JPH05103595A - 牛乳ホエータンパク加水分解物の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ブロメライン、パパイン等の植物由来のタン
パク分解酵素を用いて濃度５〜２０重量％に調整した牛
乳ホエータンパク水溶液の該タンパク中のβ−ラクトグ
ロブリンを選択的に加水分解する牛乳ホエータンパク酵
素加水分解物の製造法。 【効果】 高濃度の牛乳ホエータンパク水溶液を加水分
解することができるので効率的に低アレルゲン化された
牛乳ホエータンパク加水分解物を得ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、植物由来のタンパク分
解酵素を用いて効率よく牛乳ホエータンパク加水分解物
を製造する方法に関する。本発明の方法によるとβ−ラ
クトグロブリンが選択的に加水分解されるので、低アレ
ルゲン化された牛乳ホエータンパク加水分解物を提供す
ることができる。

【０００２】

【従来の技術】牛乳ホエータンパクにはその主成分とし
てβ−ラクトグロブリンが、さらにα−ラクトアルブミ
ン、免疫グロブリンあるいは牛血清アルブミン等のタン
パクが存在している。これらのタンパクは程度の大小は
あるが全てアレルゲンとなる。特に、β−ラクトグロブ
リンは母乳中に存在せず、アレルギー患児に対して強い
アレルゲンとなる。

【０００３】従来、牛乳ホエータンパクの低アレルゲン
化方法として、タンパク分解酵素を使用した加水分解処
理が知られていた。特に、強いアレルゲンであるβ−ラ
クトグロブリンの酵素加水分解や除去には、ある特定の
酵素を使用した選択的分解する方法あるいはその他の処
理手段を施すことによる除去する方法が知られている。

【０００４】例えば、Ｈａｙａｓｈｉ等のＦｏｏｄ Ｓ
ｃｉ．，５２，１１０７（１９８７）には、超高圧下に
おけるβ−ラクトグロブリンとα−ラクトアルブミンの
圧変性の受けやすさの違いを利用し、２００ＭＰａの超
高圧下でタンパク分解酵素であるサーモライシン（大和
化成（株）、Ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ）を使用してβ−
ラクトグロブリンを選択的に分解除去する方法が記載さ
れている。

【０００５】また、特開平２−２６５４４１号公報に
は、ウシトリプシン（Ｓｉｇｍａ社，Ｔ−８００３）、
枯草菌由来のタンパク分解酵素（ＮＯＶＯ社，Ｎｅｕｔ
ｒａｓｅ）とアスペルギルス・オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇ
ｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のタンパク分解酵素
（天野製薬（株），ＰｒｏｔｅａｓｅＡ）を使用し、ｐ
Ｈ７〜９、３０〜４０℃、３０分〜２０時間処理するこ
とによりβ−ラクトグロブリンを選択的に分解する方法
が記載されている。

【０００６】更に、特開平３−１９６５４号公報では、
ホエータンパクを含む出発原料からラクトグロブリンを
除去するために、強塩基型陰イオン交換器を使用する方
法が記載されている。

【０００７】上記方法によるβ−ラクトグロブリンの選
択的分解あるいは選択的除去は、例えば、高圧下でのβ
−ラクトグロブリンの選択的分解は、大量処理が困難で
あり、また、使用するタンパク分解酵素が高価であるう
え、高圧装置を使用せねばならず、コストアップになっ
てしまう。

【０００８】また、ウシトリプシン、枯草菌由来のタン
パク分解酵素、アスペルギルス オリーゼ（Ａｓｐｅｒ
ｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のタンパク分解酵素
を使用したβ−ラクトグロブリンの選択的分解は、基質
濃度が１％と低いためコストアップになり、また、基質
濃度１％で処理するためβ−ラクトグロブリンの分解が
進行するとともにα−ラクトアルブミンの分解も進行
し、その結果、α−ラクトアルブミンの含有量の低いβ
−ラクトグロブリンの選択的分解物になってしまう。更
に、これらの酵素を使用することによっても得られる分
解物はそのアレルゲン性が充分に低下していない。

