）を 補充したＭｃＣｏｙの５３培地の培養物中に保存した。ＣＯ３−７細胞を、１０ ％ウシ血清を補充したダルベツコ変性イーグル培地（ＩＩＧ−ＤＭＥＭ）中に保 存した。

Ｃ０Ｓ７細胞トランスフェクションおよび好中球ロゼ１．ティングアッセイ ＧＭＦ−１４０またはＥＬＡＭ−１をコードする全長ｅＤＮＡを、Ｇｅｎｇら、 Ｎ〔且■（１９９０）により記載されているように、ＣＤＭ８に挿入した。

Ｃ０Ｓ７細胞を、１０％ウシ血清を補充した高グルコースＤＭＥＭ　（Ｇ４ｂｃ ｏ）　（ＨＧ−ＤＭＥＭ／１０％ＣＳ）を含む１０　ｃｍベトリ皿において、約 ８０％コンフルエンスになるまで増殖させた。５０μｌのトランスフェクチンＴ ″試薬（ＢＲＬ　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ、）を、５０μ ｌの水中２０μｇのｃＤＮＡまたは水のみと混合し、室温で１５分間放置した。

ＣＯＳ細胞を３ｓｌのＯｐ　ｔ　ｉＭＥＭ”　Ｉ還元血清血清培地（ＢＲＬ　Ｌ ｉｒｅ　Ｔｅｃｈｎｏｇｉｅｓ、　Ｉｎｃ、）で２回洗浄した後、ｅ　ＤＮＡ− リポフエクチン試薬混合物を加え、５ｚのｃｏ２雰囲気中３７℃で一昼夜インキ ュベートした。６ｓｌのＨＧ−ＤＭＥＭ／１０％　ＣＳを加え、細胞をさらに２ ４時間インキュベートした。次いで、Ｃａ”およびＭｇ”２を含まないＨＢＳＳ で単層を１回洗浄し、０．０２％のＥＤＴＡを用いて細胞を分離し、遠心分離に よりベレット化し、次いで１２ｍ１のＨＧ−ＤＭＥＭ／１０ｚＣＳ中で再懸濁し た。２ｓｌの細胞懸濁液を、３ｓｌのＨＧ−ＤＭＥＭ／１０％ＣＳを含む６−ウ ェルの組織培養物（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を含む各ウェルにプレートし、さらに２４ 時間増殖した。付着アッセイの前に、ウェルをＨＢＳＳで２回洗浄した。ウェル を、３０℃ｇ／ｍｌのＧＩ　Ｆ（ａｂ’）２、Ｈ１ｌｌ／７　Ｆ（ａｂ’）２ま たは緩衝液のみを含む０．５ｓｌのＨＢＳＳと一緒に２２℃で３０分間インキコ ベートし、これを２回繰り返した。

次いで、３０℃ｇｅｍ　１のＧＭＰ−１４０または希釈液の存在下で３０分間イ ンキュベートして新たに単離したヒト好中球ＣＨＢＳＳ中２　ｘ　１０’／ｍｌ ）　ｂ＊１を単層に加え、２２℃で２０分間インキコベートした。

新たに単離したヒト好中球または３５Ｓ−メチオニンで標識したＨＴ−２９細胞 （ＢＢＳＳ中２　Ｘ　１０’／１％ｌ５Ａ）を１園１加え、２２℃で２０分間イ ンキコベートした。いくつかの実験において、付着アッセイの前に、好中球を、 精製されたＧＭＰ−１４０（最終濃度１０μｇ／ｍ１）と−緒に２２℃で３０分 間、インキユベートした。

細胞付着をアッセイするために、５ＩｌｌのＨＢＳＳ／１％［ｌＳＡで５回洗浄 した後、付着した好中球を、Ｓ０璽Ｍのリン酸カリウム中０．５％のヘキサデシ ルトリメチル臭化アンモニウム（ｐＨ６，０）　２００μｌで可溶性にした。Ｇ ｅｎｇら、ＬＬＬＬｒｊ３４３．７５７−７６０　（１９９０）により記載され ているように、付着した好中球をミエロベルオキシダーゼで２回繰り返しアッセ イした。ＨＴ〜２９細胞付着をアッセイするために、付着細胞を１％のトリトン Ｘ１００で可溶性にし、液体シンチレーシｌンカウンティングにより定量した。

