JPH05509330A - Gmp―140に対する糖タンパク質リガンド - Google Patents
Gmp―140に対する糖タンパク質リガンドInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
機能的に活性なセレクチンで誘導さするペプチド、およびGMP−140に対す
るリガンド
主息ヱどえ!
本発明は、一般に、GMP(40,ELAM(およびす7パ球ホーミングレセプ
ターを含むセレクチン類(Selectins)との結合反応をともなう炎症反
応の治療法と予防法に関する。
本発明は米国国立心臓、肺臓および血液研究所(NationalHeart、
Lung and Blood 1nstitute)の助成金によるもので
あるから、米国政府は本発明に権利をもっている。
血小板とリンパ球の血管表面への付着は炎症反応の重要な要素であり、かつ補体
系、凝血系および免疫系の同時におこる相互に関連する活性化を伴う一連の複雑
な反応の一部である。
トロンビンおよびヒスタミンのような「迅速」活性化因子に暴露された内皮は2
〜10分以内に好中球に対して付着性になるが、一方腫瘍壊死因子およびインタ
ーロイキン−1のようなサイトカイン類に暴露された内皮は、1〜6時間後に付
着性になる。迅速な内皮依存性のリンパ球の付着は、細胞表面での脂質媒介物血
小板活性化因子(PAF)の発現と関連があり、およびおそらくその他の内皮リ
ンパ球の表面レセプターの出現と関連がある。サイトカインで誘発される、内皮
のリンパ球に対するゆっ(すした付着は、少なくとも一部分は、内皮細胞レセプ
ターのELAM−1で媒介される。このELAM−1は内皮細胞がサイトカイン
類に暴露された後に合成され、次いで細胞表面に輸送され、そこで好中球を補足
する。ELAM−1の単離、特性決定およびクローニングについては< Bev
ilacquaらが5afe但硯243巻、1160〜1165頁、1989年
で概説している。末梢リンパ節ホーミングレセプターは、「ネズミMel14抗
原」、rLeu8J、r Leu8抗原」およびrLAM−IJとも呼ばれるが
、末梢リンパ節において高内皮性小静脈にリンパ球を結合させる好中球、単球お
よびリンパ球上の別の構造体である。このタンパク質の特性決定とクローニング
については、La5kyら、Ce1156巻、1045〜1055頁、1989
年(マウス)およびTedderら、L−シ」−111170巻、123〜13
3頁、1989年に概説されている。
GMP−140(顆粒膜タンパク質140)はPADGEMとして知られている
が、システィンに富んだ、強くグリコジル化された膜内存在性域タンパク質であ
り、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法(5DS−PA
GE)で測定した見かけの分子量は140.000である。GMP−140は、
MeEverとMartinが最初にヒト血小板から精製した(J、 Biol
、 Cem、 259巻、979g〜9804頁、1984年)。このタンパク
質は、S tenbergら(1985年)が報告しているように、休止血小板
のα顆粒中に存在しているが血小板を活性化してから迅速に細胞膜に再分布され
る。GMP−140が内皮細胞内に存在しこれらの細胞によって生合成されるこ
とは、McEvarら、L立回70(5) 5uppl 1:355a、 Ab
stract No、1274 (1987年)に報告された。内皮細胞中で、
GMP−140は、ワイベルパレイド(IFeibel−Palade)体とし
て知られている貯蔵顆粒に見られる。またGMP−140(PADGEMと呼ば
れている)は、活性化された血小板と、好中球および単球との相互作用も媒介す
ると報告されている(Larsenら、Ce1l 59巻、305〜312頁、
1989年10月およびHamburgerとMcEverSBi!2!2i7
5巻、550〜554頁、1990年)。
そのcDNA由来アミノ酸配列は、Johonstonら、廁■56巻、103
3〜1044頁、1989年3月24日および1989年3月8日出願の米国特
許出願第07/320.408号に報告されたが、独立して折り重なっているよ
うである多数のモジュールドメインを含有していることを示している。N末端か
ら始まって、これらのドメインは、1つの「レクチン」 ドメイン、1つのrE
GFJ ドメイン、補体結合タンパク質中のものと類似の9つの縦列共通反復構
造、トランスメンブランドメイン(分化スプライシングから得られる可溶性形を
除く)および細胞質テールを含有している。
血小板もしくは内皮細胞がトロンビンのような媒介物で活性化されると、貯蔵顆
粒の膜は原形質膜とともに溶解して顆粒性の可溶性内容物が外部環境に放出され
、膜に結合していたGMP−140が、数秒以内に細胞表面に提供される。GM
P−140が活性化された結果血小板および内皮細胞の表面に迅速に再分布する
というとは、この糖タンパク質が炎症もしくは血管の破裂の部位で重要な役割を
し得るということを示唆している。
ELAM−1、ホーミングレセプター、およびGNP−140はその構造と機能
が関連していることから「セレノチン類」と称されている。
血小板リンパ球の相互作用のインビボでの重要性はまだ綿密には研究されていな
い。しかし血管の損傷に応答して、血小板は、内皮下面に付着して活性化され凝
血を助けることが知られている。また血小板および他の細胞は、微生物の侵入を
防止するためにリンパ球を創傷内に補充するのに重要な役割を果たす。逆に、リ
ンパ球は、1ssekutzら、Lab、 Invest。
49巻、716頁、1983年に報告されているように、炎症部位の組織中に血
小板を補充する。
凝血と炎症の経路は、組織の損傷に応答して協調方式で調節される。例えば、活
性化された内皮細胞は、リンパ球に対して付着性になるのに加えて、その細胞表
面に組織因子を発現させ、それらの表面がトロンボモジュリンを発現するのを減
少させて、最終的に、細胞表面で凝血反応を起こり易くする。場合によっては、
単一のレセプターが、炎症と凝血のプロセスの両者に関与できる。
止血経路と炎症経路に関与するタンパク質は、ヒトの疾患の診断および治療を行
うのに重要である。しかしタンパク質を治療に用いるには多くの問題がある。タ
ンパク質は、患者に投与するのに十分であるように大量生産すると、通常は経費
がかかる。更に、タンパク質を患者に複数回投与した後そのタンパク質に対する
反応が起こり得る。従って、対象のタンパク質と同じかまたはより優れた活性を
有し、安価に合成可能で、再現性があり、比較的無害なペプチドを開発すること
が望ましい。また、インビトロとインビボの両方で用いて、セレノチン類の結合
作用を対象のタンパク質分子と同等に有効に調節することができて、かつ合成に
要する経費が少なく、より再現性が高く、反応を起こすことが少ないと考えられ
る炭水化物の分子を開発することが望ましい。
それ故に、本発明の目的は、GMP−140,ELAM(およびリンパ球ホーミ
ングレセプターを含むセレノチン類と相互に作用するペプチドを提供することで
ある。
本発明の他の目的は、GMP−140に対するリンパ球リガンドの構造に基づい
た構造を有し、GMI’−140性付着相互作用を阻害する炭水化物ベースの薬
剤を提供することである。
それ故に本発明の目的は、ELAM−1のような他のセレノチン類とは全く異な
るセレクチンである、GMP−140に対するレセプターの一部を形成する炭水
化物構造体を提供することである。
本発明の他の目的は、これらのペプチドおよび炭水化物構造体を用いてリンパ球
が内皮もしくは血小板に付着するのを抑制する方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、これらのペプチドおよび炭水化物構造体を用いて免疫
応答と止血経路を調節する方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、GMP−140,ELAM−1およびリン/4球ホ
ーミングレセプターに関する診断上のアッセイに用いる炭水化物およびペプチド
を提供することである。
λ肌立11
GMP−140のレクチン結合領域の3つの領域由来のペプチドは、GMP−1
40、ELAM−1およびリンパ球ホーミングレセプターを含む「セレクチン類
」と選択的に相互に作用することが見い出されている。この3つの領域は、上記
ペプチドに含有される残基の番号にしたがってアミノ酸番号19〜34.54〜
72および66〜89を含有している。なお残基1は、シグナルペプチドを切断
した後の前記成熟タンパク質のN末端と定義する。該ペプチドは、長さが5〜8
アミノ酸の短いものであり、標準的な技法で容易に調製することができる。
GMP−140と結合する、フコシル化シアル化(Sialyated)ラクト
サミン構造体も発見されている。この構造体は、α(2,3)シアル酸で置換さ
れたラクトサミングリカン類を含有する受容体を改変できるα(1,3)フコシ
ルトランスフェラーゼ類を発現させることによって生成される。骨髄性細胞には
存在するがリンパ球もしくは赤血球の細胞には存在しない共通の三糖構造体であ
るLe’すなわちGalβ1.4(Fuca1.3) GlcNAcβ1−R(
式中Rはタンパク質もしくは他の炭水化物構造体)が、上記シアル酸化構造体の
コアを形成している。実際の構造体はシアリルLeXすなわちNeuAca 2
−3Galβ1−4(Fuca 1.3)GleNAc−Rであってもよい。他
の可能な構造体には、ジフコシルシアリルL eXsすなわちより長いポリフコ
シル化ポリアクトサミノグリカン(polyfucosylated poly
actosaminoglycan)または類縁の変異体が含まれる。これらの
構造体のいくつかは、種々のアフィニティ一度でGMP−140に結合できる。
実施例は、これらのペプチドが好中球に結合してGMP−140が好中球と結合
するのを阻害し、+C6θ(好中球が固定されたGMP−140に付着するのを
50%まで阻害するのに必要な投与量)が50から300マイクロモルの範囲内
にあることを実証している。
その結合親和性は、EGFドメイン由来配列と、このEGFドメインとレクチド
メインの両方に結合する二価のカオチンを用いて調節することがでいる。全セレ
クチン類または個々のセレクチン類、特にGMP−140の結合を阻害するこれ
らのペプチドの変異体をスクリーニングするのに有用なアッセイも示しである。
特異的グリコジルトランスフェラーゼでトランスフェクトされたチャイニーズハ
ムスター卵Jl! (CIO)細胞系を用いる実施例によって、GMP−140
に対するオリゴ糖リガンドがシアル化フコシル化構造体であり、そのシアル酸の
結合がGa1へのα2.3結合であり、およびフコースの結合はGlcNaeへ
のα1,3結合であり、そのGlcNacにGalがβ1.4結合で結合してい
ることがN認されている。
シアリルLex、 ジフコジルシアリルLex、またはより長いポリフコモル化