【０００９】強塩基型陰イオン交換器使用したホエータ
ンパクを含む出発原料からのラクトグロブリンの除去
は、その収率が低く、コストアップになってしまう。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、牛乳ホ
エータンパクに含まれるβ−ラクトグロブリンを選択的
に加水分解してアレルゲン性を低減し、かつα−ラクト
アルブミン含量の比較的高い牛乳ホエータンパク加水分
解物を製造する方法について種々検討したところ、植物
由来のタンパク分解酵素であるブロメラインやパパイン
を用いることによって、牛乳ホエータンパクの濃度を５
〜２０重量％に高めて加水分解することができることを
見出し本発明を成すに至った。

【００１１】したがって、本発明は、植物由来のタンパ
ク分解酵素を用いて、効率よく牛乳ホエータンパク加水
分解物を製造する方法を提供することを課題とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、牛
乳ホエータンパク濃度５〜２０重量％に調製された牛乳
ホエータンパク水溶液に植物由来のタンパク分解酵素を
添加して牛乳ホエータンパク中のβ−ラクトグロブリン
を選択的に分解し、アレルゲン性の低い牛乳ホエータン
パク酵素分解物を製造する方法に関する。さらに、具体
的には、５〜２０％の牛乳ホエータンパク水溶液をＮａ
ＯＨ、ＫＯＨやＣａ（ＯＨ）₂ でｐＨ７〜９に調整し、
植物由来のタンパク分解酵素を２０〜５００ｕ／ｇ−Ｗ
ＰＣ添加し、４０〜６０℃、３０分〜１２時間処理し、
加水分解終了後、プレート式熱交換機により加熱するこ
とで酵素を失活させ、凍結乾燥機又は噴霧乾燥機で乾燥
し、アレルゲン性が低く、分解物濃度の高い牛乳ホエー
タンパク酵素分解物を得る方法に関する。

【００１３】本発明における酵素は、植物由来のタンパ
ク分解酵素であって、このような酵素としてブロメライ
ン（天野製薬（株）、ＢｒｏｍｅｌｉｎＦ）、パパイン
（天野製薬（株）、ＰａｐａｉｎＷ）等を例示すること
ができる。また、酵素は１種類又は２種類以上でも使用
でき、複数の酵素を使用する場合は植物由来のタンパク
分解酵素のブロメラインやパパインと植物以外の起源に
由来する他のタンパク分解酵素とを併用することが有効
である。

【００１４】酵素反応は、前記したように牛乳ホエータ
ンパク５〜２０重量％を含有する水溶液をｐＨ７〜９に
調整し、前記タンパク分解酵素を添加し、４０〜６０℃
で３０分〜１２時間酵素分解を行なう。

【００１５】従来の方法では、牛乳タンパク１重量％を
含有する溶液でタンパク分解酵素処理が行なわれていた
が、本発明では前記したタンパク分解酵素を使用するこ
とによって効率的に高濃度の牛乳タンパク酵素分解物を
得ることができる。この点が本発明の大きな特徴のひと
つである。

【００１６】酵素分解終了後の酵素失活は、ブロメライ
ンやパパイン等の酵素についてはプレート式熱交換機を
用い、１２５℃５秒間の加熱で行うことができ、α−ラ
クトアルブミンを変性させずに加熱して酵素失活し、分
解物を得ることができる。得られる溶液はそのままある
いは濃縮するか乾燥粉末化して低アレルゲン化食品の原
料として利用することができる。本発明の方法によると
β−ラクトグロブリンが選択的に分解され、α−ラクト
アルブミンが出発原料の５０％以上をしめる牛乳ホエー
タンパク分解物を得ることができる。本発明の方法によ
って得られる牛乳ホエータンパクは、α−ラクトアルブ
ミンとβ−ラクトグロブリンとの比率は、その分子量に
差があることを利用してその分子量分布をＳｗｅｒｇｏ
ｌｄらの方法〔Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ，１３１，２９５（１９８３）〕で測定する
ことによって知ることができる。