界面活性剤を加える前に、単層を位相差顕微鏡検査により検査し、単層が十分に 洗浄され、ＣＯ３細胞単層が無傷であることを確認した。

結果 ＧＭＰ−１４０は、ＧＭＰ−１４０をコードするｃＤＮＡでトランスフェクトさ れたＣ０Ｓ７細胞への好中球の付着を阻害するが、ＥＬＡＭ−１をコードするｃ ＤＮＡでトランスフェクトされた細胞への付着は阻害しないＱ　ＣＯＳ？細胞を 、ＧＭＰ−１４０またはＥＬＡＭ−１をコードするｃＤＮＡで偽トランスフェク トまたはトランスフェクトした。精製されたＧＭＰ−１４０、ＧＩ　Ｆ（ａｂ’ ）２またはＨ１δ７７　Ｆ（ａｈ’＞２（最終濃度はすべて１０μｇ／■ｌ）が 、トランスフェクトされたＣＯＳ？細胞に好中球がロゼ／ティングするのを阻害 する能力を、図６に示す。

データは、２つの独立したトランスフェクション実験からの結果である。各トラ ンスフェクシヨンにおいて、ＧＮＰ−１４０およびＧＬ　Ｆ（ａｂ’）２または Ｈ１８／７　Ｆ（ａｂ’）２の存在下または非存在下で、付着アッセイを単層上 で２回繰り返し行った。結果を、結合した好中球の数（平均±ＳＤ）として表す 。

この結果は、好中球が、ＥＬＡＭ−１またはＧＮＰ−１４０をコードするｃＤＮ ＡでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞に結合し、その結合が適切なモノクロー ナル抗体により阻害されることを明確に示している。すなわち、抗ＥＬＡＭ〜１ 抗体（Ｈ１８／７）は、ＥＬＡＭ（でトランスフェクトされた細胞への好中球の 結合をブロックし、抗ＧＭＰ−１４０抗体（Ｇ１）は、ＧＭＰ（４０でトランス フェクトされたＣＯ３細胞への好中球の結合をブロックする。しかし、液相ＧＭ Ｐ−１４０は、ＧＭＰ−１４０でトランスフェクトされたＣＯ３細胞への好中球 の付着を完全にブロックするが、ＥＬＡＭ−１でトランスフェクトされたＣＯ３ 細胞への好中球の付着には影響を与えない。

次いで、大量のシアリルＬｅゞ構造を含むＨＴ−２９細胞の結合における相違を 調べるために、トランスフェクトされたＣＯ８細胞を用いた。図７に示す結果は 、ＨＴ−２９細胞がＥＬＡＭ−１でトランスフェクトされた細胞に強く結合する が、ＧＮＰ−１４０でトランスフェクトされた細胞には全く結合しないことを示 している。従って、ＧＭＰ−１４０およびＥＬＡＭ−１は両方とも、α（２，３ ）シアル化α（１，３）フコモル化ラクトうミノグリカンを含むオリゴ糖構造を 認識するが、ＨＴ−２９細胞と、ＧＭＰ−１４０およびＥＬＡＭ−１でトランス フェクトされたＣＯ３細胞との相互作用は、同一ではない。

実施例８：好中球におけるＧＭＩ’−１４０リガンドのタンパク質成分の特性付 は トリプシンによる好中球の処理により、特異的なＧＭＰ（４０の結合が破壊され た。このことは、好中球におけるＧＮＰ−１４０に対する優勢なリガンドがグリ コスピンゴリビドではな（表面糖タンパク質であることを示している。図８に示 すように、Ｈし一６０ｍ胞およびＮｅｏｌ、ｅｔｉｓ　ＣＨＯ細胞のトリプシン 処理もまた、ＧＭＰ−４４０へのそれらの付着を著しく減少させた。このことは 、糖タンパク質成分は、これらの細胞におけるＧＭＰ−１４０に対する主要なリ ガンドでもあることを示している。Ｃｌｌ０細胞により合成された単一糖脂質は 、トランスフェクトされたフコシルトランスフェラーゼの基質ではないため、糖 脂質リガンドは、ＮｅｏＬｅｗｉｓ　ＣＩＯ細胞上では期待されない。ＧＭＰ− １４０により認識されるオリゴ糖構造を有する表面タンパク質は、ヒト骨髄細胞 およびチャイニーズハムスター卵巣細胞においては同一ではないようである。こ のことは、リガンドへのＧＭＰ（４０の強い親和性結合は、タンパク質問の相互 作用を必要としないことを示唆している。