ポリアクトサミノグリカン変異体(合成で製造するかまたは遺伝子工学で作製し
た細胞内で発現させる)を含む本発明のペプチドもしくは炭水化物の構造体は、
診断用薬として有用であり、かつ適切な医薬用キャリヤーを組合わせて凝血過程
もしくは炎症過程を調節もしくは阻害する臨床の適用に有用である。また本発明
のペプチドと炭水化物は、そのアミノ酸を化学的に改変するかまたはキャリヤー
分子もしくは不活性基質に結合させることによって、改変してインビボでの半減
期を増大することができる。またこれらの構造体に対する抗体も、診断用薬とし
て、および凝血もしくは炎症のプロセスの調節に用いる医薬として有用である。
の な! d
図1は内皮細胞GMP−140のヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列である。
読取り枠の翻訳アミノ酸配列は、−文字コードで示しである。終止コドンは星印
で示している。細い下線は、血小板GMP−140のN末端を含むN末端から2
6のペプチドから決定したアミノ酸配列の一致している位置を示す。シグナルペ
プチドは−41から−1の位置に相当する。推定トランスメンプラントドメイン
には太い下線をつけである。システィン残基は丸で囲み、アスパラギンが連結し
た潜在的なグリコジル化部位(NXS/T)は黒丸で示しである。3′未翻訳領
域における2つの潜在的なポリアデニル化シグナルには上側と下側に線をつけで
ある。
図2は、 GMP−140のレクチンドメインである、アミノ酸66−78(三
角印)、アミノ酸73−83 (四角印)、アミノ酸54−63 (丸印)およ
びアミノ酸23−30 (黒丸印)が、ペプチドによって結合が阻害されるのを
、ペプチドのmMの値に対して結合した細胞の数を比較して実証したグラフであ
る0図3AおよびBは、次のようなマイクロタイターウェルへの好中球の特異的
付着性を比較した図であり、すなわち、(1)ペプチドをコートしていないウェ
ル; (2)KHLに結合されたレクチンドメインペプチド19−34をコート
したウェル;または(3)KLHに結合された対照のカルボキン末端ペプチド(
アミノ酸残基761〜777)をコートしたウェル;をヒト血清アルブミンを含
有するハンクスの平衡塩類溶液で遮断したのちに、各ウェル毎に液相競合体の存
在下2X105の好中球を添加して比較した。
ウェルに入れる前に好中球に添加した液相競合体は次の通りである。図A;金含
有ず(黒バー印)、精製血小板の糖タンパク質Irb−nIa(斜線バー印)、
または精製GMP(40C点彩パー印);ならびに図B;金含有ず(黒バー印)
、1.5mM C末端ペプチド761−777 (斜線バー印)および1.5
曹Mレクチンドメインペプチド19−34 (点彩バー印)である。
図4A−Dは、トランスフェクトされた野生梨のCHO細胞と、■L60細胞に
対するGMP−140の結合性を、ウェルをコートするのに使用したGNP−1
40の濃度(ug GMP−140/+il)、Ca2”の存在もしくは非存在
、およびノイラミニダーゼ処理の関数としてCPMS I Crとして測定した
結果を示すグラフである。図4AはCHOのGMP−140に対する結合性を示
す[CHO+Ca” (四角印) 、CHO−Ca2゛(黒ひし形印)];2図
4はLec8C)10のGMP−140に対する結合性を示す[Lec8+ C
a” (四角印) s Lec8−LeeCa2″(黒ひし形印)];2図4は
ネオルイス(Neo Levis) CHOのGMP−140に対する結合性を
示す[ネオルイス+Ca” (四角印)、ネオルイス、ノイラミニダーゼ(黒ひ
し形)、およびネオルイス、EDTA (黒画角印)コ;ならびに図4Dは、l
1lL60細胞のGMP−140に対する結合性を示す[HL60+Ca” (
四角中) 、 +IL60、/イラミニダーゼ(黒しひ形印)およびHL60、
EDTA (黒画角印)]。
図5は、ネオルイスCHO細胞の固定化GMP−140への結合性に対するモノ
クローナル抗体の作用を示すグラフであり、対照(黒色バー)の結合χを対照と
して、G1抗体(///印)、Si2抗体(江廿印)およびEDTA C///
印)それぞれの存在下での結合性を%で示したグラフである。
図6は、可溶性のELAM−1もしくはGMP−140によって結合される、ト
ランスフェクトされたCO3細胞を示すグラフである[対照および以下の阻害剤
の存在下: ELAM−1なし、GMP−140、および1118/7 (EL
AM−1の結合を阻害するがGMP−140の結合を阻害しない);ならびにG
MP−1,40なし、GMP、およびG1の場合について示す。コ
図7は、トランスフェクトされたCO3細胞が結合したPMS細胞とHT−29
細胞(これらの細胞はシアリルLexを発現する)を示す(x 10−’)グラ
フである。すなわち対照、 ELAM−1のみの場合と、さらにELAM−1に
よる結合を阻害するがGMP−140による結合を阻害しないH18/7抗体が
存在する場合;およびGMP−140のみの場合と、さらにGMP−140によ
る結合を阻害するがELAM−1による結合を阻害しないG1抗体が存在する場
合について示す。
図8は、ネオルイスCHO細胞の固定化GMP−140への結合性に対するトリ
プシンの作用を示すグラフであり、対照(黒色バー)の結合性を100%とした
場合の、トリプシンによる処理時(///印)およびEDTAの存在下(細いバ
ー印)での結合性を%で示したグラフである。
発明の詳細な説明
GMP−140の構造と生合成法を詳細に分析した。GMP−140の全アミノ
酸配列を、精製された血小板GMP−140由来のペプチドフラグメントのタン
パク質配列決定の結果を組み合わせ、ヒト内皮細胞のcDNAライブラリーから
GMP−140をコードするcDNAをクローニングすることによって決定した
。GMP−140は、その構造と機能の研究に基づいて、好中球に対するレセプ
ターとして作用し、かつ補体タンパク質C3bおよび抗凝血性補因子のプロティ
ンSと相互に作用する。
GMP−140のcDNAとアミノ酸配列GMP−140に対する遺伝子のクロ
ーニングは、G、 [、Johnston。
R,G、 CookおよびR,P、 McEverが初めてAbstract
12385uppt+aent II C1rculation 78(4)
(1988年10月)に報告している。オリゴヌクレオチドを、GMP−14(
lのペプチドのN末端アミノ酸の配列決定結果に基づいて調製して、ヒト内皮細
胞のcDNAライブラリーをスクリーニングするのに使用した。727のアミノ
酸からなるタンパク質をコードする3、Okbのクローンを単離した。
多くのシスティン、リシンおよびチロシンを含有する118の残基からなるN末
端ドメインは、アシアロ糖タンパク質のレセプターに類似しているが、このN末
端ドメインに、EGI!の反復ドメイン構造と、各々62のアミノ酸からなる8
つの縦列反復構造(ただし6番目の縦列反復構造のみ7Qのアミノ酸で構成され
ている)とが続いている。これらの反復構造は、C3bとC4bを調節するタン
パク質を含むタンパク質類のファミリーに見いだされる反復構造と相同であるが
、1反復構造当り6つの保存システィンを含有し、これは一般に4つの保存シス
ティンを含有しているのと異なる独特の構造である。これらに対して、24のア
ミノ酸のトランスメンプラン領域と35のアミノ酸の細胞質テールが続いている
。同じ遺伝子の転写体、可溶性形と膜または顆粒結合形を選択的にスプライスす
ることによってもたらされる少なくとも2つの形のタンパク質、が存在するよう
である。
内皮細胞GMP−140の予測アミノ酸配列(図1に示す)には、6つの異なる
構造ドメインが存在することを示唆している。これらの領域の1つは、C端末の
近くにある24残基の疎水性セグメントであり、メンプランスパニングドメイン
の特徴を有する。そのタンパク質の大部分はこのドメインのN末端側に位置し、
細胞質外に存在しているようである。すなわち分泌顆粒のルーメンに体面してい
るが、または細胞が活性化された後、細胞外環境に暴露される。
N末端から始まる第1のドメインは41の残基(図1に−41から−1の標職を
つけて示す)を含有し、シグナルペプチドの特徴を有する。これらの残基中には
いくつかの正の電荷を有するアミノ酸を含有し、次いで疎水性ドメインが続き、
次に極性残基が多い領域が続いている。−3および−1の位置に見られる電荷を
もっていない小さな残基は、シグナルペプチドゼによって開裂される部位に見ら
れる一般的な残基である。その上=
に、血小板GMP−140のN末端のアミノ酸配列は、残基1から27の27個
の位置のうち25個が内皮細胞の推定配列に一致している。
シグナルペプチドに続いて、翻訳されるcDNA配列によって、789の残基で
構成された成熟タンパク質が予測される。血小板GMP−440ペプチドの配列
を内皮細胞の推定配列とを比べると、341の帰属アミノ酸のうち337が一致
することが分かったが、このことは、療法の細胞型が同じタンパク質を合成する
ことを示唆している。
共通配列NxS/Tを有する、12の潜在的アスパラギン連結グリコジル化部位
がある。これらはすべて分子の細胞質外の部分に位置しており、かつ血小板GM
P−140の炭水化物の組成に基づいてグリコジル化されているようである。そ
の成熟タンパク質は、全アミノ酸の8%を占める65のシスティンを含有してい
る。これらの大部分はジスルフィド架橋で組繊化されていると予測されるが、そ
の理由は、ヨードアセトアミドで処理しり非還元GMP−140の試料中にごく
少量のカルボキシメチルシスティンを同定できるからである。
第2のドメインは残基1から始まり、その成熟タンパク質の最初の118のアミ
ノ酸が含まれる。この領域は、リシン(12%)、チロシン(10%)、アスパ
ラギン(13%)およびトリプトファン(6%)の残基を豊富に含有している。
GMP−140のこの領域は、このモチーフを有するタンパク質の多(が炭水化
物を結合するので「レクチンドメイン」と称される。
第3のドメインは残基119から始まり、6つのシスティンを含有する40のア
ミノ酸の配列を有する。GMP−140のこの領域を、NBRFのデータベース
の配列と比較すると、同じシスティンの配列を含有する多数のタンパク質がある
。このモチーフで報告された最初のタンパク質は上皮増殖因子(EGF)前駆物
質であり、10の相同コピーを含有している(Grayら、Nature 30
3巻、236〜240頁、1983年H5cottら、Nature 221巻
、236〜240頁、1983年)。
第4のドメインは残基159から始まり、各々62のアミノ酸を含有する9つの
縦列共通反復構造で構成され、その上に、8つの残基と4つの残基の延長部分が
それぞれ7番目と9番目の反復構造の末端にみとめられる。このドメインの境界
部は、最初の反復構造の最初のシスティンと推定トランスメンブランドメインの
前の最後の残基とともに任意に設定される。共通配列により、9つの反復構造の
うちの少なくとも5つで多数のアミノ酸が生成することが分かる。すべての反復