【００１７】分子量分布の測定は、下記に示す条件で行
うことができる。 （１）試料濃度：０．０５％ （２）注入量 ：２０μｌ （３）カラム ：ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＰＷ_XL （４）溶 媒 ：０．１％トリフルオロ酢酸含有 ５５
％アセトニトリル溶液 （５）溶媒速度：０．３０ｍｌ／ｍｉｎ （６）検出波長：２１０ｎｍ （７）分析温度：２０〜３０℃

【００１８】また、ホエータンパク分解物のアレルゲン
性はＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ試験〔日本小児
アレルギー学会誌，１，３６（１９８７）〕あるいはＭ
ｏｔａらのＰＣＡ（受身皮膚アナフィラキシー法）によ
る抗原抗体反応〔ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ ８ ８１３
（１９６９）〕によって確認することができる。

【００１９】β−ラクトグロブリンを指標としたＩｎｈ
ｉｂｉｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ試験に使用した溶液等は下
記のように調製することができる。

【００２０】（１）β−ラクトグロブリンのコーティン
グ：０．０５ＭのＮａＨＣＯ₃ −Ｂｕｆｆｅｒ １１ｍ
ｌにβ−ラクトグロブリン（１ｍｇ／ｍｌ）を１００μ
ｌ溶解し、分注（１００μｌ／ｗｅｌｌ）する。 （２）サンプル：サンプル２００ｍｇをＰＢＳに１ｍｌ
に溶解する。 （３）ヤギ全血清希釈液：ヤギ全血清３４μｌをＰＢＳ
−ｔｗｅｅｎ２０ ５．１ｍｌに溶解する。 （４）抗β−ラクトグロブリン（β−Ｌｇ）ウサギ血清
希釈液：抗β−Ｌｇウサギ血清３４μｌをＰＢＳ−ｔｗ
ｅｅｎ２０ ５．１ｍｌに溶解する。 （５）ペルオキシダーゼ標識抗ウサギ免疫グロブリン
（ＩｇＧ）ヤギＩｇＧ：ペルオキシダーゼ標識抗ウサギ
ＩｇＧ ヤギＩｇＧ ３μｌをＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０
１０ｍｌに溶解する。 （６）ＡＢＴＳ溶液：ＡＢＴＳ（２，２´−Ａｚｉｎｏ
・ｂｉｓ−３−ｅｔｈｙｌ ｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉ
ｎｅ ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）３ｍｇを脱イオン
水 ５ｍｌに溶解し、０．００６％ Ｈ₂ Ｏ ₂−０．２
Ｍクエン酸Ｎａ緩衝液・ｐＨ４．０（ＡＢＴＳ用Ｂｕｆ
ｆｅｒ）５ｍｌと混合する。

【００２１】また、ＰＣＡによる抗原抗体反応における
抗血清の調製及びＰＣＡによる判定は、下記のように行
うことができる。

【００２２】（１）抗血清の調製：Ａｌ（ＯＨ）₃ ４．
０ｍｇを２００ｍｌ ＰＢＳに媒散後滅菌した液２０ｍ
ｌとタンパク当量として１０ｍｇ／ｍｌとなるように反
応液をＰＢＳにより希釈した１ｍｌをＰＢＳで１００ｍ
ｌにメスアップした溶液２０ｍｌを振盪混合したもの４
００μｌ（抗原として２０μｇを含有）を１１日間訓化
飼育したＢＡＬＢ／ｃマウス（５週齢の雄）に４週間に
渡り１週間隔で５回に分けて腹腔内投与した。第５回投
与５日後に大腿基部を切断して全採血し、使用まで−８
０℃に保存した。