トリプシン処理については、　ＨＥＰＥｓ緩衝液Ａ緩衝液層中たＮｅｏＬｅｗｉ ｓ　Ｃ）１０細胞を、０．１％のＤＰＣＣ−トリプシンと一緒に３７℃で１０分 間インキュベートした。コントロール細胞を、ＤＦＰで不可逆的に不活性化した ＤＰＣＣ−トＩＪプシンと一緒に、同一条件下でインキュベートした。トリプシ ン処理後、細胞を氷上で冷凍し、最終濃度が２＋ｉＭになるようにＤＦＰを加え て酵素を不活性化した。トリプシンで処理した後、アッセイする前に、細胞を氷 で冷却した［ＩＥＰＥＳ緩衝液Ａで新液洗浄した。

好中球の場合、還元条件下で５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析すると、ＧＭＰ−１４ ０で認識された主要な糖タンパク質の、見かけ上のＭｒは約１２０，０００であ ることが証明されている。ヒト好中球の血漿膜フラクシヨンを調製し、その調製 物を［リガンドブロッティング」で分析した。この調製物を５ＤＳ−ＰＡＧＥで 分画し、イモピロン膜に移し換え、［’　２５］ＧＭＰ−１４０でプローブした 。還元条件下では、標識されたＧＭＰ−１４０は１２０−ｋＤバンドに一貫して 結合しているのが観察された。この結合は特異的である。なぜなら、Ｃａ”依存 性であり、抗体Ｇ１によりブロックされるが、Ｓ１２によってはブロックされず 、ノイラミニダーゼによる膜の前処理により除去されるからである。このタンパ ク質は、小麦胚芽凝集素アフィニティーカラム上に定量的に結合し、このことは 、シアル化されたオリゴ糖を広（含むことを示している。

このタンパク質は、ＡｆｆｆｇｅｌＴ″に結合したＧＮＰ−１４０のアフィニテ ィーカラムに結合し、カラムから溶出され得る。部分的に精製されたタンパク質 は、銀およびクーマシーブルーではあまり染色されない。このタンパク質は、同 様の見かけ上のＭｒを有し、ＳＯＳポリアクリルアミドゲル上に染色パターンを 有するロイコシアリンとして公知の、強く０−グリコジル化されたタンパク質を 示し得る。さらに、低用量のノイラミニダーゼでこのタンパク質を処理すると、 タンパク質からはすべてのシアル酸が除去されるわけではないが、結果としてゲ ル上の移動度はゆるやかになり、特定の強（Ｏ−グリコジル化されたタンパク質 が部分的に脱シフル酸化されたパターンと一致する。

ＧＭＰ−１４０に対するオリゴ糖リガンドを有する骨髄細胞には、他のタンパク 質が存在し得る。リガンドプロブティングにより決定されるように、１２０−ｋ Ｄａ糖タンパク質は、　ＧＭＰ−１４０に最も強い親和性で結合する最も豊富な リガンドおよび／またはその構造を示し得る。

ＧＮＰ−１４０のレクチンドメインまたはＧＭＰ−１４０と相互作用する炭水化 物由来のペプチドからの診断試薬および治療薬の調製上記のペプチドおよび炭水 化物は、診断試薬として様々に応用され、特に、多くの炎症性疾患の治療に適用 される。

診断試薬 ＧＭＰ−１４０に結合するペプチドおよび抗体または炭水化物に対する他のプロ ーブはまた、ＧＭＰ−１４０のリガンドを欠くヒトの疾患の検出に使用され得る 。このような疾、！！は、白血球が活性化された血小板または内皮に結合し得な い感染症に感染しやすい患者に多（見られる。テストされる細胞、通常白血球を 、医学的に容認されている標準技術で集めてスクリーニングする。検出システム には、ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法、放射標識された抗体の固定化された活性化細胞への結 合、フローサイトメトリー、または当業者に公知の他の方法が含まれる。