構造が6つの保存システィン、3つのグリシン、および1つずつのトリプトファ
ン、フェニルアラニン、プロリン、およびロイシンを含有している。そのンステ
イン残基は、rEGFJ ドメインに見られる6つのシスティンとは異なるモチ
ーフで配列されている。その反復構造は、互いに、アミノ酸レベルで31%かう
56%同一テあり、ヌクレオチドレベルで42%から62%同一である。反復構
造間の配列を最大にするのにギャップを必要としない。
第5のドメインは残基731から始まる24残基の推定トランスメンブランドメ
インである。この第5ドメインに続いて第6ドメインがあり、この第6ドメイン
は、高電荷を有するいくつかの残基で始まりそのタンパク質のC末端の残基78
9で終わる35残基の推定細胞質セグメントである。セリン、トレオニンおよび
チロメンの残基、ならびに翻訳後に修飾されるかもしれないシスティンには、ホ
スホリル化されうる部位がある。
2つの異なる枠内欠失部(in−frame−deletion)が、詳細に試
験された4つの内皮細胞クローンの配列中に同定される。第1の欠失部は186
bpである。この欠失によって、第7の共通反復構造から62のアミノ酸が除か
れ、9つの反復構造の代わりに8つの反復構造を含有するタンパク質が予測され
る。第2の欠失部は120bpであり、第9の反復構造の末端の直後の40のア
ミノ酸を除去されている。欠失した領域は、トランスメンブラン領域と、細胞質
領域の最初のい(っかの残基を含んでいる。
C末端における残りの28の残基は第9の反復構造の直後に続くと予測される。
親水性を示す図(5teとDoolittle%J、M(江」包L157巻、1
05〜132頁、1982年)は、この形態のGNP−140が可溶性であるこ
とを予報している。
GMP−140は、血小板および内皮細胞に存在するレセプターであり、好中球
と単球の表面リガンドに結合して炎症過程を促進することが実証されている。
GMP−140は、リンパ球が活性化された内皮細胞および血小板に付着するた
めのレセプターとして働(という結論は、本来次のようないくつかの観察結果に
基づいてなされた。すなわちトロンビンもしくはヒスタミンで刺激された内皮の
表面のGMP−140の迅速な出現が、これらのアゴニストによって刺激された
内皮への好中球の誘発性付着と平行して起こることiGMP−140の細胞表面
への再分布を起こすトロンビンのようなアゴニストで血小板を刺激した後だけ起
こり、ADPのような血小板アゴニストでは起こらない、好中球もしくは単球と
血小板との相互作用;リンパ球が内皮を通過して組織へ移行する前に内皮に結合
する主要な部位である後毛細血管静脈におけるGMP−14(lの濃度;組織培
養マイクロタイターウェルにコートしたGMP−140に対する精製された好中
球の特異的付着;ヒスタミンによって刺激された培養ヒト謄静派内皮細胞への好
中球の付着の60〜90%がGMP−140に対するポリクローナル抗体で阻止
されること; GMP−140のcDNA由来アミノ酸配列が、ELA、M−1
、好中球に結合することがすでに知られている内皮細胞タンパク質、およびリン
パ球ホーミングレセプターのアミノ酸配列に相似していることである。続く研究
によって、Ca”の存在下、GMP−140はまた刺激された血小板への好中球
の付着を媒介するが、刺激されていない血小板については媒介しないことが実証
さレタ。血小板の好中球への結合は、GMP−140に対するモノクローナル抗
体および精製されたGMP−140によって阻害された。
他の研究によって、GMP−140が、補体系タンパク質であるC3b、および
抗凝血性補因子タンパク質であるプロティンSに結合することが実証された。G
MP−140は、血漿タンパク質のC4b結合タンパク質(C4bp)と配列相
同性を共有しており、このC4bpは血漿タンパク質C4bと相互に作用するの
みならずプロティンSと相互に作用する。
GMP−140由来のペプチドが、診断用薬として有用であり、およびワンバク
球がGMI’−140を認識するのを阻止できるペプチドの治療上の有効量を患
者に投与して患者の止血応答と炎症応答を調節するのに有用であることが発見さ
れたのである。
また、他のタンパク質、特にELAM−1およびそのホーミングレセプターのレ
クチンドメインと相同性のGMP−140のレクチンドメイン内のペプチド配列
は、好中球が精製されたGMP−140に付着するのを選択的に阻害するので、
患者およびこれらの分子による結合性の変化を特徴とする疾患の診断上のアッセ
イ、ならびにこの結合を変化させる化合物のスクリーニングアッセイに用いるこ
とができ、および凝血および/または炎症の過程を伴う、リンパ球と、血小板も
しくは内皮細胞との相互作用を抑制もしくは調節するのに臨床上有用に違いない
ことが発見されたのである。
GMP−140のcDNA由来の一次構造によって、血管系におけるGMP(4
0の機能についていくつかのことが分かる。最も注目すべき観察結果は、GMP
−140が、血管細胞にみられ最近クローニングされた2つの他のレセプターと
構造が著しく類似していることである。
これらの類似したレセプターの第1のものはELAM−1である。
ELAM−1は未刺激の内皮中には存在しない内皮細胞タンパク質である。しか
し、内皮が腫瘍壊死因子またはインターロイキン−1のようなサイトカイン類に
暴露されると、ELAM−1の遺伝子が転写されてRNAを産生じ、次いでその
RNAはタンパク質に翻訳される。その結果、ELAM−1はタンパク質に翻訳
される。
その結果、ELAM−1は、Bevi 1acquaら、Proc、 Natl
、Acad、 Sci、 USA 84巻、9238〜9242頁、1987年
に記載されているように、サイトカイン類に暴露されてから1−4時間後に内皮
細胞の表面に発現される(顆粒内に貯蔵されて活性化後数秒以内に細胞表面に現
れるGMP−140とは異なる)。ELAM−1は、好中球が、サイトカインで
処理された内皮に付着するのを媒介することが判明し、従って、リンパ球をサイ
トカインで刺激された内皮を通過させて組織中へ移行させるのに重要であるらし
い。ELAM−1の一次構造は、ELAM−1が「レクチン」 ドメイン、EG
Fドメインおよび補体調節タンパク質の反復構造に類似の6つの反復構造(GN
P−140の9つの反復構造の代わりに)、トランスメンブランドメイン、およ
び短い細胞質テールを含有することを示している。GMP−140とELAM−
1間には、両方のタンパク質を通じて広範囲の相同配列が存在するが、その相似
性がレクチンドメインとEGFドメインにおいて特に顕著である。
GMP−140に構造全体が類似している第2の分子は、リンパ球に見出される
ホーミングレセプターである。ホーミングレセプターは、高内皮性細胞もしくは
高内皮性細胞脈と呼ばれる、リンパ組織中の特殊な内皮細胞にリンパ球を結合さ
せるリンパ球表面構造体である( YednockおよびRose%Advan
ces in 11朋11■44巻、F、 1. Dixonil集、313〜
31B頁、Academic Press、 New York、1989年に
概説されている)。この結合によって、リンパ球は内皮を通過してリンパ組織に
移行し、そこで処理された抗原に暴露される。そのリンパ球は次にリンパ系を通
じて血液中に再び入る。そのホーミングレセプターは、レクチンドメイン、EG
Fドメイン、2つの補体結合性反復構造、トランスメンブランドメイン、および
短い細胞質テールを含有している。このホーミングレセプターも、特にレクチン
ドメインおよびEGFドメインが、GMP−140と広範囲の相同配列を共有し
ている。
GMP(40、ELAM−1およびこのホーミングレセプター(LEU−8)そ
れぞれのレクチンドメイン間の比較を表Iに示す、これらの配列相似性に基づい
て、好中球がGMF−140に結合するのを阻害するペプチドであって、ELA
M−1、そのホーミングレセプター、および他の相同セレクチン類が炎症過程の
成分に結合するのを阻害するか、または逆にGMP−140の結合だけを阻害す
るペプチドを選択することが可能なはずである。
GMP−140に結合スるフコシル化シアル化ラクトサミン構造体を発見された
。この構造体は、α(2J)シアル酸置換うクトサミノグリカンを含有する受容
体を改変することができるα(1,3)フコシルトランスフェラーゼを発現する
ことによって生成することができる。骨髄細胞に存在するがリンパ球もしくは赤
血球細胞には存在しない共通の三糖構造体であるLe’″すなわちGalβ1.
4(Fueα1.3)GIcNAcβ1−R(式中、Rはタンパク質もしくは他
の炭水化物構造)は、上記のシアル化構造のコアを形成している。実際の構造は
シアリルしexsすなわちNeuAcαて、GMP−140のりガントへの結合
をインビボで操作することが可能である。単一の分子に結合した多数のシアル化
フコシル化ラクトサミンを使用すれば、天然のリガンド以上に、人工の分子に対
してGMP−140の親和性を増大させることができる。
以下の実施例によって上記の結論をもたらした物質、方法および試験結果をさら
に説明するが本発明を限定するものではない。
実施例1 : GMP−140のレクチンドメイン由来のペプチドによる、好中
球の固定化GMP〜140への結合の競合阻害の証明。
分子内部に引っ込んでいると予想される2つの疎水性ストレッチを除いて、レク
チンドメインの118個の残基のほとんどすべてにまたがる一連のペプチドを合
成することにより、GMP−140レクチンドメインの役割をテストした。また
、レクチンドメインにつづ< EGF様ドノドメイン6個の残基)を含むペプチ
ドをも合成した。また対照として、分子の共通反復構造、トランスメンプラン領
域、およびC末端(細胞質テール)のうちのひとつから、ペプチドを得た。レク
チンドメイン由来の活性ペプチドを表Iに示す。表Iはまた、ELAM−1およ
びホーミングレセプターであるLEU−8のレクチンドメインの関連する配列の
配置をも示す。t−Boaの化学的特性を利用したAppliedBiosys
tems Model 430A自動ペプチド合成機か、または、F+++oc
の化学的特性を利用したDupont RAMPS手動ペプチド合成機かのいず
れかで、ペプチドを調製した。合成が行われた樹脂からの開裂後、逆相高性能液
体クロマトグラフィーにより、すべてのペプチドを精製した。
プラスチックウェル上に固定化された精製GNP−140への好中球の付着を阻
害する、ペプチドの能力を調べるために、Gengら、hムR343,757−
760(1990)に記載のアッセイを用いて、ペプチドをスクリーニングした
。
Flow Laboratories&!Mono−Poly分離媒体における
密度勾配遠心分離法により、ヒト好中球をヘパリン処理した全血から単離する。
好中球懸濁液は、98%より高い純度およびトリパンブルー排除法による95%
より高い生存度を有する。付着アッセイツタめに、好中球を、5諺g/■lヒト
血清アルブミン(■BSS/H3A)と共に1.26 mM Ca”および0.