【００２３】（２）ＰＣＡによる判定：生理食塩水を用
い、上記抗血清の調製にて得たマウス抗α−ラクトアル
ブミン血清、マウス抗β−ラクトグロブリン血清、マウ
ス抗ペプチド血清の１／２希釈列（１／１０，１／２
０，１／４０，１／８０，１／１００）を作り、各希釈
血清５０μｌを背毛を刈ったＳＤ系ラット（１０週齢の
雄）の背部に皮下注射する。２４時間後に、各ペプチド
溶液（抗原として１ｍｇを含有）を含む０．６％エバン
スブルー液 １．０ｍｌを尾静脈より注射し、３０分後
屠殺し、背部皮膚をはいで紫斑を測定した。判定は陽性
反応がでた最大の希釈倍率を抗体価とした。

【００２４】次に実施例を示し、本発明をさらに詳しく
説明する。

【実施例１】牛乳ホエータンパク１００ｇを水８００ｇ
で溶解し、Ｃａ（ＯＨ）₂ でｐＨ８に調整し、ブロメラ
インを１００ｕ／ｇ−ＷＰＣ添加することで１０％溶液
にし、ｐＨを反応時間中８に一定にし、４５℃で４時間
酵素処理した。４時間後にプレート式熱交換機で１２５
℃に５秒間加熱して酵素を失活させ、凍結乾燥し、牛乳
ホエータンパク加水分解物を得た。ＴＳＫｇｅｌＧ３０
００Ｐ_XLのカラム（東ソー（株））と０．１％トリフル
オロ酢酸含有の５５％アセトニトリル溶液を使用してこ
の分解物の分子量分布を測定したところ、図１に示すよ
うに未分解のホエータンパクと比較してβ−ラクトグロ
ブリンは分解されており、α−ラクトアルブミンが出発
原料の５０％以上の分解物を得ることができた。

【００２５】

【実施例２】牛乳ホエータンパク１００ｇを水８００ｇ
で溶解し、Ｃａ（ＯＨ）₂ でｐＨ８に調整し、水に溶解
したパパインを１００ｕ／ｇ−ＷＰＣ添加し、さらに水
を加え１０％溶液にし、反応時間中ｐＨを８に一定に
し、４５℃で４時間酵素処理した。４時間後にプレート
式熱交換機で１２５℃で５秒間加熱して酵素を失活さ
せ、凍結乾燥し、牛乳ホエータンパク加水分解物を得
た。分解物の分子量分布を測定したところ、図２に示す
ように未分解のホエータンパクと比較してβ−ラクトグ
ロブリンは分解されており、α−ラクトアルブミンが出
発原料の５０％以上の分解物を得ることができた。

【００２６】

【比較例１】牛乳ホエータンパク１００ｇを水８００ｇ
で溶解し、Ｃａ（ＯＨ）₂ でｐＨ７に調整し、水に溶解
したニュートラーゼ（ＮＯＶＯ社、Ｎｅｕｔｒａｓｅ
ｌ．５ＭＧ）を１００ｕ／ｇ−ＷＰＣ添加し、さらに水
を加え１０％溶液にし、４０℃で４時間酵素処理した。
４時間後プレート式熱交換機で１２５℃で５秒間加熱す
ることで酵素失活させ、凍結乾燥し、牛乳ホエータンパ
ク加水分解物を得た。分解物の分子量分布を測定したと
ころ、図３に示すように未分解のホエータンパクと比較
してβ−ラクトグロブリンとα−ラクトアルブミンは分
解されておらず、α−ラクトアルブミンが出発原料の５
０％以上の分解物を得ることができなかった。