レクチンドメインペプチドの存在下および非存在下での結合の阻害は、セレクチ ン結合における欠陥または改変を検出するのに使用され得る。このような疾患は 、ＧＭＰ−１４０に対する白血球のリガンドがないために、白血球が血小板およ び内皮に対して結合しない感染症に感染しやすい患者に多く見られる。ＧＭＰ− １４０ペプチドを、蛍光タッグで放射的に、酵素的に、または電子顕微鏡の金の ような高電子密度物質で標識する。

検査される細胞、通常白血球は、標識されたＧＭＰ−１４０ペプチドと一緒にイ ンキユベートされ、結合は、ＧＭＰ−１４０に対する抗体を用いて上記の方法に より評価されるか、または当業者に公知の他の方法により評価される。ＧＭＰ− １４０に対するリガンドが血漿中にも見いだされると、それらはまた、検出試薬 として抗体の代わりに標識されたＧＭＰ−１４０ペプチドを用いて、標準ＥＬＩ ＳＡ法またはラジオイムノアッセイ法により測定され得る。

同様のアプローチは、ＧＭＰ−１４０の定性的または定量的な疾患を決定するの にも使用され得る。炭水化物を標識し、ＧＭＦ−１４０に欠陥があると思われる 疾患を有する患者からの活性化血小板におけるＧＭＰ−１４０への炭水化物の結 合能力をテストする。

臨床上の応用 ＧＭＰ−１４０は、白血球付着、炎症および凝血に関連したいくつかの機能を有 するため、ＧＭＰ−１４０ならびに／あるいは、ＥＬＡＭ−１およびＬＥｔｌ− ８を含む、ＧＭＰ−１４０ペプチドまたは炭水化物のような他のセレクチン結合 に相互作用する臨床上の化合物は、これらの応答を調節するために使用され得る 。

例えば、ＧＭＰ（４０ペプチドまたは炭水化物は、活性化された血小板または内 皮細胞の表面にあるＧＭＰ−１４０のレセプターへ競合的に結合することにより 、白血球の付着を競合的に阻害するのに使用され得る。この種の治療法は、白血 球により媒介される炎症の阻害が望ましい急性の状況下において特に有用であり 得、効果的であるが一時的である。ＧＭＰ−１４０ペプチドまたは炭水化物の注 入による慢性治療法もまた、い（つかの状況では可能である。

炎症応答は、もし再チェックされなければ、宿主を損傷し得る。なぜなら、白血 球は、正常な組織を損傷し得る有毒なが内皮に付着するメカニズムおよびそれに 続く移行は、あまりよく理解されていないが、少なくともいくつかの点で、白血 球のメカニズムと同様であり得る。血小板と転移腸瘍細胞との結合については詳 しく記載されており、いくつかのがんの蔓延における血小板の役割を示唆してい る。

血小板−白血球の相互作用は、アテローム硬化症において重要であると考えられ る。血小板は、単球がアテローム硬化プラークに補充される際の役割を果たし得 る。単球の蓄積は、アテローム発生中の最も初期に検出可能な症状の１つである ことが知られている。完全に発達したプラークが破裂すると、血小板の沈着、活 性化、血栓形成の促進、ならびに虚血領域への好中球の初期補充が引き起こされ 得る。

他の領域における可能な応用は、慢性関節リウマチの治療である。

これらの臨床上の応用では、適切な薬学的キャリヤー中のペプチドまたは炭水化 物またはその混合物は、迅速な緩和を必要とする場所に静脈注射により投与され るのが好ましい。

ペプチドもしくは炭水化物はまた、キャリヤー分子に結合したペプチドもしくは 炭水化物として、筋肉内、腹膜内、皮下、経口により、または薬物送達装置によ っても投与され得る。

ペプチドまたは炭水化物は、インビボにおける半減期を増加させるために、さら に化学的に改変され得る。

ペプチドは、ＧＭＰ−１４０のタンパク質分解的開裂、または好ましくは実施例 １においてペプチドを調製するために使用したような合成手段により調製され得 る。これらの方法は、当業者により公知である。例としては、米国特許第４．７ ９２．５２５号において使用され、米国特許第４．２４４．９４６号において記 載されている、Ｊ、　Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ　Ａｔ　Ｃｅ　、Ｓｏｃ、８５ ．　２１４９　（１９６４）により記載の固相合成が挙げられる。この合成では 、保護されたαアミノ酸は、適切な樹脂に結合され、Ｃ末端から開始するペプチ ドの合成を開始する。他の合成方法については、米国特許第４．３０５．８７２ 号および第４，３１６．８９１号に記載されている。