81 mM Mg2°(HBSS、 Gibco)を含むハンクス平衡塩類溶液
中に、2 x 10’細胞/mlの濃度で懸濁する。付着アッセイを、Corn
ing製96ウエルマイクロタイタープレートにおいて3回行い、様々なタンパ
ク質溶液50マイクロリフドルを用いて4℃で一晩インキコベートする。
以下のように、抗体512−セファロースT″でのイムノアフィニティークロマ
トグラフィーおよびMono−Q”カラム(FLPC,Phar+5acia
Fine Chemicals)でのイオン交換りO?トゲラフイーにより、G
MP−140をヒト血小板溶解産物から単離する。
血液銀行から得て4℃で貯蔵した使用期限の過ぎたヒト血小板パック(100ユ
ニツト)をプールし、pEl、5の5 mM EDTAに調整し、1リツトルボ
トル中で30分間、4.00Orpmで遠心分離する。次いで、0.1 M N
aCl、 20 mMトリス pEl 7.5 (TBS)、S−20を含むH
BSSで3回洗浄し、HBSSで1回洗浄する。細胞(ウェル毎にZ x 10
5個)をウェルに添加し、22℃で20分間インキコベートした。次いで、ウェ
ルをHBSS/HSAで満たし、アセテートテープ(Dynatech)で密封
し、5分間150gで遠心分離してひっくり返した。非付着細胞および上澄みを
廃棄した後、各ウェルの含有物を、Sigma製0.5z臭化ヘキサデシルトリ
メチルアンモニウムの50膳Mリン酸カリウム溶液pH6,0,Zooマイクロ
リットルを用いて可溶化し、Leyら、1lfl!1i73.1324−133
0(1989)に記載のように、ミエロペルオキシダーゼ活性についてアッセイ
する。結合した細胞の数を、ミエロペルオキシダーゼ活性対細胞の数の標準曲線
から導き出した。すべてのアブセイ条件下において、細胞は、全ミエロペルオキ
シダーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼの5%未満を放出した。結果を表Iに示す
。負の対照としてのC末端ペプチド(GNP−140のアミノ酸残基761−7
77)の存在下で、10ozの付着が見られ、この値は、細胞にペプチドも抗体
も添加されない対照の場合と同じである。5%という値は特異的付着の95%が
阻害されたことを意味するので、阻害を、より低い付着率と解釈する。
GMP−140のEGFドメイン由来のペプチドは、どれも付着を阻害しなかっ
た。しかし、レクチンドメインの3つの非隣接領域由来のペプチドは、付着を阻
害した。そのレクチンドメイン由来の3つの領域とは、アミノ酸19から34、
アミノ酸54から72、アミノ酸73から89、およびアミノ酸66−78の重
複ペプチドである。アミノ酸は、ペプチドに含まれる残基の数に基づいて番号付
けられ、残基1は、シグナルペプチドの開裂後の成熟タンパク質のN末端と定義
づけられる。
現在、活性を有することが知られている、これらの配列に由来する最も短いペプ
チド配列は、それが由来するレクチンドメインの面積にある程度依存して変化す
る、8個から13個のアミノ酸の範囲にある。より短いペプチドのいくつかは、
より長いペプチド配列よりも高い活性を有する。この時点で特徴づけられる最も
短い活性ペプチドは、レクチンドメインアミノ酸23から30であり、レクチン
ドメインアミノ酸19から34由来のものである。このペプチドは、ELAM−
1中の単一のアミノ酸の違いを除いて、GMP−140、ELAM−1、および
ホーミングレセプターの間で同一であり、従って、3個のセレクチンすべてによ
って媒介された細胞−細胞接触を阻害する。現時点で周知の、レクチンドメイン
アミノ酸54から72由来の最も短い活性ペプチドは、アミノ酸54から63で
ある。現時点で周知の、レクチンドメインアミノ酸7g−89由来の最も短い活
性ペプチドは、アミノ酸73から83である。さらに、アミノ酸66から78に
またがる重複ペプチドは、非常に活性が高い。アミノ酸66から83にまたがる
領域から、2つの、活性があってより短い、非重複ペプチドを設計することが可
能であり得る。
表工に示すように、これらの領域のいくつかは、他の領域よりも、セレクチンの
間でより高度に保存されている。その結果、全セレクチンを含む、相互作用を調
節するための高度に保存された領域由来のペプチドを用いること、およびGMP
−140のみを含む、相互作用を調節するためのセレクチンの間でより低い程度
で保存されている領域からのペプチドを用いることが可能である。例えば、レク
チン領域19−34(残基23−30)の中心コアは、3つの分子の間で非常に
高度に保存されている。対照的に、レクチン領域54から72由来のアミノ酸配
列54から60は、セレクチンの間で多くの違いを有する。
(以下余白)
一〇
表I : GMP−140のレクチンドメイン、ELAM−1、およびLEU−
8の比較、そして、GMP−140由来ペプチドの存在下における、GMP−1
40への好中球の結合率。
クンバフ“良/へ゛1°ナビ 1ミノ シ叉 車呑令外119−30 −−−−
−−−−−−−− 12t23−34 30士
21−コQ 20&
GMP−140RKN’N’KTW TWVGTKKALT NE54−63
−−−−−−−−−− 1’3t54−58 −−−−− 1.081
59−63 1.02に
54−60 −−−−−−− 6:1t表!続き。
ワン1%’7 ’l/ 八’ 7°ナト イミl う支 朱百令Pa、固定化G
MP−140に結合した細胞の数を、Gengら、狂m■343ニアS’l−1
60(1990)に記載のように決定した。対照C末端ペプチド(残基761−
777)の存在下において結合した細胞の数を10ozに樟準化した。この値は
、ペプチドを含まないときに観察されたものと同一であった。ペプチドによる付
着の阻害は、100%よりも大幅に低い付着値により示される。例えば、5工と
いう値は、対照において見られる付着が95%阻害されたということを示す。す
べてのペプチドを加えて、1.5 +iMという最終濃度にした。
実施例2 : GMP−140のレクチンドメイン由来のペプチドによる、固定
化GMP−140へのモノクローナル抗体の結合の競合阻害の証明。
実施例1は、GMP−140のレクチンドメインの3つの領域由来のペプチドが
、表面に固定化されたGMP−140に対する好中球の結合を阻害するというこ
とを示す。そのペプチドがまた、固定化GMP−140に対するモノクローナル
抗体の結合をも阻害するかどうかを決定するための研究も行った。
GMP−140に対する好中球の付着をブロックする3つのモノクローナル抗体
(+*Ab)を発生させ、G1.G2、およびG3と命名した。
精製タンパク質を用いた競合ELISAに基づいて、G1、G2、およびG3は
各々、異なる、または部分的に重複したエピトープを認識する。1.5■Mペプ
チドを、2.5マイクログラム/議lの濃度でビオチニル化iAbに添加し、次
いで、得られた物質を、実施例1に記載のように、GNP−140を含むウェル
に添加した。結合を、アビジン検出システムを用いたEIjSAにより測定した
。
モノクローナル抗体を、以下のようにビオチニル化した。
0.5mlの精製[gG抗体(PBS中に1■g/■L pH7,4)に、3.
2鵬MN−ヒドロキシスクシンイミドビオチンのジメチルスルホキシド溶液50
μlおよびI M NaHCOz 50μlを添加した。室温で2時間、暗所で
インキュベートした後、50μmのIM NHaCLにより反応を停止した。次
いで、PBS中で平衡させたPD−10カラム上でゲル濾過して、ビオチニル化
抗体を他の成分から分離した。EL[SAを以下のように行った。全工程を室温
で行った。
1.5■Mペプチドを有するまたは有さない、ビオチニル化抗体(2,5μg/
ml)を、実施例1に記載のように、GMP−140により分属する。
実施例4:ペプチドの改変およびGMP〜140への付着力の比較いくつかの場
合においては、インビボで分子の半減期を増大させるために、アミノ酸自身の変
更、またはキャリヤー分子への付着により、ペプチドを改変することが必要であ
る。
Pierce Chetfcalsから市販されているInjectキプトのよ
うな標準的な手順を用いて、レクチンペプチド19−34を、そのN末端システ
ィンにより、キャリヤータンパク質キーホールリンペブトヘモシアニンに結合し
た。次いで、このペプチド−にLE[複合体を実施例1に記載のアッセイでテス
トし、結合した細胞の数を決定した。
図3Aおよび図3Bは、(1)ペプチドをコートしていない、(2)rHLに結
合したレクチンドメインペプチド19−34をコートした、または(3)KLH
こ結合した対照カルボキシ末端ペプチド(アミノ酸残基761−777)をコー
トした、マイクロタイターウェルに対して行われ、液相競合体の存在下において
、各ウェルに2x105個の好中球を添加する前に、ヒト血清アルブミンを含む
ハンクス平衡塩類溶液によりブロックした、好中球の特異的付着を比較したもの
である。ウェルに入れる前に好中球に添加した液相競合体は、皆無(対照)、精
製血小板糖タンパク質11b−111a (対照)、または、精製GMP−14
0(パネルA);あるいは、皆無(対照)、1.5+iMC末端ペプチド761
−777 (対照)、1.51Mレクチンドメインペプチド19−34 (パネ
ルB)であつた。
グラフより、レクチンペプチド−KHL結合体は、プラスチック上に固定化され
た場合は、天然のGMP−140はど効果的ではないが、好中球の付着を直接支
持するということが明白である。
比較のために、ウェルに200,000個の好中球を添加した時、レクチンペプ
チド19−34は40.000個を結合し、GMP−140はtzo、o。
0個を結合した。単にプラスチックへのペプチドのコートを促進するために、ペ
プチドをKLHにカップリングする。液相精製GMP−140およびレクチンペ
プチド19−34を用いるが、他のタンパク質またはペプチドを用いない、付着
に関する競合能力は、付着が特異的であるということを示す。他の研究において
は、レクチンドメインの他の領域、EGFドメイン、およびGMP−140の散
在した他の領域の多くのペプチドは、固定化GMP−140に対する好中球の付
着を阻害しない。
(以下余白)
実施例5:酵素消化によるGMP−140に対する「リガンド」または「カウン
ターレセプター」の特性付はレクチン19−34ペプチドは、GMP−140の