【００２７】

【比較例２】牛乳ホエータンパク１００ｇを水８００ｇ
で溶解し、Ｃａ（ＯＨ）₂ でｐＨ７．５に調整し、水で
溶解したプロテアーゼＡ（天野製薬（株）、Ｐｒｏｔｅ
ａｓｅＡ）を１００ｕ／ｇ−ＷＰＣ添加し、さらに水を
加えて１０％溶液にし、４０℃で４時間酵素処理した。
４時間後にプレート式熱交換機で１２５℃で５秒間加熱
することによって酵素失活させ、凍結乾燥し、分解物を
得た。分解物の分子量分布を測定したところ、図４に示
すように未分解のホエータンパクと比較してβ−ラクト
グロブリンは分解されていたが、α−ラクトアルブミン
が出発原料の５０％以上の分解物を得ることができなか
った。

【００２８】以上の（実施例１）、（実施例２）及び
（比較例１）、（比較例２）により得た分解物について
β−ラクトグロブリンを指標としたＩｎｈｉｂｉｔｉｏ
ｎ ＥＬＩＳＡ試験を行った。その結果を図５に示す。
この図ではβ−ラクトグロブリンの曲線との距離が大き
いほど分解物の抗原性が小さくなることを示す。図に示
すようにニュートラーゼやプロテアーゼＡに比べてブロ
メラインとパパインは著しい抗原性の低下が認められ
た。

【００２９】また、（実施例１）、（実施例２）及び
（比較例２）により得た分解物についてＰＣＡによる判
定を行ったところ、図６〜９に示すように未分解のホエ
ータンパクと比較してプロテアーゼＡはアレルゲン性が
残存し、ブロメラインとパパインはアレルゲン性の低下
が認められた。

【００３０】また、（実施例１）及び（実施例２）は、
酵素を含めた原材料費が安価で、収率がほぼ１００％で
あり、官能評価では苦味の発現が小さかった。

【００３１】

【発明の効果】本発明によると、牛乳ホエータンパク中
に多量に含まれるβ−ラクトグロブリンを植物由来の蛋
白分解酵素により選択的に加水分解し、α−ラクトアル
ブミンがリッチな牛乳ホエータンパクの酵素加水分解物
を得ることができる。得られる分解物は低アレルゲン化
食品として有効に利用することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１のブロメラインによる牛乳ホエータン
パク加水分解物の分子量分布を示す。

【図２】実施例２のパパインによる牛乳ホエータンパク
加水分解物の分子量分布を示す。

【図３】比較例１のニュウトラーゼによる牛乳ホエータ
ンパク加水分解物の分子量分布を示す。

【図４】比較例２のプロテアーゼＡによる牛乳ホエータ
ンパク加水分解物の分子量分布を示す。

【図５】実施例１，２及び比較例１，２のＩｎｈｉｂｉ
ｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ試験の結果を示す。

【図６】実施例１のＰＣＡによる免疫原性評価結果を示
す。

【図７】実施例２のＰＣＡによる免疫原性評価結果を示
す。

【図８】比較例１のＰＣＡによる免疫原性評価結果を示
す。

【図９】比較例２のＰＣＡによる免疫原性評価結果を示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 中村 哲郎 埼玉県入間市下藤沢580−５ (72)発明者 高橋 伸彰 埼玉県川越市新宿町５−11−３ 雪印乳業 株式会社独身寮 (72)発明者 島谷 雅治 埼玉県狭山市新狭山３−１−２ レジデン ス新狭山303 (72)発明者 平野 賢一 愛知県岩倉市稲荷町稲荷西212−11 (72)発明者 伊藤 浩史 愛知県岩倉市稲荷町221

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 濃度５〜２０重量％に調整した牛乳ホエ
   ータンパク水溶液に植物由来のタンパク分解酵素を加え
   て、該タンパク中のβ−ラクトグロブリンを選択的に加
   水分解することを特徴とする牛乳ホエータンパク加水分
   解物の製造法。
2. 【請求項２】 植物由来のタンパク分解酵素が、ブロメ
   ラインおよび／またはパパインである請求項１に記載の
   牛乳ホエータンパク酵素加水分解物の製造方法。