これらの方法は、ＧＭＰ−１４０と同一の配列を有するペプチド、またはアミノ 酸の置換物または付加物を合成するのに使用され得、これらは、実施例１および ２に記載されているように、その活性を調べるためにスクリーニングされ得る。

ペプチドはまた、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸およ びリン酸のような無機酸、ならびにギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、 乳酸、ピルビン酸、シニウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸およびフマル酸 のような有機酸との反応、または水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸 化カリウムのような無機塩基、およびモノ−、ジー、トリアルキルおよびアリル アミンのような冑機塩基、および置換エタノールアミンとの反応により形成され る薬学的に受容可能な酸または塩基付加塩として投与され得る。

シクロプロピルアミノ酸、または同様に誘導されるアミノ酸を含むペプチドもま た使用され得る。これらのペプチドは、その最初の活性を保持するが、インビボ において半減期を増化した。アミノ酸を改変することが知られている方法、およ びその使用については、例えば、Ｓｔａｍ＋＋＋ｅｒの米国特許第４．６２９． ７８４号に記載されているように、当業者に公知である。

炭水化物は、天然に、またはトランスフェクトされたＣｏｓ細胞の例において記 載されているような遺伝子工学の結果、または好ましくは合成手段により、炭水 化物を発現する細胞から単離され得る。これらの方法は、当業者に公知である。

さらに、多数のグリコジルトランスフェラーゼがクローニングされている（Ｊ、 Ｃ，Ｐａｕｌｓｏｎおよびに、Ｊ、　Ｃｏ１１ｅｙ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ ｇ３．−２６４：１７６１５−１７６１８．１９８９）。従って、当業者は、調 合薬または診断試薬を調製するために、合成化学および酵素的合成を組み合わせ て使用することができる。

生物学的に活性なペプチドおよび炭水化物は、ＧＭＰ−１４０への好中球および 単球の結合を阻害するもの、またはＥＬＡＭ−１および／またはホーミングレセ プターの媒介による白血球の内皮への付着を阻害するものである。

患者への投与に適切な薬学ビヒクルは、当業者に公知である。非経口投与では、 ペプチドまたは炭水化物は、通常、滅菌水または生理食塩水中で溶解または懸濁 され得る。腸内投与では、ペプチドまたは炭水化物は、錠剤、液体またはカプセ ル形態で不活性キャリヤーに導入され得る。適切なキャリヤーは、デンプンまた は砂糖であり、潤滑剤、香料、結合剤および同じ特性を有する他の物質が含まれ る。ＧＭＰ−１４０ペプチドまたは炭水化物はまた、創傷部または炎症部位に、 特異的には溶液またはクリームで塗布して局部投与され得る。

あるいは、ペプチドまたは炭水化物は、リポソームまたはマイクロスフェア（ま たは微量粒子）で投与され得る。患者へ投与するためのリポソームおよびマイク ロスフェアを調製するための方法は、当業者に公知である。米国特許第４．７８ ９゜７３４号は、リポソーム中に生物学的物質をカプセル化する方法について記 載している。実質的に、物質は、水溶液に溶解され、必要に応じて、界面活性剤 と共に適切なリン脂質および脂質が添加され、物質は、必要に応じて透析または 超音波処理される。公知の方法は、Ｇ、　Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、　１４章、 ’Ｌｆｐｏｓｏ＋＊ｅｓ″、　Ｄｒｕ　Ｃａｒ　１ｅｒｓ　’ｎ　ｉｏ　ｏ　ａ ｎｄ　Ｍｅｄ’ｃｉｎｅ　ｐｐ、　２ｇ？−３４１（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ ｓｓ、　１９７９）により詳しく記載されており、その教示は本願で寥考のため に援用している。ポリマーまたはタンパク質により形成されるマイクロスフェア は、当業者に公知であり、胃腸管を通じて血流に直接送達されるように設計され 得る。あるいは、ペプチドまたは炭水化物が導入され、マイクロスフェアまたは マイクロスフェアの複合体が数日から数カ月の期間に渡ってゆっくりと放出され るように移植され得る。例えば、米国特許第４．９０６．４７４号、箪４．９２ ５．６７３号および第３．６２５．２１４号を参照。