白血球との相互作用をブロックする3つのモノクローナル抗体すべてがGMP−
140と結合するのを妨げる。これにより、白血球の認識におけるレクチンドメ
インの重要性がさらに証明される。このデータから、レクチンドメインのコンフ
ォメーシヲンがEGFドメインと相互作用することにより調節され、これらの相
互作用は次に、レクチンドメインおよびEGFドメインの両方に結合し得る二価
カチオンにより調節されることが仮定される。この結果、好中球および単球上の
レセプターに結合する親和性および特異性を付与する3次元フンフォメーション
のレクチンドメインが得られる。
好中球を単離し、Ca”/Mg”がないHBSSにIB/s+1のHSAおよび
1+mMのCa2°を補充した(■BSS/HSA/Ca)中に4X10’/I
IIとなるように懸濁し、使用するまで4℃で保存した。
好中球をトリプシンまたはエラスターゼのいずれかのプロテアーゼで処理して、
このレセプターがプロテアーゼ感受性タンパク質成分を含有しているかどうかを
決定した。E[BSS/10a+M MOPS、 pH7,5(HBSS/MO
PS)中に懸濁した好中球を、2mMのジイソプロピルフルオロホスフェート(
DFP)で22℃で10分間、2回処理して、内因性血清プロテアーゼを不活性
化した。次ニ細胞をHBSS/MOPSで洗浄し、8分の1容量の8%バラホル
ムアルデヒドで22℃で30分間、固定して、次に、8分の1容量の0.5Mグ
リシン10.25Mトリス、pi(7,5を加えた。固定したFIBSS/MO
F’S中の好中球(7,5xlO’/+*l)をTPCに一トリプシン(0,7
7MM、4IU/ml)と−緒に10分間、またはエラスターゼ(40MM、
7.llU/ml)トー緒に30分間、37℃でインキユベートした。コントロ
ール細胞をDFPまたは緩衝液のみで予め不活性化した同一濃度の酵素と一緒に
同一の条件下でインキユベートした。インキュベーション期間の後、DFPを加
えて2dとし、細胞を400gで5分間ペレット化した。細胞をHBSS/MO
PSで再懸濁し、ざらにDFPを加えて2mMとした。400gで5分間遠心分
離した後、細胞ベレットをHBSS/ヒト血清アルブミン(HSA) /Ca中
に4xlO6/+*1となるように再懸濁し、[’ 25[]GMP(40の特
異的結合を決定した6 0.15M NaC1,SO+*Mアセテート、pH6
,0、Long/+*I HSA、 9mM CaCl2.0.05%アジ化ナ
トリウム(消化緩衝液)中にDFP処理して固定した好中球(1,6XIQ7/
+*l)を、ノイラミニダーゼ、エンド−β−ガラクトシダーゼ、または緩衝液
と一緒に、20MMロイペプチン、30AtMアンチパイン、0.64+sMベ
ンザミジン、および100 KIU/mlアプロチニンの存在下で、37℃で時
間を変えてインキュベートした。いくつかのインキュベージコンでは、消化緩衝
液に溶解した0、5からZQmMのフイラミニダーゼインヒビターNeu2en
5Acを加えてインキュベーションした。このような濃度では、インヒビターに
よる反応混合物のpHへの影響はなかった。酵素による処理の後、細胞を冷たい
HBSS/HSA/Caで2回洗浄し、HBSS/ISA/Ca中に4xlO6
7mlとなるように再懸濁して、その後、[+251]GMP−140の結合を
測定した。使用したNDVノイラミニダーゼはウィルス粒子の懸濁液であった。
これら粒子の各々は約103個のノイラミニダーゼ分子を含有し、一方、V、
cholerae酵素は溶液中に存在する。
[”IICMP−140の好中球への結合はプロテアーゼによって4から5%に
減少したが、ジイソプロピルフルオロホスフェートで不活性化されたエラスター
ゼまたはトリプシンによっては減少しなかった。これにより、GMP−140に
対する白血球カウンターレセプターの少(とも実質的なフラクシ冒ンは、プロテ
アーゼ感受性タンパク質成分を含有、またはこれに結合することが示される。
Vfbrio cholera (Boehringer−Mannheim
Bioehewicals、 Indianapolis、 IN)またはニュ
ーカッスル病ウィルス(NDV) (Paulson、J、C,、ら、J、’o
、Ctm、254:2120−2124 (1979)に記載のように単離)
のいずれかから得られるノイラミニダーゼ、およびBacteroides f
ragilis (Boehringer−Mannheim)から得られるエ
ンド−β−ガラクトシダーゼにより、好中球を処理した。V、 cholera
から得られるノイラミニダーゼはα2−3−1α2−6−5α2−8−結合した
シアル酸を開裂させる。NDVノイラミニダーゼは、α2−3−およびα2−8
−結合したシアル酸のみを開裂させる。
好中球をVibrio choleraから精製したノイラミニダーゼで処理す
ると、”’ [GMP−1401のヒト好中球への結合、および好中球の固定化
GMP−140への付着の両方が著しく減少した。これにより、シアル酸残基が
GMP(40に対する白血球のカウンターレセプターの実質的な成分を構成する
ことがわかる。0.1から0.2 U/mlのV、 eholeraまたはND
Vノイラミニダーゼと一緒に10かう30分間インキュベートすると、GNP−
140の特異的な結合は、偽処理されたコントロールと比較すると各々28±9
および52±H(平均値上標準偏差、n・7)に減少した。この効果はノイラミ
ニダーゼ調整物中の内因性好中球プロテアーゼまたはプロテアーゼの混入のいず
れかによるものであるという可能性を最小限にするために、好中球を固定化する
荊にDPPで処理し、内因性血清プロテアーゼを不活性化した。そして、10+
sg/ml EISAおよびいくつかのプロテアーゼインヒビターの存在下でノ
イラミニダーゼをインキユベーシッンした。ノイラミニダーゼ効果の特異性はさ
らに、ノイラミニダーゼの競合インヒビターNeu2en5Acが、GMP−1
40の好中球への結合がノイラミニダーゼにより減少するのを阻止し得ることに
より示された。
Neu2en5Acは、用量依存的にノイラミニダーゼの効果を阻害し、1cs
aは2.5■Mであった。
これらの結果により、GMP−140に対する白血球上のカウンターレセプター
、またはリンガントは糖タンパク質であり、ここでは、レセプター機能のために
はシアル酸が必要であることが示される。好中球はα2−3−およびα2−6−
結合したシアル酸を共に含有するが、α2−8−結合は検出されていない。ND
Vノイラミニダーゼで処理した後、 GMP−140の結合が一部失われること
から、レセプター中のシアル酸結合の少くともいくつかはα2−34であること
が示唆される。V、 cholera酵素を使用してさらに大きな阻害が観察さ
れたことは、α2−6−結合がまたレセプター機能のためにも必要であることを
意味し得、または、これらの結果は、無傷ウィルスの成分であるNDV酵素によ
って本質的な結合のすべてに接近し得ないためであり得る。
赤血球細胞およびリンパ球細胞とは対照的に、骨髄細胞は、α2−3−またはα
2−6−結合シアル酸を末端とし得るポリラクトサミ/グリカンが豊富である。
これらラクトサミノグリカンの多くはフコシル化されている。これらの構造は好
中球の糖タンパク質および糖脂質の両方に存在する。GMP−140の認職にお
けるこれらグリカンの可能な役割を調べるために、細胞を、糖タンパク質の分枝
していないポリラクトサミニル側鎖のガラクトースとN−アセチルグルコサミン
の間のβ1−4結合を加水分解するエンド−β−ガラクトシダーゼで処理した。
固定した好中球を0.2 U/+slまでのE. freundiiエンド−β
−ガラクトシダーゼで30分間、または0.4 U/mlまでのB. frag
ilisエンド−β−ガラクトシダーゼで60分間、前処理してもGMP−14
0の特異的結合に対する影響はなかった。これらの酵素が結合に影響を与えない
ことは、GMP−140を認識する構造がポリラクト−サミン側鎖上には存在し
ないことと一致する。
別の可能性として、および恐らくより高い可能性として、関連する側鎖はこれら
の条件下では酵素による加水分解に対して非感受性であり得る。分枝したポリラ
クトサミ/グリカンは好中球には存在しないが、高度にフコシル化したおよび/
または分枝したポリラクトサミノグリカンはこの酵素による加水分解に耐性であ
る。さらに、N−または〇−結合構造のコアに直接結合する単一のラクトサミノ
グリカンは酵素に耐性であり得る。
実施例6:シアル化したフコシル化構造がGMP−140に結合するための必要
条件
以下の研究は、ジョーシア大学のRichard CunIIingsによりチ
ャイニーズハムスターの卵巣細胞、すなわちCHO細胞を使用して行われた。使
用した細胞系には、Ade−C細胞および特異的グリコジルトランスフェラーゼ
で永久にトランスフェクトされたAds−C細胞が含まれる。Ade−C細胞は
、これらが非常に低レベルの内因性α(1.3)フコシルトランスフェラーゼを
含有するために選択された。これらの細胞は以下に述べる研究では野生型細胞と
呼ばれる。トランスフェクトされた細胞は、野生型細胞上には存在しない特定の
盟のオリゴ糖を発現する。
Let8 CHOと呼ばれる、使用する別のCHO細胞系にはUDI’Galに
対するトランスポーターを欠(。この結果、細胞にはガラクトシル化およびシア
ル化した複合糖質がない(DeutscherおよびHirscbberg.ム
ーし」1J上l−261:96−100. 1986)。これらのいくつかの細
胞に存在するオリゴ糖構造およびその細胞の型を表IIIに示す。関連する細胞
としては、野生型細胞( CHO)、ネオルイス(Neo Law) 、ネオル
イス関連細胞(Neo Let (tel))、およびLet8 CHO細胞(
Lecll)がある。
以下の方法を用いて細胞を培養およびトランスフェクトした。
CHO系のAde−C(OatasおよびPattl!lr$ons3:561
−577 (1977); Van Keurenら、m、J、 311ニア9
3−804 (1986))を、10%のウシ胎児血清を補充したα−改変イー
グル培地で増殖させた。トランスフェクトされたCIO細胞を、400μg/m
lのG41g (G[BCO) (活性薬剤)を補充した培地で増殖させた。