主題のペプチドは、一般に、体重１ｋｇ当り約１μｇより多い量で非経口投与さ れると活性となる。大抵の炎症性疾患の治療には、投与量は、体重１ｋｇ当り０ ．１から３ｈｇの間である。実施例で特徴づけられるペプチドの中には、７０Ｂ ／ｋｇの投与量が必要なものもある。この投与量は、一部には、１つ以上のペプ チドが投与されるか否かに依存し得る。レクチンドメインの３つの領域の結合に 関して記載されているように、相乗効果は、レクチンドメインの異なるまたは重 複する領域からのペプチドの組合せ、またはＧＭＰ（４０のＥＧＦドメイン由来 のペプチドとの組合せにより見られる。

炭水化物は、非経口または他の手段により投与されるときに、活性とならなけれ ばならない。必要な量は、インビトロアッセイにおけるＧＭＰ〜１４０の骨髄性 細胞への結合の阻害に必要な濃度、および注入された炭水化物のクリアランス速 度に基づく。この投与量は、一部には、１つまたはそれ以上の炭水化物が投与さ れるか否かに依存し得る。相乗効果は、炭水化物の組合せ、または多価形態の天 然のリガンドもしくはＧＭＰ−１４０に対する親和性および／または親和力を増 加させるために設計されたリガンドの誘導体により見られる。

ペプチドまたは炭水化物はまた、白血球の血小板または内皮への付着を防止する ために、身体に注入される補てつ物として使用されるために、基質にコーティン グされ得る。

ＧＭＰ−１４０、そのペプチドまたは炭水化物の抗体を用いた治療理学療法に対 する応答を評価するための基準は、特定の条件により左右され、通常、標準的な 医学的実践に従う。例えば、心筋梗塞の拡張を防止するために有効な投与量の基 準は、心電図、生存徴候および臨床応答をモニターして、血漿中の心筋壊死のマ ーカー酵素を観察することにより、当業者により決定され得る。急性呼吸性困難 症候群の治療では、動脈酸素および肺浸潤物の分解における改善、ならびに呼吸 困難および頻呼吸の減少により測定される臨床上の改善が調べられる。

ショックを起こした（低血圧）の患者の治療では、有効な投与量は、臨床上の応 答、および血圧回復後の、肝臓および腎臓のような生体臓器の機能の特異的な測 定に基づく。神経機能は、発作を起こした患者においてモニターされる。移植さ れた臓器の機能をモニターするために、特異的なテストが使用され、例えば、腎 臓移植を受けた患者の血清、尿流、および血清電解質がモニターされる。

本発明の変更および改変、ＧＮＰ−１４０由来のペプチドを用いたＧＭＦ−１４ ０を含む結合反応を調節する方法、またはＧＭＰ−１４０リガンドの部分を形成 する方法は、上記の詳細な記載より当業者に自明である。このような変更および 改変は、添付の請求の範囲の範囲内にあるものとする。

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３つの領域には、アミノ酸１９−３４．５４−７２および６６−８９が含まれる 。この番号は、シグナルペプチドを開裂した後の成熟タンパク質のＮ末端を残基 １と定義した、ペプチド中の残基の番号ニ基ツく。ＧＭＰ−１４０に結合するフ コシル化シアル化ラクトサミン構造もまた発見された。この構造は、α（２，３ ）シアル酸で置換したラクトサミノグリカン類を含む受容体を改変し得るα（１ ，３）フコシルトランスフェラーゼ類の発現により形成される。

Ｌｅｘ、　Ｇａｌβ１．４（Ｆｕｃα１．３）Ｇ１ｅＮＡｅβ１−Ｒ（ここで、 Ｒはタンパク質または他の炭水化物構造である）は、このシアル化構造のコアを 形成する。ペプチドおよび炭水化物構造は、診断薬、および凝血過程または炎症 過程の調節または阻害への臨床上の応用において有用である。

国際調査報告 国際調査報告

Claims (40)