前述のように、Ade−CCHO細胞をa (1,3/1.4)フコシルトラン
スフェラーゼをコードするDNAで安定にトランスフェクトすることにより、N
ew Law CHO細胞を調製した(1.oweら、姐L 53:475−4
J14.199G、この文献ではこの細胞をCHO−FTと呼んだ)。野生型C
HO細胞を、GDPフコースが非シアル化うクトーサミノグリカンのみに転移す
るのを触媒するα(1,3)フコシルトランスフェラーゼをコードするDNAで
同様の方法により安定にトランスフェクトすることにより、Neo Lel(r
el) (rel)関連細胞を調製した。このトランスフェラーゼは、Love
ら、廊、ll 63:475−4114.1990に記載されている。これらト
ランスフェクトされた細胞系は共にミシガン大学のDr、 John Love
から贈与されたものである。
GM!’−140を含有するセレクチンが結合する炭水化物に関する結果および
結論
野生型CHO細胞およびトランスフェクトされたClll0細胞により生成され
る構造を表II+に示す。野生型CFIO細胞はGalβ1.4細胞上のGMP
−140に対するオリゴ糖リガンドの少くとも実質的なフラクションがタンパク
質により運ばれることが示唆される。
これらのデータにより、GMP−140に対するオリゴ糖リガンドはシアル化し
たフコシル化構造であることが確認される。シアル酸結合は、CE[0細胞がC
2,6結合を有しないため、GalにC2,3結合し得る。フコース結合はGl
cNAeにC1,3結合し、GlcNAcにはβ1,4結合によりGalが結合
している。可能な構造としては、シアリルLex自体、ジフコシルシアリルL
e lls シアリルLexのより長いポリフコシル化ポリラクトーサミノグリ
カン変異株、または上記成分の要素を含有する分枝構造がある。Le8自体は結
合に対する必要な親和性または特異性を提供しない。
末端シアル酸に最も近いGlcNAcに結合するFueがないシアル化構造を有
するVIM−2は、この構造はGMP−1,40に結合しないNeoLewi
s関連細胞上に存在するため、GMP−140に対して親和性を有し得る。しか
し、NeoLevfs関連細胞上に存在するVIM−2の数量は知られていない
。数量が少い場合は、VIM−2がGMF−140に対していくらか親和性があ
る場合でも、細胞は十分には結合しない。
別の研究により、高濃度のLe”は付着を阻害することが示されているが、Le
’三糖類を含むLNFI++は、300μMまでの濃度では、精製され固定化さ
れたGMP−140への好中球の結合には全く影響を及ぼさない。
1JiP+ 7 : GMP−140およびELAM−1によるリガンドの結合
における相違の証明
ELAM−1およびGMP−140に対するリガンドが同一または非常に類似し
ていることを示すデータにもかかわらず、そうではないことを示す2つの証拠が
ある。
まず第1に、GMP−140またはELAM−1をコードするeDNAでトラン
スフェクトされたCO3細胞への好中球の付着は、両タイプのトランスフェクト
された細胞に対して特異的な付着を示す。
Gengら、1fature (1990)に記載されているように、GMP−
140でトランスフェクトされた細胞への付着を、GNP−140に対するモノ
クローナル抗体G1によりブロックし、ELAM−1でトランスフェクトされた
細胞への付着を、ELAM−1に対するモノクローナル抗体11111/7によ
りブロックした。しかし、液相GMP−140は、GMP−140でトランスフ
ェクトされた細胞への付着をブロックしたが、ELAM−1でトランスフェクト
された細胞への付着には影響を与えなかった。(図6)
箪2に、豊富な量のシアリルLe”を含むヒトがん腫細胞系■T−29は、EL
AM−1でトランスフェクトされた細胞に結合するが、GMP−140でトラン
スフェクトされた細胞には結合しない。(図図6および図7のデータは、GMP
−140およびELAM−1が、若干具なる構造のリガンドを認識し、モして/
または同じリガンドを認識する親和性の点で異なることを示している。GMP−
140およびELAM−1はそれぞれ、親和性の程度が異なる関連したオリゴ糖
構造の範囲に結合し得る。
ELAM(およびGMP(40による結合を比較研究するために使用される方法
および物質は、以下のものであった:細胞の単離および培養物
Mooreら、J、CelユBfo1.112.491−499 (1991)
に記載されているように、モノポリ分離媒体を用いて、正常なボランティアから
ヒト好中球を単離した。ヒ) ML−60前骨髄細胞およびHT−29ヒト結腸
がん腫細胞を、アメリカンタイプカルチャーコレクション(Rockville
、 MD)から得たo 111.−ao細胞を、RPMI−1640/101ウ
シ胎児血清中に保存した。HT−29細胞を、10%ウシ胎児血清(fes)を
補充したMcCoyの53培地の培養物中に保存した。CO3−7細胞を、10
%ウシ血清を補充したダルベツコ変性イーグル培地(IIG−DMEM)中に保
存した。
C0S7細胞トランスフェクションおよび好中球ロゼ1.ティングアッセイ
GMF−140またはELAM−1をコードする全長eDNAを、Gengら、
N〔且■(1990)により記載されているように、CDM8に挿入した。
C0S7細胞を、10%ウシ血清を補充した高グルコースDMEM (G4bc
o) (HG−DMEM/10%CS)を含む10 cmベトリ皿において、約
80%コンフルエンスになるまで増殖させた。50μlのトランスフェクチンT
″試薬(BRL Life Technologies、Inc、)を、50μ
lの水中20μgのcDNAまたは水のみと混合し、室温で15分間放置した。
COS細胞を3slのOp t iMEM” I還元血清血清培地(BRL L
ire Technogies、 Inc、)で2回洗浄した後、e DNA−
リポフエクチン試薬混合物を加え、5zのco2雰囲気中37℃で一昼夜インキ
ュベートした。6slのHG−DMEM/10% CSを加え、細胞をさらに2
4時間インキュベートした。次いで、Ca”およびMg”2を含まないHBSS
で単層を1回洗浄し、0.02%のEDTAを用いて細胞を分離し、遠心分離に
よりベレット化し、次いで12m1のHG−DMEM/10zCS中で再懸濁し
た。2slの細胞懸濁液を、3slのHG−DMEM/10%CSを含む6−ウ
ェルの組織培養物(Corning)を含む各ウェルにプレートし、さらに24
時間増殖した。付着アッセイの前に、ウェルをHBSSで2回洗浄した。ウェル
を、30℃g/mlのGI F(ab’)2、H1ll/7 F(ab’)2ま
たは緩衝液のみを含む0.5slのHBSSと一緒に22℃で30分間インキコ
ベートし、これを2回繰り返した。
次いで、30℃gem 1のGMP−140または希釈液の存在下で30分間イ
ンキュベートして新たに単離したヒト好中球CHBSS中2 x 10’/ml
) b*1を単層に加え、22℃で20分間インキコベートした。
新たに単離したヒト好中球または35S−メチオニンで標識したHT−29細胞
(BBSS中2 X 10’/1%l5A)を1園1加え、22℃で20分間イ
ンキコベートした。いくつかの実験において、付着アッセイの前に、好中球を、
精製されたGMP−140(最終濃度10μg/m1)と−緒に22℃で30分
間、インキユベートした。
細胞付着をアッセイするために、5IllのHBSS/1%[lSAで5回洗浄
した後、付着した好中球を、S0璽Mのリン酸カリウム中0.5%のヘキサデシ
ルトリメチル臭化アンモニウム(pH6,0) 200μlで可溶性にした。G
engら、LLLLrj343.757−760 (1990)により記載され
ているように、付着した好中球をミエロベルオキシダーゼで2回繰り返しアッセ
イした。HT〜29細胞付着をアッセイするために、付着細胞を1%のトリトン
X100で可溶性にし、液体シンチレーシlンカウンティングにより定量した。
界面活性剤を加える前に、単層を位相差顕微鏡検査により検査し、単層が十分に
洗浄され、CO3細胞単層が無傷であることを確認した。
結果
GMP−140は、GMP−140をコードするcDNAでトランスフェクトさ
れたC0S7細胞への好中球の付着を阻害するが、ELAM−1をコードするc
DNAでトランスフェクトされた細胞への付着は阻害しないQ COS?細胞を
、GMP−140またはELAM−1をコードするcDNAで偽トランスフェク
トまたはトランスフェクトした。精製されたGMP−140、GI F(ab’
)2またはH1δ77 F(ah’>2(最終濃度はすべて10μg/■l)が
、トランスフェクトされたCOS?細胞に好中球がロゼ/ティングするのを阻害
する能力を、図6に示す。
データは、2つの独立したトランスフェクション実験からの結果である。各トラ
ンスフェクシヨンにおいて、GNP−140およびGL F(ab’)2または
H18/7 F(ab’)2の存在下または非存在下で、付着アッセイを単層上
で2回繰り返し行った。結果を、結合した好中球の数(平均±SD)として表す
。
この結果は、好中球が、ELAM−1またはGNP−140をコードするcDN
AでトランスフェクトされたCOS細胞に結合し、その結合が適切なモノクロー
ナル抗体により阻害されることを明確に示している。すなわち、抗ELAM〜1
抗体(H18/7)は、ELAM(でトランスフェクトされた細胞への好中球の
結合をブロックし、抗GMP−140抗体(G1)は、GMP(40でトランス
フェクトされたCO3細胞への好中球の結合をブロックする。しかし、液相GM
P−140は、GMP−140でトランスフェクトされたCO3細胞への好中球
の付着を完全にブロックするが、ELAM−1でトランスフェクトされたCO3
細胞への好中球の付着には影響を与えない。
次いで、大量のシアリルLeゞ構造を含むHT−29細胞の結合における相違を
調べるために、トランスフェクトされたCO8細胞を用いた。図7に示す結果は
、HT−29細胞がELAM−1でトランスフェクトされた細胞に強く結合する
が、GNP−140でトランスフェクトされた細胞には全く結合しないことを示
している。従って、GMP−140およびELAM−1は両方とも、α(2,3
)シアル化α(1,3)フコモル化ラクトうミノグリカンを含むオリゴ糖構造を
認識するが、HT−29細胞と、GMP−140およびELAM−1でトランス
フェクトされたCO3細胞との相互作用は、同一ではない。
実施例8:好中球におけるGMI’−140リガンドのタンパク質成分の特性付
は
トリプシンによる好中球の処理により、特異的なGMP(40の結合が破壊され
た。このことは、好中球におけるGNP−140に対する優勢なリガンドがグリ
コスピンゴリビドではな(表面糖タンパク質であることを示している。図8に示
すように、Hし一60m胞およびNeol、etis CHO細胞のトリプシン
処理もまた、GMP−440へのそれらの付着を著しく減少させた。このことは
、糖タンパク質成分は、これらの細胞におけるGMP−140に対する主要なリ
ガンドでもあることを示している。Cll0細胞により合成された単一糖脂質は
、トランスフェクトされたフコシルトランスフェラーゼの基質ではないため、糖
脂質リガンドは、NeoLewis CIO細胞上では期待されない。GMP−
140により認識されるオリゴ糖構造を有する表面タンパク質は、ヒト骨髄細胞
およびチャイニーズハムスター卵巣細胞においては同一ではないようである。こ
のことは、リガンドへのGMP(40の強い親和性結合は、タンパク質問の相互
作用を必要としないことを示唆している。
トリプシン処理については、 HEPEs緩衝液A緩衝液層中たNeoLewi
s C)10細胞を、0.1%のDPCC−トリプシンと一緒に37℃で10分
間インキュベートした。コントロール細胞を、DFPで不可逆的に不活性化した
DPCC−トIJプシンと一緒に、同一条件下でインキュベートした。トリプシ
ン処理後、細胞を氷上で冷凍し、最終濃度が2+iMになるようにDFPを加え
て酵素を不活性化した。トリプシンで処理した後、アッセイする前に、細胞を氷
で冷却した[IEPES緩衝液Aで新液洗浄した。
好中球の場合、還元条件下で5DS−PAGEにより分析すると、GMP−14
0で認識された主要な糖タンパク質の、見かけ上のMrは約120,000であ
ることが証明されている。ヒト好中球の血漿膜フラクシヨンを調製し、その調製
物を[リガンドブロッティング」で分析した。この調製物を5DS−PAGEで
分画し、イモピロン膜に移し換え、[’ 25]GMP−140でプローブした
。還元条件下では、標識されたGMP−140は120−kDバンドに一貫して
結合しているのが観察された。この結合は特異的である。なぜなら、Ca”依存
性であり、抗体G1によりブロックされるが、S12によってはブロックされず
、ノイラミニダーゼによる膜の前処理により除去されるからである。このタンパ
ク質は、小麦胚芽凝集素アフィニティーカラム上に定量的に結合し、このことは
、シアル化されたオリゴ糖を広(含むことを示している。
このタンパク質は、AfffgelT″に結合したGNP−140のアフィニテ
ィーカラムに結合し、カラムから溶出され得る。部分的に精製されたタンパク質
は、銀およびクーマシーブルーではあまり染色されない。このタンパク質は、同
様の見かけ上のMrを有し、SOSポリアクリルアミドゲル上に染色パターンを
有するロイコシアリンとして公知の、強く0−グリコジル化されたタンパク質を
示し得る。さらに、低用量のノイラミニダーゼでこのタンパク質を処理すると、
タンパク質からはすべてのシアル酸が除去されるわけではないが、結果としてゲ
ル上の移動度はゆるやかになり、特定の強(O−グリコジル化されたタンパク質
が部分的に脱シフル酸化されたパターンと一致する。
GMP−140に対するオリゴ糖リガンドを有する骨髄細胞には、他のタンパク
質が存在し得る。リガンドプロブティングにより決定されるように、120−k
Da糖タンパク質は、 GMP−140に最も強い親和性で結合する最も豊富な
リガンドおよび/またはその構造を示し得る。
GNP−140のレクチンドメインまたはGMP−140と相互作用する炭水化
物由来のペプチドからの診断試薬および治療薬の調製上記のペプチドおよび炭水
化物は、診断試薬として様々に応用され、特に、多くの炎症性疾患の治療に適用
される。
診断試薬
GMP−140に結合するペプチドおよび抗体または炭水化物に対する他のプロ
ーブはまた、GMP−140のリガンドを欠くヒトの疾患の検出に使用され得る
。このような疾、!!は、白血球が活性化された血小板または内皮に結合し得な
い感染症に感染しやすい患者に多(見られる。テストされる細胞、通常白血球を
、医学的に容認されている標準技術で集めてスクリーニングする。検出システム
には、EL I SA法、放射標識された抗体の固定化された活性化細胞への結
合、フローサイトメトリー、または当業者に公知の他の方法が含まれる。
レクチンドメインペプチドの存在下および非存在下での結合の阻害は、セレクチ
ン結合における欠陥または改変を検出するのに使用され得る。このような疾患は
、GMP−140に対する白血球のリガンドがないために、白血球が血小板およ
び内皮に対して結合しない感染症に感染しやすい患者に多く見られる。GMP−
140ペプチドを、蛍光タッグで放射的に、酵素的に、または電子顕微鏡の金の
ような高電子密度物質で標識する。
検査される細胞、通常白血球は、標識されたGMP−140ペプチドと一緒にイ
ンキユベートされ、結合は、GMP−140に対する抗体を用いて上記の方法に
より評価されるか、または当業者に公知の他の方法により評価される。GMP−
140に対するリガンドが血漿中にも見いだされると、それらはまた、検出試薬
として抗体の代わりに標識されたGMP−140ペプチドを用いて、標準ELI
SA法またはラジオイムノアッセイ法により測定され得る。
同様のアプローチは、GMP−140の定性的または定量的な疾患を決定するの
にも使用され得る。炭水化物を標識し、GMF−140に欠陥があると思われる
疾患を有する患者からの活性化血小板におけるGMP−140への炭水化物の結
合能力をテストする。
臨床上の応用
GMP−140は、白血球付着、炎症および凝血に関連したいくつかの機能を有
するため、GMP−140ならびに/あるいは、ELAM−1およびLEtl−
8を含む、GMP−140ペプチドまたは炭水化物のような他のセレクチン結合
に相互作用する臨床上の化合物は、これらの応答を調節するために使用され得る
。
例えば、GMP(40ペプチドまたは炭水化物は、活性化された血小板または内
皮細胞の表面にあるGMP−140のレセプターへ競合的に結合することにより
、白血球の付着を競合的に阻害するのに使用され得る。この種の治療法は、白血
球により媒介される炎症の阻害が望ましい急性の状況下において特に有用であり
得、効果的であるが一時的である。GMP−140ペプチドまたは炭水化物の注
入による慢性治療法もまた、い(つかの状況では可能である。
炎症応答は、もし再チェックされなければ、宿主を損傷し得る。なぜなら、白血
球は、正常な組織を損傷し得る有毒なが内皮に付着するメカニズムおよびそれに
続く移行は、あまりよく理解されていないが、少なくともいくつかの点で、白血
球のメカニズムと同様であり得る。血小板と転移腸瘍細胞との結合については詳
しく記載されており、いくつかのがんの蔓延における血小板の役割を示唆してい
る。
血小板−白血球の相互作用は、アテローム硬化症において重要であると考えられ
る。血小板は、単球がアテローム硬化プラークに補充される際の役割を果たし得
る。単球の蓄積は、アテローム発生中の最も初期に検出可能な症状の1つである
ことが知られている。完全に発達したプラークが破裂すると、血小板の沈着、活
性化、血栓形成の促進、ならびに虚血領域への好中球の初期補充が引き起こされ
得る。
他の領域における可能な応用は、慢性関節リウマチの治療である。
これらの臨床上の応用では、適切な薬学的キャリヤー中のペプチドまたは炭水化
物またはその混合物は、迅速な緩和を必要とする場所に静脈注射により投与され
るのが好ましい。
ペプチドもしくは炭水化物はまた、キャリヤー分子に結合したペプチドもしくは
炭水化物として、筋肉内、腹膜内、皮下、経口により、または薬物送達装置によ
っても投与され得る。
ペプチドまたは炭水化物は、インビボにおける半減期を増加させるために、さら
に化学的に改変され得る。
ペプチドは、GMP−140のタンパク質分解的開裂、または好ましくは実施例
1においてペプチドを調製するために使用したような合成手段により調製され得
る。これらの方法は、当業者により公知である。例としては、米国特許第4.7
92.525号において使用され、米国特許第4.244.946号において記
載されている、J、 Merrifield、J At Ce 、Soc、85
. 2149 (1964)により記載の固相合成が挙げられる。この合成では
、保護されたαアミノ酸は、適切な樹脂に結合され、C末端から開始するペプチ
ドの合成を開始する。他の合成方法については、米国特許第4.305.872
号および第4,316.891号に記載されている。
これらの方法は、GMP−140と同一の配列を有するペプチド、またはアミノ
酸の置換物または付加物を合成するのに使用され得、これらは、実施例1および
2に記載されているように、その活性を調べるためにスクリーニングされ得る。
ペプチドはまた、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸およ
びリン酸のような無機酸、ならびにギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、
乳酸、ピルビン酸、シニウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸およびフマル酸
のような有機酸との反応、または水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸
化カリウムのような無機塩基、およびモノ−、ジー、トリアルキルおよびアリル
アミンのような冑機塩基、および置換エタノールアミンとの反応により形成され
る薬学的に受容可能な酸または塩基付加塩として投与され得る。
シクロプロピルアミノ酸、または同様に誘導されるアミノ酸を含むペプチドもま
た使用され得る。これらのペプチドは、その最初の活性を保持するが、インビボ
において半減期を増化した。アミノ酸を改変することが知られている方法、およ
びその使用については、例えば、Stam+++erの米国特許第4.629.