【特許請求の範囲】
1. １．ＧＭＰ−１４０への好中球および単球の結合を阻害するＧＨＰ−１４０のレ クチン様ドメイン由来の単離されたペプチド。
2. ２．ＣＱＮＲＹＴＤＬＶＡＩＱＮＫＮＥ、ＡＥＮＷＡＤＮＥＰＮＮＸＲＮＮＥＤ 、ＲＫＮＮＫＴＷＴＷＶＧＴＫＡＬＴＮＥ、ＫＫＡＬＮＥＡＥＮＷＡＤ、ならび にＧＭＰ−１４０への好中球および単球の結合を阻害するこれらの部分からなる 群から選択されるペプチドを含む、請求項１に記載のペプチド。
3. ３．ＣＱ．ＲＹＴＤＬＶＡＩＱＮＫ．Ｅ、ＲＫ．Ｎ．．ＷＴＷＶＧＴ．Ｋ．ＬＴ ＥＥ、ＡＥＮＷＡＤＧＥＰＮＮＫ．Ｎ．ＥＤ、Ｃ．．．ＹＴ．ＬＶＡＩＱＮＫ． Ｅ、ＲＫ．．．．Ｗ．ＷＶＧＴ．Ｋ．ＬＴ，Ｅ、Ａ．ＮＷ．．ＥＰＮＮ．．．． ＥＤ、および．Ｋ．ＫＴ．ＥＡ．ＮＷ．．からなる群から選択され、ここで、“ ．”が任意のアミノ酸である、請求項１に記載のペプチド。
4. ４．レクチンドメインペプチドのアミノ酸１９−３４、１９−３０、２３−３４ 、２１−３０、２２−３０、２３−３０、５４−７２、５４−６３、７３−８９ 、７３−８３、７３−８５、７７−８９およびその組合せからなる群より選択さ れるペプチドを含む、請求項１に記載のペプチド。
5. ５．キャリヤー分子に結合される、請求項１に記載のペプチド。
6. ６．身体へ移植するために不活性基質に結合される、請求項１に記載のペプチド 。
7. ７．患者へ投与するために、受容可能な薬学的キヤリやー中にある、請求項１に 記載のペプチド。
8. ８．蛍光、放射、および酵素標識からなる群から選択される検出可能な標識をさ らに含む、請求項１に記載のペプチド。
9. ９．α１，３−トフコシル化、α２，３−シアル化ラクトサミノグリカン構造を 含む、セレクチンに結合する単離された炭水化物。
10. １０．シアリルＬ６ｘ、ジフコシルシアリルＬｅｘ、およびより長いポリフコシ ル化ポリアクトサミノグリカン（ｐｏｌｙａｃｔｏｓａｍｉｎｏｇ１ｙｃａｎｓ ）からなる群から選択される、請求項９に記載の炭水化物。
11. １１．ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａ１β１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃβ１ −Ｒであり、そしてＲがタンパク質または他の炭水化物構造である、請求項１０ に記載の炭水化物。
12. １２．タンパク質をさらに含む、請求項９に記載の炭水化物。
13. １３．ＧＭＰ−１４０の単球および好中球への結合を阻害する、請求項９に記載 の炭水化物。
14. １４．ＥＬＡＭ−１の血小板および内皮細胞への結合を阻害しない、請求項１３ に記載の炭水化物。
15. １５．身体へ移植するために不活性基質に結合される、請求項９に記載の炭水化 物。
16. １６．患者へ投与するために受容可能な薬学的キャリヤー中にある、請求項９に 記載の炭水化物。
17. １７．蛍光、放射および酵素標識からなる群から選択される検出可能な標識をさ らに含む、請求項９に記載の炭水化物。
18. １８．ＧＭＰ−１４０の結合を阻害して生物学的機能を変化させるるペプチド、 ＧＨＰ−１４０に結合される炭水化物、およびＧＭＰ−１４０のレクチンドメイ ンから単離されたペプチドからなる群から選択される物質の有効な量を投与する ことを含む、炎症応答を調節する方法。
19. １９．前記ペプチドが、好中球のＧＨＰ−１４０への結合を阻害するＧＭＰ−１ ４０のレクチン様ドメイン由来のペプチドから選択される、請求項１８に記載の 方法。
20. ２０．前記ペプチドが、ＣＱＮＲＹＴＤＬＶＡＩＯＮＫＮＥ、ＡＥＮＷＡＤＮＥ ＰＮＮＫＲＮＮＥＤ、ＲＫＮＮＫＴＷＴＷＶＧＴＫＫＡＬＴＮＥ、ＫＫＡＬＴＮ ＡＥＮＷＡＤ、および好中球のＧＭＰ−１４０への結合を阻害するこれらの部分 からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
21. ２１．ＣＱ．ＲＹＴＤＬＶＡＩＱＮＫ．Ｅ、ＲＫ．Ｎ．．ＷＴＷＶＧＴ．Ｋ．Ｌ ＴＥＥ、ＡＥＮＷＡＤＧＥＰＮＮＫ．Ｎ．ＥＤ、Ｃ．．．ＹＴ．ＬＶＡＩＱＮＫ ．Ｅ、ＲＫ．．．，Ｗ．ＷＶＧＴ．Ｋ．ＬＴ，Ｅ、Ａ．ＮＷ．．．ＥＰＮＮ．． ．．ＥＤ、および．Ｋ．ＫＴ．ＥＡ．ＮＷからなる群から選択され、ここで、“ ．”が任意のアミノ酸である、請求項１９に記載の方法。