784号に記載されているように、当業者に公知である。
炭水化物は、天然に、またはトランスフェクトされたCos細胞の例において記
載されているような遺伝子工学の結果、または好ましくは合成手段により、炭水
化物を発現する細胞から単離され得る。これらの方法は、当業者に公知である。
さらに、多数のグリコジルトランスフェラーゼがクローニングされている(J、
C,Paulsonおよびに、J、 Co11ey、 J、 Biol、 Ch
g3.−264:17615−17618.1989)。従って、当業者は、調
合薬または診断試薬を調製するために、合成化学および酵素的合成を組み合わせ
て使用することができる。
生物学的に活性なペプチドおよび炭水化物は、GMP−140への好中球および
単球の結合を阻害するもの、またはELAM−1および/またはホーミングレセ
プターの媒介による白血球の内皮への付着を阻害するものである。
患者への投与に適切な薬学ビヒクルは、当業者に公知である。非経口投与では、
ペプチドまたは炭水化物は、通常、滅菌水または生理食塩水中で溶解または懸濁
され得る。腸内投与では、ペプチドまたは炭水化物は、錠剤、液体またはカプセ
ル形態で不活性キャリヤーに導入され得る。適切なキャリヤーは、デンプンまた
は砂糖であり、潤滑剤、香料、結合剤および同じ特性を有する他の物質が含まれ
る。GMP−140ペプチドまたは炭水化物はまた、創傷部または炎症部位に、
特異的には溶液またはクリームで塗布して局部投与され得る。
あるいは、ペプチドまたは炭水化物は、リポソームまたはマイクロスフェア(ま
たは微量粒子)で投与され得る。患者へ投与するためのリポソームおよびマイク
ロスフェアを調製するための方法は、当業者に公知である。米国特許第4.78
9゜734号は、リポソーム中に生物学的物質をカプセル化する方法について記
載している。実質的に、物質は、水溶液に溶解され、必要に応じて、界面活性剤
と共に適切なリン脂質および脂質が添加され、物質は、必要に応じて透析または
超音波処理される。公知の方法は、G、 Gregoriadis、 14章、
’Lfposo+*es″、 Dru Car 1ers ’n io o a
nd Med’cine pp、 2g?−341(Academic Pre
ss、 1979)により詳しく記載されており、その教示は本願で寥考のため
に援用している。ポリマーまたはタンパク質により形成されるマイクロスフェア
は、当業者に公知であり、胃腸管を通じて血流に直接送達されるように設計され
得る。あるいは、ペプチドまたは炭水化物が導入され、マイクロスフェアまたは
マイクロスフェアの複合体が数日から数カ月の期間に渡ってゆっくりと放出され
るように移植され得る。例えば、米国特許第4.906.474号、箪4.92
5.673号および第3.625.214号を参照。
主題のペプチドは、一般に、体重1kg当り約1μgより多い量で非経口投与さ
れると活性となる。大抵の炎症性疾患の治療には、投与量は、体重1kg当り0
.1から3hgの間である。実施例で特徴づけられるペプチドの中には、70B
/kgの投与量が必要なものもある。この投与量は、一部には、1つ以上のペプ
チドが投与されるか否かに依存し得る。レクチンドメインの3つの領域の結合に
関して記載されているように、相乗効果は、レクチンドメインの異なるまたは重
複する領域からのペプチドの組合せ、またはGMP(40のEGFドメイン由来
のペプチドとの組合せにより見られる。
炭水化物は、非経口または他の手段により投与されるときに、活性とならなけれ
ばならない。必要な量は、インビトロアッセイにおけるGMP〜140の骨髄性
細胞への結合の阻害に必要な濃度、および注入された炭水化物のクリアランス速
度に基づく。この投与量は、一部には、1つまたはそれ以上の炭水化物が投与さ
れるか否かに依存し得る。相乗効果は、炭水化物の組合せ、または多価形態の天
然のリガンドもしくはGMP−140に対する親和性および/または親和力を増
加させるために設計されたリガンドの誘導体により見られる。
ペプチドまたは炭水化物はまた、白血球の血小板または内皮への付着を防止する
ために、身体に注入される補てつ物として使用されるために、基質にコーティン
グされ得る。
GMP−140、そのペプチドまたは炭水化物の抗体を用いた治療理学療法に対
する応答を評価するための基準は、特定の条件により左右され、通常、標準的な
医学的実践に従う。例えば、心筋梗塞の拡張を防止するために有効な投与量の基
準は、心電図、生存徴候および臨床応答をモニターして、血漿中の心筋壊死のマ
ーカー酵素を観察することにより、当業者により決定され得る。急性呼吸性困難
症候群の治療では、動脈酸素および肺浸潤物の分解における改善、ならびに呼吸
困難および頻呼吸の減少により測定される臨床上の改善が調べられる。
ショックを起こした(低血圧)の患者の治療では、有効な投与量は、臨床上の応
答、および血圧回復後の、肝臓および腎臓のような生体臓器の機能の特異的な測
定に基づく。神経機能は、発作を起こした患者においてモニターされる。移植さ
れた臓器の機能をモニターするために、特異的なテストが使用され、例えば、腎
臓移植を受けた患者の血清、尿流、および血清電解質がモニターされる。
本発明の変更および改変、GNP−140由来のペプチドを用いたGMF−14
0を含む結合反応を調節する方法、またはGMP−140リガンドの部分を形成
する方法は、上記の詳細な記載より当業者に自明である。このような変更および
改変は、添付の請求の範囲の範囲内にあるものとする。
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要約書
GMP−140のレクチン結合領域の3つの領域由来のペプチドは、GMP−1
40,ELAM−1およびリンパ球ホーミングレセプターを含む、「セレクチン
類jと選択的に相互作用することが発見された。
3つの領域には、アミノ酸19−34.54−72および66−89が含まれる
。この番号は、シグナルペプチドを開裂した後の成熟タンパク質のN末端を残基
1と定義した、ペプチド中の残基の番号ニ基ツく。GMP−140に結合するフ
コシル化シアル化ラクトサミン構造もまた発見された。この構造は、α(2,3
)シアル酸で置換したラクトサミノグリカン類を含む受容体を改変し得るα(1
,3)フコシルトランスフェラーゼ類の発現により形成される。
Lex、 Galβ1.4(Fucα1.3)G1eNAeβ1−R(ここで、
Rはタンパク質または他の炭水化物構造である)は、このシアル化構造のコアを
形成する。ペプチドおよび炭水化物構造は、診断薬、および凝血過程または炎症
過程の調節または阻害への臨床上の応用において有用である。
国際調査報告
国際調査報告
Claims (40)
- 1.GMP−140への好中球および単球の結合を阻害するGHP−140のレ クチン様ドメイン由来の単離されたペプチド。
- 2.CQNRYTDLVAIQNKNE、AENWADNEPNNXRNNED 、RKNNKTWTWVGTKALTNE、KKALNEAENWAD、ならび にGMP−140への好中球および単球の結合を阻害するこれらの部分からなる 群から選択されるペプチドを含む、請求項1に記載のペプチド。
- 3.CQ.RYTDLVAIQNK.E、RK.N..WTWVGT.K.LT EE、AENWADGEPNNK.N.ED、C...YT.LVAIQNK. E、RK....W.WVGT.K.LT,E、A.NW..EPNN.... ED、および.K.KT.EA.NW..からなる群から選択され、ここで、“ .”が任意のアミノ酸である、請求項1に記載のペプチド。
- 4.レクチンドメインペプチドのアミノ酸19−34、19−30、23−34 、21−30、22−30、23−30、54−72、54−63、73−89 、73−83、73−85、77−89およびその組合せからなる群より選択さ れるペプチドを含む、請求項1に記載のペプチド。
- 5.キャリヤー分子に結合される、請求項1に記載のペプチド。
- 6.身体へ移植するために不活性基質に結合される、請求項1に記載のペプチド 。
- 7.患者へ投与するために、受容可能な薬学的キヤリやー中にある、請求項1に 記載のペプチド。
- 8.蛍光、放射、および酵素標識からなる群から選択される検出可能な標識をさ らに含む、請求項1に記載のペプチド。
- 9.α1,3−トフコシル化、α2,3−シアル化ラクトサミノグリカン構造を 含む、セレクチンに結合する単離された炭水化物。
- 10.シアリルL6x、ジフコシルシアリルLex、およびより長いポリフコシ ル化ポリアクトサミノグリカン(polyactosaminog1ycans )からなる群から選択される、請求項9に記載の炭水化物。
- 11.NeuAcα2,3Ga1β1,4(Fucα1,3)GlcNAcβ1 −Rであり、そしてRがタンパク質または他の炭水化物構造である、請求項10 に記載の炭水化物。
- 12.タンパク質をさらに含む、請求項9に記載の炭水化物。
- 13.GMP−140の単球および好中球への結合を阻害する、請求項9に記載 の炭水化物。
- 14.ELAM−1の血小板および内皮細胞への結合を阻害しない、請求項13 に記載の炭水化物。
- 15.身体へ移植するために不活性基質に結合される、請求項9に記載の炭水化 物。
- 16.患者へ投与するために受容可能な薬学的キャリヤー中にある、請求項9に 記載の炭水化物。
- 17.蛍光、放射および酵素標識からなる群から選択される検出可能な標識をさ らに含む、請求項9に記載の炭水化物。
- 18.GMP−140の結合を阻害して生物学的機能を変化させるるペプチド、 GHP−140に結合される炭水化物、およびGMP−140のレクチンドメイ ンから単離されたペプチドからなる群から選択される物質の有効な量を投与する ことを含む、炎症応答を調節する方法。
- 19.前記ペプチドが、好中球のGHP−140への結合を阻害するGMP−1 40のレクチン様ドメイン由来のペプチドから選択される、請求項18に記載の 方法。
- 20.前記ペプチドが、CQNRYTDLVAIONKNE、AENWADNE PNNKRNNED、RKNNKTWTWVGTKKALTNE、KKALTN AENWAD、および好中球のGMP−140への結合を阻害するこれらの部分 からなる群から選択される、請求項19に記載の方法。
- 21.CQ.RYTDLVAIQNK.E、RK.N..WTWVGT.K.L TEE、AENWADGEPNNK.N.ED、C...YT.LVAIQNK .E、RK...,W.WVGT.K.LT,E、A.NW...EPNN.. ..ED、および.K.KT.EA.NWからなる群から選択され、ここで、“ .”が任意のアミノ酸である、請求項19に記載の方法。
- 22.前記ペプチドが、レクチンドメインペプチドのアミノ酸19−34、19 −30、23−34、21−30、22−30、23−30、54−72、54 −63、73−83、73−89、73−85、77−89およびその組合せか らなる群より選択される、請求項19に記載の方法。
- 23.前記物質をキャリヤー分子に結合する工程をさらに包含する、請求項19 に記載の方法。
- 24.身体へ移植するために不活性基質に前記物質を結合する工程をさらに包含 する、請求項19に記載の方法。
- 25.前記物質と、患者に投与するために受容可能な薬学的キャリヤーとを組み 合わせる工程をさらに包含する、請求項19に記載の方法。
- 26.蛍光、放射および酸素標識の群から選択される検出可能な標識で、前記物 質を標識する工程をさらに包含する、請求項19に記載の方法。
- 27.インビボにおける半減期を増大させるために、前記物質を化学的に改変す る工程をさらに包含する、請求項19に記載の方法。
- 28.前記キャリヤーが、マイクロスフェア、マイクロカプセル、およびリボソ ームからなる群から選択される、請求項25に記載の方法。
- 29.前記炭水化物が、α1,3−フコシル化、α2,3−シアル化ラクトサミ ノグリカン構造、糖タンパク質、および炭水化物または糖タンパク質に対する抗 体からなる群から選択される、炎症応答を調節する、請求項18に記載の方法。
- 30.前記炭水化物が、シアリルLex、ジフコシルシアワルLex、およびよ り長いポリフコシル化ポリアクトサミノグリカンからなる群から選択される、請 求項29に記載の方法。
- 31.前記炭水化物が、NeuAcα2,3Ga1β1.4(Fucα1.3) GlcNAcβ1−Rであり、そしてRがタンパク質または他の炭水化物構造で ある、請求項30に記載の方法。
- 32.前記炭水化物が、GMP−140の単球および好中球への結合を阻害する 、請求項29に記載の方法。
- 33.前記炭水化物が、ELAM−1の血小板および内皮細胞への結合を阻害し ない、請求項29に記載の方法。
- 34.前記炭水化物が、GMP−140およびELAM−1の結合を阻害し、G MP−140またはELAM−1の結合を実質的に阻害するのに有効な量の炭水 化物を投与する工程を含む、請求項29に記載の方法。
- 35.前記炎症応答が、腫瘍に対するものであり、前記物質が、該腫瘍の転移を 阻害するのに有効な量で投与される、請求項18に記載の方法。
- 36.セレクチンに結合する単離された炭水化物に対する抗体であって、該炭水 化物が、α1,3−フコシル化、α2,3−シアル化ラクトサミノグリカン構造 を含む、抗体。
- 37.前記炭水化物が、シアリルLex、ジフコシルシアリルLex、およびよ り長いポリフコシル化ポリアクトサミノグリカンからなる群から選択される、請 求項36に記載の抗体。
- 38.前記炭水化物が、NeuAcα2,3Galβ1,4(Fucα1,3) GlcNAcβ1−Rであり、Rがタンパク質または他の炭水化物構造である、 請求項36に記載の抗体。
- 39.還元条件下でのSDS−PAGEによる120,000ダルトンの分子量 を有し、0−グリコシル化のための複数の部位を有する、セレクチンに対するリ ガンドの単離されたタンパク質成分。
- 40.前記タンパク質がロイコシアリンである、請求項39に記載のタンパク質 。
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