22. ２２．前記ペプチドが、レクチンドメインペプチドのアミノ酸１９−３４、１９ −３０、２３−３４、２１−３０、２２−３０、２３−３０、５４−７２、５４ −６３、７３−８３、７３−８９、７３−８５、７７−８９およびその組合せか らなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
23. ２３．前記物質をキャリヤー分子に結合する工程をさらに包含する、請求項１９ に記載の方法。
24. ２４．身体へ移植するために不活性基質に前記物質を結合する工程をさらに包含 する、請求項１９に記載の方法。
25. ２５．前記物質と、患者に投与するために受容可能な薬学的キャリヤーとを組み 合わせる工程をさらに包含する、請求項１９に記載の方法。
26. ２６．蛍光、放射および酸素標識の群から選択される検出可能な標識で、前記物 質を標識する工程をさらに包含する、請求項１９に記載の方法。
27. ２７．インビボにおける半減期を増大させるために、前記物質を化学的に改変す る工程をさらに包含する、請求項１９に記載の方法。
28. ２８．前記キャリヤーが、マイクロスフェア、マイクロカプセル、およびリボソ ームからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
29. ２９．前記炭水化物が、α１，３−フコシル化、α２，３−シアル化ラクトサミ ノグリカン構造、糖タンパク質、および炭水化物または糖タンパク質に対する抗 体からなる群から選択される、炎症応答を調節する、請求項１８に記載の方法。
30. ３０．前記炭水化物が、シアリルＬｅｘ、ジフコシルシアワルＬｅｘ、およびよ り長いポリフコシル化ポリアクトサミノグリカンからなる群から選択される、請 求項２９に記載の方法。
31. ３１．前記炭水化物が、ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａ１β１．４（Ｆｕｃα１．３） ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｒであり、そしてＲがタンパク質または他の炭水化物構造で ある、請求項３０に記載の方法。
32. ３２．前記炭水化物が、ＧＭＰ−１４０の単球および好中球への結合を阻害する 、請求項２９に記載の方法。
33. ３３．前記炭水化物が、ＥＬＡＭ−１の血小板および内皮細胞への結合を阻害し ない、請求項２９に記載の方法。
34. ３４．前記炭水化物が、ＧＭＰ−１４０およびＥＬＡＭ−１の結合を阻害し、Ｇ ＭＰ−１４０またはＥＬＡＭ−１の結合を実質的に阻害するのに有効な量の炭水 化物を投与する工程を含む、請求項２９に記載の方法。
35. ３５．前記炎症応答が、腫瘍に対するものであり、前記物質が、該腫瘍の転移を 阻害するのに有効な量で投与される、請求項１８に記載の方法。
36. ３６．セレクチンに結合する単離された炭水化物に対する抗体であって、該炭水 化物が、α１，３−フコシル化、α２，３−シアル化ラクトサミノグリカン構造 を含む、抗体。
37. ３７．前記炭水化物が、シアリルＬｅｘ、ジフコシルシアリルＬｅｘ、およびよ り長いポリフコシル化ポリアクトサミノグリカンからなる群から選択される、請 求項３６に記載の抗体。
38. ３８．前記炭水化物が、ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３） ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｒであり、Ｒがタンパク質または他の炭水化物構造である、 請求項３６に記載の抗体。
39. ３９．還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる１２０，０００ダルトンの分子量 を有し、０−グリコシル化のための複数の部位を有する、セレクチンに対するリ ガンドの単離されたタンパク質成分。
40. ４０．前記タンパク質がロイコシアリンである、請求項３９に記載のタンパク質 。